CN107412786A - 一种基因载体系统的制备与应用 - Google Patents

一种基因载体系统的制备与应用 Download PDF

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何伟
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Abstract

本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种基因载体系统的制备与应用。所述基因载体系统为一种阳离子化β‑乳球蛋白与紫杉醇形成的纳米晶，所述纳米晶的粒径为140‑180nm。本发明的基因载体系统中，纳米晶能够与基因发生静电结合形成复合物，保护基因免于被RNA酶降解，因此是一种可用于基因治疗的良好的基因载体系统。与现有的基因递送体系相比，本发明不含有毒性较大的聚合物和易引起过敏反应的溶剂，因此安全性有很大的提高。在小鼠药效学实验中，本发明显示出较好的治疗效果。

Description

一种基因载体系统的制备与应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种基因载体系统的制备与应用。
背景技术
基因药物在疾病的治疗方面发挥着重要的作用，病毒载体和非病毒载体是目前用于基因治疗的两大载体。
病毒载体的临床安全性差，难以实现广泛应用。非病毒类载体主要包括阳离子聚合物PEI和阳离子脂质体Lipofectamine 2000等，但此类载体具有明显的体内外毒性，且在溶酶体逃逸过程中基因容易被降解，难以实现细胞浆递送。
β-乳球蛋白为脂笼蛋白家族成员，含162个氨基酸，分子量约为18400Da，是鲜奶中蛋白质的一种，安全无毒，生物相容性好，能作为难溶性抗肿瘤药物(如：紫杉醇)载体，绕开溶酶体细胞摄取途径，实现药物的细胞质递送。鉴于目前基因递送存在的问题，本发明将β-乳球蛋白进行阳离子化处理后，利用其与难溶性抗肿瘤药物紫杉醇良好的疏水作用力，形成的阳离子化乳球蛋白/紫杉醇纳米结晶作为基因载体，体系构成简单，构建容易，毒性低，可实现基因的细胞质递送。
发明内容
本发明的目的之一在于构建一种基因载体。本发明使用一种安全性高的β-乳球蛋白，将其阳离子化后与紫杉醇形成阳离子化β-乳球蛋白//紫杉醇纳米晶作为基因递送载体。
本发明的目的之二在于提供该种基因载体的制备方法，该制备方法工艺简单，制备过程易控，制备的纳米晶质量稳定。
本发明的目的之三在于提供该种基因载体在基因递送中的用途。
本发明提供以下技术方案：
1)以β-乳球蛋白为原料，采用酰化反应合成胺基修饰的阳离子化β-乳球蛋白。
采用的胺基修饰试剂为乙二胺，加入盐酸和蒸馏水，配制成pH～4.74的乙二胺缓冲液；采用的催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；反应温度为室温；反应时间为2小时；反应2小时后，采用pH～4.74的醋酸盐缓冲液终止反应40分钟；反应结束后，将反应液转移到透析袋中，置于31％(w/v)的聚乙二醇20000中浓缩除去残留的乙二胺，待乙二胺除尽后，将透析袋置于蒸馏水中纯化3天后，冷冻干燥收集样品。
2)采用共沉淀-探头超声法将阳离子化β-乳球蛋白与紫杉醇制备成纳米晶作为基因载体。
将紫杉醇原料药加入丙酮中，超声溶解后作为有机相；将阳离子化β-乳球蛋白加入蒸馏水中，搅拌溶解；在搅拌的条件下将有机相加入到水相中，20～30秒后在冰浴条件下探头超声10-15分钟，制得阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶；采用减压蒸发的方法除去纳米晶中残留的丙酮。所述搅拌条件优选转速不低于1200/分钟进行搅拌，仪器可采用磁力搅拌器和电动搅拌器。
3)纳米晶与基因复合物的制备。
在超净台中，用无菌无酶水将基因稀释到不同浓度，使阳离子化β-乳球蛋白与基因的质量比为16～320∶1；将制得的阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶和基因于1分钟内在温和涡旋的条件下等体积混合，室温孵育30分钟后，二者通过静电作用力结合，制得纳米晶与基因复合物。
本发明所用的原料或者试剂，均市售可得。
采用动态光散射纳米粒径仪(ZetaPlus)，透射电镜等对阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶和纳米晶与基因复合物进行表征。
采用琼脂糖凝胶电泳对纳米晶与基因复合物的形成进行验证。
本发明的阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶具有制备工艺简单，安全性高，基因转染效率高，抗肿瘤药效好等特点。
附图说明
图1为本发明中阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶和纳米晶与基因复合物的粒径分布图。
图2为本发明中纳米晶与基因结合能力的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明中阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶和纳米晶与基因复合物在pH7.4条件下的体外释放曲线。
图4为本发明中阳离子化β-乳球蛋白与阳离子聚合物聚醚酰亚胺(PEI)的细胞毒性对比图。
图5为本发明中纳米晶与基因复合物细胞摄取机制图。
图6为本发明中纳米晶与基因复合物体外细胞转染免疫印迹试验图，1：对照组，2：阳离子化β-乳球蛋白组，3：泰素组，4：阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶组，5：纳米晶与基因复合物组。
图7为本发明中阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶和纳米晶与基因复合物在荷瘤小鼠体内的肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
实例1：
制备工艺：
称取紫杉醇20mg，溶于1mL丙酮作为有机相；称取10mg阳离子化β-乳球蛋白，于10mL蒸馏水中搅拌溶解；将有机相和水相在搅拌(1200转/分钟)条件下混合20秒，转移至探头超声，冰浴条件下450W超声10分钟；通过减压蒸发法将残留的丙酮除去；制得阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶。
粒径结果见图1，阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶的粒径为130nm。
实例2：
阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶选用实例1中的制剂，基因选用let-7a，将let-7a用无RNA酶无菌水稀释至62.5μg/mL，实例1中的阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶和基因let-7a于1分钟内在温和涡旋的条件下等体积混合，室温孵育30分钟后，二者通过静电作用力结合，制得纳米晶与基因复合物。
粒径结果见图1，纳米晶/基因复合物的粒径为178nm。
实例3：
琼脂糖凝胶电泳验证纳米晶/基因复合物的形成：
电泳缓冲液的配制：称取Tris碱54g，硼酸27.5g，量取0.5M乙二胺四乙酸二钠(pH8.0)20mL，用蒸馏水定容至1L，配置成5×TBE缓冲液；取该缓冲液200mL，定容至1L配置成1×TBE缓冲液；称取1.8g的琼脂糖，加入1×TBE缓冲液150mL，微波加热溶解后倒入电泳槽内，室温条件下凝固，配制成0.8％的琼脂糖凝胶。
基因let-7a用无RNA酶无菌水稀释至3.125μg/mL，将实例1中的阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶用无菌水分别稀释至含阳离子化β-乳球蛋白1mg/mL、400μg/mL、200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、12.5μg/mL和6.25μg/mL；取稀释的纳米晶和let-7a各6μL，在温和涡旋的条件下混合，室温孵育30分钟后，每个样品中加入3μLGelRed后混匀。将样品上样后，在110V条件下电泳15分钟后，用凝胶成像仪进行成像。
实验结果见图2，阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶与基因let-7a在质量比16～320时形成纳米晶/基因复合物。
实例4：
阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶，纳米晶/基因复合物的体外释放评价：取阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶和纳米晶/基因复合物于透析袋(截留分子量3500Da)内，两端用棉线扎紧，置于50mL离心管内，各加入释放介质(pH 7.4)30mL，置于37℃恒温水浴振荡器中，转速为100转/分钟，分别于1、2、4、6、8、12、24、36和48小时取释放介质1mL于离心管中，过0.22μm水膜，弃初滤液，取续滤液于进样小瓶，于高效液相色谱仪进样，计算药物累积释放量。
实验结果见图3，阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶和纳米晶/基因复合物在48小时的体外累积释放率约为40％。
实例5：
阳离子化β-乳球蛋白和聚醚酰亚胺的细胞毒性评价：将A549和4T1细胞以5000个/孔接种于96孔板中，分别孵育24和48小时后，将阳离子化β-乳球蛋白和聚醚酰亚胺加入到96孔板中，给药浓度为100μg/mL，孵育48小时后，取20μL四甲基偶氮唑蓝(5mg/mL)加入各孔内，继续孵育4小时，弃去孔内液体，加入二甲亚砜200μL，振摇，使结晶充分溶解，在490nm波长下用酶标仪测定各样品的吸光度值，同时测定空白组吸光度值，并计算细胞存活率。
实验结果见图4，同浓度条件下，阳离子化β-乳球蛋白在A549和4T1细胞中的存活率均大于80％，而聚醚酰亚胺在A549和4T1细胞中的存活率仅有2～3％，说明阳离子化β-乳球蛋白的细胞相容性强，安全性高。
实例6：
纳米晶/基因复合物的细胞摄取机制验证：将4T1细胞接种在12孔细胞培养板中，每孔2×105个，孵育48小时后，分别用细胞摄取途径抑制剂，制霉菌素(10μm)和甲基-β-环糊精(2.5mM)的新鲜培养基在37℃下孵育30分钟，用磷酸盐缓冲液漂洗后加入纳米晶/基因复合物共培养2小时，再次用磷酸盐缓冲液漂洗，用0.25％胰酶消化细胞，吹悬后用流式细胞仪检测荧光强度。
实验结果见图5，纳米晶/基因复合物的细胞摄取被制霉菌素和甲基-β-环糊精分别抑制了约50％和30％，说明纳米晶/基因复合物的细胞摄取途径是通过小窝蛋白介导。
实例7：
纳米晶/基因复合物体外转染实验：将4T1细胞接种在12孔细胞培养板中，每孔2×105个，孵育48小时后，分别用磷酸盐缓冲液，阳离子化β-乳球蛋白，泰素组，阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶，纳米晶与基因复合物进行处理，其中紫杉醇和基因let-7a的给药浓度分别是10μg/mL和100nM，处理6小时后，用磷酸盐缓冲液洗涤，用含10％血清的新鲜培养基孵育24小时后进行蛋白提取，SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测。
实验结果见图6，纳米晶/基因复合物对靶蛋白KRAS产生了显著的抑制效果，表明纳米晶/基因复合物的高体外转染效率。
实例8：
阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶的制备：为实例1中的制剂，用蒸馏水稀释成每1mL含1mg紫杉醇的纳米晶。
纳米晶/基因复合物的制备：为实例2中的制剂。
药效学评价：以Balb/C小鼠(18-20g)为动物模型，对阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶和纳米晶/基因复合物的体内抗肿瘤效果进行考察。
1)荷4T1小鼠乳腺癌模型的建立：收集对数生长期4T1细胞，以RPMI 1640调整细胞浓度为1×107个/mL，于Balb/C小鼠左侧腋下进行无菌皮下接种，接种数量为0.1mL细胞悬液，细胞总数为1×106个。
2)实验动物的分组和处理：待肿瘤体积生长至100-200mm3时，将小鼠随机分成3组，每组10只，分别注射阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶和纳米晶/基因复合物，以注射生理盐水为对照组，每3天给药一次，连续给药5次，给药剂量为紫杉醇10mg/kg，基因let-7a1mg/kg，与此同时将等体积的生理盐水注射到小鼠体内作为阴性对照。
3)体内抗肿瘤活性研究：给药前对小鼠的肿瘤以及体重大小进行测量。采用游标卡尺量取肿瘤的最大直径和最小直径，用公式：肿瘤体积＝0.5×最大直径×(最小直径)2，计算肿瘤体积。治疗结束后脱颈处死所有的老鼠。
实验结果见图7，在治疗结束后，纳米晶/基因复合物治疗的小鼠相对肿瘤生长率最低，该制剂显示出最好的治疗效果。

Claims (10)

1.一种用于基因治疗的基因载体系统，由一种阳离子化β-乳球蛋白与紫杉醇形成的纳米晶构成。
2.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于：
1)所述阳离子化β-乳球蛋白与紫杉醇的质量比为1∶0.05～5；
2)所述纳米晶的粒径为140-180nm；
3)所述纳米晶的电位为+20～+30mV。
3.根据权利要求1所述的基因载体系统，基因以静电结合的方式与阳离子化β-乳球蛋白与紫杉醇形成的纳米晶结合形成纳米晶/基因复合物。
4.根据权利要求3所述的纳米晶/基因复合物，其特征在于：
1)所述纳米晶/基因复合物的粒径为150-200nm；
2)所述纳米晶/基因复合物的电位为+10～+20mV。
5.根据权利要求1-3所述的阳离子化β-乳球蛋白的合成方法，其特征在于：以乳球蛋白为原料，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为催化剂，加入乙二胺缓冲液，待溶液室温搅拌2小时后，加入醋酸盐缓冲液室温条件下终止反应40分钟，得到阳离子化的β-乳球蛋白溶液，进行浓缩和透析纯化后，冻干收集产物。
6.根据权利要求1-3所述的一种基因载体系统的制备方法，其特征在于：
1)将紫杉醇原料药加入丙酮中，超声溶解后作为有机相；
2)将阳离子β-乳球蛋白粉末加入到蒸馏水中，搅拌溶解，作为水相；
3)在搅拌的条件下将有机相加入水相中，20～30秒后冰浴条件下探头超声10-15分钟；
4)通过减压蒸发法除去残留的丙酮，得到阳离子化β-乳球蛋白/紫杉醇纳米晶。
7.根据权利要求3所述的纳米晶/基因复合物的制备方法，其特征在于：
1)阳离子化β-乳球蛋白与基因的质量比为16～320∶1；
2)纳米晶/基因按以上质量比进行等体积混合，混合后室温孵育30分钟，得到纳米晶/基因复合物。
8.根据权利要求5所述的阳离子化β-乳球蛋白的合成方法，其特征在于：所述浓缩和纯化过程中所使用的透析袋的截留分子量为3500Da。
9.根据权利要求6所述的一种基因载体系统的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述的搅拌条件是转速不低于1200转/分钟。
10.根据权利要求1所述的阳离子化β-乳球蛋白与紫杉醇纳米晶基因载体系统在抗肿瘤基因治疗中的应用。
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