CN108498804A - 一种基于小分子药物与大分子药物的组合物以及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种基于小分子药物与大分子药物的组合物以及制备方法。所述载体系统为阳离子化材料如β‑乳球蛋白、白蛋白、多糖、高分子材料、磷脂等与小分子难溶药物形成的纳米晶或颗粒，该纳米晶或颗粒能与大分子药物如基因、酶、蛋白、多肽、抗原、抗体等发生静电结合，保护大分子药物在递送过程中的稳定性，是一种良好的大分子药物递送系统。与现有的大分子药物递送系统相比，本发明不含有毒性较大的聚合物和容易引起过敏反应的有机试剂，且载药量高达800％，显示出较好的治疗效果。大分子药物(如基因、酶、蛋白、多肽、抗原、抗体等)以静电结合的方式与小分子难溶药物形成的纳米晶或颗粒结合形成复合物，该复合物具有绕过溶酶体吞噬，将大分子药物递送至胞浆，避免溶酶体对大分子药物破坏的特性。

Description

一种基于小分子药物与大分子药物的组合物以及制备方法
技术领域
本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种大分子药物递送系统的制备以及应用。
背景技术
大分子药物如基因、蛋白与多肽等的治疗功效远优于小分子药物。一般而言，小分子药物杀灭一个肿 瘤细胞需要10,000个分子以上，而大分子药物仅需要1-2个分子，极为高效。尽管如此，大分子药物的递 送非常具有挑战性。
传统的阳离子载体一般需要通过溶酶体逃逸，才能实现大分子药物的胞内递送；但效率极低，只有＜2％ 的大分子药物能实现溶酶体逃逸。因此，如果能绕开溶酶体递送大分子药物，效率将会得到根本的提高。
蛋白、多糖、磷脂等材料安全无毒，生物相容性理想，生物可降解。可以作为小分子药物(包括但不 局限于紫杉醇、黄芩素、吲哚美辛、洛伐他汀、阿托伐他汀、喜树碱、阿霉素、布洛芬、氯丙嗪、地高辛、苯 妥英、格列吡嗪、那非那韦、萘普生、氯噻嗪、环丙沙星、两性霉素B、多粘菌素、双氯芬酸、氧氟沙星、环 丙沙星、卡马西平、他克莫司、沙奎那韦、格列本脲等)的递送载体，绕开溶酶体摄取途径，实现药物的细胞 质递送。鉴于目前大分子药物递送存在的问题，本发明将阳离子化材料(如β-乳球蛋白、白蛋白、多糖等进 行阳离子化处理后得到)，与难溶性小分子药物良好的疏水作用力，形成阳离子化材料/小分子药物纳米晶或颗 粒作为大分子药物递送载体，体系构成简单，构建容易，毒性低，可以实现基因的细胞质递送。
发明内容
本发明的目的之一在于构建一种大分子药物递送载体。本发明将阳离子化材料(如β-乳球蛋白、白 蛋白、多糖进行阳离子化处理后得到)，与难溶性小分子药物良好的疏水作用力，形成阳离子化材料/小分子药 物纳米晶或颗粒作为大分子药物递送载体。
本发明的目的之二在于提供该大分子药物递送系统的制备方法，该制备方法简单易重现，使用的材料 安全无毒，制备的纳米载体稳定可控。
本发明的目的之三在于阐述该药物递送系统在大分子递送系统中的应用。
将通过具体的小分子药物如(黄芩素、紫杉醇、阿托伐他汀、洛伐他汀、阿霉素、硝苯地平等)以及 大分子药物(miRNA、siRNA、DNA、多肽、蛋白、基因、抗体等)具体阐述本发明，但并不因此将发明限制在所 列举实例中。
本发明提供以下技术方案：
1)以β-乳球蛋白为例，采用酰化反应合成阳离子化β-乳球蛋白。
采用的酰胺修饰剂为乙二胺，加入盐酸和蒸馏水，配制成pH为4.74的乙二胺缓冲液；以1-(3-二甲 氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为催化剂，反应温度为室温，反应时间为2h；反应两小时后，采用pH为4.74 的醋酸盐缓冲液终止反应，反应结束后，将反应液转移到截留分子量为3500道尔顿的透析袋，置于31％(v/v) 的聚乙二醇20000中浓缩除去残留的乙二胺。乙二胺除去后，将透析袋置于蒸馏水中纯化3天后，冷冻干燥收 集样品。
采用共沉淀-探头超声法将阳离子化乳球蛋白与小分子药物制备纳米晶或颗粒作为大分子药物递送载 体。
将小分子药物加入到丙酮溶液中，超声溶解后作为有机相；将阳离子化材料溶解于蒸馏水中作为水相， 在搅拌的条件下将有机相加入到水相中搅拌完全，冰浴条件下于探头超声15min，超声结束后，采用减压蒸馏 除去有机相。所述搅拌条件转速不低于1200/分钟进行搅拌，仪器可以采用磁力搅拌器。
3)纳米晶/颗粒与大分子药物复合物的制备。
在超净台中，用无菌无酶水将大分子药物稀释到不同浓度，使阳离子化乳球蛋白与大分子质量比为 16∶1～320∶1；将制得的纳米晶与不同浓度的大分子药物溶液等体积混合，室温孵育三十分钟后，二者通过静电 相互作用结合，得到纳米晶或颗粒与大分子复合物。
采用动态光散射纳米粒径仪(Zetaplus)，透射电镜等对制得的阳离子化/小分子难溶药纳米晶或颗粒 和大分子复合物进行表征。
采用琼脂糖凝胶电泳对纳米晶/颗粒与大分子复合物的形成进行表征。
本发明的阳离子化材料/小分子药物纳米晶或颗粒以及大分子复合物制备方法简单，纳米粒稳定。
附图说明
图1为本发明实施例1中阳离子化乳球蛋白/小分子药物纳米晶以及大分子复合物的粒径分布图。
图2为本发明实施例1中纳米晶与大分子复合物的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为实施例1中纳米晶与纳米晶/大分子复合物细胞摄取机制图。
图4为实施例1中纳米晶与纳米晶/大分子复合物药物代谢动力学曲线图。
图5为本发明实施例2中阳离子化乳球蛋白/小分子药物纳米晶以及大分子复合物的粒径分布图。
图6为本发明实施例2中纳米晶与大分子复合物的琼脂糖凝胶电泳图。
图7为实施例2纳米晶与纳米晶/大分子复合物细胞摄取机制图。
图8为实施例2纳米晶与纳米晶/大分子复合物药物代谢动力学曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明，但并不因此将发明局限在所述的实施例中。
实施例1 阳离子化β-乳球蛋白/黄芩素纳米晶
制备工艺：
秤取黄芩素30mg，溶解于1mL丙酮中作为有机相，10mg阳离子化乳球蛋白溶于10mL蒸馏水中作 为水相。将有机相加入到水相中，搅拌均匀，冰浴条件下，探头超声15min，超声功率为450W。超声结束后， 通过减压蒸馏除去丙酮，制得阳离子化β-乳球蛋白/黄芩素纳米晶。
粒径结果见图1，阳离子化β-乳球蛋白/黄芩素纳米晶的粒径约为130nm。
实施例2：阳离子化β-乳球蛋白-黄芩素纳米晶/miRNA复合物
选用实例1中制得的阳离子化β-乳球蛋白/黄芩素纳米晶，miRNA选用miRNA105，将miRNA105用无 菌无酶水在超净台中稀释至62.5μg/mL，将实例1中制得的纳米晶溶液与miRNA105溶液等体积混合均匀，室 温孵育三十分钟，通过静电相互作用得到阳离子化β-乳球蛋白-黄芩素纳米晶体/miRNA复合物。
粒径结果见图1，纳米晶/miRNA复合物粒径约为150nm。
琼脂糖凝胶电泳验证纳米晶/miRNA复合物的形成：
电泳缓冲液的配制：秤取Tris碱54g，硼酸27.5g，量取0.5M乙二胺四乙酸二钠(pH8.0)20mL， 用蒸馏水定容至1L，配置成5×TBE缓冲液；取该缓冲液200mL，定容至1L配置成1×TBE缓冲液；秤取1.8g 的琼脂糖，加入1×TBE缓冲液150mL，微波炉加热后倒入电泳槽内，室温条件下凝固，配制成0.8％的琼脂糖凝 胶。
基因miRNA105用RNA酶无菌水稀释至3.125μg/mL，将实例1中制得的纳米晶用无菌水稀释至阳离子 化乳球蛋白1mg/mL、400μg/mL、200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、12.5μg/mL和6.25μg/mL。 取稀释的纳米晶和miRNA105各6μL，涡旋混合，室温孵育30min后，每个样品加入3μLGelRed后混匀。将样 品上样后，在110V下电泳15分钟后，用凝胶电泳仪成像.
实验结果见图2，阳离子化乳球蛋白-黄芩素纳米晶于基因miRNA105在质量比16～320时形成纳米晶/ 基因混合物。
纳米晶/基因复合物的细胞摄取机制验证：
将4T1细胞接种在12孔细胞培养板中，每孔2×105个，孵育48小时后，分别用细胞摄取途径抑制剂， 制霉菌素(10μM)和甲基-β-环糊精(2.5mM)的新鲜培养基在37℃下孵育30min，PBS漂洗后，加入纳米晶 /miRNA复合物共培养2小时，PBS漂洗，使用0.25％胰酶消化细胞，吹悬后用流式细胞仪检测荧光强度。
实验结果见图3，纳米晶/miRNA复合物的细胞摄取分别被制霉菌素和甲基-β-环糊精抑制了50％和60％。 说明细胞摄取途径主要是通过小窝蛋白介导。
纳米晶/基因复合物在大鼠体内药物代谢动力学验证：
取雄性SD大鼠18只，随机分为6组，给药前禁食12h，自由饮水，分别尾静脉注射游离荧光标记、 纳米晶制剂、纳米晶/miRNA制剂。静脉注射给药后采血时间点为0.08、0.17、0.33、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、 8.0、10、12、24h。
药物代谢动力学结果见图4。
实施例3 阳离子化β-乳球蛋白/PTX纳米晶
制备工艺：
秤取PTX 20mg，溶解于1mL丙酮中作为有机相，10mg阳离子化乳球蛋白溶于10mL蒸馏水中作为 水相。将有机相加入到水相中，搅拌均匀，冰浴条件下，探头超声15min，超声功率为450W。超声结束后，通 过减压蒸馏除去丙酮，制得阳离子化β-乳球蛋白/PTX纳米晶。
粒径结果见图5，阳离子化β-乳球蛋白/PTX纳米晶的粒径约为130nm。
实例4：阳离子化β-乳球蛋白-PTX纳米晶/蛋白复合物
选用实例3中制得的阳离子化β-乳球蛋白/PTX纳米晶，蛋白选用Cas3，将Cas3用无菌无酶水在超 净台中稀释至62.5μg/mL，将实例3中制得的纳米晶溶液液与蛋白溶液等体积混合均匀，室温孵育三十分钟， 通过静电相互作用得到阳离子化β-乳球蛋白-PTX纳米晶体/蛋白复合物。
粒径结果见图1，纳米晶/蛋白复合物粒径约为150nm。
琼脂糖凝胶电泳验证纳米晶/蛋白复合物的形成：
电泳缓冲液的配制：秤取Tris碱54g，硼酸27.5g，量取0.5M乙二胺四乙酸二钠(pH8.0)20mL， 用蒸馏水定容至1L，配置成5×TBE缓冲液；取该缓冲液200mL，定容至1L配置成1×TBE缓冲液；秤取1.8g 的琼脂糖，加入1×TBE缓冲液150mL，微波炉加热后倒入电泳槽内，室温条件下凝固，配制成0.8％的琼脂糖凝 胶。
Cas3蛋白用RNA酶无菌水稀释至3.125μg/mL，将实例3中制得的纳米晶用无菌水稀释至阳离子化乳 球蛋白1mg/mL、400μg/mL、200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、12.5μg/mL和6.25μg/mL。取 稀释的纳米晶和Cas3蛋白各6μL，涡旋混合，室温孵育30min后，每个样品加入3μLGelRed后混匀。将样品 上样后，在110V下电泳15分钟后，用凝胶电泳仪成像。
实验结果见图2，阳离子化乳球蛋白-PTX纳米晶与Cas3蛋白在质量比16～320时形成纳米晶/蛋白复合 物。
纳米晶/蛋白复合物的细胞摄取机制验证：
将4T1细胞接种在12孔细胞培养板中，每孔2×105个，孵育48小时后，分别用细胞摄取途径抑制剂， 细胞松弛素D(10μg/mL)、莫能菌素(200nM)、制霉菌素(10μM)+甲基-β-环糊精(2.5mM)、氯丙嗪(10μg/mL)、 制霉菌素(10μM)和甲基-β-环糊精(2.5mM)的新鲜培养基在37℃下孵育30min，PBS漂洗后，加入实例4 制得的纳米晶/蛋白复合物共培养2小时，PBS漂洗，使用0.25％胰酶消化细胞，吹悬后用流式细胞仪检测荧光 强度。
实验结果见图7，纳米晶/蛋白复合物的细胞摄取主要被制霉菌素和甲基-β-环糊精抑制，说明细胞摄 取途径主要是通过小窝蛋白介导。
纳米晶/蛋白复合物在大鼠体内药物代谢动力学验证：
取雄性SD大鼠18只，随机分为6组，给药前禁食12h，自由饮水，分别尾静脉注射游离荧光标记、 纳米晶制剂、纳米晶/蛋白制剂。静脉注射给药后采血时间点为0.08、0.17、0.33、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、 8.0、10、12、24h。
药物代谢动力学结果见图8。
实施例5 阳离子化β-乳球蛋白/洛伐他汀颗粒
制备工艺：
秤取洛伐他汀20mg，溶解于1mL丙酮中作为有机相，10mg阳离子化乳球蛋白溶于10mL蒸馏水中 作为水相。将有机相加入到水相中，搅拌均匀，冰浴条件下，探头超声15min，超声功率为450W。超声结束后， 通过减压蒸馏除去丙酮，制得阳离子化β-乳球蛋白/洛伐他汀纳米晶。
实施例6 阳离子化β-乳球蛋白/阿托伐他汀颗粒
制备工艺：
秤取阿托伐他汀20mg，溶解于1mL丙酮中作为有机相，10mg阳离子化乳球蛋白溶于10mL蒸馏水 中作为水相。将有机相加入到水相中，搅拌均匀，冰浴条件下，探头超声15min，超声功率为450W。超声结束 后，通过减压蒸馏除去丙酮，制得阳离子化β-乳球蛋白/阿托伐他汀纳米晶。
实施例7 阳离子化大豆分离蛋白/吲哚美辛纳米晶
制备工艺：
秤取吲哚美辛20mg，溶解于2mL丙酮中作为有机相，10mg阳离子化大豆分离蛋白溶于10mL蒸馏 水中作为水相。将有机相加入到水相中，搅拌均匀，冰浴条件下，探头超声15min，超声功率为450W。超声结 束后，通过减压蒸馏除去丙酮，制得阳离子化大豆分离蛋白/吲哚美辛颗粒。
实施例8 阳离子化乳球蛋白/喜树碱纳米晶
制备工艺：
秤取喜树碱20mg，溶解于1mL丙酮中作为有机相，10mg阳离子化乳球蛋白溶于10mL蒸馏水中 作为水相。将有机相加入到水相中，搅拌均匀，冰浴条件下，探头超声15min，超声功率为450W。超声结束后， 通过减压蒸馏除去丙酮，制得阳离子化乳球蛋白/喜树碱纳米晶。
实施例9 阳离子化乳球蛋白/硼替佐米纳米晶
制备工艺：
秤取硼替佐米20mg，溶解于1mL乙醇中作为有机相，10mg阳离子化乳球蛋白溶于10mL蒸馏水 中作为水相。将有机相加入到水相中，搅拌均匀，冰浴条件下，探头超声15min，超声功率为450W。超声结束 后，通过减压蒸馏除去丙酮，制得阳离子化乳球蛋白/硼替佐米纳米晶。
实施例10 阳离子化乳球蛋白/地高辛纳米晶
制备工艺：
秤取地高辛20mg，溶解于1mL乙醇中作为有机相，10mg阳离子化乳球蛋白溶于10mL蒸馏水中作 为水相。将有机相加入到水相中，搅拌均匀，冰浴条件下，探头超声15min，超声功率为450W。超声结束后， 通过减压蒸馏除去丙酮，制得阳离子化乳球蛋白/地高辛纳米晶。

Claims (10)

1.一种用于大分子药物递送的载体系统，由一种阳离子化材料和小分子难溶药物形成的纳米晶或颗粒构成。
2.根据权利要求书1所述的阳离子化材料，所述材料包括聚乙烯亚胺(PEG化修饰的聚乙烯亚胺、连接靶向配基的聚乙烯亚胺)、β-乳球蛋白、白蛋白、树形聚合物材料(聚合物亚胺树形聚合物、聚酰胺-胺型树形聚合物)、壳聚糖、明胶、鱼精蛋白、聚氨基酸类(聚-L-赖氨酸、聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物等)、聚精胺、聚合物前药(聚乙二醇前药物、HPMA前药、聚谷氨酸前药)、大豆分离蛋白、乳清分离蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等。
3.根据权利要求书1所述的小分子难溶药物，所述难溶性药物包括紫杉醇、黄芩素、吲哚美辛、洛伐他汀、阿托伐他汀、喜树碱、阿霉素、布洛芬、氯丙嗪、地高辛、苯妥英、格列吡嗪、那非那韦、萘普生、氯噻嗪、环丙沙星、两性霉素B、多粘菌素、双氯芬酸、氧氟沙星、环丙沙星、卡马西平、他克莫司、沙奎那韦、格列本脲等。
4.根据权利要求1所述的载体系统，其特征在于：
1)所述阳离子化材料与药物质量比为1∶1～1000∶1；
2)所述纳米晶或颗粒的粒径约为1-10000nm；
3)所述纳米晶或颗粒的电位约为0mv～+50mv。
5.根据权利要求1所述的大分子药物递送系统，大分子药物如抗体、酶、蛋白(转铁蛋白、CAS3、let-7a等)、多肽/寡肽(胰岛素、血管降压素、降钙素等)、寡核苷酸及基因(miRNA、siRNA、DNA、反义寡核苷酸、核酶、cDNA等)等以静电结合的方式与难溶药物形成的纳米晶或颗粒结合形成复合物。
6.根据权利要求1-5所述的复合物，其特征在于：
1)所述复合物的粒径为10-10000nm；
2)所述复合物的电位为0mv～+50mv；
3)所述复合物具有绕过溶酶体吞噬，将大分子药物递送至胞浆的优势。
7.根据权利要求1-2所述的阳离子化材料的合成方法，其特征在于：以乳球蛋白或其他球蛋白、多糖、磷脂、白蛋白及其衍生物、壳聚糖及其衍生物转铁、乳铁蛋白蛋白、大豆分离蛋白等为原料，将其溶解于乙二胺溶液中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为催化剂，室温搅拌反应两小时，加入醋酸缓冲液终止反应，浓缩后透析，冻干得到产物。
8.根据权利要求1-5所述的复合物的制备方法，其特征在于：
1)将阳离子化的材料溶解于蒸馏水中，作为水相备用。
2)将小分子药物溶解于丙酮或其他有机溶剂中，作为有机相备用。
3)在搅拌的条件下，将有机相缓慢滴加到水相中，冰浴条件下探头超声15min。
4)通过减压蒸馏法除去丙酮或其他有机溶剂，得到阳离子化药物纳米晶或颗粒。
9.根据权利要求1-5所述的复合物，其特征在于：
1)阳离子化的材料与基因质量比为1∶500-500∶1。
2)纳米晶或颗粒与大分子药物按质量比等体积混合，室温孵育半小时后，得到复合物。
10.根据权利要其特征在于：浓缩和透析过程中使用的透析袋为500Da-4000Da。
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