CN112773895A - 一种纳米反应器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种纳米反应器及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112773895A
CN112773895A CN202011562255.9A CN202011562255A CN112773895A CN 112773895 A CN112773895 A CN 112773895A CN 202011562255 A CN202011562255 A CN 202011562255A CN 112773895 A CN112773895 A CN 112773895A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ptfcg
core
nanoreactor
nano
shell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011562255.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112773895B (zh
Inventor
黄术
周文虎
谢勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Provincial Peoples Hospital
Original Assignee
Hunan Provincial Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Provincial Peoples Hospital filed Critical Hunan Provincial Peoples Hospital
Priority to CN202011562255.9A priority Critical patent/CN112773895B/zh
Publication of CN112773895A publication Critical patent/CN112773895A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112773895B publication Critical patent/CN112773895B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/32—Manganese; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/443—Oxidoreductases (1) acting on CH-OH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一一种纳米反应器及其制备方法和应用，所述纳米反应器包括核壳纳米粒和层层包裹在所述核壳纳米粒表面的二氧化锰和靶向配体；所述核壳纳米粒由金属有机框架、光敏剂、葡萄糖氧化酶和被金属有机框架包裹的聚乳酸‑‑羟基乙酸共聚物纳米内核形成，所述金属有机框架由鞣酸和铁通过配位作用形成；所述靶向配体为透明质酸、合成多肽、叶酸修饰的亲水聚合物和核酸适配体中的一一种或多种。本发明的纳米反应器可主动靶向至肿瘤细胞，并催化产氧实现肿瘤原位供氧，清除谷胱甘肽和ATP从而抑制克服耐受，增强光动力治疗效率；其制备方法简单有效，有效避免了载体的毒性，载药量和修饰率高，可应用于制备肿瘤靶向药物。

Description

一种纳米反应器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种纳米生物技术领域，具体涉及一种纳米反应器及其制备方法和应用。
背景技术
光动力治疗是一种临床上治疗肿瘤的常用手段，然而，由于肿瘤微环境本身的特性，其疗效往往受到多种耐受机制的限制。例如，肿瘤乏氧可通过切断氧气供应直接削弱光动力治疗效率，并上调低氧诱导因子(HIF-1α)导致耐受；肿瘤细胞的抗氧化机制，如过表达的谷胱甘肽，可清除光动力转换产生的活性氧，从而消除活性氧导致的细胞损伤；肿瘤细胞会自发形成能量依赖性的耐受机制，导致药物外排和DNA损伤修复。鉴于肿瘤微环境的复杂性，克服多种耐受机制是一种有效增强肿瘤的光动力治疗的手段。
设计多功能纳米反应器同时循环供氧，清除谷胱甘肽及ATP可优化光动力治疗，但是繁琐的材料合成，复杂的制备工艺增加了设计难度。因此，亟需一种具有多重催化作用的靶向纳米反应器通过重塑肿瘤微环境以克服多种耐受机制，进而有效诱导光动力治疗增敏。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种纳米反应器及其制备方法和应用，所述纳米反应器可主动靶向至肿瘤细胞，并催化产氧实现肿瘤原位供氧，清除谷胱甘肽和ATP从而抑制克服耐受，增强光动力治疗效率；其制备方法简单有效，有效避免了载体的毒性，载药量和修饰率高，可应用于制备肿瘤靶向药物。
为了实现上述目的，本发明提供了一种纳米反应器，所述纳米反应器包括核壳纳米粒和层层包裹在所述核壳纳米粒表面的二氧化锰和靶向配体；所述核壳纳米粒由金属有机框架、光敏剂、葡萄糖氧化酶和被金属有机框架包裹的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米内核形成，所述金属有机框架由鞣酸和铁通过配位作用形成；所述靶向配体为透明质酸、合成多肽、叶酸修饰的亲水聚合物和核酸适配体中的一种或多种。
进一步，所述光敏剂为二氢卟吩纳米光敏剂；优选的，所述光敏剂为二氢卟吩e6。
进一步，所述透明质酸分子量为7000。
进一步，所述光敏剂和葡萄糖氧化酶的药载比为2-3∶1，具有良好协同效应。
进一步，所述纳米反应器中铁含量为0.2％-0.5％，锰含量为4％-8％；优选的，所述纳米反应器中铁含量为0.34％，锰含量为6.04％。
进一步，所述纳米反应器为球形核壳结构。
基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种纳米反应器的制备方法，包括以下步骤：
S1、将光敏剂、氯化铁、聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于丙酮中作为有机相，将葡萄糖氧化酶、鞣酸溶于纯水中作为水相；
S2、将有机相缓慢滴入水相中，超声搅拌、离心清洗得核壳纳米粒；
S3、将聚丙烯亚胺，高锰酸钾依次滴入核壳纳米粒溶液中，搅拌得二氧化锰包裹的核壳纳米粒；
S4、将靶向配体滴入S3所述的核壳纳米粒溶液中，离心清洗即得纳米反应器。
基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种所述纳米反应器在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。
基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种所述纳米反应器在制备恶性肿瘤光动力治疗的靶向纳米药物的应用。优选的，所说恶性肿瘤为三阴性乳腺癌细胞。
上述的药物，进一步的，所述药物为外用制剂、口服制剂或注射剂。作为优选，所述的外用制剂为外用凝胶剂。所述的口服制剂为包含所述的纳米反应器的颗粒剂、片剂、口服溶液剂等。所述的注射剂为包含所述的纳米反应器的静脉注射液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种纳米反应器，鞣酸和铁通过配位作用形成金属有机框架稳定乳酸-羟基乙酸共聚物内核形成核壳纳米粒，并层层包裹二氧化锰和透明质酸形成纳米反应器，该纳米反应器可循环供氧、清除肿瘤细胞内的谷胱甘肽和ATP，而增强光动力治疗，最终有效杀死肿瘤细胞。本发明所述的纳米反应器是由金属有机框架，纳米酶，生物酶及靶向配体等组成的复合多功能纳米体系，本申请中乳酸-羟基乙酸共聚物疏水性纳米粒不需要掺入任何稳定剂，采用纳米粒稳定纳米粒的方式形成核壳纳米体系，并层层包裹进行修饰及稳定，属于一种工艺简单且稳定性高的纳米反应器的制备方法。
2、本发明提供了一种纳米反应器，其外层修饰透明质酸，该纳米反应器具有纳米级粒径，可以通过实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)被动靶向至肿瘤部位，增加药物在肿瘤部位的累积量，降低药物对正常组织的毒副作用。透明质酸是CD44受体的配体，可以主动靶向CD44高表达的肿瘤细胞，增加肿瘤细胞对配位聚合物的摄取，从而进一步增强其对肿瘤治疗的疗效。
3、本发明提供了一种纳米反应器的制备方法，其制备过程简单可控，有效避免了载体的毒性，载药量和修饰率高。
4、本发明提供了一种纳米反应器在制备肿瘤药物中的应用，纳米反应器可靶向富集于肿瘤病灶部位，通过增强光动力治疗导致肿瘤细胞死亡，对心、肝、脾、肺、肾等无损伤，可以对肿瘤治疗提供依据和思路。纳米反应器可被动富集于所有实体瘤组织(通过公认的EPR效应)，并可主动靶向所有CD44高表达的肿瘤细胞，纳米反应器可循环供氧、清除肿瘤细胞内的谷胱甘肽和ATP，而增强光动力治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1和2中PTFCG，PTFCG@M，PTFCG@MH的粒径变化图
图2为本发明实施例1和2中PTFCG，PTFCG@M，PTFCG@MH的电位变化图
图3为本发明实施例1和2中PTFCG@MH的透射电镜图
图4为本发明实施例1和2中Ce6，PTFCG，PTFCG@MH的紫外吸收图谱
图5为本发明实施例1和2中PTFCG@MH的透射-能谱图
图6为本发明实施例1和2中PTFCG@MH在不同条件下释放曲线图
图7为本发明实施例3中PTFCG@MH，PTF@MH分别与过氧化氢和葡萄糖混合后的葡萄糖的消耗量
图8为本发明实施例3中PTFCG@MH，PTFCG分别与葡萄糖混合后pH的动态变化图
图9为本发明实施例3中不同pH条件下PTFCG@MH与过氧化氢混合后的溶氧变化图
图10为本发明实施例3中各条件下的溶氧变化图
图11为本发明实施例3中各条件下的ROS变化图
图12为本发明实施例4中细胞在用PTFCG@MH处理后后激光共聚焦显微镜下的成像图
图13为本发明实施例5中PTFCG@MH，PTF@MH，PTFCG或Ce6细胞孵育后的细胞乏氧水平和ROS水平
图14为本发明实施例5中PTFCG@MH，PTF@MH，PTFCG或GOx细胞孵育后的ATP水平
图15为本发明实施例5中PTFCG@MH，PTF@MH，PTFCG或GOx细胞孵育后的谷胱甘肽水平
图16为本发明实施例5中PTFCG@MH，PTF@MH，PTFCG与细胞孵育并激光照射后，用MTT法测定细胞存活率结果。
图17为本发明实施例6中药物在体内的分布研究
图18为本发明实施例7中分别在第0、4天分别注射PBS，PTFCG@MH，PTFCG并给予激光照射后的肿瘤体积变化曲线
图19为本发明实施例7中各组肿瘤组织H&E染色图
图20为本发明实施例8中各组小鼠的体重变化
图21为本发明实施例8中为各组小鼠心、肝、脾、肺、肾病理切片分析
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
本发明涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。
以下实施例中，所采用的仪器及生产厂家的详细信息参见表1：
表1主要仪器名称及生产厂家
Figure BDA0002861068820000041
Figure BDA0002861068820000051
以下实施例中，所采用的主要试剂名称及生产厂家参见表2：
表2主要试剂名称及生产厂家
Figure BDA0002861068820000052
Figure BDA0002861068820000061
实施例1
本实施例提供了一种核壳纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)40μL浓度为40mg/mL的鞣酸(TA)水溶液与10μL浓度为10mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOx)水溶液依次加至5mL超纯水中作为水相。100μL浓度为20mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)丙酮溶液，40μL浓度为10mg/mL的氯化铁(FeCl3)丙酮溶液与20μL浓度为20mg/mL的二氢卟吩e6(Ce6)二甲亚砜溶液依次加至1mL丙酮中作为有机相。
(2)将有机相缓慢滴入水相，超声搅拌，离心清洗即得核壳纳米粒(PTFCG)。
实施例2
本实施例提供一种纳米反应器的制备方法，包括如下步骤：
(1)40μL浓度为40mg/mL的鞣酸(TA)水溶液与10μL浓度为10mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOx)水溶液依次加至5mL超纯水中作为水相。100μL浓度为20mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)丙酮溶液，40μL浓度为10mg/mL的氯化铁(FeCl3)丙酮溶液与20μL浓度为20mg/mL的二氢卟吩e6(Ce6)二甲亚砜溶液依次加至1mL丙酮中作为有机相。
(2)将有机相缓慢滴入水相，超声搅拌，离心清洗即得核壳纳米粒(PTFCG)。
(3)取1mL上述核壳纳米粒，依次加入50μL浓度为20mg/mL的聚丙烯亚胺(PAH)，25μL浓度为20mg/mL的高锰酸钾(KMnO4)，搅拌即得二氧化锰包裹的核壳纳米粒(PTFCG@M)。
(4)500μL浓度为20mg/mL的HA加至上述溶液，离心清洗即得纳米反应器(PTFCG@MH)。
(5)40μL浓度为40mg/mL的鞣酸(TA)水溶液加至5mL超纯水中作为水相。100μL浓度为20mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)丙酮溶液，40μL浓度为10mg/mL的氯化铁(FeCl3)丙酮溶液依次加至1mL丙酮中作为有机相。将有机相缓慢滴入水相，超声搅拌，离心清洗即得核壳纳米粒。取1mL上述核壳纳米粒，依次加入50μL浓度为20mg/mL的聚丙烯亚胺(PAH)，25μL浓度为20mg/mL的高锰酸钾(KMnO4)，搅拌即得二氧化锰包裹的核壳纳米粒。500μL浓度为20mg/mL的HA加至上述溶液，离心清洗即得空白纳米反应器(PTF@MH)。
实验例一：
对实施例1和实施例2的纳米反应器进行如下检测：
一、粒径与电位：分别检测PTFCG，PTFCG@M，PTFCG@MH的粒径与电位，测量方法为：取样品溶液置于Marlven Nano ZS仪器，采用动态光激光散射法检测粒径，测定池温度设定为25℃，每个样品平行操作3份。图1和图2为PTFCG，PTFCG@M，PTFCG@MH的粒径及电位变化图，从图的结果可知：PTFCG粒径为170nm，电位为-34mV，而包裹二氧化锰后(PTFCG@M)粒径增至200nm，电位升至+18mV，继续包裹HA形成纳米反应器PTFCG@MH的粒径增至210nm，电位降至-21mV。
二、形态：观察PTFCG@MH的形态，形态的检测方法：样品滴加在覆盖碳膜的400目铜网上，置于干燥器中，待其自然干燥后置于透射电镜Titan G2-F20下观察。图3为PTFCG@MH的透射电镜图，从图中可知：本发明的PTFCG@MH在透射电子显微镜下为球形核壳结构。
三、紫外光谱：分别对Ce6，PTFCG，PTFCG@MH进行紫外光谱扫描，测定方法为：以蒸馏水为空白对照液，测定Ce6，PTFCG，PTFCG@MH紫外吸收图谱。图4为Ce6，PTFCG，PTFCG@MH的紫外吸收图谱，从图中可知：Ce6在404nm及640nm有特征吸收峰，而PTFCG，PTFCG@MH在404nm及640nm也有较强的紫外吸收。
四、红外光谱：对PTFCG@MH进行透射-能谱扫描。图5为PTFCG@MH的透射-能谱图。从图中可知铁和锰的含量分别为0.34％及6.04％。
五、释放率检测：将PTFCG@MH取1mL至于截留分子量为3500的透析袋中，将装有纳米粒的透析袋分别置于装有释放介质的50mL离心管中，释放介质分别为：pH 7.4、pH 7.4+10mM GSH。分别于1、2、4、8、12取出透析袋的溶液，在640nm处测定吸光度A，以未进行释放的纳米粒的吸光度为A0，累计释放率＝(1-A/A0)×100。图6为PTFCG@MH在不同条件下释放曲线图。结果表明GSH可以促进PTFCG@MH中的药物释放。
实施例3
考察实施例1和实施例2纳米反应器循环催化活性：
(1)取PTFCG@MH及PTF@MH，加入100μM的过氧化氢及10mM的葡萄糖，用DNS试剂测定葡萄糖的浓度。图7为PTFCG@MH，PTF@MH分别与过氧化氢和葡萄糖混合后的葡萄糖的消耗量。结果表明PTFCG@MH在含有过氧化氢的条件下可消耗较多的葡萄糖。
(2)取PTFCG@MH及PTFCG，加入10mM的葡萄糖，用pH计测定pH值的变化。图8为PTFCG@MH，PTFCG分别与葡萄糖混合后pH的动态变化图。结果表明PTFCG@MH及PTFCG在有葡萄糖的情况下可导致pH降低。
(3)取PTFCG@MH加入100μM的过氧化氢，并用缓冲液调pH，用溶氧仪测定氧气的产生量。图9为不同pH条件下PTFCG@MH与100μM的过氧化氢混合后的溶氧变化图。结果表明PTFCG@MH在含过氧化氢及酸性条件下可产生更多的氧气。
(4)取PTFCG@MH及PTFCG，加入100μM的过氧化氢及10mM的葡萄糖，并给予激光照射，用溶氧仪测定氧气的产生量。图10为各条件下的溶氧变化图。结果表明PTFCG@MH在含过氧化氢，葡萄糖及激光照射的条件下可维持氧压平衡。
(5)取PTFCG@MH，PTFCG及PTF@MH，加入100μM的过氧化氢，10mM的葡萄糖，用ROS探针(SOSG)检测ROS产生量。图11为各条件下的ROS变化图。结果表明PTFCG@MH在含过氧化氢或葡萄糖的条件下可产生较多的ROS。
实施例4
考察实施例1和实施例2的纳米反应器对肿瘤的靶向作用：
(1)取对数生长的MDA-MB-231细胞(人源性三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞，购自中南大学湘雅医学实验中心)，消化计数，适量DMEM完全培养基稀释至2×105cells/mL的细胞悬液，每孔2mL接种于24孔板，总共接种3个孔。贴壁培养24h后吸弃培基，PBS润洗3次。
(2)取一个孔加入2mL 5mg/mL游离HA(无FBS的DMEM溶解)，其余孔加入2mL无FBS的DMEM。孵育4h后吸弃培基，PBS润洗3次。
(3)将PTFCG@MH用DMEM培养基(无FBS)稀释。
(4)加入2mL PTFCG@MH或Ce6。37℃孵育4h后吸弃培基，PBS润洗3次。
(5)每孔加入1 mL多聚甲醛避光固定20min，吸弃上清，PBS洗涤三次。
(6)每孔加入0.5mL 1μg/mL DAPI，避光染核15min，吸弃上清，PBS洗涤3次，激光共聚焦显微镜下观察各孔荧光强弱。
图12为细胞摄取结果。其中，Ce6及PTFCG@MH分别与M231细胞共孵育4h后，荧光成像图；15mg/mL HA预处理M231细胞4h，PTFCG@MH再与细胞孵育4h，激光共聚焦显微镜观察。DAPI通道表明细胞核染为蓝色荧光，Ce6通道表明NPs标记为红色荧光，Merged表明叠加DAPI和Ce6通道。+HA表示游离HA预处理。标尺＝50μm。
从图中可知：Ce6及PTFCG@MH与M231细胞孵育4h，荧光显微镜下可见细胞内有明显的红色荧光，表明纳米粒被细胞摄取，其中PTFCG@MH孔荧光较Ce6孔强。然而，游离HA预处理4h后，其红色显著减少。结果说明纳米反应器对肿瘤细胞具有主动靶向作用，包裹透明质酸后能增强肿瘤细胞对纳米反应器的摄取。
实施例5
考察实施例1和实施例2的纳米反应器对肿瘤细胞的调控和毒性：
(1)取胰酶消化对数生长的MDA-MB-231细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释成细胞悬液，以105/孔接种到24孔培养板中。在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO2、饱和湿度)培养24h后移弃培养液。每孔加入液。每孔加入PTFCG@MH，PTF@MH，PTFCG或Ce6，孵育2h后用激光照射。分别加入低氧探针(ROS-ID)和ROS探针(DCFDA)孵育30分钟，用激光共聚焦显微镜下观察各孔荧光强弱。
(2)取胰酶消化对数生长的MDA-MB-231细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释成细胞悬液，以2×105/孔接种到12孔培养板中。在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO2、饱和湿度)培养24h后移弃培养液。每孔加入液。每孔加入PTFCG@MH，PTF@MH，PTFCG或GOx孵育24h后。分别用ATP裂解液及曲拉通-X 100裂解细胞，并用ATP检测试剂盒和Ellman试剂检测ATP及谷胱甘肽浓度。
(3)取胰酶消化对数生长的MDA-MB-231细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释成细胞悬液，以5000/孔接种到24孔培养板中。在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO2、饱和湿度)培养24h后移弃培养液。每孔加入PTFCG@MH，PTF@MH，PTFCG，同一浓度重复6个复孔，激光照射并孵育48h。每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，继续孵育4h后终止培养。每孔加入DMSO溶液150μL，置摇床上低速振摇10min使结晶溶解完全，用酶标仪测定570nm波长处的吸光值(OD)。
图13为PTFCG@MH，PTF@MH，PTFCG或Ce6细胞孵育2h后的细胞乏氧水平和ROS水平。其中G1为Control；G2为PTF@MH；G3为PTFCG@MH；G4为Ce6+激光；G5为PTFCG+激光；G6为PTFCG@MH+激光。从图13可以看出，纳米反应器PTFCG@MH可以维持细胞内氧气平衡，产生更多的ROS。
图14和图15为PTFCG@MH，PTF@MH，PTFCG或GOx细胞孵育24h后的ATP及谷胱甘肽水平。从图14和图15可以看出纳米反应器PTFCG@MH可以降低胞内ATP及谷胱甘肽水平。
图16为PTFCG@MH，PTF@MH，PTFCG与细胞孵育48h并激光照射后，用MTT法测定细胞存活率结果。从图16可以看出，本发明的纳米反应器PTFCG@MH的细胞存活率均为剂量依赖性，并且在激光照射下PTFCG@MH的细胞毒性最强。
实施例6
考察实施例1和实施例2的纳米反应器在体内的分布研究：
(1)建立荷瘤裸鼠模型：收集对数生长的M231细胞分散于PBS中，细胞密度为1×107/100μL，等体积与基质胶混合，注射于BALB/c裸鼠(雌性，6周)的腋下部位。雌性BALB/c裸鼠，6周龄，购自常州卡文斯实验动物有限公司。
(2)处理：待小鼠肿瘤增长至200mm3时，分别给小鼠尾静脉注射游离Ce6和PTFCG@MH(Ce6，2.5mg/kg)。
(3)检测：分别在注射后1h和24h麻醉小鼠，活体成像系统对小鼠进行成像。24h活体成像后，将小鼠处死，取出心肝脾肺肾和肿瘤，成像系统进行成像。
图17为药物在体内的分布研究。分别给裸鼠尾静脉注射游离Ce6和PTFCG@MH，分别在不同时间点拍摄。分别为尾静脉注射后1h和24h的小鼠体内荧光分布图，及注射24h后，将小鼠处死，心、肝、脾、肺、肾和肿瘤的荧光分布图。
从图17中可知：1h时，注射游离Ce6的小鼠荧光强度强于注射PTFCG@MH的小鼠，24h后两只小鼠荧光强度相反。24h后，注射PTFCG@MH的小鼠肿瘤部位荧光强度要强于其他部位，而注射游离Ce6的小鼠无此趋势。离体肿瘤中，注射PTFCG@MH的小鼠肿瘤荧光强度明显强于注射游离Ce6的荧光强度。表明本发明的纳米反应器可在肿瘤部位蓄积，对肿瘤具有靶向性。
实施例7
考察实施例1和实施例2的纳米反应器的体内抗肿瘤活性：
按照实施例6的方法处理小鼠，待荷瘤小鼠肿瘤长至100mm3左右时，将小鼠随机分成5组(n＝5)，每组在第0、4天分别注射PBS，PTFCG@MH，PTFCG，每两天给小鼠称重并用游标卡尺测量肿瘤的体积至第14天，通过各组肿瘤的相对体积比较各组抗肿瘤效率。肿瘤体积计算公式：V＝长×宽2/2。
图18为分别在第0、4天分别注射PBS，PTFCG@MH，PTFCG并给予激光照射后的肿瘤体积变化曲线；其中G1为PBS，G2为Ce6+激光，G3为PTFCG+激光，G4为PTFCG@MH，G5为PTFCG@MH+激光。
图19为各组肿瘤组织H&E染色图。其中G1为PBS，G2为Ce6+激光，G3为PTFCG+激光，G4为PTFCG@MH，G5为PTFCG@MH+激光。
从图18中可知，与PBS组相比，Ce6+激光，PTFCG+激光，PTFCG@MH，PTFCG@MH+激光均具有一定的抗肿瘤效果，其中PTFCG@MH+激光组肿瘤抑制效果最强。从图19图中可知，PTFCG@MH+激光组具有最多的肿瘤坏死区域。结果表明，纳米反应器可实现增强的光动力治疗，具有较强的抗肿瘤疗效。
实施例8
考察实施例1和实施例2的纳米反应器的体内安全性：
按照实施例6的方法处理小鼠，给药第14天后，处死四组小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾，生理盐水洗涤，滤纸吸干水分，4％多聚甲醛固定24h。将组织石蜡包埋、切片、HE染色，利用光学显微镜观察病理改变。
图20为各组小鼠的体重变化，都未出现明显的体重降低。图21为各组小鼠心、肝、脾、肺、肾病理切片分析。标尺＝100μm。与PBS组相比，其他三组各器官无明显病理改变。说明纳米纳米反应器体内安全性良好。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种纳米反应器，其特征在于，所述纳米反应器包括核壳纳米粒和层层包裹在所述核壳纳米粒表面的二氧化锰和靶向配体；所述核壳纳米粒由金属有机框架、光敏剂、葡萄糖氧化酶和被金属有机框架包裹的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米内核形成，所述金属有机框架由鞣酸和铁通过配位作用形成；所述靶向配体为透明质酸。
2.根据权利要求1所述的纳米反应器，其特征在于，所述光敏剂为二氢卟吩纳米光敏剂；优选的，所述光敏剂为二氢卟吩e6。
3.根据权利要求1所述的纳米反应器，其特征在于，所述透明质酸分子量为7000。
4.根据权利要求1所述的纳米反应器，其特征在于，所述光敏剂和葡萄糖氧化酶的药载比为2-3:1。
5.根据权利要求1所述的纳米反应器，其特征在于，所述纳米反应器中铁含量为0.2％-0.5％，锰含量为4％-8％。
6.根据权利要求1所述的纳米反应器，其特征在于，所述纳米反应器为球形核壳结构。
7.一种权利要求1至6中任一项所述纳米反应器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将光敏剂、氯化铁、聚乳酸--羟基乙酸共聚物溶于丙酮中作为有机相，将葡萄糖氧化酶、鞣酸溶于纯水中作为水相；
S2、将有机相缓慢滴入水相中，超声搅拌、离心清洗得核壳纳米粒；
S3、将聚丙烯亚胺，高锰酸钾依次滴入核壳纳米粒溶液中，搅拌得二氧化锰包裹的核壳纳米粒；
S4、将靶向配体滴入S3所述的核壳纳米粒溶液中，离心清洗即得纳米反应器。
8.一种权利要求1至6中任一一项所述纳米反应器在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。
9.一种权利要求1至6中任一一项所述纳米反应器在制备恶性肿瘤光动力治疗的靶向纳米药物的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所说恶性肿瘤为三阴性乳腺癌细胞。
CN202011562255.9A 2020-12-25 2020-12-25 一种纳米反应器及其制备方法和应用 Active CN112773895B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011562255.9A CN112773895B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 一种纳米反应器及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011562255.9A CN112773895B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 一种纳米反应器及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112773895A true CN112773895A (zh) 2021-05-11
CN112773895B CN112773895B (zh) 2021-12-17

Family

ID=75752485

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011562255.9A Active CN112773895B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 一种纳米反应器及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112773895B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113599506A (zh) * 2021-05-31 2021-11-05 长沙理工大学 一种铂纳米酶/葡萄糖氧化酶@透明质酸复合抗菌材料及其制备和应用
CN114177311A (zh) * 2021-11-30 2022-03-15 郑州大学 一种葡萄糖氧化酶修饰的铁基金属有机框架纳米载药系统的制备方法及应用
CN114259476A (zh) * 2021-12-29 2022-04-01 中南大学湘雅三医院 一种调控巨噬细胞的纳米制剂及其制备方法与应用
CN114917248A (zh) * 2022-05-27 2022-08-19 中山大学附属第三医院 胞内自供给过氧化氢的纳米材料及其制备方法和应用
CN114949247A (zh) * 2022-04-29 2022-08-30 中南大学 一种可稳定装载dna的杂化纳米粒及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108939072A (zh) * 2018-07-13 2018-12-07 湖北大学 一种用于肿瘤光动力治疗的纳米载体及其制备方法
CN110585169A (zh) * 2019-09-12 2019-12-20 郑州大学 一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法
US10675250B1 (en) * 2018-12-22 2020-06-09 National Tsing Hua University Nanoparticle, preparation process and uses thereof
CN111297830A (zh) * 2020-03-10 2020-06-19 徐州医科大学附属医院 一种介导光疗的新型分级靶向纳米粒及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108939072A (zh) * 2018-07-13 2018-12-07 湖北大学 一种用于肿瘤光动力治疗的纳米载体及其制备方法
US10675250B1 (en) * 2018-12-22 2020-06-09 National Tsing Hua University Nanoparticle, preparation process and uses thereof
CN110585169A (zh) * 2019-09-12 2019-12-20 郑州大学 一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法
CN111297830A (zh) * 2020-03-10 2020-06-19 徐州医科大学附属医院 一种介导光疗的新型分级靶向纳米粒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LU ZHANG, ET AL.: "An Adenosine Triphosphate-Responsive Autocatalytic Fenton Nanoparticle for Tumor Ablation with Self-Supplied H2O2 and Acceleration of Fe(III)/Fe(II) Conversion", 《NANO LETT.》 *
XUE YANG, ET AL.: "Biomimetic Hybrid Nanozymes with Self-Supplied H+ and Accelerated O2 Generation for Enhanced Starvation and Photodynamic Therapy against Hypoxic Tumors", 《NANO LETT.》 *
孙少平等: "《高分子材料在纳米给药系统中的应用》", 31 August 2017, 哈尔滨：黑龙江大学出版社 *
郝永伟: "基于锰纳米材料的肿瘤微环境响应式治疗成像系统基础研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)医药卫生科技辑》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113599506A (zh) * 2021-05-31 2021-11-05 长沙理工大学 一种铂纳米酶/葡萄糖氧化酶@透明质酸复合抗菌材料及其制备和应用
CN113599506B (zh) * 2021-05-31 2023-07-21 长沙理工大学 一种铂纳米酶/葡萄糖氧化酶@透明质酸复合抗菌材料及其制备和应用
CN114177311A (zh) * 2021-11-30 2022-03-15 郑州大学 一种葡萄糖氧化酶修饰的铁基金属有机框架纳米载药系统的制备方法及应用
CN114177311B (zh) * 2021-11-30 2023-08-15 郑州大学 一种葡萄糖氧化酶修饰的铁基金属有机框架纳米载药系统的制备方法及应用
CN114259476A (zh) * 2021-12-29 2022-04-01 中南大学湘雅三医院 一种调控巨噬细胞的纳米制剂及其制备方法与应用
CN114949247A (zh) * 2022-04-29 2022-08-30 中南大学 一种可稳定装载dna的杂化纳米粒及其制备方法与应用
CN114949247B (zh) * 2022-04-29 2023-09-05 中南大学湘雅医院 一种可稳定装载dna的杂化纳米粒及其制备方法与应用
CN114917248A (zh) * 2022-05-27 2022-08-19 中山大学附属第三医院 胞内自供给过氧化氢的纳米材料及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112773895B (zh) 2021-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112773895B (zh) 一种纳米反应器及其制备方法和应用
He et al. Tumor pH-responsive metastable-phase manganese sulfide nanotheranostics for traceable hydrogen sulfide gas therapy primed chemodynamic therapy
Zhang et al. Janus γ-Fe2O3/SiO2-based nanotheranostics for dual-modal imaging and enhanced synergistic cancer starvation/chemodynamic therapy
Wang et al. Platelet membrane biomimetic bufalin-loaded hollow MnO2 nanoparticles for MRI-guided chemo-chemodynamic combined therapy of cancer
Tian et al. Ellagic acid-Fe@ BSA nanoparticles for endogenous H2S accelerated Fe (III)/Fe (II) conversion and photothermal synergistically enhanced chemodynamic therapy
An et al. ROS-augmented and tumor-microenvironment responsive biodegradable nanoplatform for enhancing chemo-sonodynamic therapy
Han et al. Duplex metal co-doped carbon quantum dots-based drug delivery system with intelligent adjustable size as adjuvant for synergistic cancer therapy
Yao et al. On-demand CO release for amplification of chemotherapy by MOF functionalized magnetic carbon nanoparticles with NIR irradiation
Wang et al. Oxygen-supplementing mesoporous polydopamine nanosponges with WS2 QDs-embedded for CT/MSOT/MR imaging and thermoradiotherapy of hypoxic cancer
Liu et al. Nanoscale metal− organic frameworks for combined photodynamic & radiation therapy in cancer treatment
Liu et al. Nanoscale‐coordination‐polymer‐shelled manganese dioxide composite nanoparticles: a multistage redox/pH/H2O2‐responsive cancer theranostic nanoplatform
Zhu et al. Ru@ CeO2 yolk shell nanozymes: Oxygen supply in situ enhanced dual chemotherapy combined with photothermal therapy for orthotopic/subcutaneous colorectal cancer
Hu et al. Oxygen-generating hybrid polymeric nanoparticles with encapsulated doxorubicin and chlorin e6 for trimodal imaging-guided combined chemo-photodynamic therapy
Wang et al. Orthogonal near-infrared upconversion co-regulated site-specific O2 delivery and photodynamic therapy for hypoxia tumor by using red blood cell microcarriers
Jing et al. Intelligent nanoflowers: a full tumor microenvironment-responsive multimodal cancer theranostic nanoplatform
Jing et al. Multistage tumor microenvironment-responsive theranostic nanopeanuts: toward multimode imaging guided chemo-photodynamic therapy
Tang et al. Self-accelerating H2O2-responsive plasmonic nanovesicles for synergistic chemo/starving therapy of tumors
Cao et al. Tablet-like TiO2/C nanocomposites for repeated type I sonodynamic therapy of pancreatic cancer
Yan et al. Ultrasmall hybrid protein–copper sulfide nanoparticles for targeted photoacoustic imaging of orthotopic hepatocellular carcinoma with a high signal-to-noise ratio
CN110408047B (zh) 纳米配位聚合物及其制备方法和应用
Jing et al. Tumor microenvironment self-regulation: Bimetallic metal nanozyme-derived multifunctional nanodrug for optimizable cascade catalytic reaction-synergetic anti-tumor theranostics
Yin et al. Cleavable collagenase-assistant nanosonosensitizer for tumor penetration and sonodynamic therapy
CN112999153B (zh) 载化疗药物/光敏剂的纳米胶束及其制备方法和应用
Huang et al. Oxygen-sufficient nanoplatform for chemo-sonodynamic therapy of hypoxic tumors
Zhang et al. An intelligent hypoxia-relieving chitosan-based nanoplatform for enhanced targeted chemo-sonodynamic combination therapy on lung cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: No.61 Jiefang West Road, Changsha, Hunan 410000

Applicant after: Hunan Provincial People's Hospital (the First Affiliated Hospital of Hunan Normal University)

Address before: No.61 Jiefang West Road, Changsha, Hunan 410000

Applicant before: HUNAN PROVINCIAL PEOPLE'S Hospital

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant