CN114259476A - 一种调控巨噬细胞的纳米制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种调控巨噬细胞的纳米制剂及其制备方法与应用,该纳米制剂包括纯药物IPI549纳米内核、核酸药物CpG和金属有机框架MOF,所述IPI549自组装形成纳米内核,鞣酸和铁配位作用形成金属有机框架包裹IPI549纳米内核,并包载核酸药物CpG形成多功能纳米制剂IPI549@MOF/CpG。本发明的纳米制剂,通过金属有机框架将亲水性IPI549和疏水性CpG实现共载并发挥协同作用,促进巨噬细胞复极化为M1型,然后通过CpG刺激M1型巨噬细胞增加摄取吞噬肿瘤细胞并且分泌细胞因子来实现抗肿瘤活性;另一方面,IPI549可以提高摄取肿瘤细胞后的巨噬细胞抗原提呈能力,来激发强有力的适应性免疫,该纳米制剂可与PD‑L1抗体协同作用引发强大的抗肿瘤免疫反应,为肿瘤免疫治疗提供新思路。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料和纳米生物医药领域,具体涉及一种调控巨噬细胞的纳米制剂及其制备方法与应用。
背景技术
免疫疗法是当今国际公认最有前景的肿瘤治愈手段之一,激活机体的免疫系统以攻击肿瘤细胞,相关免疫治疗药物也大量上市。但是目前临床统计数据显示,免疫治疗的疗效不尽如人意,不到30%的患者可以获益,其原因与肿瘤免疫抑制微环境(ITM)有关。肿瘤的免疫应答是一个连续的多环节过程,包括肿瘤抗原的释放、抗原提呈、效应T细胞的浸润以及T细胞对肿瘤细胞的攻击。以上过程属于串联过程,任意环节束缚都会影响肿瘤免疫的效应。然而,目前已上市的免疫治疗药物大多仅关注T细胞对肿瘤细胞的攻击,忽略了前面多个环节而导致治疗失败。实际上,T细胞攻击肿瘤细胞之前的多个免疫环节均由抗原提呈细胞(APC)完成,其主要职责是摄取并加工肿瘤抗原,将抗原提呈至T细胞以激活抗肿瘤效应。同时,APC还分泌多种细胞因子对肿瘤细胞直接杀伤,以及招募与激活T细胞。因此,APC是需要重点关注的免疫治疗靶标,也是提升免疫治疗疗效的重要前提。
巨噬细胞是肿瘤组织中含量最为丰富的APC,约占细胞总量的50%,在不同的刺激下可以分化成截然不同的表型:M1型或M2型。在肿瘤发生初期,巨噬细胞倾向于极化为M1型,发挥抗肿瘤作用。随着肿瘤的进展,ITM促进巨噬细胞极化为M2型的肿瘤相关巨噬细胞(TAM),协助肿瘤生长、侵袭与转移。因此,巨噬细胞的“沉默”和“叛变”引起抗肿瘤免疫级联反应的断裂,是导致免疫治疗失败的主因之一。极化的巨噬细胞是可塑的,在不同的处理方式下可以进行表型转换,如M2型巨噬细胞可以在某些刺激下逆转为M1型,以恢复其抗肿瘤活性。为此,人们开发了多种巨噬细胞靶向策略来调控,如巨噬细胞的消耗和抑制、巨噬细胞的再极化,以及增强其吞噬作用等。虽然抑制/消耗TAMs的策略已经产生了实际的临床影响,但重编辑巨噬细胞更具吸引力,因为可以以最小的副作用调节ITM,并协同免疫检查点阻断(ICB)来增强免疫治疗效果。尽管已有多种靶向TAM的智能纳米制剂,但目前仍需进一步开发一类简单的纳米制剂协同增强TAM的天然免疫与适应性免疫反应,从而高效启动肿瘤免疫应答,抑制肿瘤侵袭和迁移。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提出了一种调控巨噬细胞的纳米制剂及其制备方法与应用,其目的是构建一种纳米制剂,通过共载IPI549和CpG发挥协同作用以促进巨噬细胞复极化为M1型,然后通过CpG刺激M1型巨噬细胞增加摄取吞噬肿瘤细胞并且分泌细胞因子来实现抗肿瘤活性;另一方面,IPI549可以提高摄取肿瘤细胞后的巨噬细胞抗原提呈能力,来激发强有力的适应性免疫,协同作用引发强大的抗肿瘤免疫反应,为肿瘤免疫治疗提供新思路。
为了实现上述目的,本发明首先提供了一种调控巨噬细胞的纳米制剂,所述纳米制剂包括纯药物IPI549纳米内核、核酸药物CpG和金属有机框架MOF,所述IPI549自组装形成纳米内核,所述金属有机框架包裹IPI549纳米内核并包载核酸药物CpG形成纳米制剂IPI549@MOF/CpG,所述金属有机框架由鞣酸和铁配位作用形成。
作为优选,所述金属有机框架MOF、纯药物IPI549纳米内核和核酸药物CpG的质量比为30:5~30:1~5。
作为优选,所述纳米制剂为核壳结构,平均粒径为150~300nm。
基于一个总的发明构思,本发明还提供了一种调控巨噬细胞的纳米制剂的制备方法,包括以下步骤:
S1、在震荡超声条件下,将IPI549溶解于二甲基亚砜,随后加入大量的超纯水中,IPI549迅速成核生长,自组装形成纯药物IPI549纳米内核;
S2、在步骤S1中制得的IPI549纳米内核中加入鞣酸和FeCl3水溶液,超声2~10min后充分涡旋,鞣酸与Fe3+在IPI549纳米内核表面配位形成金属有机框架MOF,将IPI549纳米内核包裹,形成IPI549@MOF纳米粒;
S3、在步骤S2制得的IPI549@MOF纳米粒中加入CpG水溶液,室温下孵育30~60min,高速离心后弃去上清,取沉淀加入超纯水复溶,得到IPI549@MOF/CpG纳米粒。
作为优选,所述步骤S1中二甲基亚砜与超纯水的体积比为1:10~500。
作为优选,所述步骤S2中鞣酸与FeCl3的质量比为1~10:1。
基于一个总的发明构思,本发明还提供了一种调控巨噬细胞的纳米制剂在制备抑制肿瘤生长和转移药物中的应用。
作为优选,所述调控巨噬细胞的纳米制剂制备抑制肿瘤生长和转移药物与PD-L1抗体联合应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1..本发明提供了一种易于制备且通过重编辑巨噬细胞能够高效抑制肿瘤生长和转移的纳米制剂。药物IPI549通过溶剂交换而自组装形成疏水内核纳米粒,鞣酸与Fe3+在IPI549纳米内核表面配位将纳米内核包裹,并在壳层包载核酸药物CpG,得到的IPI549@MOF/CpG纳米制剂,具有核壳结构,从而实现了将亲水性大分子IPI549和疏水性小分子CpG组合在一起来协同作用。该纳米制剂的制备方法简单可控,具有较高的载药量,稳定性良好。
2..本发明提供的调控巨噬细胞的纳米制剂不同于多数纳米载体包裹化疗药物杀伤肿瘤细胞为靶标,该纳米制剂是对巨噬细胞特异性基因调控和免疫治疗,激活机体的自身免疫杀伤肿瘤细胞,生物相容性好,细胞毒性低。
3..本发明提供的纳米制剂可以实现对巨噬细胞的全面调控:首先,该纳米制剂通过对巨噬细胞的天然免疫进行调控实现巨噬细胞的抗肿瘤活性,通过共载IPI549和CpG发挥协同作用以促进M2型巨噬细胞复极化为M1型,并且能够刺激M1型巨噬细胞提高对肿瘤细胞的摄取,刺激M1型巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6、IL-12等细胞因子来对肿瘤细胞进行直接杀伤;另一方面,该纳米制剂可以激发巨噬细胞强有力的适应性免疫来激活抗肿瘤效应,通过IPI549和CpG协同作用提高M1型巨噬细胞对于抗原肿瘤细胞的提呈能力,将肿瘤细胞提呈至T细胞进行免疫杀伤。该纳米制剂通过多途径协同增强巨噬细胞的天然免疫与适应性免疫反应,可引发强大的抗肿瘤免疫反应,从而抑制肿瘤的生长和转移。
4..本发明提供的纳米制剂与PD-L1抗体联合治疗,通过该纳米制剂对于巨噬细胞的适应性免疫调控增加其对肿瘤细胞的提呈作用,PD-L1抗体通过阻断PD-L1/PD-1抑制信号,恢复T细胞对肿瘤的免疫监视,提高T细胞的免疫应答,T细胞高效识别被巨噬细胞提呈的肿瘤细胞并进行杀伤,纳米制剂与PD-L1抗体的联合作用能够显著增加肿瘤免疫治疗的效果。
5..本发明提供的纳米制剂可以实现核酸药物CpG免受生理介质降解。CpG核酸药物难以穿透细胞膜进入细胞内,该纳米制剂的核壳结构能通过细胞内吞-溶酶体途径进入细胞内部,可以携带核酸药物CpG穿透细胞膜在细胞内发挥作用;IPI549@MOF/CpG纳米制剂在进入细胞内后在溶酶体酸性环境中,纳米粒的金属有机框架MOF被破坏,释放除CpG,而且CpG可以在溶酶体中持续停留,能够实现溶酶体防御体系的突破。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明IPI549@MOF/CpG纳米制剂材料合成及应用示意图,图1A为IPI549@MOF/CpG纳米制剂材料合成示意图;图1B为IPI549@MOF/CpG纳米制剂材料应用示意图。
图2为本发明实施例1-2检测获得的IPI549纳米粒(NPs)和IPI549@MOF/CpG NPs的粒径图。
图3为本发明实施例1-2检测获得的TA/Fe,IPI549 NPs和IPI549@MOF/CpG NPs电位图。
图4为本发明实验例1检测获得的IPI549浓度对IPI549@MOF NPs的载药量和粒径的影响。
图5为本发明实验例1检测获得的CpG浓度对吸附量的影响图。
图6为本发明实验例1检测获得的TA/Fe,IPI549 NPs和IPI549@MOF/CpG NPs的紫外光谱图。
图7为本发明实验例1检测获得的IPI549@MOF/CpG NPs的透射电镜图(图7A)和元素分析图(图7B)。
图8为本发明实验例1检测获得的IPI549@MOF/CpG NPs在H2O、PBS和DMEM完全培养基中的粒径变化图。
图9为本发明实验例1检测获得的MOF对CpG的保护作用图。
图10为本发明实验例2检测获得的CD206蛋白表达图。
图11为本发明实验例3检测获得的不同浓度IPI549@MOF/CpG NPs处理RAW264.7细胞(图11A)和B16F10细胞(图11B)的细胞存活率情况。
图12为本发明实验例4检测获得的游离CpG和IPI549@MOF/CpG NPs的细胞摄取情况图。
图13为本发明实验例5检测获得的IPI549@MOF/CpG NPs和溶酶体共定位的激光共聚焦图。
图14为本发明实验例6检测获得的mRNA表达情况,图14A为iNOS、TNF-α、IL-6、IL-12mRNA的表达情况图,图14B为Arg-1、TGF-β和IL-10的mRNA表达情况图。
图15为本发明实验例7检测获得的B16F10细胞与不同RAW264.7细胞上清液孵育4天后的相对生长曲线图。
图16为本发明实验例8检测获得的体内评价疗效结果。
图17为本发明实验例8检测获得的HE染色结果。
图18为本发明实验例9检测获得的体内评价疗效结果。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段;若未特别指明,实施例中所用试剂均为市售。
实施例1
制备IPI549@MOF纳米粒
称取20mg IPI549溶于2mL DMSO中制成浓度为10mg/mL的IPI549溶液,备用。在烧杯中加入5mL超纯水,于振荡超声条件下,迅速加入IPI549溶液50μL,使浓度为100μg/mL,得到IPI549疏水内核纳米粒,再加入50μL 40mg/mL的鞣酸(TA)水溶液和50μL 10mg/mL的氯化铁(FeCl3)水溶液,超声2min,充分涡旋,即得IPI549@MOF NPs。
实施例2
制备IPI549@MOF/CpG纳米粒
称取20mg IPI549溶于2mL DMSO中制成浓度为10mg/mL的IPI549溶液,备用。在振荡超声条件下,向5mL超纯水中迅速加入50μL 10mg/mL IPI549溶液,超声30s,再加入50μL40mg/mL的TA溶液和50μL 10mg/mL的FeCl3溶液,超声2min,充分涡旋,加入200μL CpG溶液(100μM),孵育30min,20000rpm离心10min,弃去上清,取沉淀加入超纯水复溶,即得IPI549@MOF/CpG NPs。图1为本发明IPI549@MOF/CpG纳米制剂材料合成及应用示意图,图1A为IPI549@MOF/CpG纳米制剂材料合成示意图;图1B为IPI549@MOF/CpG纳米制剂材料应用示意图。
实验例1
实施例1~2所得产物的测试
一、粒径与电位:分别检测IPI549 NPs和IPI549@MOF/CpG NPs的粒径和电位,测量方法为:取样品溶液置于Marlven Nano ZS仪器,采用动态光激光散射法检测粒径和电位,测定池温度设定为25℃,每个样品平行操作3份。图2为IPI549 NPs和IPI549@MOF/CpG NPs的粒径图,图3为MOF、IPI549 NPs和IPI549@MOF/CpG NPs的电位图,从图中可知:IPI549NPs粒径为190nm,电位为-15.6mV,IPI549@MOF/CpG NPs的粒径为275nm,电位为-17.9mV。
二、IPI549的投药浓度探索:IPI549的投药浓度对IPI549@MOF NPs的载药量和粒径影响的探索,测量方法:(1)粒径的探索:在烧杯中加入5mL超纯水,设置三份,于振荡超声条件下,迅速加入IPI549溶液25、50、75μL,使浓度分别为50、100、150μg/mL,得到IPI549疏水内核,再加入50μL 40mg/mL的TA溶液和50μL 10mg/mL的FeCl3溶液,超声2min,充分涡旋,20000rpm离心10min,弃去上清,取沉淀加入超纯水复溶,即得IPI549@MOF纳米粒,通过粒径考察IPI549投药浓度对纳米粒制备的影响。(2)载药量的探索:配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/mL的IPI549溶液,测定267nm波长处溶液的吸光度(Abs),以浓度(C)为横坐标,Abs为纵坐标进行线性回归,建立IPI549标准曲线。取上述离心复溶后纳米粒沉淀,加入700μL EDTA(1M)水溶液,涡旋超声30min,20000rpm离心10min,弃去上清,得到白色沉淀,再加入300μL DMSO,涡旋后20000rpm离心10min,取200μL上清,用DMSO稀释至3mL,测定各组吸光度值,代入标准曲线得到相应的浓度,同时,纳米粒溶液进行冷冻干燥,精密称重,计算载药量。图4为IPI549浓度对IPI549@MOF NPs的载药量和粒径的影响图。从图中可知:随着IPI549投药浓度升高,载药量和粒径也逐渐增加,粒径均小于300nm,综合考虑下选择150μg/mL作为IPI549的投药浓度。
三、CpG的投药浓度探索:其测定方法为:在实例1中形成的IPI549@MOF纳米粒溶液,加入CpG-FAM,使其浓度依次为1、2、4μM,孵育30min,20000rpm离心10min,取上清液,以凝胶电泳分析CpG-FAM的吸附程度,筛选CpG的投入量。聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳具体实验操作如下:
(1)制胶:称取48g尿素固体,加入10mL 10×TBE,再加入50mL 30%聚丙烯酰胺,60℃加热溶解,室温保存备用。取7mL凝胶储备液,加入32μL 10%APS和5μL TEMED,搅拌均匀,在凝胶板中灌液,插入孔道梳子;
(2)上样:待凝胶凝固,轻轻取出梳子,用注射液吸取1×TBE缓冲液清理孔道,取15μL各上清液及1、2、4μM游离CpG-FAM溶液分别混合3μL上样缓冲液(6×loading buffer),注入凝胶孔道;
(3)跑胶:将凝胶置于电泳槽中,加入1×TBE缓冲液,设置电压200V,运行30min后停止电泳;
(4)成像:将凝胶取出,在荧光成像仪上显像,用ImageJ软件对条带进行灰度分析。
图5为CpG浓度对吸附量的影响图。从图中可知:CpG投药浓度升高到4μM时,上清液也只出现了极少量的CpG,表明纳米粒对CpG的吸附率将近100%,最终选择4μM作为CpG的投药浓度。
四、紫外光谱:分别对TA/Fe3+、IPI549 NPs和IPI549@MOF/CpG NPs进行紫外光谱扫描,测定方法为:以超纯水作为空白对照,采用UV-Vis在200~700nm范围内对溶液进行紫外吸收扫描。图6为TA/Fe3+、IPI549 NPs和IPI549@MOF/CpG NPs的紫外吸收光谱,从图中IPI549@MOF/CpG NPs出现了IPI549的特征吸收峰,但发生了红移,并且~300nm处的肩峰升高明显是IPI549肩峰和TA/Fe3+紫外吸收峰叠加所致,上述表明IPI549 NPs成功被TA/Fe3+包载。
五、形态表征:观察IPI549@MOF/CpG NPs的形态,形态的检测方法:样品滴加在覆盖碳膜的400目铜网上,置于干燥器中,待其自然干燥后置于透射电镜Titan G2-F20下观察。图7A为IPI549@MOF/CpG NPs的透射电镜图,图7B为IPI549@MOF/CpG NPs的元素分析图,图7确证了纳米粒的核壳结构。
六、稳定性检测:将IPI549@MOF/CpG NPs在37℃下置于H2O、PBS和含10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基,在不同时间点测定二者的粒径。图8为IPI549@MOF/CpG NPs在H2O、PBS和DMEM完全培养基中的粒径变化图,从图中可知:IPI549@MOF/CpG NPs粒径均无显著性变化,说明IPI549@MOF/CpG NPs在H2O、PBS溶液及血浆中的稳定性良好。
七、MOF对CpG的保护作用:测定方法:按照实施例2的制备方法制备5-羧基荧光素(FAM)标记的IPI549@MOF/CpG-FAM NPS,用超纯水稀释2倍,使CpG浓度达2μM,另外配制2μMCpG-FAM溶液,各取三份分别与10%、20%、40%FBS等体积混匀,各取13μL置于37℃水浴温热3h,然后95℃加热10min。向其中加入1.5μL 1M EDTA、0.5μL Tris-HCl(pH 7.4,300mM)和10μL 8M尿素,涡旋混匀,备用,然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。图9为MOF对CpG的保护作用图,从图中可知,米粒MOF对CpG有强大的保护作用,可以避免或减少其在体内环境中被酶解。
实验例2
M2型巨噬细胞模型的建立
IL-4刺激RAW264.7细胞,可将其活化成M2型,以此模拟TAM。将IL-4溶于灭菌超纯水中配制20μg/mL母液,备用。将正常RAW264.7以2×105个/孔接种于6孔板中,孵育过夜,待其贴壁后,弃去培养液,用PBS清洗两遍,每孔分别加入IL-4,使浓度依次为1、10、50、100ng/mL,并设置不加IL-4对照孔,置于细胞培养箱中培养24h。利用Western blot实验检测CD206蛋白表达,筛选适宜的IL-4孵育浓度,具体操作步骤如下:
(1)蛋白样品提取及处理:细胞孵育结束后,弃去培养基,用PBS清洗细胞2~3次,加入200μL RIPA细胞裂解液(含1%PMSF)裂解细胞,用200μL tip头刮下细胞,收集细胞裂解液转移至1.5mL离心管中,充分涡旋,4℃裂解半小时,每隔10min涡旋一次。结束后,低温离心(10000rpm,15min,4℃),收集蛋白保存在-80℃冰箱备用。按BCA蛋白试剂盒说明书操作,建立蛋白标准曲线,并测定蛋白样品浓度,将其稀释至相同的浓度,按上样缓冲液/蛋白溶液(v/v)=1:4的比例将两者混匀,95℃加热蛋白10min使其变性,结束后将处理好的蛋白样品保存至-80℃,备用。
(2)凝胶电泳及转膜:安装制胶玻璃板,按试剂盒说明配制分离胶,向玻璃板中灌胶至一定高度,缓慢加入超纯水压胶,静置约30min,待水与分离胶出现明显界限(即分离胶凝固),倒去上层水,并用滤纸吸干。配制浓缩胶,灌满分离胶上方,立即插入梳子,待浓缩胶凝固,置于4℃保存过夜。将凝胶卡入电泳槽,加入适量的1×电泳液,垂直拔出梳子,用注射器吸取电泳液轻轻冲洗孔道。取蛋白样品10μL上样,最左边的上样孔加入5μL Marker,80V电压跑胶约20min,待蛋白从浓缩胶跑至分离胶,转换电压为120V,1h后溴酚蓝到达胶的底端处时停止电泳。将凝胶取出,切去多余凝胶,保留目标蛋白部分,剪取比凝胶面积稍大的0.45μm的PVDF膜,用甲醇浸泡活化1min,在样品夹板中依序铺上海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵,置于转膜装置中,放入冰盒,加入转膜液,设置电流200mA,在4℃转膜1h。
(3)抗体孵育及显影:转膜结束后,取出PVDF膜浸在5%的脱脂牛奶中,置于摇床上室温封闭1.5h,封闭结束后,加入一抗(5%脱脂牛奶配制),4℃孵育过夜。孵育结束后,用PBST清洗PVDF 3~4次,每次10min,加入HRP标记的二抗,37℃孵育1h,PBST洗涤3~4次,每次10min。最后用ECL显影液孵育PVDF,置于显影仪进行成像分析。
图10为IL-4处理之后CD206蛋白表达情况图。从图中可知与对照组相比,经IL-4处理的细胞CD206表达有不同程度的增加,表明IL-4可用作活化M2型。
实验例3
实施例2的IPI549@MOF/CpG NPs对RAW264.7细胞和B16F10细胞的细胞活力影响
(1)分别取对数生长期RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞,购自中南大学湘雅医学实验中心)和B16F10细胞(小鼠皮肤黑色素瘤细胞,购自中南大学湘雅医学实验中心),胰酶消化,镜下计数,将细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板中,培养24h。
(2)在RAW264.7孔中加入100ng/mL IL-4进行细胞活化。细胞贴壁后,弃去培养基,PBS清洗2次,每组加入100μL预先稀释配制的系列浓度IPI549@MOF/CpG NPs溶液(以IPI549浓度计,分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50μg/mL),设4个复孔,另设不含细胞的调零组和不含药物的阴性对照组,每组细胞孵育48h。
(3)PBS清洗2次,每孔加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL,DMEM稀释),继续孵育4h后终止培养,小心吸弃培基。
(4)每孔加入DMSO溶液100μL,置摇床上低速振摇10min使结晶溶解完全,用酶标仪测定490nm波长处的吸光值(OD)。
图11为IPI549@MOF/CpG NPs与细胞孵育48h后,用MTT法测定细胞存活率结果。从图中看出RAW264.7(图11A)和B16F10(图11B)的细胞活力在纳米粒IPI549浓度0~20μg/mL时保持~100%,即使浓度进一步提高至50μg/mL,两种细胞的存活率仍大于80%,表明IPI549@MOF/CpG NPs对细胞生长抑制作用较弱,毒性低。
实验例4
实施例2的IPI549@MOF/CpG NPs对巨噬细胞的靶向作用
(1)制备5-羧基荧光素(FAM)标记的载药纳米粒IPI549@MOF/CpG-FAM NPs。具体步骤为:同实施例2的制备方法,制备包载IPI549@MOF/CpG-FAM NPs。
(2)取对数生长的RAW264.7细胞,消化计数,用适量含10%FBS的DMEM完全培养基稀释为4×104个/mL的细胞悬液,接种于35mm激光共聚焦专用培养皿中,加入IL-4 100ng/mL培养24h后,吸弃培基,PBS润洗2次。
(3)取预先配制的IPI549@MOF/CpG-FAM和CpG-FAM溶液各1mL加入不同的小皿中,孵育细胞4h,用PBS清洗3次,去除多余的药物。
(4)室温避光环境下,加入0.5mL 4%多聚甲醛固定15min,结束后,用200μL DAPI溶液(1μg/mL)染核10min,用PBS将染料清洗干净,将小皿置于激光共聚焦显微镜(CLSM)下成像,观察细胞中荧光的分布情况。
其检测结果如图12所示。图12为IPI549@MOF/CpG NPs的细胞摄取荧光成像图,其中,游离CpG组,FAM通道未出现荧光,表明游离的CpG无法穿过细胞膜进入细胞中,这是由于CpG的负电性使细胞膜将其排斥在外。与之相反,IPI549@MOF/CpG NPs中,FAM通道出现大量明显的绿色荧光,Merged图显示绿色荧光紧密围绕在蓝色荧光标记的细胞核外侧,表明IPI549@MOF/CpG NPs可将药物递送至细胞内,并分散在细胞质中。
实验例5
实施例2的IPI549@MOF/CpG NPs和溶酶体共定位情况
(1)制备5-羧基荧光素(FAM)标记的载药纳米粒IPI549@MOF/CpG-FAM NPs。具体步骤为:同实施例2的制备方法,制备包载IPI549@MOF/CpG-FAM NPs
(2)取对数生长的RAW264.7细胞,消化计数,用适量含10%FBS的DMEM完全培养基稀释为4×104个/mL的细胞悬液,接种于35mm激光共聚焦专用培养皿中,加入IL-4 100ng/mL培养24h后,吸弃培基,PBS润洗2次。
(3)取预先配制的IPI549@MOF/CpG-FAM 1mL加入不同的小皿中,孵育细胞1、8h,用PBS清洗3次,去除多余的药物。
(4)避光环境中加入0.5mL Lyso-Tracker Red,置于培养箱中染色30min,用PBS清洗3次,用200μL Hoechst 33342溶液(1μg/mL)染细胞核10min,用PBS清洗3次,将小皿置于激光共聚焦显微镜(CLSM)下成像,观察细胞中荧光的分布情况。
其检测结果如图13所示,图13为IPI549@MOF/CpG NPs和溶酶体共定位情况图。从图中可以看出,1h时,红色荧光与绿色荧光部分重合,即IPI549@MOF/CpG NPs存在于溶酶体中,表明IPI549@MOF/CpG NPs通过内吞-溶酶体途径进入细胞内,并且在溶酶体酸性环境中,纳米粒MOF被破坏,释放CpG(荧光恢复)。当孵育时间延长8h时,橙黄色荧光仍然十分强烈,表明CpG可以在溶酶体中持续停留。
实验例6
实施例2的IPI549@MOF/CpG NPs促进M2-M1复极化
将RAW264.7按密度2×105个/孔接种于6孔板中,每孔分别加入100ng/mL IL-4,置于培养箱中孵育24h,贴壁后,弃去培养液,PBS清洗2次,细胞孔中依次加入2mL IPI549、IPI549@MOF、IPI549@MOF/CpG NPs(IPI549浓度为10μg/mL)培养基,另设不加药物的对照组(M2),孵育48h。
PCR的具体操作步骤如下:
(1)RNA提取:从培养箱中取出孔板,弃去培养基,用PBS清洗2次,每孔加入0.5mLTRIzol裂解液,吹打混匀,至于4℃静置30min,将裂解液转移至1.5mL无酶管中,加入200μL无水氯仿,涡旋,冰上静置15min,12000rpm离心15min,样品分三层,小心吸取水层100~200μL装至1.5mL无酶管,再加入等体积异丙醇,涡旋,冰上静置15min,12000rpm离心15min,吸弃上清,加入4℃预冷75%乙醇(DEPC水配制),涡旋,12000rpm离心15min,弃去上清,将沉淀于室温环境中晾干,加入20μL DEPC水,混匀,利用超微量分光光度计测定RNA的浓度,其A260/A280应在1.7~2.0范围内。将所有样品用DEPC水稀释至浓度为200ng/μL,备用。
(2)逆转录:取5.5μL 200ng/μL RNA样品,加入0.5μL Primer,置于PCR仪中65℃加热5min,取出PCR管4℃迅速冷却30s,依次加入2μL 5×React buffer,0.5μL Inhibitor,1μL 10mM dNTP和0.5μL AID RT 1μL,每管总体积10μL,混匀,置于PCR仪中逆转录,设置程序:42℃90min,70℃5min,即得cDNA,4℃保存产物。利用超微量分光光度计测定其浓度,A260/A280应在1.7~2.0范围内,将cDNA用DEPC水稀释至浓度为500ng/μL,-20℃保存备用。
(3)RT-PCR:引物序列见表1。根据荧光实时定量试剂盒,在PCR管中加入5μL TaqSYBR qPCR Mix,0.6μL上游引物,0.6μL下游引物,2.8μL dd H2O,1μL cDNA(500ng/μL),每管总体积10μL,混匀,置于CFX96TM系统定量分析,设置扩增程序:95℃预变性5min;95℃变性20s;60℃退火30s;72℃延伸30s;40个循环。内参基因β-actin,采用2-△△Ct法进行数据处理。
其检测结果如图14所示,图14A为iNOS、TNF-α、IL-6、IL-12mRNA的表达情况图,图14B为Arg-1、TGF-β和IL-10的mRNA表达情况图。从图中可知与IL-4组相比,各药物处理组Arg-1(M2标志物)的表达明显下调,同时iNOS(M1标志物)表达上调,证实了药物促进M2型巨噬细胞复极化成M1型。与对照组相比,IPI549、IPI549@MOF和IPI549@MOF/CpG均能上调促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-12)的mRNA表达水平,而抗炎细胞因子(TGF-β、IL-10)mRNA表达水平有所下调,且IPI549@MOF/CpG作用更明显,表明IPI549@MOF/CpG促进巨噬细胞促炎/抗肿瘤效应最强。
表1 RT-PCR 引物序列
实验例7
实施例2的IPI549@MOF/CpG NPs诱导巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
(1)将RAW264.7细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板中,加入IL-4 100ng/mL,刺激24h,待细胞贴壁后,弃去培养基,PBS清洗2次。
(2)细胞孔中依次加入2mL IPI549、IPI549@MOF NPs、IPI549@MOF/CpG NPs(IPI549浓度为10μg/mL)培养基,设置不加药物的对照组(M2),每组设3个复孔,孵育24h后,收集各组上层培养液,装至灭菌离心管中,20000rpm离心5min,吸取上清3mL加入10%FBS,即得上清培养液,4℃备用。
(3)取对数生长期B16F10细胞,将细胞以500个/孔的密度接种于96孔板中,孵育过夜,待细胞贴壁后,弃去培养基,PBS清洗2次。
(4)分别加入各组上清培养液200μL,另设不含细胞的调零组,每组设三个复孔,于第0、1、2、3、4天取出孔板,弃去培养基,PBS清洗2次。
(5)每孔加入100μL 0.5mg/mL MTT溶液作用4h,小心吸弃上清,加入DMSO 100μL/孔,37℃恒温振荡10min溶解甲瓒,以酶标仪检测样品490nm波长处吸光度值(OD)。
其检测结果如图15所示,图15为B16F10经不同RAW264.7细胞上清液孵育4天的相对生长曲线。从图中可知,与IL-4组生长曲线相比,其他三组细胞生长速度明显减慢,其中双载药系统作用最显著,第4天生长速度仅为IL-4组的1/3,证明了IPI549@MOF/CpG促进更多促炎因子的分泌,进而抑制B16F10的生长。
实验例8
IPI549@MOF/CpG NPs的体内抗肿瘤活性
(1)建立荷瘤裸鼠模型:收集对数生长的B16F10细胞分散于PBS中,细胞密度为2×107/100mL,等体积与基质胶混合,注射于雄性C57小鼠(4-6周龄,约20g)的腋下部位。雄性C57小鼠(4-6周龄,约20g)购自常州卡文斯实验动物有限公司。
(2)待荷瘤小鼠肿瘤体积达150mm3时,将小鼠随机分成四组,每组5只,分别于第0、2、4、6天尾静脉注射100μL PBS、IPI549、IPI549@MOF和IPI549@MOF/CpG NPs(5mg/kgIPI549,1mg/kg CpG)。治疗期间,每两天测量肿瘤长宽并计算肿瘤体积,绘制肿瘤体积相对生长曲线。肿瘤体积计算公式:V=长×宽2/2,于第8天,处死小鼠,取出肿瘤,称重。
图16为分别在第0、2、4、6、8天尾静脉注PBS、IPI549、IPI549@MOF NPs和IPI549@MOF/CpG NPs后的肿瘤体积变化曲线。从图中可知,PBS肿瘤生长速度最快,第8天时肿瘤平均体积达起点的9倍,药物组均能明显抑制肿瘤生长,其中IPI549@MOF/CpG NPs组抑制作用最强。
图17为各组肿瘤组织H&E染色图,其结果与图15一致。
实验例9
IPI549@MOF/CpG NPs与PD-L1抗体联用体内抗肿瘤效应
(1)建立荷瘤裸鼠模型:收集对数生长的B16F10细胞分散于PBS中,细胞密度为2×107/100mL,等体积与基质胶混合,注射于雄性C57小鼠(4-6周龄,约20g)的腋下部位。
(2)当肿瘤体积达到50mm3时,将小鼠随机分为4组,分别在第0、3、6、9天给药,给药配方为:PBS、aPD-L1、IPI549@MOF/CpG NPs、aPD-L1+IPI549@MOF/CpG NPs(aPD-L1:腹腔注射,其余:尾静脉注射,[aPD-L1]=7.5mg/kg,[IPI549]=5mg/kg,[CpG]=1mg/kg)。治疗期间,每2天测量一次肿瘤的长度、宽度和体重。计算肿瘤体积以评估肿瘤生长曲线。第12天处死小鼠,擦拭肿瘤组织后拍照称重。
图18为分别在第0、2、4、6、8、10、12天给注PBS、aPD-L1、IPI549@MOF/CpG NPs、aPD-L1+IPI549@MOF/CpG NPs后的肿瘤体积变化曲线。从图中可知IPI549@MOF/CpG NPs具有较强的免疫调节作用,其治疗效果优于aPD-L1,且与aPD-L1联合使用时抑制作用最强。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种调控巨噬细胞的纳米制剂,其特征在于,所述纳米制剂包括纯药物IPI549纳米内核、核酸药物CpG和金属有机框架MOF,所述IPI549自组装形成纳米内核,所述金属有机框架包裹IPI549纳米内核并包载核酸药物CpG形成纳米制剂IPI549@MOF/CpG,所述金属有机框架由鞣酸和铁配位作用形成。
2.根据权利要求1所述的调控巨噬细胞的纳米制剂,其特征在于,所述金属有机框架MOF、纯药物IPI549纳米内核和核酸药物CpG的质量比为30:5~30:1~5。
3.根据权利要求1所述的调控巨噬细胞的纳米制剂,其特征在于,所述纳米制剂为核壳结构,平均粒径为150~300nm。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的调控巨噬细胞的纳米制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、在震荡超声条件下,将IPI549溶解于二甲基亚砜,随后加入大量的超纯水中,IPI549迅速成核生长,自组装形成纯药物IPI549纳米内核;
S2、在步骤S1中制得的IPI549纳米内核中加入鞣酸和FeCl3水溶液,超声2~10min后充分涡旋,鞣酸与Fe3+在IPI549纳米内核表面配位形成金属有机框架MOF,将IPI549纳米内核包裹,形成IPI549@MOF纳米粒;
S3、在步骤S2制得的IPI549@MOF纳米粒中加入CpG水溶液,室温下孵育30~60min,高速离心后弃去上清,取沉淀加入超纯水复溶,得到IPI549@MOF/CpG纳米粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤S1中二甲基亚砜与超纯水的体积比为1:10~500。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中鞣酸与FeCl3的质量比为1~10:1。
7.一种如权利要求1-3任一项所述的调控巨噬细胞的纳米制剂或如权利要求4-6任一项所述制备方法制得的调控巨噬细胞的纳米制剂在制备抑制肿瘤生长和转移药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述调控巨噬细胞的纳米制剂制备抑制肿瘤生长和转移药物与PD-L1抗体联合应用。
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