KR102115468B1 - 마이코박테리움 파라고르도네의 항암 면역치료법 용도 - Google Patents
마이코박테리움 파라고르도네의 항암 면역치료법 용도 Download PDFInfo
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Abstract
마이코박테리움 파라고르도네(M. paragordonae)에 의한 항암 조절반응과 면역요법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 마이코박테리움 파라고르도네는 암 세포에 대한 세포독성뿐만 아니라, 자연살해세포 또는 T 세포 매개 암 세포 독성을 갖고, 대식세포 또는 수지상 세포의 암 세포 독성조절 T 세포의 활성화를 억제함으로써 면역 반응을 유도하여 종양 형성을 억제하여 면역 항암제에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
Description
마이코박테리움 파라고르도네(M. paragordonae)에 의한 항암 조절반응과 면역요법에 관한 것이다.
악성종양인 암은 감염성 질환과는 다르게 특정 지역에 한해서 발병하는 것이 아니라 전 세계적으로 발병되고 있다. WHO 보고에 따르면 전 세계적으로 2012년 한 해에 약 1천 4백만 명의 환자가 새롭게 암으로 진단받았고, 약 3 300백만 명의 환자가 암으로 고통 받고 있으며, 그 해 820만 명의 환자가 암으로 사망하였다. 국내의 경우, 2011년 보고에 따르면 약 22만 명의 환자가 암으로 진단받았고, 백 십여만 명이 기존에 있던 암환자로 조사되었다. 뿐만 아니라 7만 2천 명의 환자가 암으로 사망하며, 질병으로 인한 사망률 1위를 차지하는 것으로 확인되었다.
암을 치료하기 위하여 1차적으로 외과적 절제술이 요구되지만, 암의 크기 및 전이 정도에 따라, 외과적 수술이 제한된다는 한계점이 있다. 현재 가장 많이 사용 되고 있는 항암치료 중 하나인 화학요법은 특정 치료제가 특정 암에만 적용 가능하기 때문에, 100여 가지가 넘는 다양한 암에 대한 치료제 개발이 필요하다는 한계점이 있음. 뿐만 아니라 암세포의 기원은 정상적인 세포이기 때문에 화학요법을 적용할 경우 정상세포에도 작용하여 다양한 부작용이 초래되고 있다. 또 다른 항암치료로 사용되고 있는 방사선치료법은 다양한 암에 대하여 적용 가능하다는 장점이 있음에도 불구하고, 화학요법과 마찬가지로 심각한 부작용을 초래하는 것으로 알려져 있다. 암의 경우 주로 고령의 환자에서 발병되는 것을 고려해 보았을 때, 위와 같은 요법에 의한 부작용은 환자에게 상당한 부담이며, 치료를 통한 생명연장과 삶의 질 향상이 비례하지 않다고 볼 수 있다. 따라서 다양한 암에 적용 가능하며 부작용이 적은 종양면역요법이 큰 관심을 받고 있다.
종양면역요법은 1891년 Coley에 의해 세균감염이 암환자의 일시적인 차도를 유도한다는 발견에서부터 시작되었으며, 1960년대에는 Mycobacterium bovis BCG (이하 BCG)가 일부 암을 제거하는 것을 확인하였다. 비결핵 항산균은 복잡한 세포벽 구성성분으로 인하여 면역 유도능이 뛰어나다는 것으로 알려져 있어, 다양한 종류의 암에 대한 치료제개발 연구에 사용되고 있다 (표 1). 특히, 1990년대에 BCG는 방광암에 대한 종양면역치료제로 적합하다는 FDA 승인을 받고 현재까지 사용하고 있으며 BCG를 치료제로 사용할 경우 재발률을 40% 이상 감소시키는 것으로 보고되었다. 하지만 BCG 치료제는 초기의 방광암 치료에만 효과적이며, 상당한 수준의 부작용이 보고되었다. 뿐만 아니라, 치료를 받은 방광암환자의 90%가 방광염 증상을 보였고, 4%의 환자에게서 고열이 관찰되었으며 드물게 감염으로 인한 육아종이 유도되기도 하였다. 폐암이나 간암에 대한 치료제로 사용할 경우에는 40℃의 고열 및 간의 기능장애와 같은 심각한 부작용발생이 보고되기도 하였다.
이에, 암의 치료를 위한 새로운 면역 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 항암면역요법에 기반한 마이코박테리움 파라고르도네(M. paragordonae) 및 그 용도를 제공하는 것이다.
다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae), 그의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae), 그의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 함유하는 암의 면역 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae), 그의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 조절을 위한 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 항암면역요법에 기반한 마이코박테리움 파라고르도네(M. paragordonae) 및 그 용도를 제공한다.
다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae), 그의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae), 그의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 함유하는 암의 면역 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "치료 (treat)"는 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 암이 치유되는 것을 의미할 수 있다. 상기 치료는 암의 예방, 개선 및/또는 완화를 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료는 암과 관련된 질환의 치료를 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량" 또는 "유효성분"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "투여하는," "도포하는", "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항암"이라는 용어는 암의 예방, 치료, 증상의 경감 및 완화 등을 모두 포괄하는 의미이며, 상기 " 암" 이란 용어는 비 제한적으로 고형암과 혈액암을 포함한다. 본 명세서는 다양한 유형의 암, 예를 들어 비 제한적으로 머리, 목, 눈, 입, 목구멍, 식도, 가슴, 뼈, 폐, 결장, 직장, 위, 전립선, 유방, 난소, 신장, 간, 췌장 및 뇌 암의 치료를 포함한다. "암" 이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 1차 및 전이성 암을 추가로 포함할 수 있다. 상기 암의 예시는 폐암, 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 난소암, 흑색종, 두경부암, 피부암, 전립선암, 결장직장암, 췌장암, 간세포암, 또는 자궁경부암을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "용해물"은 상기 마이코박테리움 파라고르도네 내에 포함된 세포 내 생물학적 구성성분, 예를 들어, 세포벽 또는 막, 또는 박테리아 DNA 등의 구성성분, 및 상기 마이코박테리움 파라고르도네가 배양 중 세포 외에 방출한 대사산물이 함유된 배양물과 같은 유용성분의 파쇄물을 포함하는 것을 의미할 수 있다. 상기 용해물은 멸균(예를 들면, 습열을 이용한 멸균), 조사(irradiation), 압력 또는 초음파 파쇄에 의해 제조될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae)는 생균(살아있는 균)이거나 사균(죽어있는 균)일 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 사균은 열처리에 의한 사균일 수 있다. 상기 열처리된 마이코박테리움은 비-병원성 또는 비-활성화된 마이코박테리움 파라고르도네일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 마이코박테리움 파라고르도네는 기탁번호 KCTC 12628BP(한국생명공학연구원)의 마이코박테리움 파라고르도네 균주인 것일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae), 그의 용해물 또는 배양액은 항암제와 병용 투여되는 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "병용 투여"는 "함께" 또는 "동시에" 같은 날에 투여되거나, "순차적으로" 또는 "별도로"는 서로 다른 날에 투여되는 것을 의미할 수 있다. "동시" 투여는, 본원에 정의된 바에 따라, 약 2시간 이내에 또는 약 1시간 미만의 기간 내에, 투여 또는 수행하는 것을 포함한다. "별도" 투여는, 본원에 정의된 바에 따라, 약 12시간 이상, 약 8시간 이상, 약 6시간 이상, 약 4시간 이상 또는 약 2 시간 이상의 간격을 두고 투여 또는 수행하는 것을 포함한다. "순차적인" 투여는, 본원에 정의된 바에 따라, 마이코박테리움 파라고르도네와 항암제를 각각 복수의 분액 및/또는 용량으로 및/또는 별도의 시기로 투여하는 것을 포함한다. 상기 항암제의 예는 백금계 알킬화 항암제를 포함할 수 있다. 상세하게는, 상기 백금계 알킬화 항암제는 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin), 오르마플라틴, 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 독소루비신, 제니플라틴, 엔로플라틴, 로바플라틴, 스피로플라틴, 테트라플라틴, 오르미플라틴 및 이프로플라틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
특정 이론에 제한됨이 없이, 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네는 세포 사멸을 억제하는 인자(예를 들면, Bcl-2)의 발현 또는 활성을 억제하거나, 세포 독성 인자(예를 들면, 퍼포린 및 그랜자임)의 발현 또는 활성을 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 특정 이론에 제한됨이 없이, 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네는 면역 세포의 종양 조직 내 침투를 유도하는 것일 수 있다. 더욱 상세하게는 마이코박테리움 파라고르도네는 면역 사이토카인을 조절하는 것일 수 있다. 예를 들면, 마이코박테리움 파라고르도네는 IL(interleukin)-10의 발현 또는 활성을 억제하거나, TNF-α, IFN-γ, IL-2, 또는 IL-12의 발현 또는 활성을 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 특정 이론에 제한됨이 없이, 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네는 자연살해세포 또는 T 세포 매개 암 세포 독성을 갖는 것이거나, 자연살세포 (Natural Killer cell), 대식세포 또는 수지상 세포의 암 세포 독성을 증가시키거나, 체액 면역반응을 유도하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 마이코박테리움 파라고르도네는 상기한 효과를 가짐으로써, 암 세포 자체에 대한 세포 독성뿐만 아니라, 면역 반응을 유도함으로써, 암의 면역 치료용 약학적 조성물, 또는 백신 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물 또는 백신 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품, 의약외품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염 등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 아주번트, 특히 T-세포 매개반응을 촉진 또는 증가시킬 수 있는 임의의 물질 또는 화합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서 아주번트는 화학적 또는 열에 의해 사멸된 균이 조성물에 포함되는 경우에 사용될 수 있다. 아주번트는 당업계에 공지되어있으며, 예를 들면 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 포타슘 설페이트, 가교 폴리아크릴산 중합체, DDA (dimethyldioctadecyl-ammonium bromide), 면역 조절물질, 락토페린, 또는 IFN-gamma 유도제 등이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 가교 폴리아크릴산 중합체는 Carbopol® 단일중합체 또는 공중합체를 포함하고, 상기 림포카인은 IFN-gamma, IL-1, IL-2 또는 IL-12를 포함하며, 상기 IFN-gamma 유도제는 poly I:C를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 합성된 당 폴리머인 상기 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 또는 알루미늄 포타슘 설페이트는 약 0.05 내지 0.1 중량 %로 포함되고, 상기 가교 폴리아크릴산 중합체는 0.25 중량%로 포함될 수 있다.
상기 마이코박테리움 파라고르도네의 투여양은 환자의 면역계가 암 또는 종양에 대해 효과적인 면역 반응을 탑재할 수 있도록, 환자에서 방어적인 면역 반응을 유발하는데 충분한 양일 수 있다. 본 명세서의 특정 구현예에서, 상기 마이코박테리움 파라고르도네는 103 내지 1011개, 104 내지 1010개, 106 내지 1010개, 또는 106 내지 109개일 수 있다. 다른 예로, 용량은 현탁제 또는 건조 조제물로서 제공되는 마이코박테리움 파라고르도네 0.01 mg 내지 10 mg 또는 0.1 mg 내지 1 mg일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 용량은 1 X 103 내지 1 X 1011 cfu/ml, 1 X 104 내지 1 X 1010 cfu/ml, 1 X 106 내지 1 X 1010 cfu/ml, 또는 1 X 106 내지 1 X 109 cfu/ml 일 수 있다.
또 다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae), 그의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 조절을 위한 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품은 면역 조절(예를 들면, 면역 증강)을 통한 암의 예방 도는 개선을 위한 것일 수 있다.
상기 건강식품 조성물은 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae), 그의 용해물 또는 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
일 양상에 따른 마이코박테리움 파라고르도네는 암 세포에 대한 세포독성뿐만 아니라, 자연살해세포 또는 T 세포 매개 암 세포 독성을 갖고, 대식세포 또는 수지상 세포의 암 세포 독성조절 T 세포의 활성화를 억제함으로써 면역 반응을 유도하여 종양 형성을 억제하여 면역 항암제에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 동물 모델에의 투여 계획을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 1b는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 암 발생 빈도를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 1c는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 1d는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 생존률을 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 1e는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 도면이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 동물 모델에의 투여 계획을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2b는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2c는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 생존률을 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2d는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 도면이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2e는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 Day 24에서의 종양 무게를 나타낸 도면이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 세포의 사멸을 TUNEL 분석법으로 확인한 결과(왼쪽 패널)이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 세포의 사멸을 TUNEL 분석법으로 확인한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 Bcl-2의 발현 억제를 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 퍼포린의 발현 증가를 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 퍼포린 및 그랜자임의 발현을 IHC 분석법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 세포의 사멸을 H&E 염색으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 IL-10, 및 FoxP3의 발현을 정량적 실시간 PCR로 확인한 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양조직 내 CD8 T 세포의 수를 IHC분석법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 종양 내 TNF-α를 발현하는 CD4, CD8 T세포, 자연살해세포의 비율을 유세포분석방법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 세포 매개 독성을 확인한 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4f는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 NK 세포 독성을 확인한 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4g는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 NK 세포 독성을 유세포 분석으로 확인한 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 비장세포로부터의 다양한 염증성 사이토카인 생산을 나타낸 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네를 비장세포에 자극한 후, MC38 종양세포 항원으로 재자극하여 분비되는 염증성 사이토카인의 생산을 나타낸 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 비장세포 내 자연살해세포로부터의 염증성 사이토카인 생산을 나타낸 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)에서의 IL-12 및 IL-10의 분비량을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 혈청 내 IgG1, IgG2a, 및 전체 IgG의 비율을 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5f는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 비장세포 내 TNF-α를 발현하는 CD8 T세포, 자연살해세포의 비율을 유세포분석방법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 MC38 대장암세포에 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 수지상 세포(DC.24)의 MC38 대장암세포에 대한 세포독성을 세포 독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 A549 폐암세포주 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 HepG2 간암세포주 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 Mbt-2 방광암세포주 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6f는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 마우스 비장세포의 세포배양액이 마우스유래 MC38 대장암세포주 대한 세포독성을 보인다는 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 7a는 병용 투여 효과를 확인하기 위해 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 동물 모델에의 투여 계획을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 7b는 병용 투여 효과를 확인하기 위해 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; Cis+Mpg: 시스플라틴 + 마이코박테리움 파라고르도네; Cisplatin: 시스플라틴; PBS: 음성 대조군.
도 7c는 병용 투여 효과를 확인하기 위해 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 생존률을 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; Cis+Mpg: 시스플라틴 + 마이코박테리움 파라고르도네; Cisplatin: 시스플라틴; PBS: 음성 대조군.
도 1b는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 암 발생 빈도를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 1c는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 1d는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 생존률을 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 1e는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 도면이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 동물 모델에의 투여 계획을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2b는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2c는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 생존률을 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2d는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 도면이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2e는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 Day 24에서의 종양 무게를 나타낸 도면이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 세포의 사멸을 TUNEL 분석법으로 확인한 결과(왼쪽 패널)이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 세포의 사멸을 TUNEL 분석법으로 확인한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 Bcl-2의 발현 억제를 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 퍼포린의 발현 증가를 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 퍼포린 및 그랜자임의 발현을 IHC 분석법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 세포의 사멸을 H&E 염색으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 IL-10, 및 FoxP3의 발현을 정량적 실시간 PCR로 확인한 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양조직 내 CD8 T 세포의 수를 IHC분석법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 종양 내 TNF-α를 발현하는 CD4, CD8 T세포, 자연살해세포의 비율을 유세포분석방법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 세포 매개 독성을 확인한 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4f는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 NK 세포 독성을 확인한 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4g는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 NK 세포 독성을 유세포 분석으로 확인한 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 비장세포로부터의 다양한 염증성 사이토카인 생산을 나타낸 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네를 비장세포에 자극한 후, MC38 종양세포 항원으로 재자극하여 분비되는 염증성 사이토카인의 생산을 나타낸 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 비장세포 내 자연살해세포로부터의 염증성 사이토카인 생산을 나타낸 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)에서의 IL-12 및 IL-10의 분비량을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 혈청 내 IgG1, IgG2a, 및 전체 IgG의 비율을 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5f는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 비장세포 내 TNF-α를 발현하는 CD8 T세포, 자연살해세포의 비율을 유세포분석방법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 MC38 대장암세포에 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 수지상 세포(DC.24)의 MC38 대장암세포에 대한 세포독성을 세포 독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 A549 폐암세포주 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 HepG2 간암세포주 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 Mbt-2 방광암세포주 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6f는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 마우스 비장세포의 세포배양액이 마우스유래 MC38 대장암세포주 대한 세포독성을 보인다는 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 7a는 병용 투여 효과를 확인하기 위해 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 동물 모델에의 투여 계획을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 7b는 병용 투여 효과를 확인하기 위해 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; Cis+Mpg: 시스플라틴 + 마이코박테리움 파라고르도네; Cisplatin: 시스플라틴; PBS: 음성 대조군.
도 7c는 병용 투여 효과를 확인하기 위해 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 생존률을 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; Cis+Mpg: 시스플라틴 + 마이코박테리움 파라고르도네; Cisplatin: 시스플라틴; PBS: 음성 대조군.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1. 세포주의 배양
마우스 유래 대장암세포주 MC38과 인체유래 유방암세포주 MCF-7는 DMEM(Hyclon) 배지를 사용하여 배양하였고, 마우스 유래 마크로 파지 세포주인 J774.1A (American Type Culture Collection, Manassa, VA, USA)와 마우스 유래 수지상세포주 (DC2.4), 인체유래 간암세포주 Huh7, 폐암세포주 A549, 방광암세포주 Mbt-2는 RPMI1640 (Hyclon) 배지를 사용하여 배양하였다. 상기 두 배지에 10% 우태아혈청 (Invitrogen, USA), 2 mmol/ml L-글루타민, 100 ug/ml 페니실린 및 100 units/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
참고예 2. 종양 동물 모델의 제조 및 종양 크기 분석
7주령 된 C57BL/6 암컷 마우스의 오른쪽 뒷다리 피하조직에 대장암 MC38 세포주 1X106/100 μl)을 주사하여 종양형성을 유도하였다. 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네는 1 X 108 /100 μl를 림프절 근처 피하에 3일 간격으로 3회 주사하였다. 항암효과를 비교하기 위하여 현재 면역요법에 사용되고 있는 마이코박테리움 보비스 BCG를 양성 대조군으로, PBS를 음성대조군으로 사용하였다. 또한, 병용 투여 효과도 확인하기 위해 시스플라틴(50 μg/kg)을 복강 내 투여하였다. 형성된 종양의 크기는 일주일에 2회 측정하였고, wide2 X length X 0.52의 공식에 따라 계산되었다. 실험 종료 후 마우스에서 종양을 분리해 일부는 4% 포르말린용액에 고정시키고, 5-10μm 두께로 잘라 파라핀에 보관하였다.
참고예 3. TUNEL 어세이
종양 세포의 사멸 세포 사멸을 분석하기 위해 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 분석법으로 DNA 단편을 검출 하였다. 절편화 된 종양 조직을 자일렌에서 탈파라핀화 하고, 죽은 세포를 ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore)로 제조사의 지시에 따라 염색하였다. 염색된 세포 사멸 세포를 공초점-A1 현미경 (NIKON, 136 Japan) 하에서 평가하고, 형광을 이미징 소프트웨어 (NIS Elements Viewer 137 프로그램)을 사용하여 분석하였다.
참고예 4. 조직학적 분석
제거된 종양을 10 % 중성 완충 포르말린에 고정시키고 파라핀에 보관하였다. 파라핀에 침지된 블록을 5μm 절편으로 자르고, 각 절편을 H&E로 염색하였고, CD8 (1:100, ebioscience), Granzyme B, 및 Perforin (1 : 100, Santa cruz)에 대한 IHC 분석을 수행하였다. 슬라이드를 Aperio Scanscope (Leica Microsystems)로 디지털 촬영하고 염색된 항원에 대해 HistoQuest 소프트웨어 (버전 6.0.1.116, TissueGnostics, Austria)를 사용하여 정량화하였다.
참고예 5. 실시간 PCR을 통한 mRNA 발현 분석
종양 환경에서의 유전자 발현을 분석하기 위해 정량적 실시간 PCR을 수행 하였다. Trizol 시약법으로 종양 조직에서 총 mRNA를 추출하고 PCR 기계를 사용하여 정량화 하였다. 프라이머는 하기 표 1에 기재된 프라이머를 사용하였다.
| 타겟 유전자 | 서열번호 | 프라이머 서열 |
| mBcl2 | 서열번호 1 | F: 5'- ACT TCG CAG AGA TGT CCA GTC A -3' |
| 서열번호 2 | R: 5'- TGG CAA AGC GTC CCC CTC -3' | |
| mFoxp3 | 서열번호 3 | F: 5'- GGC CCT TCT CCA GGA CAG A -3' |
| 서열번호 4 | R: 5'- GCT GAT CAT GGC TGG GTT GT -3' | |
| mIL-10 | 서열번호 5 | F: 5'- CCC TTT GCT ATG GTG TCC TT -3' |
| 서열번호 6 | R: 5'- TGG TTT CTC TTC CCA AGA CC -3' | |
| mPerforin1 | 서열번호 7 | F: 5'- CTG GCT CCC ACT CCA AGG TA -3' |
| 서열번호 8 | R: 5'- GGC TGT AAG HAC CGA GAT GC -3' | |
| m β-actin | 서열번호 9 | F: 5'- ATG CCA CAG GAT TCC ATA CC -3' |
| 서열번호 10 | R: 5'- GAC GGC CAG GTC ATC ACT AT -3' |
참고예 6. 세포 독성 분석
Ex vivo 분석을 위해, 종양을 갖는 마우스의 비장 세포를 MC38 세포 용해물 (100 ㎍ / ml) 및 IL-2 (50 ng / ㎖)로 5 일 동안 자극하였다. 이후에, effector 세포를 10:1 및 20:1의 Effector:Target(ET) 비율로 MC38 세포와 4 시간 동안 공배양하였다. 또한 종양 세포에 대한 면역 세포의 세포 독성 능력을 시험을 수행하였다. In vitro 분석을 위해, 24 시간 및 48 시간 동안 열 살균된 마이코박테리움 파라고르도네의 1 MOI 및 10 MOI로 자극된 마우스 안정 대식세포 (J774A.1) 및 수지상 세포 (DC2.4)를 effector 세포로 사용하였다. 뿐만 아니라, 다양한 암세포주에 대한 세포독성능력을 보이는지 확인하기 위하여 대식세포를 열 살균된 마이코박테리움 파라고르도네의 1 MOI, 5 MOI 및 10 MOI로 24시간 자극시킨 후, 인체유래 폐암세포주 (A549), 간암세포주 (HepG2), 그리고 마우스유래 방광암세포주 (Mbt-2)와 4시간 공배양하였다. 이후 LDH(Lactate dehydrogenase)는 배양상등액에 대해 CytoTox96 Non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega, USA)를 사용하여 측정하였다.
참고예 7. 자연살해세포 (NK cells) 활성 분석
YAC-1 세포를 사용하여 비장 NK 세포 활성을 평가하였다. 구체적으로, YAC-1 세포를 CFSE (Thermo)로 표지하고, effector 세포와 함께 ET 비율 20 : 1에서 4 시간 동안 공배양하였다. 배양 상등액을 LDH의 측정에 사용하고, 세포를 FACS로 분석하여 CFSE 강도를 조사 하였다.
참고예 8. 사이토카인 및 체액면역 항체 분석
effector 세포로부터 생성된 사이토카인을 평가하기 위해 배양 상등액을 사용하여 제조자의 지시에 따라 ELISA 키트(ebioscience)를 사용하여 TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-10 및 IL-12를 측정 하였다. 또한 실험군의 마우스 혈청 내에서 IgG1, IgG2a, 전체 IgG (ebioscinece)를 측정함으로서 체액면역을 비교하였다. 사이토카인과 항체의 농도는 Tecan Microplate Reader (Infinite® M1000 PRO, 스위스)를 사용하여 흡광도를 측정하여 분석하였다.
참고예 9. 유세포분석
마우스의 비장세포 또는 종양 조직 내 면역세포를 유세포분석기를 통해 평가하였다. 구체적으로, 분리된 종양세포와 비장세포는 모두 CD3-BC421 (1:100, BD Pharmingen), CD4-PE-Cy5 (1:100, BD Pharmingen), CD8-APC-Cy7 (1:100, ebioscience), NK1.1-PE (1:100, BD Pharmingen)으로 염색한 후, 세포를 고정하고, 세포 내로 항체를 침투시키기 위해 Fixation/Permeabilization kit (ebioscience) 제조사의 지시에 따라 진행하였다. 고정된 세포 내 TNF-α는 항체 -TNF-α-FITC (1:100, BD Pharmingen)로 염색하였다. 위와 같이 준비한 세포는 BD LSRFortessa™ X-20 유세포분석기를 사용하여 평가하였다.
참고예 10. 통계 분석
통계적 유의성을 비교하기 위해 Student 's t-test를 수행 하였다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었고 graph pad software(Prism 5, version 5.01)를 사용하여 분석하였다. 통계적 유의성은 다음과 같은 별표로 표시하였다: * p=0.05; ** p≤=0.01; *** p≤=0.001.
실시예 1. 열처리 비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 제조
마이코박테리움 파라고르도네(KCTC 12628BP)의 열처리 비활성화(사균)는 아래와 같이 제조하였고, 대조군으로서, 마이코박테리움 보비스 BCG를 제조하였다.
먼저, 마이코박테리움 파라고르도네를 10% 알부민 덱스트로즈 카탈라아제(ADC), 2.4 % 글리세롤 및 0.2% Tween 80를 포함하는 7H9 액체배지에 접종하였다. 이후에, 마이코박테리움 파라고르도네는 30℃에서, 및 마이코박테리움 보비스 BCG는 37℃에서 정상기까지 배양하였다. 정상기의 균주는 흡광도 측정을 용이하게 하기 위하여 1% Tween 80 용액으로 재부유하였고, 알갱이가 생기지 않도록 인슐린 주사기에 통과시켰다. 그 후, 이미 확인한 특정 흡광도에 따른 CFU (Colony-Forming Unit)를 참고하여 균주를 1 Х 108 CFU (OD600 1.0 = 1 X 108 CFU/ml)로 맞추었고, 고압증기멸균기를 통해 121℃에서 1.5기압으로 15분간 멸균시켰다. 고압증기멸균으로 인한 용액의 손실은 용액 내 균주의 농도에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 13,000rpm으로 5분간 원심분리하여 마이코박테리움의 펠렛을 얻고 인산완충용액 (Phosphate-based saline, PBS)으로 재부유하여 오차범위를 줄였다. 이렇게 준비한 열처리비활성된 마이코박테리움 파라고르도네 및 마이코박테리움 보비스 BCG를 이후의 실험에서 사용하였다.
실시예 2. 종양형성 이전에 주사한 마이코박테리움 파라고르도네의 암 발생 지연 효과
종양형성 이전에 마이코박테리움 파라고르도네의 암 발생 지연 효과를 확인하기 위해 도 1a에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 참고예 2에 기재된 바와 같이 MC38 세포주를 마우스에 피하 주사하고 종양이 형성되기 이전인 세포주 주사 3일 후에, 상기 실시예 1에서 제조한 열처리 비활성화 마이코박테리움 파라고르도네를 림프절 근처 피하에 1 X 108 /100 μl의 농도로 주사하였고, 일주일 간격으로 2회 추가적으로 주사하여 항암효과를 관찰하였다. 또한, 참조예 2에 기재된 바와 같이 마이코박테리움 파라고르도네와 동일한 농도의 마이코박테리움 보비스 BCG를 양성 대조군으로, 열처리비활성화 마이코박테리움을 부유시킨 용액 PBS를 음성대조군으로 사용하였고, 상기 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 동물 모델에의 투여 계획을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 1b는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 암 발생 빈도를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 1c는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 1d는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 생존률을 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 1e는 종양 형성 이전에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 도면이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 1에 나타낸 바와 같이, 종양 형성 이전에 주사한 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네는 종양발생을 30~50% 감소시켰다. 하지만 현재 항암면역요법에 적용되고 있는 마이코박테리움 보비스 BCG를 투여하였을 때에는 모든 마우스에서 종양이 발생하였다. 또한 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네는 종양 형성뿐만 아니라 암 발생 역시 지연시켰고 그로 인하여 마우스의 생존률을 70% 이상 증가시켰다. 이러한 마이코박테리움 파라고르도네에 의한 항암효과는 마이코박테리움 보비스 BCG와 비교하였을 때 통계학적으로 유의한 결과임을 확인하였다. 또한, 실험 종료 후 마우스에서 적출한 암의 크기를 육안으로 관찰하였을 때, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 투여로 인하여 현저히 작은 크기의 종양이 확인되었다.
이러한 결과는 마이코박테리움 파라고르도네가 외과수술 후 치료제로 사용되고 있는 마이코박테리움 보비스 BCG를 대체할 수 있는 효과적인 치료제임을 의미한다. 뿐만 아니라 종양 절제 후, 잠재적으로 종양세포가 될 수 있는 주변 조직에 마이코박테리움 파라고르도네를 주사할 경우 종양의 재발을 감소시킬 가능성이 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 종양형성 후 주사한 마이코박테리움 파라고르도네의 항암효과
종양형성 이후에 마이코박테리움 파라고르도네의 항암 효과를 확인하기 위해 도 2a에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 참고예 2에 기재된 바와 같이 MC38 세포주를 마우스에 피하 주사하고 일주일 후 모든 마우스에서 종양이 형성된 것을 확인한 후, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 마이코박테리움 파라고르도네의 항암 효과를 확인하였다. 상기 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 동물 모델에의 투여 계획을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2b는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2c는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 생존률을 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2d는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 도면이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2e는 종양 형성 이후에 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 Day 24에서의 종양 무게를 나타낸 도면이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 2에 나타낸 바와 같이, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네는 종양의 성장 속도를 지연시켰고 그로 인하여 마우스의 생존률을 70% 이상 증가시켰으며 이 같은 항암효과는 양성대조군인 마이코박테리움 보비스 BCG 보다 통계학적으로 유의한 결과임을 알 수 있었다. 또한, 실험 종료 후 마우스에서 적출한 암의 크기는 음성 또는 양성대조군과 비교하였을 때, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 주사로 인하여 작아진 것을 육안으로 관찰 가능하였다. 뿐만 아니라, 음성 혹은 양성대조군을 이용한 치료보다 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 치료를 통하여 종양의 무게가 유의하게 줄어든 것을 확인하였다.
이러한 결과는 이미 진행 중인 암 질환에 대해서도 마이코박테리움 파라고르도네가 효과적인 치료제로 사용 가능할 뿐만 아니라, 기존에 방광암 초기에만 사용가능했던 마이코박테리움 보비스 BCG를 대체할 수 있는 치료제임을 의미한다.
실시예 4. 마이코박테리움 파라고르도네의 항암 백신 활성 분석
마이코박테리움 파라고르도네에 의해 종양세포의 세포사멸이 유도되는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 참고예 3에 기재된 바와 같이 TUNEL 어세이를 수행하였고, 그 결과를 도 3a 및 3b에 나타내었다. 또한, 상기 참고예 4에 기재된 바와 같이, Bcl-2 및 Perforin의 발현을 분석하였고, 그 결과를 각각 도 3c 및 3d에 나타내었다. 또한, 상기 참고예 4에 기재된 바와 같이, perforin 및 granzyme에 대한 IHC 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 3e에 나타내었다.
도 3a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 세포의 사멸을 TUNEL 분석법으로 확인한 결과(왼쪽 패널)이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 세포의 사멸을 TUNEL 분석법으로 확인한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 Bcl-2의 발현 억제를 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 퍼포린의 발현 증가를 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 퍼포린 및 그랜자임의 발현을 IHC 분석법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 3에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군인 열처리비활성화 마이코박테리움 보비스 BCG 에 비해 마이코박테리움 파라고르도네를 통한 치료에서 높은 수준의 종양세포의 세포 사멸을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 형광 이미지를 수치화시켜 비교하였을 때, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네에 의해 현저하게 높은 세포 사멸이 통계학적으로 유의함을 확인할 수 있었다. 세포 사멸을 방해하는 유전자 Bcl-2과 세포 독성 단백질인 퍼포린 및 그랜자임의 발현 정도를 비교 분석한 결과, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 의해 각각 감소(Bcl-2)하거나, 및 증가(퍼포린 및 그랜자임)하는 것을 알 수 있었다.
종양세포의 세포사멸은 암세포의 성장을 저해시키기 때문에 암 질환의 진행을 막고, 다른 장기로의 전이를 최소화시킬 수 있다. 이러한 세포 사멸은 암 치료에 있어 중요함에도 불구하고, 상용화되고 있는 마이코박테리움 보비스 치료에서는 관찰되지 않은 반면, 마이코박테리움 파라고르도네를 통한 치료에서는 종양세포의 세포사멸을 현저하게 유도하는 활성이 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 마이코박테리움 파라고르도네는 암 진행 및 전이를 막고 질병의 예후를 호전시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 5. 마이코박테리움 파라고르도네의 종양 환경에서의 증가된 염증 유도 활성 분석
마이코박테리움 파라고르도네의 종양 환경에서의 증가된 염증 활성을 분석하였다.
구체적으로, 상기 참고예 4에 기재된 바와 같이 H&E 염색을 수행하였고, 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 또한, 상기 참고예 5에 기재된 바와 같이 IL-10 및 FoxP3의 발현을 분석하였고, 그 결과를 도 4b에 나타내었다. 또한, 상기 참고예 4에 기재된 바와 같이, CD8 T 세포에 대한 IHC 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 4c에 나타내었다. 뿐만 아니라, 세포독성을 야기하는 TNF-α를 분비하는 CD4, CD8 T 세포와 자연살해세포를 도 4d에 나타내었다.
도 4a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 세포의 사멸을 H&E 염색으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 IL-10, 및 FoxP3의 발현을 정량적 실시간 PCR로 확인한 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 CD8 T 세포의 비율을 IHC분석법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 TNF-α를 분비하는 CD8 T 세포의 비율을 유세포분석법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 종양 내 TNF-α를 발현하는 CD4, CD8 T세포, 자연살해세포의 비율을 유세포분석방법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군 PBS와 양성대조군 열처리비활성화 마이코박테리움 보비스 BCG를 주사한 마우스의 종양 조직 내 세포는 핵이 크고 느슨하며 여러 개의 핵을 가진 종양세포의 특성으로 확인되었다. 이에 반해, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네를 투여한 마우스에서는 세포의 크기가 비교적 작고, 핵이 응축된 형태를 지닌 정상세포들의 구획이 뚜렷하게 나누어져 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 마이코박테리움 파라고르도네 치료에 의해 면역세포가 종양조직으로 이동해 온 것을 의미한다.
또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 면역억제반응에 관여하는 사이토카인 IL-10과 면역조절세포의 조절 T 세포의 마커 FoxP3를 합성하는 유전자의 전사발현을 확인한 결과, 면역세포의 종양조직 내 침투로 인해 종양세포가 유도하는 면역 억제 반응이 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네에 의해 개선되는 것을 확인하였다.
또한, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 투여는 종양을 제거하기 위한 세포독성 T 세포 (CD8 T 세포)의 비율이 증가되었음을 IHC 분석을 통하여 확인하였다. 이는 단순히 세포독성 T 세포의 비율만이 증가한 것이 아니라, 세포독성을 야기하는 TNF-α를 발현하는 CD4, CD8 T세포, 자연살해세포의 비율 모두가 증가함을 도 4d에 나타낸 바와 같이 유세포분석방법으로 확인하였다.
이러한 결과는, 양성대조군인 마이코박테리움 보비스 BCG는 면역저하와 관련된 두 유전자의 발현을 억제시키는데 반해, 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네가 상용화되어있는 마이코박테리움 보비스 BCG보다 더욱 효과적으로 암 주변 미세 환경의 면역 저하를 억제하여 종양을 제거하는 면역세포가 증가하는 것을 의미한다.
실시예 6. 마이코박테리움 파라고르도네의 자연살해 세포 또는 T 세포 매개 세포독성 활성 분석
암 세포를 제거할 수 있는 세포 독성 반응은 주로 자연살해 세포 및 세포독성 T 림프구(CTL)에 의해 매개된다. 이에, 상기 실시예 5에 이어서, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 자극이 T 세포 또는 NK 세포 매개에 의한 증가된 종양세포 사멸을 유도하는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 참고예 6에 기재된 바와 같이 세포 매개 세포 독성을 분석하였고, 그 결과를 도 4e에 나타내었다. 또한, 상기 참고예 7에 기재된 바와 같이 자연살해세포 활성을 분석하였고, 그 결과를 도 4f 및 도 4g에 나타내었다.
도 4e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 세포 매개 독성을 확인한 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4f는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 NK 세포 독성을 확인한 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4g는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 NK 세포 독성을 유세포 분석으로 확인한 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 4e에 나타낸 바와 같이, 마이코박테리움 보비스 BCG는 대조군에 비해 증가된 CTL 반응을 일으키지만, 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여는 마이코박테리움 보비스 BCG에 비해 현저하게 증가된 CTL 반응을 유도함을 알 수 있었다. 이러한 결과는 마이코박테리움 파라고르도네가 마이코박테리움 보비스에 비해 증가된 항원 특이적 CTL 유도능을 가짐을 의미한다.
또한, 도 4f에 나타낸 바와 같이, 마이코박테리움 파라고르도네에 의한 NK 세포 매개 종양 세포 사멸을 분석한 결과, 음성 대조군 또는 양성 대조군 대비 현저하게 증가된 YAC-1 세포에 대한 NK 세포 매개 세포 독성을 가짐을 알 수 있었다.
또한, 도 4g에 나타낸 바와 같이, CFSE 표지된 YAC-1 세포에 대한 유세포 분석에서, 마이코박테리움 파라고르도네의 투여는 약 20%의 세포독성을 가지며, 이는 다른 음성 또는 양성 대조군에 비해 2배 이상 증가된 수치임을 알 수 있었다.
이러한 결과는 마이코박테리움 파라고르도네가 마이코박테리움 보비스보다 현저하게 증가된 CTL 또는 NK 세포 매개 새포 독성 활성을 가져, 암 치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
실시예 7. 마이코박테리움 파라고르도네를 자극한 비장세포 및 자연살해세포와 항원제시세포인 대식세포 또는 수지상세포에서 분비하는 염증성 사이토카인 분석
항원 제시 세포인 대식 세포와 수지상 세포와 다양한 면역세포를 포함하는 비장세포 및 자연살해세포는 외부 자극에 의하여 활성화되어 TNF-α, IFN-γ, IL-2 및 IL-12와 같은 사이토카인을 분비하여 적응면역을 유도하고, 과도한 면역반응을 제한하기 위하여 IL-10과 같은 사이토카인을 분비하여 반응을 조절한다. 이에, 상기 참조예 5 및 6을 참조하여 TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-10 및 IL-12의 발현 및 세포독성 활성을 분석하였고, 마우스 비장세포 및 종양 내 면역세포의 비율을 도 5에 나타내었다.
도 5a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 비장세포로부터의 다양한 염증성 사이토카인 생산을 나타낸 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네를 비장세포에 자극한 후, MC38 종양세포 항원으로 재자극하여 분비되는 염증성 사이토카인의 생산을 나타낸 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 비장세포 내 자연살해세포로부터의 염증성 사이토카인 생산을 나타낸 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)와 수지상 세포(DC.24)에서의 IL-12 및 IL-10의 분비량을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 혈청 내 IgG1, IgG2a, 그리고 전체 IgG의 비율을 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5f는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 따른 비장세포 내 TNF-α를 발현하는 CD8 T세포, 자연살해세포의 비율을 유세포분석방법으로 확인한 도면이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 5a 내지 5c에 나타낸 바와 같이, 면역을 유도하는 사이토카인 TNF-α, IFN-γ, IL-2 및 IL-12는 음성 또는 양성대조군과 비교하였을 때, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네를 자극한 비장세포에서 높게 분비되는 것을 확인할 수 있었다. 그 중 TNF-α, IFN-γ는 비장세포 내 자연살해세포에서도 높게 분비됨을 관찰하였다.
또한 도 5d에 나타낸 바와 같이, 면역을 유도하는 사이토카인 IL-12는 음성 또는 양성대조군과 비교하였을 때, 적은 MOI의 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네 자극에 의해서도 높게 분비되는 것을 대식세포와 수지상세포에서 모두 관찰할 수 있었다. 이에 반해, 면역반응을 억제하는 사이토카인 IL-10의 경우, 대식세포와 수지상세포에서 모두 양성대조군 보다 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 의해 감소되는 것을 알 수 있었다. 이는 기존에 항암면역요법에 사용되고 있는 마이코박테리움 보비스 BCG 보다 마이코박테리움 파라고르도네에 의해 면역유도가 더욱 효과적으로 일어나며, 유도된 면역반응에 의한 항암효과가 증가되는 것을 의미한다. 또한, 마우스 대식세포와 수지상세포는 모두 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 자극에 의해 종양 세포 독성이 증가되었고, 이러한 효과는 기존에 상용화된 마이코박테리움 보비스 BCG보다 효과적임을 확인하였다. 뿐만 아니라, 도 5e에 나타낸 바와 같이, 마우스의 혈청 내 IgG1, IgG2a, 전체 IgG을 측정하여 체액면역반응을 비교한 결과, 기존에 상용화된 마이코박테리움 보비스 BCG의 경우 증가된 면역반응을 낮추기 위한 IgG1이 현저히 높아진 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네를 자극시킨 마우스의 혈청 내에서 IFN-γ를 증가시켜 Th1 반응을 유도하는 IgG2a의 양이 양성대조군과 음성대조군에 비하여 현저히 증가된 것을 확인하였다.
이를 통해 마이코박테리움 파라고르도네의 자극이 면역반응을 향상시키는 사이토카인 분비 및 체액면역을 유도할 뿐만 아니라, 종양세포를 공격하고 퇴치할 수 있도록 면역세포를 활성화시켜 항암효과를 극대화 시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 8. 다양한 암 세포주에 대한 마이코박테리움 파라고르도네의 세포 독성 활성 분석
상기 실시예 7에 이어서, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 자극이 대식 세포 및 수지상 세포를 통한 증가된 종양세포 사멸을 유도하는지 확인하였다.
마이코박테리움 파라고르도네가 면역세포를 유도하는 것 뿐만 아니라 직접적으로 종양세포에 대한 세포독성능도 보이는지 확인하기 위하여 다양한 암 세포주에서의 세포 독성을 분석하였다.
구체적으로, 마우스 유래 대장암 세포주 MC38, 인체유래, 폐암세포주 A549, 간암세포주 HepG2, 폐암세포주 A549, 마우스유래 방광암세포주 Mbt-2를 사용하였고, 상기 실시예 1에서 제조한 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네 1, 10, 20 MOI를 24, 48시간 동안 처리한 후 참조예 6에 기재된 바와 같이 세포 독성을 수행하였다. 상기 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6a는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 MC38 대장암세포에 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6b는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 수지상 세포(DC.24)의 MC38 대장암세포에 대한 세포독성을 세포 독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6c는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 A549 폐암세포주 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6d는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 HepG2 간암세포주 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6e는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 대식세포(J774A.1)의 Mbt-2 방광암세포주 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6f는 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 처리에 따른 마우스 비장세포의 세포배양액이 마우스유래 MC38 대장암세포주 대한 세포독성을 보인다는 그래프이다; BCG: 마이코박테리움 보비스 BCG; PBS: 음성 대조군.
도 6a 내지 6e에 나타낸 바와 같이, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 자극은 마우스 실험에서 보여진 MC38 세포에 대한 세포 독성을 나타낼 뿐만 아니라, 다양한 암세포주에 대하여 세포독성을 보이는 것을 확인하였다. 이는 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네의 항암효과가 단순히 마우스 유래 대장암 세포주 MC38 뿐만 아니라 방광암세포주 Mbt-2, 인체유래 간암세포주 HepG2와 폐암세포주 A549에 대한 항암효과도 포함하는 것을 의미하며 다양한 암세포주에 적용 가능함을 시사한다. 뿐만 아니라, 도 6f에 나타낸 바와 같이, 열처리비활성화 마이코박테리움 파라고르도네를 자극한 비장세포의 배양액에서도 MC38 세포에 대한 세포독성을 보임으로서 배양액 내의 물질 역시 항암효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 9. 마이코박테리움 파라고르도네 항암제와의 병용요법
마이코박테리움 파라고르도네의 항암효과를 극대화하기 위하여 항암제와의 병용 요법을 도 7a에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 참고예 2에 기재된 바와 같이 MC38 세포주를 마우스에 피하 주사하고 종양을 형성한 후에, 상기 참고예 2에 기재된 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조한 열처리 비활성화 마이코박테리움 파라고르도네를 림프절 근처 피하에 1 X 108 /100 μl의 농도로 주사하였고, 일주일 간격으로 3회 추가적으로 주사하여 항암효과를 관찰하였다. 병용 투여 효과를 확인하기 위해 열처리 비활성화 마이코박테리움의 투여와 같이 시스플라틴(50 μg/kg)을 일주일 간격으로 3회에 복강 내 투여하였다.
이후에, 종양의 크기 및 생존율을 상기 실시예 2와 동일하게 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7a는 병용 투여 효과를 확인하기 위해 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 동물 모델에의 투여 계획을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 7b는 병용 투여 효과를 확인하기 위해 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; Cis+Mpg: 시스플라틴 + 마이코박테리움 파라고르도네; Cisplatin: 시스플라틴; PBS: 음성 대조군.
도 7c는 병용 투여 효과를 확인하기 위해 일 구체예에 따른 마이코박테리움 파라고르도네의 투여에 따른 생존률을 나타낸 그래프이다; Mpg: 마이코박테리움 파라고르도네; Cis+Mpg: 시스플라틴 + 마이코박테리움 파라고르도네; Cisplatin: 시스플라틴; PBS: 음성 대조군.
도 7에 나타낸 바와 같이, 항암제 단독 투여보다 마이코박테리움 파라고르도네의 병용투여시 항암효과가 상승적으로 증가하는 것을 알 수 있었다.
본원에서 사용한 M. paragordonae는 면역반응을 유도시키는 특성 때문에 다양한 종류의 암에 작용 가능한 장점이 있다. 이 실시예와 같이, 병용투여 시 항암효과가 극대화되는 것으로 보아 특정 암에 작용하는 특정 항암제와의 병용투여는 다양한 종류의 암에 효과적인 치료제로 사용 가능할 것으로 기대된다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> Use of Mycobacterium paragordonae for anti-cancer immunotherapy
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<223> Forward primer for mIL-10
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<223> Reverse primer for mIL-10
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tggtttctct tcccaagacc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for mPerforin1
<400> 7
ctggctccca ctccaaggta 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for mPerforin1
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ggctgtaagh accgagatgc 20
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<223> Forward primer for beta-actin
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<223> Reverse primer for mbeta-actin
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gacggccagg tcatcactat 20
Claims (15)
- 기탁번호 KCTC 12628BP의 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주, 그의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 생균 또는 사균인 것인 약학적 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 사균은 열처리에 의해 비활성화된 것인 약학적 조성물.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 암은 폐암, 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 난소암, 흑색종, 두경부암, 피부암, 전립선암, 결장직장암, 췌장암, 간세포암, 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주, 그의 용해물 또는 배양액은 항암제와 병용 투여되는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 IL(interleukin)-10의 발현 또는 활성을 억제하거나, TNF-α, IFN-γ, IL-2, 또는 IL-12의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 자연살해세포 또는 T 세포에 의해 매개되는 암 세포에 대한 독성을 갖는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 대식세포 또는 수지상 세포에 의해 매개되는 암 세포에 대한 독성을 증가시키거나, 체액 면역 반응을 유도하는 것인 약학적 조성물.
- 기탁번호 KCTC 12628BP의 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주, 그의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 함유하는 암의 면역 치료용 백신 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 균주는 생균 또는 사균인 것인 백신 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 암은 폐암, 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 난소암, 흑색종, 두경부암, 피부암, 전립선암, 결장직장암, 췌장암, 간세포암, 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 백신 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 균주, 그의 용해물 또는 배양액은 항암제와 병용 투여되는 것인 백신 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 아주번트를 추가로 포함하는 백신 조성물.
- 기탁번호 KCTC 12628BP의 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주, 그의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 함유하는, 면역 조절을 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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