CN111344015B - 一种用于癌症治疗的光纳米疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于癌症治疗的光纳米疫苗及其制备方法和应用。所述光纳米疫苗包括黑磷量子点和外泌体，所述黑磷量子点包裹于所述外泌体中。本发明所涉及的光纳米疫苗具有很好的体内长期稳定性、光热转换性和肿瘤靶向性；此外，其对肿瘤具有显著的治疗和预防效果，并能促进肿瘤组织T淋巴细胞的浸润，是一种创新的用于治疗癌症或预防癌症的光纳米疫苗。

Description

一种用于癌症治疗的光纳米疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种光纳米疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及一种用于癌症治疗的光纳米疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
目前的癌症免疫疗法，如癌症疫苗、检查点阻断疗法和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)，被证明是一种有效的治疗多种癌症的方法。纳米疫苗是一个新兴领域，在动物和临床癌症模型中取得了不同程度的成功。一种有效的纳米疫苗通常由抗原(肿瘤特异性肽、蛋白质或核酸)、佐剂以及可能作为载体的纳米颗粒组成。纳米疫苗的目的是实现抗原和佐剂高效共输至引流淋巴结(dLNs)，触发抗原特异性适应性免疫和对癌细胞的长期免疫记忆效应，从而避免免疫耐受和肿瘤复发。由于肿瘤抗原表达谱具有较大的异质性，纳米疫苗对已建立的肿瘤和不同的癌症患者可能表现出显著不同的疗效。个性化的癌症免疫治疗疫苗已经成为一种新的有前途的癌症治疗策略。随着数字时代不断涌现的创新推动了疫苗接种的发展，为患者接种带有单个肿瘤突变的疫苗可能成为第一个真正个性化的癌症治疗方法。因此，我们迫切需要一种安全而有效的免疫原性纳米疫苗，以适合于患者特异性新抗原的个性化治疗。
癌症光热治疗(PTT)因其高效率和最小的侵袭性，是传统治疗方法的一个有前途的替代方法。近十年来，金纳米颗粒、氧化石墨烯、吲哚菁绿(ICG)等近红外(NIR)响应纳米制剂已被证明可以有效地将光能转化为热能，提高光热消融治疗的疗效。近年来研究表明，黑磷纳米片具有独特的物理结构、良好的光学性能、较高的表面积和载药量，可作为肿瘤协同光动力/光热治疗、肿瘤热疗等药物传递系统和其他生物医学应用。事实上，在光热/光动力协同抗肿瘤治疗中，BP量子点(BPQDs)作为传递纳米颗粒的平台表现出良好的组织穿透性。重要的是，研究表明，BPQDs几乎是无毒的，具有良好的生物相容性、降解性、治疗和渗透潜力。它的主要元素磷是生物体生命活动的基本元素之一。在酸性条件下，BP降解增加，从而加速抗肿瘤药物和肿瘤相关抗原在酸性肿瘤微环境中的释放。此外，超小尺寸(<10nm)的BPQDs半衰期较长，不易被巨噬细胞吞噬。因此，它们更可能通过增强的通透性和保留(EPR)活性而分布于肿瘤组织中，使负载的抗肿瘤药物能够在肿瘤部位积聚。这些优势使得基于BP纳米材料的无毒高效治疗成为可能。根据上述特点，BPQDs有望成为治疗肿瘤的优良光热剂。最后，许多消融性肿瘤治疗，被报道可通过释放肿瘤特异性抗原、促进DC成熟和T细胞活化来诱导强肿瘤特异性免疫反应。局部发热和热疗可增加血流量、血管通透性和间质压力，促进T细胞对抗癌细胞进入肿瘤。
外泌体是一类由细胞分泌的50-150nm脂质双层膜囊泡，是蛋白质、信使RNA和microRNA的细胞间信使，在细胞间通讯、维持正常生理过程和疾病病理等方面具有生物学作用。近年来，外泌体被广泛研究用于诊断和作为药物传递载体。然而，在光纳米颗粒传递载体和肿瘤免疫治疗中具有多功能作用的外泌体尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种光纳米疫苗及其制备方法和应用，尤其提供一种用于癌症治疗的光纳米疫苗及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种用于癌症治疗的光纳米疫苗，所述光纳米疫苗包括黑磷量子点和外泌体，所述黑磷量子点包裹于所述外泌体中。
本发明创造性地将纳米颗粒为基础的光热治疗与免疫治疗结合起来，建立了一种新的有效的个性化光纳米疫苗，即使用外泌体作为携带黑磷量子点和肿瘤特异性抗原的有效载体。其优势包括：(1)该光纳米疫苗具有长血循环效应，且外泌体可以保护黑磷量子点，避免其快速生物降解；(2)免疫原性诱导，肿瘤细胞的外泌体中含有一系列肿瘤抗原，可作为抗原载体作用于树突状细胞(DCs)和主要的细胞毒性T淋巴细胞，并对肿瘤产生免疫应答；(3)靶向性选择，外泌体含有细胞膜，可通过一系列表面粘附蛋白和载体配体(如整合素、CD11b和CD18受体)附着于靶细胞，并将有效载荷传递到靶细胞。外泌体可携带在母细胞膜中发现的细胞类型特异性蛋白，如来自少突胶质细胞的髓鞘蛋白和来自外泌体中肿瘤细胞的特异性抗原，具有独特的归巢选择性。与单纯的黑磷量子点相比，本发明所涉及的光纳米疫苗具有更好的体内长期稳定性、光热转换性和肿瘤靶向性；此外，其对肿瘤具有的显著治疗效果，并促进了肿瘤组织T淋巴细胞的浸润，是一种创新的用于治疗癌症的光纳米疫苗。
优选地，所述黑磷量子点与外泌体的质量比为1:(8-12)，例如1:8、1:9、1:10、1:11或1:12等。
所述黑磷量子点与外泌体的质量比特定选择为1:(8-12)的质量配比，是因为在此条件下才能使上述有益效果达到最佳。
优选地，所述癌症包括肺癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、淋巴癌、食管癌、胃癌或结肠癌。本发明所涉及的光纳米疫苗可以用于上述但不仅限于上述肿瘤类型的预防和治疗。
优选地，所述外泌体为肿瘤细胞的外泌体。
优选地，所述外泌体为经消融后的肿瘤细胞的外泌体。肿瘤细胞的外泌体经消融后携带更多种的肿瘤抗原，可作为抗原载体作用于树突状细胞(DCs)和主要的细胞毒性T淋巴细胞，并对肿瘤产生免疫应答。
另一方面，本发明提供一种如上所述的用于癌症治疗的光纳米疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)分离外泌体和合成黑磷量子点；
(2)将步骤(1)制得的黑磷量子点加载到外泌体中，得到所述用于癌症治疗的光纳米疫苗。
本发明所涉及的光纳米疫苗的制备方法简单易操作，便于工业化生产。
优选地，步骤(1)所述分离外泌体的方法为：对肿瘤患者进行光热治疗，取血浆并从血浆中分离出外泌体。
示例性地，肿瘤区域使用808nm的激光进行辐照(1W/cm2)10min，并于第二天再次进行上述操作，24h后分离血浆，采用超离心法分离血浆中的外泌体。简而言之，血浆先以1000g离心10min，然后以10000g离心30min；收集上层清液，用0.22μm过滤膜过滤，然后在10万g超离心作用1h；外泌体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，10万g离心1h回收；富含外泌体的部分用PBS洗涤两次，并在-80℃保存。
优选地，所述进行光热治疗的方式为：在肿瘤内注射黑磷纳米颗粒，使用近红外激光辐照肿瘤区域。
优选地，所述从血浆中分离出外泌体采用超离心法。
优选地，步骤(1)所述合成黑磷量子点的方法为液相去角质法。
优选地，所述液相去角质法包括：将黑磷晶体与异丙醇混合后进行浴超声，离心，上清液浓缩并干燥。
优选地，所述黑磷晶体与异丙醇的比例为(1.5-2.5)mg/mL，例如1.5mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2.0mg/mL、2.2mg/mL、2.3mg/mL或2.5mg/mL等。
优选地，所述浴超声的时间为45-50h，例如45h、46h、47h、48h、49h或50h等。
优选地，所述浴超声的功率为340-380W，例如340W、345W、350W、355W、360W、365W、370W或380W等。
优选地，所述离心为在(8000-10000)rpm(例如8000rpm、8500rpm、8800rpm、9000rpm、9200rpm、9500rpm、9800rpm或10000rpm等)下离心20-40min(20min、25min、30min、35min、38min或40min等)。
本发明采用简单的液相去角质法制备了黑磷量子点。为了提高黑磷量子点的生物相容性，采用异丙醇作为溶剂，易于挥发和除去。此外，为了避免超声探头可能带来的杂质，使用浴式超声而不是探针式超声。具体地，将100mg的黑磷晶体和50mL的异丙醇混合在一个60mL的棕色瓶子里，在48h浴超声(360W)后，以9000rpm离心30min；上清液是黑磷量子点的分散物，收集并以18000rpm浓缩。然后，将分散物在真空炉中干燥一夜。制备好的黑磷量子点保存在氩气手套箱中，不需要光照。
优选地，步骤(2)所述将黑磷量子点加载到外泌体中的方法包括：将黑磷量子点、外泌体和PBS液混合搅拌，超声，冷却。
优选地，所述超声的时间为2.5-3.5min，例如2.5min、2.6min、2.8min、2.9min、3.0min、3.2min或3.5min等。
优选地，所述冷却的时间为1.5-2.5min，例如1.5min、1.7min、1.8min、2.0min、2.2min、2.3min、2.4min或2.5min等。
作为本发明的优选技术方案，所述用于癌症治疗的光纳米疫苗的制备方法包括如下步骤：
(1)分离外泌体：肿瘤区域使用808nm的激光进行辐照(1W/cm2)后分离血浆，采用超离心法分离血浆中的外泌体，并在-80℃保存；
(2)合成黑磷量子点：将黑磷晶体和异丙醇混合避光，浴超声(360W)48h后，以9000rpm离心30min；收集上清液并以18000rpm离心浓缩、干燥；
(3)将黑磷量子点、外泌体和PBS液混合搅拌，超声2.5-3.5min，冷却1.5-2.5min，将黑磷量子点加载于外泌体中。
再一方面，本发明提供一种如上所述的用于癌症治疗的光纳米疫苗在制备用于癌症治疗或癌症预防的药物中的应用。
优选地，所述药物的剂型包括药剂学上的可接受的任意一种剂型，例如片剂、胶囊剂、混悬剂、栓剂、喷剂、注射剂或滴剂等。
优选地，所述药物还包括药剂学上可接受的药用辅料中的任意一种或至少两种的组合，所述药用辅料包括赋形剂、载体、增溶剂、助溶剂、稳定剂、缓释剂等。所述载体例如脂质体、胶束、树枝状大分子、微球、微囊等。
优选地，所述药物还包括直接抗肿瘤药物、辅助抗肿瘤药物或分子靶向药物。
所述直接抗癌药物包括化疗药物，例如氟尿嘧啶、环磷酰胺等药物；另外还包括抗肿瘤抗生素，例如阿霉素、紫杉醇类、紫杉烷类等。所述辅助抗癌药物多为调节内环境的内分泌治疗药物，如阿那曲唑、芳香化酶抑制剂等。所述分子靶向药物大部分情况可破坏肿瘤细胞的血管，使肿瘤细胞缺乏供血，饿死癌细胞；另外部分分子靶向药物是将癌细胞表面生长信号封闭，达到肿瘤细胞无法启动生长的目的。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地将纳米颗粒为基础的光热治疗与免疫治疗结合起来，建立了一种新的有效的个性化光纳米疫苗，即使用外泌体作为携带黑磷量子点和肿瘤特异性抗原的有效载体。其优势包括：(1)该光纳米疫苗具有长血循环效应，且外泌体可以保护黑磷量子点，避免其快速生物降解；(2)免疫原性诱导，肿瘤细胞的外泌体携带多种肿瘤抗原，可作为抗原载体作用于树突状细胞(DCs)和主要的细胞毒性T淋巴细胞，并对肿瘤产生免疫应答；(3)靶向性选择，外泌体含有细胞膜，可通过一系列表面粘附蛋白和载体配体(如整合素、CD11b和CD18受体)附着于靶细胞，并将有效载荷传递到靶细胞。外泌体可携带在母细胞膜中发现的细胞类型特异性蛋白，如来自少突胶质细胞的髓鞘蛋白和来自外泌体中肿瘤细胞的特异性抗原，具有独特的归巢选择性。与单纯的黑磷量子点相比，本发明所涉及的光纳米疫苗具有更好的体内长期稳定性、光热转换性和肿瘤靶向性；此外，其对肿瘤具有的显著治疗效果，并促进了肿瘤组织T淋巴细胞的浸润，是一种创新的用于治疗癌症的光纳米疫苗。
附图说明
图1是实施例1中实验组和对照组的人肺癌抗原MUC1和上皮细胞粘附分子EpCAM表达结果图；
图2是实施例1中实验组和对照组的glypican-3(GPC3)表达结果图；
图3是实施例1中分离得到的外泌体的粒径分布图；
图4是实施例1中分离得到的外泌体的TEM图；
图5是实施例1中外泌体被DC细胞的摄取结果图；
图6是外泌体诱导形成CD8α+CD11c+的比例结果图；
图7是外泌体诱导DC细胞成熟的结果图；
图8是黑磷量子点的TEM图；
图9是黑磷量子点的高分辨TEM图；
图10是黑磷量子点的形态信息图；
图11是黑磷量子点的厚度信息图；
图12是黑磷量子点的拉曼光谱图；
图13是本发明所涉及的hEX@BP的透射电镜图；
图14是本发明所涉及的hEX@BP的透射电镜图；
图15是本发明所涉及的hEX@BP的粒径分布图；
图16是BPQD的装载效率与剂量关系图；
图17是肿瘤细胞对hEX@BP的摄取结果图；
图18是本发明所涉及的hEX@BP对U251(人神经胶质瘤细胞)、LLC(小鼠肺癌细胞)和4T1(乳腺癌细胞)的细胞毒性结果图；
图19是本发明所涉及的hEX@BP对LLC(小鼠肺癌细胞)的细胞毒性结果图；
图20是hEX@BP在808nm激光照射下的浓度依赖性温升曲线图；
图21是hEX@BP光热稳定性能表征图；
图22是实施例5中hEX@BP在肿瘤小鼠体内的荧光成像图；
图23是实施例5中hEX@BP在肿瘤小鼠中各组织中的荧光成像图；
图24是实施例5中肿瘤切片的荧光图；
图25是hEX@BP在注射后长期的PTT功效评价结果图；
图26是小鼠左侧足底注射hEX-DiR或hEX@BP-DiR后的荧光成像图；
图27是本发明所涉及的hEX@BP在治疗性疫苗治疗程序中肿瘤体积随时间的变化趋势图；
图28是本发明所涉及的hEX@BP在治疗性疫苗治疗程序中小鼠体重随时间的变化趋势图；
图29是本发明所涉及的hEX@BP在治疗性疫苗治疗程序中小鼠生存率随时间的变化趋势图；
图30是本发明所涉及的hEX@BP在预防性疫苗治疗程序中肿瘤体积随时间的变化趋势图；
图31是本发明所涉及的hEX@BP在预防性疫苗治疗程序中小鼠体重随时间的变化趋势图；
图32是本发明所涉及的hEX@BP对IFN-γ的分泌水平影响结果图；
图33是本发明所涉及的hEX@BP对IL-2的分泌水平影响结果图；
图34是本发明所涉及的hEX@BP对IL-6的分泌水平影响结果图；
图35是本发明所涉及的hEX@BP对TNF-α的分泌水平影响结果图；
图36是本发明所涉及的hEX@BP对IL-10的分泌水平影响结果图；
图37是本发明所涉及的hEX@BP对CD4+T细胞比例影响结果图；
图38是本发明所涉及的hEX@BP对CD8+T细胞比例影响结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中涉及到的动物实验得到伦理委员会批准(暨南大学)，根据动物福利委员会批准的标准指导方针进行的动物实验(暨南大学，中国)。
除另有说明外，以下实施例的所有数据均以平均值±标准差表示。治疗组和对照组之间的统计学差异通过使用SPSS 22.0版软件(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)进行单因素或双因素方差分析和Tukey事后检验(多重比较)。生存资料采用log-rank检验。*表示差异有统计学意义，p<0.05；**，p<0.01；和***，p<0.001。
实施例1
分离外泌体及相关评价
(1)建立肺癌小鼠模型和肝癌小鼠模型
分别在雌性C57BL/6小鼠皮下(s.c.)注射5×105肝肿瘤细胞(Hepa1-6细胞)，在雌性C57BL/6小鼠皮下(s.c.)注射5×105肺肿瘤细胞(LCC细胞)，在雌性BALB/C裸鼠皮下(s.c.)注射5×106人肺肿瘤细胞(H1975细胞)，10天后，肿瘤体积达到200-300mm3，LCC肺癌小鼠模型、H1975肺癌小鼠模型和Hepa1-6肝癌小鼠模型成功建立。
(2)光热治疗
在Hepa1-6肿瘤模型和H1975肿瘤模型的小鼠瘤内注射黑磷(BP)纳米颗粒，1h后，小鼠被麻醉，肿瘤区域使用808nm的激光辐照(1W/cm2)10min，第二天重新进行第二次肿瘤光疗，此为实验组(n＝20)，以没有经过光热治疗的疾病模型小鼠为对照组(n＝20)。
(3)分离外泌体(用EX或hEX表示，前者为未热疗分离的，后者为热疗后分离的)
24h后分离小鼠全血，3000g离心15min，取细胞及细胞碎片，取血浆。采用超离心法分离血浆中的外泌体。超离心法具体为：血浆先以1000g离心10min，然后以10000g离心30min。收集上层清液，0.22μm滤膜过滤(SLGP033RS，Merck Millipore，Billerica，MA，USA)，然后在10万g超离心作用1h。外泌体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，10万g离心1h回收。富含外泌体的部分用PBS洗涤两次，并在-80℃保存。
(4)蛋白样品制备，SDS-PAGE和western blotting
利用RIPA裂解缓冲液(P0013B，Byotime)从外泌体中提取总蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒(P0010，Byotime)检测浓度。然后进行SDS-PAGE和western blotting。样本(包含10μg总蛋白和1×加样缓冲液)被标准的SDS-PAGE分离，其后用考马斯亮蓝染色或样本转到聚乙二烯二氟化膜(Millipore)。这些膜与MUC1(16564S；1:1000，Cell SignallingTechnology，CST)、EpCAM(14452S；1:1000，CST)、GPC3(ab95363；1:1000，Abcam)、CD63(ab217345，ab134045；1:1000，Abcam)、CD9(ab92726；1:1000，Abcam)抗体4℃过夜。接下来，用适当的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔IgG或HRP标记的抗小鼠二抗室温孵育膜1小时，用增强型化学发光试剂(Applygen)检测反应条带。
肺癌(H1975)小鼠模型的结果如图1所示：与对照组小鼠相比，实验组可检测到更加丰富的人肺癌抗原MUC1和上皮细胞粘附分子EpCAM表达。
肝癌(Hepa1-6)小鼠模型的结果如图2所示：与对照组小鼠相比，实验组可检测到更加丰富的glypican-3(GPC3)表达。说明从经过热疗的肿瘤小鼠体内分离到的分泌体携带有更多的肿瘤特异性抗原。
分别用DLS和TEM(透射电镜)分析肺癌模型组分离的外泌体的大小和形态分布，由图3和图4所示：外泌体的大小(中位径100nm)均匀，形态相似。
树突状细胞(DC)是一组异质化细胞，研究表明CD8α+DC有能力参与Th1细胞的分化和CD8+T细胞抗原提呈，在激活免疫反应中这是很重要的策略。为了测试外泌体是否能被DCs吸收，使用热疗肺癌(LLC)小鼠模型来源的外泌体与DCs共孵育，并在共孵育24h后检测细胞摄取情况。荧光成像图如图5所示(细胞核用Hoechst(蓝色)染色，外泌体用DiR(红色)染色)：内化的DiR标记的外泌体在外观上是分布于核周并呈点状。
为了分析外泌体对未被DiR染色的DC细胞分化和成熟的影响，我们以GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)培养的DC细胞为阳性对照组，以单纯的DC细胞对空白对照组，以未经过热疗分离出的外泌体培养的DC细胞为阴性对照组，以经过热疗分离出的外泌体培养的DC细胞为实验组，利用细胞流式术探究各条件下DC细胞分化和成熟情况，采用Flow-jo软件进行统计和分析。由图6可知：与各对照组比较，光热治疗肿瘤小鼠内的外泌体诱导CD8α+CD11c+的比例增加；由图7可知：与各对照组比较，光热治疗肿瘤小鼠内的外泌体最能诱导DC成熟，表现出最高的CD8α以及CD80和CD86的表达，这表明经热疗后肿瘤小鼠中分离的分泌体能够激活DCs，具有高的免疫原性。
实施例2
黑磷量子点(用BPQDs表示)的合成及相关评价
采用简单的液相去角质法制备黑磷量子点，将100mg的黑磷晶体和50mL的异丙醇混合在一个60mL的棕色瓶子里。在浴超声48h(360W)后，以9000rpm离心30min。收集上清液并18000rpm下离心浓缩。然后，将分散物在真空炉中干燥24h。制备好的黑磷量子点保存在氩气手套箱中，不需要光照。
用TEM(FEI Tecnai G2 spirit，80kv)测定BPQDs的形态和尺寸，如图8所示：黑磷量子点外观呈球形，形态分布均匀，粒径2.8±1.6nm。高分辨率TEM图像如图9所示：显示BP晶体(041)平面的0.224nm的晶格条纹。将BPQDs分散在IPA中，滴在Si/SiO2衬底上，通过AFM测量BPQDs，获得形态信息(如图10所示)和厚度信息(如图11所示，此图为图10所示线的高度剖面图，图中line1和line2分别为图10中线性标记区域)。采用拉曼光谱法(InVia反射共焦拉曼显微镜)测定了BPQDs的拉曼光谱，如图12所示。
实施例3
制备光纳米疫苗及相关评价
采用超声法制备光纳米疫苗(用hEX@BP表示)：将100μg/mL的黑磷量子点和实施例1LCC肺癌小鼠模型分离得到的分泌体在PBS中搅拌(hEX与BPQDs的质量比为10:1)。然后，将混合物超声6个周期，每个周期30s，共3min，2min的冷却时间，最终使BPQD加载到外泌体中(hEX@BP)。
对制得的hEX@BP进行透射电镜(TEM)表征，如图13和图14所示：hEX@BP表现出良好的球形和均匀的尺寸，且清晰可见黑磷量子点被外泌体包覆。用DLS测量hEX@BP的粒径，如图15所示：平均水动力尺寸为100nm左右。此外，我们还考察了BPQDs在hEX中的装载效率，结果如图16所示：BPQD的装载效率与剂量有关，当投料比达到1:5时，包覆BPQDs的重量是hEX的8倍以上。
实施例4
光纳米疫苗光热效应和体外生物相容性评价
用DiR和Calcein-AM分别标记外泌体和细胞质，将LLC和Hepa1-6细胞与hEX@BP(LCC肺癌小鼠模型和Hepa1-6肝癌小鼠模型)孵育4h后，用Hoechst、Calcein染细胞，DiR标记hEX@BP，结果如图17所示：显示肿瘤细胞可以有效吸收hEX@BP(图中Merge表示重叠图，标尺为25μm)。
将U251(人神经胶质瘤细胞)、LLC(小鼠肺癌细胞)和4T1(乳腺癌细胞)种在96孔板(2×104细胞)中，在完全培养基中培养12h后，细胞培养基替换为100mL含有不同浓度的实施例3中hEX@BP的H-DMEM(内部BPQDs浓度为0、5、10、25、50和100μg/mL)，重复四个样本，24h后用CCK-8法测定细胞活力，不经任何处理将细胞活力归一化至对照组，计算细胞生长抑制率：细胞活力(％)＝(处理组细胞活力平均值/对照组细胞活力平均值)×100％。结果如图18所示：在100μg/mL浓度下hEX@BP的细胞毒性很小，几乎可以忽略不计(图中柱形从左至右依次为U251、LLC和4T1组)。
将LLC细胞与上述hEX@BP在不同浓度(0、5、10、25、50、100μg/mL)孵化4h，然后暴露在波长808nm的激光中(1.0W/cm2，10min)，然后用吖啶橙(AO，绿色荧光指示活细胞)和碘化丙啶(PI，红色荧光指示死细胞)对LLC细胞进行荧光染色，以测定辐照后细胞的活力。结果如图19所示：随着hEX@BP浓度的增加，大部分LLC细胞被光热消融逐渐杀死，用红色荧光标记的死亡细胞数量也随之增加(图中标尺为25μm)。
我们还探究了hEX@BP(1mL，分散在PBS中)在808nm激光照射(1W/cm2)下的浓度依赖性温升曲线，如图20所示：在808nm激光照射下，hEX@BP色散可在10min内上升到近50℃，表现出良好的光热性能。此外，光稳定性对于光热剂来说也是至关重要的，所以我们设置了6个循环，如图21所示：hEX@BP色散在每个循环中经历了10min的808nm激光照明和自然冷却，温度升高的衰减可以忽略不计，说明hEX@BP具有良好的光热稳定性，可以计算出hEX@BP的光热转换效率为23.2％。
综上，本发明所涉及的光纳米疫苗hEX@BP具有显著的体外生物相容性和光热效应，可以促进癌细胞的光触发消融。
实施例5
光纳米疫苗对肿瘤和淋巴结的靶向性评价
通过静脉注射常用的近红外荧光染料DiR标记的外泌体(hEX-DiR和hEX@BP-DiR)，检测Balb/c裸小鼠的LLC诱导肺癌的生物分布，并进行荧光成像检测。具体操作为：Balb/c裸小鼠背部右侧注入5×105LLC肿瘤细胞，第10天将荷瘤BALB/c小鼠分三组，分别静脉注射生理盐水、hEX-DiR(0.5mg/kg hEX)和hEX@BP-DiR(5mg/kg BP，0.5mg/kg hEX)。在注射后预定的时间点，使用荧光(Xenogen IVIS-Spectrum)成像系统进行全身成像，如图22所示，在注射后24h，从肿瘤中可以观察到相当大的荧光，可以明确地从其他组织中勾画出皮下肿瘤；注射后48h，肿瘤内的荧光强度逐渐增强，说明外泌体可以在肿瘤部位持续积累。48h后，将荷瘤小鼠安乐死，主要器官(心、肝、脾、肺、肾、肿瘤)进行体外成像，并对肿瘤及主要器官每克组织的荧光强度(平行测试3次)进行统计，如图23所示(图中从左到右，从上到下依次为心、肝、脾、肺、肾、肿瘤)：得到与上述相同结论。肿瘤被临时冻结并切成10μm切片，切片用10％中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，整个肿瘤切片使用DAPI标记所有肿瘤细胞的细胞核。肿瘤切片的荧光图像在Leica DM4000B荧光显微镜上观察，如图24所示：显示细胞核(DAPI染色，蓝色显示)和外泌体(红色显示)明显共域化，证实了外泌体(hEX和hEX@BP)在肿瘤细胞内的有效穿透。
此外，我们进行了动物实验，以评价hEX@BP在注射后长期的PTT功效。静脉注射hEX@BP和裸BPQDs(5mg/kg)，ΔT被热监控。1天之后，ΔT在生理盐水对照组仅有9℃，而BPQD和hEX@BP治疗组分别为17.8和30.5℃(如图25所示)。再7天后，测量ΔT，结果表明：即使在7天之后，ΔT在BPQD组和hEX@BP组分别达到10℃和20℃，表明hEX@BP在注射后长期的PTT功效。
同时，在小鼠左侧足底注射hEX-DiR或hEX@BP-DiR，注射后6h，用体内荧光成像技术观察小鼠的迁移情况。结果如图26所示：hEX-Dir或hEX@BP-Dir均能有效迁移至淋巴结，与抗原呈递细胞(APCs)相互作用，这对诱导的免疫应答有重要影响。
实施例6
光纳米疫苗对肿瘤的治疗效果评价
治疗性疫苗治疗程序：肿瘤接种后9天(5×105LLC细胞/小鼠)，C57BL/6小鼠被随机分为三组(每组6只)，静脉注射接种100μL不同的疫苗配方：PBS(对照组)；hEX@BP(5mg/kgBP和0.5mg/kg hEX)；hEX@BP+NIR(每只小鼠的hEX@BP为5mg/kg BP和0.5mg/kg hEX，采用近红外照明，1W/cm2，8min)，在接种肿瘤细胞后第9天和第16天分别给予两次PTT治疗，治疗后每隔1天测量肿瘤大小，计算公式为：体积＝(宽)2×长×0.5。
肿瘤体积曲线图如图27所示：hEX@BP纳米疫苗能有效抑制肿瘤早期生长，另外两组(PBS单独处理或hEX单独处理)的肿瘤随后迅速生长，导致LLC细胞接种后15-25天内所有小鼠死亡；不同治疗后随时间体重变化曲线图如图28所示；小鼠的生存情况如图29所示：80％的小鼠在联合治疗后肿瘤消失，并在肿瘤细胞接种后第40天存活。表明我们开发的外泌体包被的BPQD纳米疫苗联合PTT治疗可能是一种很有吸引力的癌症免疫联合治疗策略。
预防性疫苗治疗程序：C57BL/6小鼠随机分为四组(每组5只)，静脉注射接种三次(间隔一个星期)，静脉注射不同的疫苗配方分别是：100μL PBS(对照组)；PBS溶液中裸BPQDs(每只小鼠5mg/kg BP)；hEX@BP(每只小鼠5mg/kg BP和0.5mg/kg hEX)；hEX@BP(每只小鼠5mg/kg BP和0.5mg/kg hEX)。在最后一次接种后7天，将5×105LLC细胞皮下注射到每只小鼠的右侧。接种肿瘤9天后，第4组小鼠接受近红外照射(1W/cm2，8min)，每隔1天测量肿瘤大小，计算公式为：体积＝(宽)2×长×0.5。当肿瘤体积达到1500mm3时处死小鼠。
如图30所示：与对照组(PBS)相比，免疫组和基于BP的PTT治疗组仅能部分抑制肿瘤的进展，与其他三组相比，hEX@BP+NIR组小鼠同时接种了hEX@BP疫苗和基于BP的PTT疫苗后，肿瘤生长明显延迟，且无体重异常变化(如图31所示)，这可能是由于hEX@BP诱导的免疫刺激作用和近红外肿瘤消融所致。
实施例7
基于hEX@BP的光热消融诱导免疫系统的激活评价
本发明所涉及的光纳米疫苗hEX@BP的高负载量、高效的细胞摄取和良好的抗肿瘤效果促使我们在体内进一步研究其潜在的免疫佐剂性能。用实施例6的治疗性疫苗程序处理C57BL/6小鼠，在最后一次治疗7天后，所有小鼠均被处死，并切除脾脏。
(1)脾捣碎，经过70μm细胞过滤器，并使用10mL的红细胞溶解液裂解红细胞30min。PBS洗两次，在1200rpm离心2min，以1×107细胞的密度接种于6孔板中，2mL 1640完全培养基，培养3天。上清液中细胞因子的检测使用鼠interferon-γ(IFN-γ，430807)，白细胞介素-2(IL-2，431007)，白细胞介素-6(IL-6，431307)，白细胞介素-10(IL-10，431417)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Biolegend)。结果如图32-图36所示：hEX@BP治疗组在808nm近红外光谱辐照相对于其他群体使得IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α的分泌水平大大提高，对分泌的IL-10水平并没有显著变化。与此同时，我们发现hEX@BP免疫没有近红外光谱辐照也引发了如IL-2/6和TNF-α细胞因子的分泌。
(2)通过荧光激活细胞分选(FACS)分析，进一步检测脾脏中CD4+T细胞(CD3e+CD4+作为标记)和CD8+T细胞(CD3e+CD8+作为标记)的频率。用抗小鼠CD3e-APC抗体、抗小鼠CD4-FITC抗体、抗小鼠CD8-PE抗体(均购自美国eBioscience公司)对分离的细胞进行染色，流式细胞术分析，并使用FlowJo软件分析，定量分析各组脾脏CD3e、CD4+、CD8+T细胞比例(n＝3)，结果如图37-38所示：在808nm NIR照射下免疫hEX@BP的小鼠CD4+和CD8+T细胞的频率高于其他各组，同时，与对照组相比，未近红外照射的hEX@BP组脾脏CD8+T细胞比例明显升高，说明hEX@BP单独在体内激活免疫系统是有效的。
综上结果表明，PTT可以增加炎症细胞的浸润，如CD4+T细胞和CD8+T细胞。此外，hEX@BP介导的PTT与免疫应答的协同作用较单独的hEX@BP介导的免疫应答有更好的协同免疫增强作用。综上所述，这些结果表明hEX@BP介导的PTT联合疫苗增强了对肿瘤的反应。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种用于癌症治疗的光纳米疫苗及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种用于癌症治疗的光纳米疫苗，其特征在于，所述光纳米疫苗包括黑磷量子点和外泌体，所述黑磷量子点包裹于所述外泌体中；
所述黑磷量子点与外泌体的质量比为1:(8-12)；
所述光纳米疫苗的制备方法包括如下步骤：
(1)分离外泌体和合成黑磷量子点；
(2)将步骤(1)制得的黑磷量子点加载到外泌体中，得到所述用于癌症治疗的光纳米疫苗；
其中，步骤(1)所述分离外泌体的方法为：对肿瘤患者进行光热治疗，取血浆并从血浆中分离出外泌体；
所述进行光热治疗的方式为：在肿瘤内注射黑磷纳米颗粒，使用近红外激光辐照肿瘤区域。
2.如权利要求1所述的用于癌症治疗的光纳米疫苗，其特征在于，所述癌症包括肺癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、淋巴癌、食管癌、胃癌或结肠癌。
3.如权利要求1-2中任一项所述的用于癌症治疗的光纳米疫苗，其特征在于，所述外泌体为肿瘤细胞的外泌体。
4.如权利要求3所述的用于癌症治疗的光纳米疫苗，其特征在于，所述外泌体为经消融后的肿瘤细胞的外泌体。
5.如权利要求4所述的用于癌症治疗的光纳米疫苗，其特征在于，所述从血浆中分离出外泌体采用超离心法。
6.如权利要求5所述的用于癌症治疗的光纳米疫苗，其特征在于，步骤(1)所述合成黑磷量子点的方法为液相去角质法；
所述液相去角质法包括：将黑磷晶体与异丙醇混合后进行浴超声，离心，上清液浓缩并干燥；
所述黑磷晶体与异丙醇的比例为(1.5-2.5)mg/mL；
所述浴超声的时间为45-50h；
所述浴超声的功率为340-380W；
所述离心为在(8000-10000)rpm下离心20-40min。
7.如权利要求4-6中任一项所述的用于癌症治疗的光纳米疫苗，其特征在于，步骤(2)所述将黑磷量子点加载到外泌体中的方法包括：将黑磷量子点、外泌体和PBS液混合搅拌，超声，冷却；
所述超声的时间为2.5-3.5min；
所述冷却的时间为1.5-2.5min。
8.如权利要求1-7中任一项所述的用于癌症治疗的光纳米疫苗在制备用于癌症治疗或癌症预防的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括药剂学上的可接受的任意一种剂型。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药剂学上可接受的药用辅料中的任意一种或至少两种的组合。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述药物还包括分子靶向药物。
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CN111406068A (zh) 2017-05-16 2020-07-10 约翰霍普金斯大学 MANAbody及使用方法
CN112294840B (zh) * 2020-11-02 2024-04-12 深圳北京大学香港科技大学医学中心 二维纳米材料血管斑块清除剂、m2型巨噬细胞诱导剂和细胞自噬调节剂
CN113730579A (zh) * 2021-09-30 2021-12-03 太原理工大学 一种由细胞蛋白包裹的黑磷及其制备方法
CN115154656B (zh) * 2022-06-16 2023-11-17 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架及其制备方法及应用

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106267201B (zh) * 2016-08-26 2018-05-01 深圳先进技术研究院 一种聚合物包裹的黑磷及其制备方法与应用
US10800817B2 (en) * 2016-12-19 2020-10-13 Morehouse School Of Medicine Compositions and methods for treating diseases by inhibiting exosome release
CN109432427A (zh) * 2018-12-25 2019-03-08 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 以外泌体为载体的肿瘤靶向热疗材料的制备方法及其产品
CN110320260B (zh) * 2019-07-27 2021-07-30 福建师范大学 基于MXenes和黑磷量子点增强的外泌体电致化学发光传感器

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