KR102154918B1 - 종양세포 용해물이 봉입된 암 치료용 ｃｏ₂발생 리포좀 - Google Patents

종양세포 용해물이 봉입된 암 치료용 ｃｏ₂발생 리포좀 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양세포 용해물이 봉입된 암치료용 CO2 발생 리포좀에 관한 것으로, 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀은 근적외선을 조사하면 CO2 발생으로 종양세포 용해물이 방출되며, 방출된 종양세포 용해물에 의해 효과적으로 수지상세포가 성숙되는 것을 확인하였으며, 생체 내에서 면역기능 상승 효과 및 암세포 선택적인 항암 효과를 확인하였다. 또한, 항암제를 봉입한 CO2 발생 리포좀과 병용치료 하였을 때 시너지 효과를 확인하였으므로, 본 발명의 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀은 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로 용이하게 이용할 수 있다.

Description

종양세포 용해물이 봉입된 암 치료용 ＣＯ₂발생 리포좀{ＣＯ₂Bubble Generating Liposome Containing Tumor Cell Lysate}
본 발명은 종양세포 용해물이 봉입된 암치료용 CO2 발생 리포좀에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종양세포 용해물이 봉입되어 있고 CO2가 발생하는 리포좀을 사용하여 외부의 자극에 의해 종양세포 용해물을 방출함으로써 항원제시세포에 전달함으로써 암에 특이적인 면역작용을 상승시켜 암을 치료할 수 있는 종양세포 용해물이 봉입된 암치료용 CO2 발생 리포좀 및 이를 이용한 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
현재 임상학적으로 사용되고 있는 암의 3대 치료방법은 수술(surgery), 방사선용법(radiation therapy), 화학요법(chemotherapy) 등이 있는데 암의 성질에 따라 각각의 치료방법이 한계를 자기고 있어서 단독 또는 복합적으로 사용되고 있으나 아직 이러한 치료방법에 의해 암을 완치하지 못하고 환자에게 심한 부작용과 고통을 수반하고 있는 실정이다.
최근에는 면역학적인 방법에 의하여 암을 치료하려는 새로운 시도가 활발히 진행되고 있는데, 이를 총칭하여 암 백신 또는 면역학적 치료법(cancer immunotherapy)이라고 한다. 암의 면역학적 치료법은 기존의 바이러스 및 박테리아 백신과 유사하게 특정 암 항원에 대한 면역반응 특히 암 특이 살해 T 세포(killer T cell)를 유도하여 암세포를 제거하는 것으로, 주 조직 적합성 복합체(MHC) class I 경로를 통해 항원제시 세포(antigen presenting cell, APC)가 항원을 T 세포에 전달하여 세포독성 T 세포가 활성을 높이게 된다. 최근 이러한 면역학적 치료가 암 치료의 4대 요법으로 자리잡아 가고 있다.
생체내의 주요 항원제시세포인 수지상 세포를 이용한 암 백신 개발이 활발이 진행되고 있다. 지금까지 전임상과 임상결과를 통해 수지상 세포를 이용한 암 백신이 가장 강력한 항암효과와 항암 면역을 유도하는 것으로 알려져 있다. 하지만 보다 효과적인 암 백신 개발을 위해서는 수지상 세포에 종양관련 항원을 효과적으로 적재해야 하며, 종양세포에 특이성에 필요한 항원의 다양성을 나타내어야 한다.
성숙화된 수지상 세포는 종양항원에 특이적인 CD8+ 표현형을 갖는 살해 T 세포(killer T cell)를 유도시켜 이들로 하여금 암세포를 공격하여 제거할 수 있도록 한다. 이는 수술에 의해 제거하기 힘들거나 놓쳐버린 경우의 전이된 암세포들도 찾아가서 제거할 수 있다. 또한 종양에 특이적인 공격을 하기 때문에 다른 조직에 대한 부작용을 줄일 수 있다. 또한 기억 CD8+ T세포는 수년에서 수십년까지 생체 내에서 살수 있어 일단 이러한 기억 세포를 유도해 놓으면 완치의 가능성이 있을 뿐 아니라 재발을 억제할 수 있어 기존 항암 치료법의 한계를 극복할 수 있다.
최근에는 단일 항원을 사용하는 대신 암 세포 표적 항원의 전체 레퍼토리를 대표 할 수 있는 전체 종양세포 용해물(tumor cell lysate)이 살해 T 세포 면역 반응을 향상시키는 것으로 보고 되었다. 여러 임상 시험에서 수지상세포의 성숙과 활성화를 위한 종양 특이 항원으로 전체 종양세포 용해물을 사용했다. 따라서 전체 종양세포 용해물의 사용은 암 치료를 위한 면역 요법의 효과를 높이기 위해 사용할 수 있는 잠재적 인 접근법이다.
이에, 본 발명자들은 효과적인 암 치료법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 종양 세포 용해물(tumor cell lysate; 항원)이 봉입된 CO2 발생 리포좀은 근적외선을 조사하였을 때, 효과적으로 수지상세포를 성숙시키고, 생체 내에서 면역기능 상승 효과 및 암세포 선택적인 항암 효과를 확인하였으며, 또한 항암제를 봉입한 CO2 발생 리포좀과 병용치료 하였을 때 시너지 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
삭제
Ko-jie Chen et al, ‘A Thermoresponsive Bubble-Generating LiposomalSystem for Triggering Localized Extracellular Drug Delivery’, ACS Nano, 2013, Vol7, No1, pp438-446 Tomoaki Yoshikawa et al, ‘Vaccine Efficacy of Fusogenic Liposomes Containing Tumor Cell-Lysate against Murine B16BL6 Melanoma’, Biol Pharm Bull, 2006, Vol29, No1, pp100-104
본 발명의 목적은 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 종양세포 용해물은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 암 유래 세포 용해물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 리포좀은 인지질들 간의 자기 조립 과정으로 제조된 것으로, 상기 인지질은 L-α-포스파티딜콜린(소이 하이드로제네이티드(L-α-phosphatidylcholine(soy hydrogenated); HSPC), 1,2-디팔미토일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphochline; DPPC), 1-미리스토일-2-스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; MSPC), 1-미리스토일-2-팔미토일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; MPPC), 1,2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DSPC), 1,2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], DSPE-mPEG2000) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지질일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 리포좀은 100 내지 200nm의 입자크기를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 리포좀에 봉입된 종양세포 용해물의 농도는 0.1 내지 1 ㎎/㎖일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 리포좀은 근적외선 또는 외부 열원에 의해 CO2가 발생되어 종양세포 용해물이 방출될 수 있으며, 상기 외부 열원은 40℃ 이상의 열을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 리포좀에서 방출된 종양 세포 용해물은 수지상 세포를 성숙시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 리포좀에는 항암제가 추가로 포함될 수 있으며, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 인지질 필름을 제조하는 단계;
(b) 상기 인지질 필름을 탄화수소암모늄(ammonium bicarbonate) 및 종양세포 용해물로 수화시키는 단계; 및
(c) 초음파 처리하여 유니라멜라(unilamellar) 형태의 리포좀을 제조하는 단계;를 포함하는 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 (a) 단계의 인지질 필름은 인지질을 유기 용매에 용해한 다음, 상기 용액을 감압 증발 시켜 인지질 필름을 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 (a) 단계의 인지질은 L-α-포스파티딜콜린(소이 하이드로제네이티드(L-α-phosphatidylcholine(soy hydrogenated); HSPC), 1,2-디팔미토일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphochline; DPPC), 1-미리스토일-2-스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; MSPC), 1-미리스토일-2-팔미토일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; MPPC), 1,2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DSPC), 1,2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], DSPE-mPEG2000) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지질일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에서, 상기 (c) 단계에서 제조한 리포좀은 (e) 칼럼을 통해 봉입되지 않은 탄화수소암모늄 및 종양세포 용해물을 제거하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에서, 상기 리포좀에 봉입된 종양세포 용해물의 적재효율은 30% 내지 60%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에서, 상기 방법으로 제조된 리포좀에 항암제를 처리하여 항암제를 리포좀 내부 공간에 추가로 봉입시켜, 종양세포 용해물 및 항암제가 동시에 포함된 리포좀을 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에서, 상기 항암제 추가 봉입은 27℃ 내지 31℃에서 22시간 내지 26시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에서, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에서, 상기 리포좀에 봉입된 항암제의 적재효율은 20% 내지 40%일 수 있다.
본 발명의 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀은 근적외선을 조사하면 CO2 발생으로 종양세포 용해물이 방출되며, 방출된 종양세포 용해물에 의해 효과적으로 수지상세포가 성숙되는 것을 확인하였으며, 생체 내에서 면역기능 상승 효과 및 암세포 선택적인 항암 효과를 확인하였다. 또한, 항암제를 봉입한 CO2 발생 리포좀과 병용치료 하였을 때 시너지 효과를 확인하였으므로, 본 발명의 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀은 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로 용이하게 이용할 수 있다.
도 1은 제조된 리포좀 및 CO2 발생 리포좀의 물리적 특성을 나타낸 것으로, (A) 크기, (B) 표면전하, (C) DOX의 적재 효율 (D) TCL의 적재 효율, (E) BG-TSL 의 형태, (F) DOX-BG-TSL의 형태(scale bar: 100 nm) 및 (G) 종양세포 용해물 캡슐화 평가를 나타낸 데이터이다.
TSL: 리포좀; BG-TSL: CO2 발생 리포좀; DOX: 독소루비신(Doxorubicin); 및 TCL: 종양세포 용해물
도 2은 제조된 리포좀을 다양한 온도 조건으로 하였을 때 독소루비신 또는 종양세포 용해물의 방출정도를 확인한 것으로, (A) DOX-TSL 또는 DOX-BG-TSL로부터 DOX 방출, (B) TCL-TSL 또는 TCL-BG-TSL로부터의 TCL 방출, (C) DOX-TSLs 또는 DOX-BG-TSL로부터 NIR 조사(2W / cm2) 유무에 따른 DOX 방출, (D) TCL-TSLs 또는 TCL-BG-TSLs로부터 NIR 조사(2W / cm2) 유무에 따른 TCL 방출을 나타낸 데이터이다.
도 3은 암세포에 의한 DOX-TSLs 또는 DOX-BG-TSL의 세포 내 흡수 정도를 나타낸 것으로, (A) FACS를 이용한 확인, (B) 공초점현미경을 이용한 확인(녹색: 핵, 빨간색: DOX), (scale bar: 10 μm), (C) DOX-TSL 또는 DOX-BG-TSL의 NIR 조사 (2 W / cm2)에 의한 세포 생존 능력을 확인한 데이터이다.
도 4는 TCL-BG-TSL에 의해 유도 된 수지상세포의 성숙과 활성화 정도를 나타낸 것으로, (A) 표면 성숙 마커 (CD40, CD80 및 MHC 클래스 I)의 표현, (B) 전 염증성 사이토 카인 및 수지상세포 활성화 인자의 발현을 확인한 데이터이다.
도 5은 (A) 암세포에 의한 리포좀 흡수 후 BG-TSL에서의 CO2 발생, (B) 마우스에 BG-TSL을 혈관내 주사 혹은 종양근처에 주사한 이후 초음파 이미징 시스템을 사용하여 BG-TSL로부터의 CO2 생성 관찰한 데이터이다.
도 6은 종양 모델에서 TCR-BG-TSLs와 DOX-BG-TSLs와 NIR 조사의 조합의 치료 효능을 나타낸 것으로, (A) 실험을 위한 실험 일정, (B) 종양 부피, (C) 종양 조직의 종양 무게 및 사진, (D) 마우스 체중, (E) TCL-BG-TSL 및 DOX-BG-TSL (scale bar: 50 μm)으로 처리 한 후 종양 조직에서 세포 증식 인자 (Ki67), 미세 혈관 밀도 (MVD, CD31), 세포사멸 (TUNEL), CD8 + T 세포의 국소화 (scale bar: 50 μm)를 IHC 분석한 결과를 나타낸 데이터이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
일 관점에서 본 발명은, 종양세포 용해물(tumor cell lysate)이 봉입된 CO2 발생 리포좀에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 종양세포 용해물은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 암 또는 종양 유래 세포 용해물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 리포좀에 봉입된 종양세포 용해물의 농도는 0.1 내지 1 ㎎/㎖일 수 있으며, 종양세포 용해물의 농도가 0.4 ㎎/㎖ 이상인 경우 항암활성이 높게 나타난다.
본 발명에 있어서, 상기 리포좀은 인지질들 간의 자기 조립 과정으로 제조된 것으로, 상기 인지질은 L-α-포스파티딜콜린(소이 하이드로제네이티드(L-α-phosphatidylcholine(soy hydrogenated); HSPC), 1,2-디팔미토일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphochline; DPPC), 1-미리스토일-2-스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; MSPC), 1-미리스토일-2-팔미토일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; MPPC), 1,2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DSPC), 1,2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], DSPE-mPEG2000) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 리포좀은 100 내지 200nm의 입자크기를 가진 것을 특징으로 할 수 있으며, 리포좀에 근적외선이 조사되면 CO2가 발생되어 종양세포 용해물이 방출되는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 근적외선을 조사하였을 때, 리포좀 내부에서 CO2 기체가 생성되면 리포좀의 벽면(membrane)의 불안정이 증가되어 리포좀 내부의 종양세포 용해물 또는 항암제 방출이 급격하게 일어나게 된다. CO2 발생은 근적외선에 의하여 국한되는 것은 아니고, 외부의 열원을 이용하여 리포좀 내부의 온도를 증가시킬 경우도 이에 해당하며, 열에 의하여 CO2를 발생시킬 수 있으면 동일한 원리로 종양세포 용해물 또는 항암제의 방출이 급격히 증가한다.
본 발명에 있어서, 상기 리포좀에서 방출된 종양 세포 용해물은 수지상 세포를 성숙시킬 수 있다. 암 면역 치료의 경우, 수지상세포를 효과적으로 성숙시키는 것이 중요하며, 본 발명의 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀에서 방출된 종양세포 용해물은 수지상세포를 효과적으로 성숙시켜 T세포로 하여금 암세포만 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 리포좀에 항암제가 추가로 봉입된 CO2 발생 리포좀을 포함되거나, 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀과 항암제가 봉입된 CO2 발생 리포좀을 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게 독소루비신(doxorubicin)인 것을 특징으로 한다.
다른 관점에서 본 발명은,
(a) 인지질 필름을 제조하는 단계;
(b) 상기 인지질 필름을 탄화수소암모늄(ammonium bicarbonate) 및 종양세포 용해물로 수화시키는 단계; 및
(c) 초음파 처리하여 유니라멜라(unilamellar) 형태의 리포좀을 제조하는 단계;를 포함하는 종양세포 용해 물이 봉입된 CO2 발생 리포좀 제조방법에 관한 것이다.
상기 (a) 단계의 인지질 필름은 인지질을 유기 용매에 용해한 다음, 상기 용액을 감압 증발 시켜 인지질 필름을 제조할 수 있다. 상기 인지질은 L-α-포스파티딜콜린(소이 하이드로제네이티드(L-α-phosphatidylcholine(soy hydrogenated); HSPC), 1,2-디팔미토일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphochline; DPPC), 1-미리스토일-2-스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; MSPC), 1-미리스토일-2-팔미토일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; MPPC), 1,2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DSPC), 1,2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], DSPE-mPEG2000) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지질인 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 상기에서 선택된 1 종 이상의 인지질을 클로로포름/메탄올 혼합 용매에 용해시키고 감압 증발시켜 제조될 수 있다. 또한, 리포좀 제작시에 사용하는 인지질의 종류(구성성분) 및 구성 비율에 따라 리포좀의 물리적인 성질이 전혀 다른 현상을 나타내므로, CO2 발생에 의해 리포좀에서 종양세포 용해물의 방출이 보다 효과적으로 수행될 수 있는 인지질의 조합 및 구성 비율이 중요하다.
본 발명의 리포좀은 인지질들 간의 자기 조립(self-assembly) 과정으로 제조되는 것으로, "인지질들 간의 자기 조립(self-assembly) 과정"은 인지질의 극성분자단은 물쪽으로 향하고 비극성분자단은 자기들끼리 소수성 상호작용에 의해 결합되어 2분자막이 자발적으로 형성되며, 이는 소수성 부분이 물과 접촉하지 않기 위하여 구형의 소포체가 합성을 통해 나노미터 크기의 구조물을 제조하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법으로 제조된 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀은 100 내지 200nm의 입자크기를 가지며 나노에멀젼 형태인 것을 특징으로 할 수 있으며, 리포좀에 근적외선이 조사되면 CO2가 발생되어 종양세포 용해물이 방출되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 CO2 발생은 탄화수소암모늄(ammonium bicarbonate)가 온도에 의해 CO2가 발생되는 것을 이용한 것으로, 탄화수소암모늄은 리포좀 제작 중 수화과정에서 리포좀 안으로 들어가게 된다. 탄화수소암모늄은 253mM의 농도에 pH 4 의 용액을 사용하는 것이 바람직 하나, 이에 한정 되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 방법으로 제조된 리포좀에 봉입된 종양세포 용해물의 적재효율은 30% 내지 60%인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 리포좀에 봉입된 종양세포 용해물의 농도는 0.1 내지 1 ㎎/㎖인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀 제조방법은 좀 더 구체적으로,
(ⅰ) 인지질들을 유기용매에 용해하는 단계;
(ⅱ) 상기 (ⅰ) 단계의 용액을 증발기(evaporator)로 감압 증발 단계;
(ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계에 생성된 인지질 필름을 탄화수소암모늄 및 종양세포 용해물 용액으로 수화시키는 단계;
(ⅳ) 상기 (ⅲ) 단계의 용액을 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 유니라멜라(unilamellar) 소포 형태의 리포좀으로 제조하는 단계; 및
(ⅴ) 세파덱스(sepadex) G-50 칼럼을 이용하여 상기 (ⅳ) 단계의 용액에서 리포좀에 봉입되지 않은 탄화수소암모늄 및 종양세포 용해물을 제거하는 단계;를 포함하는 방법으로 수행될 수 있으며,
(ⅵ) 상기 (ⅴ) 단계의 용액에 독소루비신 용액을 넣어 항온 수조에서 독소루비신을 리포좀 내부 공간에 봉입시키는 단계; 및
(ⅶ) 세파덱스(sepadex) G-50 칼럼을 이용하여 상기 (ⅵ) 단계의 용액에서 리포좀에 봉입되지 않은 독소루비신을 제거하는 단계;가 추가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제 추가 봉입은 27℃ 내지 31℃에서 22시간 내지 26시간 동안 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 리포좀에 봉입된 항암제의 적재효율은 20% 내지 40%인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게 독소루비신(doxorubicin)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 도 1에 나타난 바와 같이, 리포좀(TSL), 독소루비신 리포좀(DOX-TSL), 종양세포 용해물 봉입 리포좀(TCL-TSL), CO2 발생 리포좀(BG-TSL), 종양세포 용해물 봉입 CO2 발생 리포좀(TCL-BG-TSL) 및 독소루비신 봉입 CO2 발생 리포좀(DOX-BG-TSL)을 제조하였다. 제조된 리포좀의 크기, 표면전하, 적제효율, 형태 및 캡슐화 평가에 대해 확인하였으며, 종양세포 용해물 또는 독소루비신이 봉입된 CO2 발생 리포좀은 100 내지 200nm, 바람직하게는 100 내지 150nm의 입자크기를 가지며, 리포좀에 봉입된 종양세포 용해물의 적재효율은 30% 내지 60%, 바람직하게는 40% 내지 50%인 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서, 본 발명에서 제조한 CO2 발생 리포좀은 외부 열원에 의해 CO2 발생하도록 제조된 것으로, CO2 발생 리포좀에서 온도 증가에 따른 CO2가 발생 정도를 확인한 결과, 도 2A 및 도 2B에 나타난 바와 같이, 체온인 37℃에서는 CO2가 발생하지 않아 독소루비신 및 종양세포 용해물의 방출이 거의 안된 반면, 41℃ 이상에서는 CO2 발생으로 독소루비신 및 종양세포 용해물이 방출되는 것을 확인하였다. 게다가 종양세포 용해물이 봉입된 리포좀의 경우 CO2 발생에 의해 방출이 더욱 활발하게 일어나는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에서 제조한 CO2 발생 리포좀은 외부에서 근적외선을 조사하였을 때, 리포좀 내부에서 CO2를 발생 시켜 효과적으로 종양세포 용해물 또는 항암제를 방출하도록 제조된 것으로, 도 2C 및 도 2D에 나타난 바와 같이, 근적외선 조사시에만 리포좀 내부에서 CO2를 발생 시켜 효과적으로 종양세포 용해물 또는 독소루비신을 방출하는 것을 확인하였다.
또 다른 관점에서 본 발명은, 본 발명의 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 조성물에는 항암제가 봉입된 CO2 발생 리포좀이 추가로 포함되거나 종양세포 용해물 및 항암제가 동시에 봉입된 CO2 발생 리포좀이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게 독소루비신(doxorubicin)인 것을 특징으로 한다.
상기 독소루비신의 경우 소분자(small molecule) 물질로, 단독으로 사용할 경우 원하는 종양 조직으로만 전달되는 것이 아니라 전신, 특히, 심장에 상당량 분포되기 때문에 비가역적인 심근증이나 울혈성 심부전 같은 심장 부작용이 나타난다. 암은 빠른 세포분열 등으로 인하여 산소 등의 혈액공급이 다량 요구되므로 암 조직 주위에 형성되는 신생혈관은 정상혈관에 비해서 혈관상피세포간의 간극이 느슨하고 림프조직이 덜 형성되므로 나노 크기의 리포좀이 쉽게 통과할 수 있고 이러한 EPR 효과에 의해서 정상조직이 아닌 암 부위에만 선택적으로 전달될 수 있는 효과가 있다.
본 발명에서는 종양세포 용해물과 독소루비신을 암 조직 등의 체내의 특정 부위에만 분포시키기 위하여 리포좀 (운반체)을 사용하여 생체 내에서의 약효를 최대화하고 항암제의 부작용을 최소화 하고자 하였다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 암세포에 독소루비신이 봉입된 리포좀(DOX-TSLs) 또는 독소루비신이 봉입된 CO2 발생 리포좀(DOX-BG-TSL)을 처리하였을 때 세포 내 흡수 정도를 관찰하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, CO2 발생 리포좀이 일반 리포좀에 비해 세포 흡수율이 높은 것을 확인하였으며, 암세포 사멸율 또한 우수한 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서, 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀(TCL-BG-TSL)이 수지상세포를 효과적으로 성숙시키는지 확인하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀이 처리된 수지상 세포의 표면 성숙 마커(CD40, CD80 및 MHC 클래스 I) 발현 및 사이토카인(TNF-α, IL-6 및 IL-12)의 발생이 현저하게 증가한 것을 확인하였다. 즉, 근적외선 조사에 의해 본 발명의 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀에서 방출된 종양세포 용해물은 종양세포 용해물 단독 처리군에 비해 효과적으로 수지상 세포를 성숙 시키는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서, CO2 발생 리포좀(BG-TSL)을 암세포에 처리하였을 때 CO2 발생 정도를 관찰한 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이 41℃에서 CO2가 발생하는 것을 확인하였다. 또한, 생체 내에서도 CO2 발생 리포좀에 의해 CO2가 발생하는지 확인하기 위해 마우스에 CO2 발생 리포좀을 혈관내 주사 혹은 종양근처에 주사한 이후 초음파 이미징 시스템을 사용하여 관찰한 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이 CO2 발생 리포좀으로부터 CO2가 발생하는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서, 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀 및 항암제가 봉입된 CO2 발생 리포좀의 병용 처리에 의해 항암 활성이 향상되는지 확인하였다. 도 6A에 나타낸 바와 같이, 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀(TCR-BG-TSLs) 투여군 및 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀 및 항암제가 봉입된 CO2 발생 리포좀의 병용투여군(combination)으로 나누어 일주일 간격으로 2회 투입하였다. 종양 부피(도 6B), 종양 조직 무게(도 BC) 및 마우스 체중(도 6D)를 확인한 결과, 병용투여군에 근적외선을 조사하였을 때, 종양의 성장을 가장 효과적으로 억제하는 것을 확인하였으며, 리포좀 투여에 의한 마우스 독성은 없는 것을 확인하였다. 또한, 종양 조직에서 세포 증식 인자 (Ki67), 미세 혈관 밀도 (MVD, CD31), 세포사멸 (TUNEL), CD8 + T 세포의 국소화 (scale bar: 50 μm) 정도를 분석한 결과, 병용투여군이 가장 효과적으로 항암활성을 보이는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀에 근적외선을 조사하면 CO2 발생으로 종양세포 용해물이 방출되며, 방출된 종양세포 용해물에 의해 효과적으로 수지상세포가 성숙되는 것을 확인하였다. 또한, 항암제를 봉입한 CO2 발생 리포좀과 병용치료 하였을 때 시너지 효과를 확인하였으므로, 본 발명의 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀은 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로 용이하게 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본 발명의 종양세포 용해물을 봉입한 CO2 발생 리포좀 또는 항암제를 봉입한 CO2 발생 리포좀 이를 포함하는 조성물의 투여로 암세포의 사멸 또는 암의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있으며, 주사 제형이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
리포좀 제조 및 특성 확인
1-1 : 리포좀 제조
본 발명에서는 리포좀(TSL), 독소루비 봉입 리포좀(DOX-TSL), 흑색종 유래 종양세포(B16F10) 용해물(TCL-TSL), CO2 발생 리포좀(BG-TSL), 흑색종 유래 종양세포(B16F10) 용해물 봉입 CO2 발생 리포좀(TCL-BG-TSL) 및 독소루비신 봉입 CO2 발생 리포좀(DOX-BG-TSL)을 제조하였다.
TSL은 얇은 지질막 수화 방법을 사용하여 준비하였다. TSL은 DPPC : MSPC : DSPE-mPEG-2000의 몰 비가 79.5 : 6.5 : 14이 되도록 구성하였다. 지질을 클로로포름 - 메탄올 혼합물 (8 : 2, v/v)에 용해시키고 용매를 회전감압기를 사용하여 증발시켜 얇은 지질막을 수득 하였다. 지질막을 43 ㎖의 300 mM 구연산 용액 (pH 4)으로 수화시켰다. TSL은 Sephadex G-50 컬럼을 사용하여 분리 하였다.
BG-TSL은 TSL과 동일한 몰비가 되도록 DPPC : MSPC : DSPE-mPEG-2000으로 구성하였다. 지질을 3 ㎖의 클로로포름 - 메탄올 혼합물 (8 : 2, v / v)에 용해시키고 감압기를 사용하여 용매를 증발시켜 얇은 지질막을 수득 하였다. 지질막을 6 ㎖의 253 mM 탄산암모늄(NH4CO3)용액 (pH 4)으로 43℃에서 수화시킨 후, 세파덱스 G-50 컬럼(Sephadex G-50)을 사용하여 BG-TSL을 분리 하였다.
DOX-BG-TSL에서 DOX의 봉입은 pH 그래디언트 로딩(pH gradient loading) 방법을 사용하여 BG-TSL에 캡슐화 하였다. DOX (2 ㎎/㎖)를 BG-TSL (2 : 1 w/v)과 혼합 한 후, 혼합물을 29℃에서 밤새 항온 배양 하였다. DOX-BG-TSLs는 4℃에서 세파덱스 G-50 컬럼을 사용하여 봉입되지 않은 DOX를 제거하였다.
TCL-BG-TSL은 TCL을 봉입하기 위해 지질막을 43℃에서 253 mM의 탄산암모늄을 함유 한 1 ㎎/㎖ TCL 용액으로 수화시켰다. TCL-BG-TSLs는 세파덱 G-50 컬럼을 사용하여 4℃에서 분리하여 캡슐화되지 않은 TCL과 탄산암모늄을 제거 하였다.
1-2 : 리포좀의 물리적 특성 확인
상기 실시예 1-1에서 제조한 리포좀의 크기, 입자 표면의 전위 및 흑색종 유래 종양세포(B16F10) 용해물의 적재효율(loading efficiency)을 확인하였다.
구체적으로, 광산란장치를 이용하여 나노입자와 리포좀의 크기를 측정한 결과, 흑색종 유래 종양세포(B16F10) 용해물이 봉입된 리포좀의 크기는 130nm, 흑색종 유래 종양세포(B16F10) 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀의 크기는 150nm임을 확인하였다 (도 1A).
또한, 제타 전위 측정기를 이용하여 입자 표면의 전위를 측정한 결과, 흑색종 유래 종양세포(B16F10) 용해물이 봉입된 리포좀과 흑색종 유래 종양세포(B16F10) 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀의 전위 값은 -30mV 임을 확인하였다 (도 1B).
아울러, 흑색종 유래 종양세포(B16F10) 용해물의 리포좀 적재효율(loading efficiency)을 BCA protein assay 방법으로 측정한 결과, 흑색종 유래 종양세포(B16F10) 용해물을 리포좀에 봉입했을때, 적재효율은 43%로 나타났다 (도 1C 및 1D).
종양세포 용해물 또는 항암제 방출조건 확인
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 제조한 독소루비신 봉입 리포좀(DOX-TSL), 독소루비신 봉입 CO2 발생 리포좀(DOX-BG-TSL), 종양세포 용해물 봉입 리포좀(TCL-TSL), 종양세포 용해물 봉입 CO2 발생 리포좀(TCL-BG-TSL)에서 종양세포 용해물 또는 항암제 방출 조건을 확인하였다.
먼저, 상기 리포좀들을 37℃, 39℃, 41℃, 43℃ 및 45℃로 다양한 온도 조건으로 하였을 때 독소루비신 또는 종양세포 용해물의 방출정도를 확인하였다.
튜브에 DOX-BG-TSL 또는 TCL-BG-TSL을 첨가 한 후, 튜브를 일정 시간 동안 37℃, 39℃, 41℃, 43℃ 및 45℃ 온도의 항온 수조에 각각 방치하였다. 그 다음, DOX-BG-TSL 또는 TCL-BG-TSL을 원심 분리(15,700×g, 30 분) 한 후, 상등액을 수집하여 DOX 또는 TCL의 방출을 측정 하였다. DOX는 490 nm에서 자외선 분광법으로 측정하였고, TCL은 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정 하였다.
그 결과, 도 2A 및 도 2B에 나타난 바와 같이, 체온인 37℃에서는 CO2가 발생하지 않아 독소루비신 및 종양세포 용해물의 방출이 거의 안된 반면, 41℃ 이상에서는 CO2 발생으로 독소루비신 및 종양세포 용해물이 방출되는 것을 확인하였다. 게다가 종양세포 용해물이 봉입된 리포좀의 경우 CO2 발생에 의해 방출이 더욱 활발하게 일어나는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에서 제조한 CO2 발생 리포좀은 외부에서 근적외선을 조사 하였을 때, 리포좀 내부에서 CO2를 발생 시켜 효과적으로 종양세포 용해물 또는 항암제를 방출하도록 제조된 것으로, 실시예 1-1에서 제조한 리포좀을 튜브에 첨가 한 후 튜브를 37℃의 수조에 넣은 다음, NIR (2 W/㎠) 조사하였다. 조사 후, 리포솜 용액을 15,700×g에서 30 분 동안 원심 분리하고, 상등액을 수집하여 DOX 또는 TCL의 방출을 측정 하였다. DOX는 490 nm에서 자외선 분광법으로 측정하였고, TCL은 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정 하였다.
그 결과, 도 2C 및 도 2D에 나타난 바와 같이, 근적외선 조사시에만 리포좀 내부에서 CO2를 발생 시켜 효과적으로 종양세포 용해물 또는 독소루비신을 방출하는 것을 확인하였다.
항암제 봉입 리포좀의 암 세포 내 흡수 정도 확인
본 발명에서는 암세포에 독소루비신이 봉입된 리포좀(DOX-TSL) 또는 독소루비신이 봉입된 CO2 발생 리포좀(DOX-BG-TSL)을 처리하였을 때 세포 내 흡수 정도를 관찰하였다.
DOX-BG-TSLs의 암세포 내 섭취는 유동 세포 계측법(FACS)을 이용하여 평가하였다. 흑색종 세포주인 B16F10 세포를 플레이트에 배양한 뒤, 배지를 DOX-BG-TSL을 함유하는 새로운 DMEM 배지로 교체 하였다. 세포를 20분 동안 추가 배양 한 후, DOX-BG-TSLs의 세포 내 흡수를 유동 세포 계측법을 통해 모니터링 하였다. 또한, DOX-BG-TSL을 포함하는 종양 세포의 형태는 공 초점 현미경(confocal microscopy)을 이용하여 관찰하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, CO2 발생 리포좀이 일반 리포좀에 비해 세포 흡수율이 높은 것을 확인하였으며, 암세포 사멸율 또한 우수한 것을 확인하였다.
종양세포 용해물 봉입 CO 2 리포좀의 생체 외( in vitro) 미분화 수지상세포 성숙효과
본 발명의 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀(TCL-BG-TSL)이 미분화 수지상세포에 성숙을 유도함을 확인하기 위해서 상기 실시예 1에서 제조한 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀을 쥐 유래 수지상세포에 처리하고, 성숙된 수지상세포에서 발현되는 세포표면마커를 FACS로 측정하였다.
구체적으로, C57/BL6 마우스의 경골 및 대퇴골로부터 골수를 수집한 다음, 수집된 골수에서 수지상세포 (BMDCs)를채취하였다. 수지상세포의 성숙을 확인하기 위해서 수지상세포 단독으로 대조군, BG-TSL, TCL (50 ㎍) 및 TCL-BG-TSL (TCL 50 ㎍)을 세포와 함께 30 분 동안 배양 하였다. 배양 후, 수지상세포를 NIR (2 W/㎠)로 조사하고, 추가 24 시간 동안 배양 한 후, 수지상세포를 CD11c, CD40, CD80 및 MHC I 형광 항체로 처리한 다음, 유동 세포 계측법(FACS)으로 평가 하였다.
또한, 수지상세포에서 분비 된 사이토카인 (TNF-α, IL-6 및 IL-12)을 사이토카인 특이적 ELISA 키트(eBioscience, 미국)를 사용하여 분석 하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀이 처리된 수지상 세포의 표면 성숙 마커(CD40, CD80 및 MHC 클래스 I) 발현 및 사이토카인(TNF-α, IL-6 및 IL-12)의 발생이 현저하게 증가한 것을 확인하였다.
즉, 근적외선 조사에 의해 본 발명의 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀에서 방출된 종양세포 용해물은 종양세포 용해물 단독 처리군에 비해 효과적으로 수지상 세포를 성숙 시키는 것을 확인하였다.
생체 내에서 CO 2 발생 여부 확인
5-1 : CO 2 발생 리포좀의 온도 증가에 따른 CO 2 발생 확인
CO2 발생 리포좀(BG-TSL)을 암세포에 처리하였을 때 CO2 발생 정도를 초음파 이미징 시스템을 사용하여 관찰하였다.
B16F10 암세포 내부의 BG-TSL의 온도에 의한 CO2 생성은 7 MHz 변환기(7 MHz transducer; Telemed, 리투아니아)를 포함하는 초음파 영상 시스템을 사용하여 모니터링 하였다. 세포를 BG-TSL를 포함하는 배지로 30분 동안 배양한 뒤, 둥근 바닥의 튜브에 모아 37℃또는 41℃의 온도로 가열 하였다. CO2 거품 발생은 에코 블래스터 128 CEXT(Echo Blaster 128 CEXT)의 B-모드를 사용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이 41℃에서 CO2가 발생하는 것을 확인하였다.
5-2 : 생체 내에서 CO 2 발생 확인
생체 내에서도 CO2 발생 리포좀에 의해 CO2가 발생하는지 확인하기 위해 마우스에 CO2 발생 리포좀을 혈관내 주사 혹은 종양근처에 주사한 이후 초음파 이미징 시스템을 사용하여 관찰하였다.
구체적으로, C57/BL6 마우스에서 BG-TSL의 종양 내 CO2 거품 발생을 확인하기 위해, 종양 내 (i.t.) 및 정맥 내 (i.v.) 주사를 통해 마우스의 종양 내로 BG-TSL (50 ㎕)을 주입 하였다. BG-TSL 주입 1 시간 후, 종양부위에 NIR (2 W/㎠)을 조사 하였다. CO2 거품 발생은 에코 블래스터 128 CEXT(Echo Blaster 128 CEXT)의 B-모드를 사용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이 CO2 발생 리포좀으로부터 CO2가 발생하는 것을 확인하였다.
종양세포 용해물이 봉입된 CO 2 발생 리포좀 및 항암제가 봉입된 CO 2 발생 리포좀의 병용 처리에 의해 생체 내 암세포 사멸 효과 확인
종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀 및 항암제가 봉입된 CO2 발생 리포좀의 병용 처리에 의해 항암 활성이 향상되는지 확인하였다.
도 6A에 나타낸 바와 같이, 제조된 마우스에 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀(TCR-BG-TSLs) 투여군 및 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀 및 항암제가 봉입된 CO2 발생 리포좀의 병용투여군(combination)으로 나누어 일주일 간격으로 2회 투입한 다음, 20일 후에 종양 억제 정도를 관찰하였다.
구체적으로, 암컷 C57/BL6 마우스에 종양을 생성하기 위해 B16F10 세포 (50㎕ HBSS 중 1 x 106 세포)를 마우스에 피하 주사 하였다. 종양의 부피가 60 ㎣에 도달 한 마우스를 무작위로 5 군으로 5마리씩 나누었다.
(1) 대조군;
(2) 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀에 NIR을 조사한 군;
(3) 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀에 NIR을 조사하지 않은 군;
(4) 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀 및 항암제가 봉입된 CO2 발생 리포좀을 병용 투여 하고 NIR을 조사한 군;
(5) 종양세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀 및 항암제가 봉입된 CO2 발생 리포좀을 병용 투여 하고 NIR을 조사하지 않은 군;으로 나누어 항암활성을 비교하였다.
각각의 제형을 1 주일에 1 회 주사한 뒤, 주사 1 시간 후, 종양부위에 열원 인 근적외선 (NIR) 레이저 (1 W/㎠)를 1분 동안 조사 하였다. 약물 투여기간 동안 종양 체적, 종양 무게 및 체중을 기록하였다.
종양 부피(도 6B), 종양 조직 무게(도 BC) 및 마우스 체중(도 6D)를 확인한 결과, 병용투여군에 근적외선을 조사하였을 때, 종양의 성장을 가장 효과적으로 억제하는 것을 확인하였으며, 리포좀 투여에 의한 마우스 독성은 없는 것을 확인하였다.
또한, 마우스로부터 분리 된 종양 조직에서 세포 증식 인자 (Ki67), 미세 혈관 밀도 (MVD, CD31), 세포사멸 (TUNEL), CD8 + T 세포의 국소화 (scale bar: 50 μm) 정도를 면역 조직 화학염색을 통해 분석하였다. 각 슬라이드의 5 개의 임의 필드에 ×400 배율로 기록하였다.
마우스의 비장 세포에서 세포 독성 CD8+ T 세포의 활성화를 확인 하기 위해, 비장에서 비장 세포를 수집하고 배지 1 ㎖에 재현탁 시킨 뒤, 골지플러그(GolgiPlug; BD Biosciences, 미국)를 처리하고, 항-CD8a, 항-IFN-γ 항체로 염색하였다. IFN-γ분비 CD8 + T 세포의 활성화를 유세포 분석기를 통해 확인 하였다
그 결과, 도 6E에 나타난 바와 같이, 병용투여군이 가장 효과적으로 항암활성을 보이는 것을 확인하였다.

Claims (12)

  1. 흑색종 유래 종양 세포 용해물이 봉입된 CO2 발생 리포좀 및
    독소루비신이 봉입된 CO2 발생 리포좀을 유효성분으로 포함하며,
    상기 CO2 발생 리포좀은 DPPC, MSPC 및 DSPE-mPEG2000으로 제조된 인지질 필름을 탄화수소암모늄(ammonium bicarbonate) 용액, 및 흑색종 유래 종양세포 용해물 용액 또는 독소루비신 용액으로 수화시켜 리포좀 형태로 제조한 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 100 내지 200nm의 입자크기를 가지는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 근적외선 또는 외부 열원에 의해 CO2가 발생되어 종양세포 용해물 또는 독소루비신이 방출되며, 리포좀에서 방출된 종양 세포 용해물은 수지상 세포를 성숙시키는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 암은 흑색종인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 삭제
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