CN115154656B - 一种黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架及其制备方法及应用 - Google Patents
一种黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架及其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架及其制备方法及应用。本发明采用装载了CD47抗体和免疫佐剂CpG的微纳米生物活性玻璃材料作为基相,具有光热效应的BP作为添加相,通过冷冻干燥法制备出可植入BP/BG复合多孔支架。本发明制备的复合支架具有多孔结构,适合血管在支架内生长;在近红外光照射下可以导致肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡,并可增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用,植入后可以促进树突状细胞的成熟,促进肿瘤相关巨噬细胞从抑制肿瘤免疫的M2型转变为促进肿瘤免疫的M1型,具有良好的预防肿瘤复发和转移的效果。
Description
技术领域
本发明属于骨肿瘤损伤修复医用材料技术领域,具体涉及一种黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架及其制备方法及应用。
背景技术
骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤,易早期转移、治愈率低。目前骨肉瘤的主要治疗手段是手术辅助化疗,虽然一定程度上改善了预后,但仍存在术后复发和转移率高的问题,且在转移性或复发性肿瘤患者中,长期生存率低于30%。另一方面,骨肉瘤手术中肿瘤组织的广泛切除通常会造成较大的骨缺损,这使得骨肉瘤的术后治疗面临修复无法自愈的巨大骨缺损和防治残留肿瘤复发和转移的双重挑战。构建同时具有促进骨再生和肿瘤治疗双重功能的可植入支架有望解决以上两个问题。
近年来关于双重功能支架的研究集中在将骨修复材料与光热剂或化疗药物结合构建的复合支架上,这些研究表明双功能支架能清除支架植入部位残留的部分肿瘤,并在一定程度上达到骨修复和肿瘤治疗的双重效果。现有技术中,中国专利CN10993926A公开了一种多巴胺改性纳米粉体并嵌入有机物的多孔抗肿瘤骨修复双功能复合支架及其制备方法,采用多巴胺修饰微纳结构羟基磷灰石,提高纳米羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖混合时的分散性,制得的多孔抗肿瘤骨修复双功能复合支架不仅具有骨修复功能,并且在近红外光照射下有良好的光热效应,具有良好的抗肿瘤效果。现有专利技术中,中国专利CN108079383A也公开了一种光热抗肿瘤壳聚糖-纳米羟基磷灰石-碳量子点支架、其制备方法及应用,利用碳量子点的光热效应和羟基磷灰石成骨性能制备光热骨修复支架。但这两种专利技术中的双重功能支架只对部分与支架接触的残留肿瘤细胞有杀灭效果,对已经发生转移的肿瘤无效。骨修复支架与光热治疗结合仍无法有效抑制肿瘤转移和治疗转移的骨肉瘤,这仍然是骨肉瘤术后困扰临床的关键瓶颈问题。
发明内容
为解决相关问题,本发明的首要目的在于提供一种黑磷/生物活性玻璃(BP/BG)抗肿瘤骨修复双功能复合支架的制备方法。
本发明采用装载了CD47抗体和免疫佐剂CpG的微纳米生物活性玻璃(MNBG)材料作为基相,具有光热效应的黑磷(BP)作为添加相,通过冷冻干燥法或3D打印制备出可植入BP/BG复合多孔支架。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的抗肿瘤骨修复双功能复合支架。
本发明的另一目的在于提供上述抗肿瘤骨修复双功能复合支架的应用。在骨肉瘤术后局部植入本发明提供的BP/BG复合支架后,1)BP光热杀伤残留肿瘤细胞释放的肿瘤抗原与支架释放的CpG佐剂可作为原位肿瘤疫苗激活肿瘤抗原特异性T细胞免疫;2)BG支架植入后可致局部pH值上升,促进肿瘤相关巨噬细胞(TAM)向M1极化,消除TAM的免疫抑制作用,为T细胞发挥作用提供良好的免疫微环境;3)支架对CD47抗体具有良好的缓释性能,缓释的CD47抗体可增强巨噬细胞对肿瘤抗原的吞噬作用,促进抗原提呈,启动T细胞介导的免疫反应;最终达到促进抗肿瘤免疫反应,防止肿瘤在手术部位复发,以及残余肿瘤细胞的转移,提高术后存活率的目的,4)复合支架中的BG和BP均可促进骨组织再生。
为了实现上述发明目的,本发明采用以下技术方案:
一种黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架的制备方法,包括以下步骤:
步骤(1):将生物活性玻璃颗粒分散于水中,超声破碎处理,使粉体混合均匀,得到生物活性玻璃溶液;
步骤(2):将明胶溶于水中,搅拌均匀,得到明胶溶液;
步骤(3):将生物活性玻璃溶液和明胶溶液混合,向混合液中加入黑磷纳米片(BPNSs),持续搅拌;
步骤(4):向混合液中继续加入CD47抗体和免疫佐剂CpG,持续搅拌;
步骤(5):向混合液中继续加入交联剂,搅拌后倒入模具中;
步骤(6):制得的样品经陈化,冻干,即获得所述的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架。
在上述技术方案中,明胶、黑磷和生物活性玻璃均具有良好的生物相容性,而且生物活性玻璃和明胶构成的骨修复生物材料在体内、外均具有良好的骨修复作用;进一步地,由于黑磷纳米片的加入,使得本发明的明胶-生物活性玻璃-黑磷支架具有近红外光照射下产生光热效应的性能,从而使支架具有抗肿瘤性。进一步地,复合支架在光热效应杀死的肿瘤细胞产生的肿瘤相关抗原,以及支架中所载的免疫佐剂CpG的作用下,可以作为原位肿瘤疫苗,产生特异性抗肿瘤免疫。进一步地,复合支架具有促进肿瘤相关巨噬细胞(TAM)向M1极化的作用,且支架所负载的CD47抗体可以重新唤醒TAMs的吞噬作用,促进免疫系统杀伤肿瘤的效果。
明胶和生物活性玻璃的选择是发明人通过大量的创造性试验从众多材料中筛选得到的,发明人发现两者联合使用可以有效的弥补各自的不足。发明人在研究中发现单纯使用生物活性玻璃制备得到的支架脆性大,单纯使用明胶制备得到的支架强度不足,而明胶和生物活性玻璃的联合使用具有协同增效的作用,可有效降低支架的脆性,提高支架强度,从而使得复合光免疫抗肿瘤骨修复支架的性能更优。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(1)中,生物活性玻璃颗粒采用十二胺作为模板剂和还原剂,通过溶胶-凝胶法制备而成,其化学组成为:SiO2:CaO:P2O5=80:15:5(摩尔比);优选通过如下步骤制备得到:将4g十二胺(DDA)溶于25mL去离子水和80mL无水乙醇中,恒温搅拌10min;向该溶液中依次加入配方量的正硅酸四乙酯(TEOS),磷酸三乙酯(TEP)和四水合硝酸钙(CN),每种组分加入后搅拌30min后再加入下一种,继续搅拌3h直至完全溶解;静止陈化24h后,离心去除上清,去离子水和无水乙醇交替洗三次,冻干,最后放入马弗炉中,650℃热处理3h,得到生物活性玻璃颗粒,备用。该方法制备的生物活性玻璃颗粒具有微纳米的粒度分布。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(1)中,生物活性玻璃溶液中生物活性玻璃浓度为10~20wt%。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(1)中,超声破碎处理的条件为功率600W、时间30min。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(2)中,明胶溶液中明胶浓度为20%~25%(w/v)。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(2)中,搅拌的时间为30min。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(3)中,生物活性玻璃溶液和明胶溶液的配比,以生物活性玻璃颗粒与明胶的质量比为2~2.5:0.5~1计;优选为以2.1:0.9计。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(3)中,加入的黑磷纳米片终浓度为100~500μg/mL;优选采用超声液相剥离法制备得到,具体制备步骤如下:采用NMP(N-甲基吡咯烷酮)作为分散剂,采用超声液相剥离法制备黑磷纳米片,探头超声功率为600W,时间为6小时;探头超声后的混合物继续置于水浴超声6小时;最终将超声后的产物7000rpm离心30min后重悬于去离子水中,备用。当加入的黑磷纳米片终浓度低于100μg/mL时,光热效果不佳,当加入的黑磷纳米片终浓度高于500μg/mL光热效果太强。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(3)中,持续搅拌的时间为30min。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(4)中,以生物活性玻璃颗粒的质量为2.1g计,CD47抗体的加入量为1~1.5mg,免疫佐剂CpG的加入量为200~300μg。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(4)中,持续搅拌的时间为10min。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(5)中,交联剂为京尼平或戊二醛,优选为1%(w/v)京尼平或1%(w/v)戊二醛,以生物活性玻璃颗粒的质量为2.1g计,交联剂的用量为2~3ml;优选为2.25ml。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(5)中,搅拌的时间为20min。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(5)中,模具可为培养板,例如96孔培养板。
作为对上述技术方案的进一步改进,所述步骤(6)中,陈化的条件为温度4℃、时间1~3天;冻干的条件为温度-80℃、时间12~30h,优选为24h。24h时既能保证混合液彻底冻干,同时制成的多孔结构更为稳定,适宜。
一种抗肿瘤骨修复双功能复合支架,通过上述制备方法得到。
上述抗肿瘤骨修复双功能复合支架在制备抗肿瘤骨修复材料中的应用。
进一步地,所述的肿瘤为骨肉瘤。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明制备的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架具有多孔结构,孔径大小主要在200μm左右,适合血管在支架内生长,且生物活性玻璃在支架中均匀分布;
(2)本发明的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架的制备方法,加入黑磷纳米片过程简单,使支架在近红外光照射下具有光热效应;
(3)本发明制备的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架在近红外光照射下可以导致肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡,并可增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用;
(4)本发明制备的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架应用于体外的荷瘤小鼠模型,植入后可以促进树突状细胞的成熟,促进肿瘤相关巨噬细胞从抑制肿瘤免疫的M2型转变为促进肿瘤免疫的M1型,具有良好的预防肿瘤转移的效果。
附图说明
图1为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架的扫描电镜图;
图2为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架与明胶支架的力学性能测试结果图;
图3为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架在pH6.0和pH7.4的PBS中aCD47的释放随时间的变化曲线图;
图4为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架在808nm近红外激光(功率密度0.33W/cm2)照射5min后的光热效果图;
图5为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架加入小鼠骨肉瘤细胞K7M2,在808nm近红外激光(功率密度0.33W/cm2)照射5min后,肿瘤细胞表面钙网蛋白(CRT)表达的流式细胞术检测结果图;
图6为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架与小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)对肿瘤细胞(K7M2)吞噬作用的结果图,其中control组和LPS组分别为阴性和阳性对照组;
图7为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架植入荷瘤小鼠后,在第1,3,5天分别用808nm近红外激光(功率密度0.33W/cm2)照射5min,第7天检测肿瘤组织中树突状细胞的成熟以及巨噬细胞极化的流式细胞术检测结果图;
图8为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架植入荷瘤小鼠后的肿瘤生长曲线图;
图9为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架植入荷瘤小鼠后的对肿瘤肺转移的抑制效果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中的生物活性玻璃颗粒采用十二胺(DDA)作为模板剂和还原剂,通过溶胶-凝胶法制备而成,其化学组成为:SiO2:CaO:P2O5=80:15:5(摩尔比),具体制备步骤如下:将4g十二胺(DDA)溶于25mL去离子水和80mL无水乙醇中,恒温搅拌10min。向该溶液中依次加入配方量的正硅酸四乙酯(TEOS),磷酸三乙酯(TEP)和四水合硝酸钙(CN),每种药品加入后搅拌30min后再缓慢加入下一种,继续搅拌3h直至完全溶解。静止陈化上述乳白悬浊液24h后,离心去除上清,去离子水和无水乙醇交替洗三次。最后将清洗后的白色凝胶放入冷冻干燥仪中冻干,得到干燥的未烧结的生物活性玻璃粉末,最后将粉体放入马弗炉中,650℃热处理3h,得到生物活性玻璃粉体,备用。
下述实施例中采用的BP NSs的具体制备步骤如下:采用NMP(N-甲基吡咯烷酮)作为分散剂,采用超声液相剥离法制备黑磷纳米片,探头超声功率为600W,时间为6小时;探头超声后的混合物继续置于水浴超声6小时;最终将超声后的产物7000rpm离心30min后重悬于去离子水中,备用。
实施例1
称取2.1g生物活性玻璃颗粒,分散于10ml超纯水中,通过探头超声破碎仪超声30min(功率600W),将粉体混合均匀。再称取0.9g明胶,溶于4ml超纯水中,搅拌30min。将生物玻璃溶液和明胶溶液混合,将BP NSs悬液加至混合液中,使BP NSs在混合液中的终浓度为250μg/mL,持续搅拌3小时。继续加入1mg CD47抗体和200μgCpG搅拌10min。最后向混合液中加入交联剂1%(w/v)京尼平2.25ml,搅拌20min后倒入96孔板中。将样品放置于4℃冰箱3天后,放入-80℃冻箱中冷冻过夜,使用冷冻干燥机冻干24h得到支架,即为黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架。
将所得的支架置于10ml PBS(pH7.4和pH6.0)中,放于120rpm,37℃摇床中,在一定时间点(2h,6h,12h,24h,48h,168h)取100μL上清液,1200rpm离心5min后,通过aCD47AbELISA检测试剂盒检测上清中释放的aCD47的浓度,并计算出释放百分比,得出在不同pH条件下支架中的aCD47释放的百分比随时间变化的曲线。其中释放百分比的计算方法为:释放百分比=(上清中释放的aCD47的浓度×PBS总体积)/支架中aCD47的总量×100%。
将所得的支架放于48孔细胞培养板中,加入0.3ml PBS,用808nm近红外激光(功率密度0.33W/cm2)器照射5min,用红外热像仪记录材料在光照后的温度变化情况。
用6孔板中培养1×105的小鼠骨肉瘤细胞株K7M2细胞过夜。轻轻放入灭菌的所得支架并激光照射5min,同时设置培养液、激光和所得支架组。收集各组细胞,用anti-CRT-Alexa Flour488抗体染色后流式细胞仪分析各组细胞CRT的表达情况。
小鼠骨髓来源巨噬细胞(BoneMarrow Derive Macrophage,BMDMs)的提取:从4-6周的BALB/c小鼠骨髓分离BMDCs。具体过程如下:将小鼠处死后取其胫骨和股骨,用1mL注射器吸取无血清培养基反复将骨髓冲出,直到骨髓变为白色。加入红细胞裂解液裂解骨髓中的红细胞,PBS清洗两次后重悬于含10ng/mL MCSF(Peprotech,USA)、20%FBS的高糖DMEM完全培养基中。尽量不动细胞,第三天不洗直接换液,第五天换液,第七天则可以视为成熟BMDM(M0)。
用Celltracker Red CM-DiI对BMDM进行染色,小鼠骨肉瘤细胞株K7M2细胞用Celltracker Green CMFDA染色。将支架置于24孔板中,加入癌细胞与BMDM细胞(K7M2:BMDM=1:1)在无血清培养基中共培养,在37℃温育2小时后,通过荧光显微镜研究BMEM细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。
所得的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架进行体内抗肿瘤效果检测实验,实验所用小鼠为4-6周龄雌性SPF级Balb/c小鼠。在小鼠接种肿瘤细胞前一天进行脱毛,提前培养好大量对数期K7M2肿瘤细胞,消化后用PBS配置成细胞浓度为1×107个/mL的肿瘤细胞悬液,在小鼠的皮下部注射100μL/只,持续观察肿瘤生长情况,待肿瘤体积到达300mm3后进行手术。所述肿瘤体积的计算方式为:肿瘤体积=1/2(长径×短径2)。将荷瘤小鼠随机分为5组,分别为:(1)GEL支架对照组、(2)GEL/CpG组、(3)GEL/CpG+aCD47组、(4)BG/GEL/CpG组、(5)BG/GEL/CpG-aCD47组。其中,除GEL支架对照组外,其他组的支架中均含有BPNSs,并进行激光照射,且每只小鼠植入的支架中CpG用量为10μg/只;BP NSs的用量为175μg/只。GEL/CpG+aCD47组和BG/GEL/CpG-aCD47组aCD47的用量为50μL/只。用1%戊巴比妥钠40mg/kg的用量麻醉小鼠。将肿瘤切除,留下约10%体积的残余肿瘤模拟手术中的残余肿瘤,将各组的支架植入手术床,其中第(2)(3)(4)(5)组小鼠在术后1、3、5天进行近红外光激光照射(0.33W/cm2,5min)。在各组治疗后第七天,将小鼠处死,取小鼠的肿瘤,I型胶原酶(1mg/mL)消化后加入各荧光标记的流式抗体(anti-mouse CD86,anti-mouse CD80,anti-mouse CD206,anti-mouse F4/80),利用流式细胞术检测树突状细胞的成熟以及巨噬细胞的极化情况。另一部分小鼠在术后21天处死,并取肿瘤组织和肺组织观察肿瘤的治疗效果以及肺转移情况。
图1为所得黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架的扫描电镜照片,由图1可知,所得双功能复合支架为多孔结构。
图2为所得黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架与明胶支架的力学性能测试结果图,由图2可知,所得双功能复合支架与单纯的明胶支架相比,具有更好的力学强度。
图3为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架在pH6.0和pH7.4的PBS中aCD47的释放随时间的变化曲线,由图3可知,所得双功能复合支架浸泡在不同pH的PBS中均有一定的缓释效果,其中在pH7.4的PBS中第7天释放百分比为18.5%,而在pH6.0时释放百分比增加到31.3%。
图4为所得黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架在808nm近红外光照射下的光热效果图,由图4可知,所得双功能复合支架浸泡在PBS中具有良好的光热效果,在0.33w/cm2,5min的近红外激光照射下温度可上升至80℃。
图5为所得黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架在0.33w/cm2,5min的近红外激光照射下导致肿瘤细胞免疫原性细胞死亡的效果,其中CRT曝露是免疫原性细胞死亡的主要标志,由图5可知,所得双功能复合支架在低功率的近红外光照射下肿瘤细胞表面钙网蛋白(CRT)的比例从3.65%上升到了15.84%,促进了肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡。
图6为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架与小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)对肿瘤细胞(K7M2)吞噬作用的结果图,其中control组和LPS组分别为阴性和阳性对照组,由图6可知,无LPS刺激时,巨噬细胞很少吞噬肿瘤细胞,在LPS的刺激下,巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用明显增强,所得双功能支架与阴性对照组相比,可以明显增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。
图7为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架植入荷瘤小鼠后,在第1,3,5天分别用808nm近红外激光(功率密度0.33W/cm2)照射5min,第7天检测肿瘤组织中树突状细胞的成熟以及巨噬细胞极化的流式细胞术检测结果图,其中CD80+CD86+的细胞代表成熟的树突状细胞,F4/80+CD86+的细胞代表M1型巨噬细胞,F480+CD206+的细胞代表M2型巨噬细胞,由图7可知,所得双功能支架植入后,成熟树突状细胞的比例从单纯明胶支架组的25.42%上升到了71.13%,M1型巨噬细胞的比例从单纯明胶支架组的9.33%上升到了39.69%,而M2型巨噬细胞从单纯明胶支架组的19.03%下降到了8.76%。
图8为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架植入荷瘤小鼠后的肿瘤生长曲线图,由图8可知,所得双功能支架与纯明胶支架相比,肿瘤体积明显缩小,体现出显著的抗肿瘤效果。
图9为实施例1制备得到的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架植入荷瘤小鼠后的对肿瘤肺转移的抑制效果图,由图9可知,所得双功能支架与纯明胶支架相比,肺转移结节明显减少,体出出显著的肿瘤肺转移抑制效果。
实施例2
称取2.1g生物活性玻璃颗粒,分散于10ml超纯水中,通过探头超声破碎仪超声30min(功率600W),将粉体混合均匀。再称取0.9g明胶,溶于4ml超纯水中,搅拌30min。将生物玻璃溶液和明胶溶液混合,将BP NSs悬液滴加至混合液中,使BP NSs的终浓度为100μg/mL,持续搅拌3小时。继续加入1mg CD47抗体和200μg CpG搅拌10min。最后向混合液中加入交联剂1%京尼平2.25ml,搅拌20min后倒入96孔板中。将样品放置于4℃冰箱3天后,放入-80℃冻箱中冷冻过夜,使用冷冻干燥机冻干24h得到支架,即为黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架。
本实施例制备的双功能复合支架浸泡在PBS中,在0.33w/cm2,5min的近红外激光照射下温度可上升至63℃。本实施例制备的双功能复合支架在低功率的近红外光照射下相对细胞活性为32.4%,具有良好的抗肿瘤活性。
实施例3
称取2.1g生物活性玻璃颗粒,分散于10ml超纯水中,通过探头超声破碎仪超声30min(功率600W),将粉体混合均匀。再称取0.9g明胶,溶于4ml超纯水中,搅拌30min。将生物玻璃溶液和明胶溶液混合,将BP NSs悬液滴加至混合液中,使BP NSs的终浓度为500μg/mL,持续搅拌3小时。继续加入1mg CD47抗体和200μg CpG搅拌10min。最后向混合液中加入交联剂1%京尼平2.25ml,搅拌20min后倒入96孔板中。将样品放置于4℃冰箱3天后,放入-80℃冻箱中冷冻过夜,使用冷冻干燥机冻干24h得到支架,即为黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架。
本实施例制备的双功能复合支架浸泡在PBS中,在0.33w/cm2,5min的近红外激光照射下温度可上升至90.2℃,本实施例制备的双功能复合支架在低功率的近红外光照射下相对细胞活性为0,具有良好的抗肿瘤活性。
实施例4
称取2.1g生物活性玻璃颗粒,分散于10ml超纯水中,通过探头超声破碎仪超声30min(功率600W),将粉体混合均匀。再称取0.9g明胶,溶于4ml超纯水中,搅拌30min。将生物玻璃溶液和明胶溶液混合,将BP NSs 7000rpm离心10min去除NMP后滴加至混合液中,使BP NSs的终浓度为250μg/mL,持续搅拌3小时。继续加入1mg CD47抗体和200μg CpG搅拌10min。最后向混合液中加入交联剂1%戊二醛2.25ml,搅拌20min后倒入96孔板中。将样品放置于4℃冰箱3天后,放入-80℃冻箱中冷冻过夜,使用冷冻干燥机冻干24h得到支架,即为黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架。
本实施例制备的双功能复合支架浸泡在PBS中,在0.33w/cm2,5min的近红外激光照射下温度可上升至59.6℃,相对于京尼平交联的支架,其光热性能明显下降。本实施例制备的双功能复合支架在低功率的近红外光照射下相对细胞活性为35.7%,具有良好的抗肿瘤活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤(1):将生物活性玻璃颗粒分散于水中,超声破碎处理,使粉体混合均匀,得到生物活性玻璃溶液;
步骤(2):将明胶溶于水中,搅拌均匀,得到明胶溶液;
步骤(3):将生物活性玻璃溶液和明胶溶液混合,向混合液中加入黑磷纳米片,持续搅拌;
步骤(4):向混合液中继续加入CD47抗体和免疫佐剂CpG,持续搅拌;
步骤(5):向混合液中继续加入交联剂,搅拌后倒入模具中;
步骤(6):制得的样品经陈化,冻干,即获得所述的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架;
所述步骤(1)中,生物活性玻璃颗粒的化学组成为摩尔比:SiO2 : CaO : P2O5 = 80 :15 : 5,通过如下步骤制备得到:将4g十二胺溶于25mL去离子水和80mL无水乙醇中,恒温搅拌10min;向该溶液中依次加入配方量的正硅酸四乙酯,磷酸三乙酯和四水合硝酸钙,每种组分加入后搅拌30min后再加入下一种,继续搅拌3h直至完全溶解;静止陈化24h后,离心去除上清,去离子水和无水乙醇交替洗三次,冻干,最后放入马弗炉中,650℃热处理3h,得到生物活性玻璃颗粒,备用;
所述步骤(3)中,所述的黑磷纳米片采用超声液相剥离法制备得到,具体制备步骤如下:采用N-甲基吡咯烷酮作为分散剂,采用超声液相剥离法制备黑磷纳米片,探头超声功率为600W,时间为6小时;探头超声后的混合物继续置于水浴超声6小时;最终将超声后的产物7000rpm离心30min后重悬于去离子水中,备用。
2.根据权利要求1所述的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架的制备方法,其特征在于:
所述步骤(1)中,生物活性玻璃溶液中生物活性玻璃浓度为10~20 wt %;
所述步骤(2)中,明胶溶液中明胶浓度为20%~25%w/v。
3.根据权利要求1或2所述的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架的制备方法,其特征在于:
所述步骤(3)中,生物活性玻璃溶液和明胶溶液的配比,以生物活性玻璃颗粒与明胶的质量比为2~2.5:0.5~1计;
所述步骤(3)中,加入的黑磷纳米片终浓度为100~500μg/mL。
4.根据权利要求1或2所述的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架的制备方法,其特征在于:
所述步骤(4)中,以生物活性玻璃颗粒的质量为2.1g计,CD47抗体的加入量为1~1.5mg,免疫佐剂CpG的加入量为200~300μg;
所述步骤(5)中,交联剂为京尼平或戊二醛。
5.根据权利要求1或2所述的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架的制备方法,其特征在于:
所述步骤(3)中,生物活性玻璃溶液和明胶溶液的配比,以生物活性玻璃颗粒与明胶的质量比为2.1:0.9计;
所述步骤(5)中,交联剂为1%w/v京尼平或1%w/v戊二醛,以生物活性玻璃颗粒的质量为2.1g计,交联剂的用量为2~3ml;其中,1%w/v表示100mL体积溶液中含有1g溶质。
6.根据权利要求1或2所述的黑磷/生物活性玻璃抗肿瘤骨修复双功能复合支架的制备方法,其特征在于:
所述步骤(1)中,超声破碎处理的条件为功率600W、时间30min;
所述步骤(2)中,搅拌的时间为30min;
所述步骤(3)中,持续搅拌的时间为30min;
所述步骤(4)中,持续搅拌的时间为10min;
所述步骤(5)中,搅拌的时间为20min;
所述步骤(6)中,陈化的条件为温度4℃、时间1~3天;冻干的条件为温度-80℃、时间12~30 h。
7.一种抗肿瘤骨修复双功能复合支架,其特征在于:通过权利要求1~6任一项中所述的制备方法得到。
8.权利要求7中所述的抗肿瘤骨修复双功能复合支架在制备抗肿瘤骨修复材料中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:
所述的肿瘤为骨肉瘤。
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