CN108578386B - 通过靶向肿瘤相关巨噬细胞递送抑制肿瘤生长的miRNA的药物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种通过靶向肿瘤相关巨噬细胞递送抑制肿瘤生长的miRNA的药物及应用。包括靶向肿瘤相关巨噬细胞的药物载体以及包裹在该药物载体内的miRNA和带有甘露糖残基的阳离子化多糖，所述miRNA的序列如SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2所示。本发明通过体外实验发现了miR‑99b‑5p可促进巨噬细胞M1型活化并抑制其M2型活化，运用靶向TAMs的纳米材料包裹miRNA，直接通过尾静脉输送给肝癌小鼠模型，发现靶向TAMs递送miRNA可显著抑制肿瘤的生长，而且靶向TAMs递送miR‑99b‑5p的抑制肿瘤生长作用优于递送其它miRNA，如miR‑125a。

Description

通过靶向肿瘤相关巨噬细胞递送抑制肿瘤生长的miRNA的药 物及应用

技术领域

本发明涉及肿瘤医学领域，具体涉及靶向肿瘤相关巨噬细胞递送miRNA抑制肿瘤生长的作用。

背景技术

巨噬细胞可大体上分为经典活化的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞，前者可由LPS和IFN-γ等诱导产生，高表达标志分子IL-12、TNF-α和IL-6等，发挥清除细菌、抗原提呈、促进炎性反应以及抗肿瘤等作用；后者可由IL-4等诱导产生，高表达标志分子甘露醇受体(mannose receptor，MR)、精氨酸酶-1和IL-10等，发挥抵御寄生虫感染、促进组织修复、抑制炎性反应以及促肿瘤等作用。肿瘤内的巨噬细胞，又称肿瘤相关巨噬细胞(Tumour-associated macrophages，TAMs)，是肿瘤炎症微环境的重要组成部分。在大多数的肿瘤组织中，TAMs的密度与肿瘤患者不良预后密切相关。TAMs在功能上类似于M2型巨噬细胞，可通过抑制抗肿瘤免疫反应和调节促肿瘤的炎性细胞等方式促进肿瘤的发生发展。已有研究证实，抑制M2样TAMs和/或促进M1样TAMs的功能能够抑制肿瘤的进展。

微小RNA(microRNA，miRNA)是长度约为22个核苷酸的非编码RNA，其通过与靶基因mRNA 3'-非翻译区(3'-untranslated region，3'-UTR)结合，抑制靶基因蛋白翻译，进而调控细胞的生物学功能。MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300～1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70～90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20～24nt的成熟miRNA。miRNA在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，引起研究人员越来越多的关注。随着对于miRNA作用机理的进一步的深入研究，以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究，将使mi RNA可能成为疾病诊断的新的生物学标记，还可能使得这一分子成为治疗靶点，或是模拟这一分子进行新药研发。

目前，传统的抗肿瘤分子靶向药物面临副作用大、易产生耐药性等缺陷，因而寻找靶向TAMs治疗肿瘤的药物显得尤为重要。目前仅见到少量具有选择性活化TAMs功能的miRNA(例如，MIMAT0000135)的报道，但仅发现其针对某些癌症，例如肺癌的抑制肿瘤生长的活性，而且将其实际应用于临床体内抗肿瘤的靶向药物还有待进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过靶向肿瘤相关巨噬细胞递送抑制肿瘤生长的miRNA的药物及应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种通过靶向肿瘤相关巨噬细胞递送抑制肿瘤生长的miRNA，该miRNA的序列如SEQ.ID.NO.1所示。

一种通过靶向肿瘤相关巨噬细胞抑制肿瘤生长的药物，包括靶向肿瘤相关巨噬细胞的药物载体以及包裹在该药物载体内的miRNA和可通过静电作用与miRNA结合的带有甘露糖残基的阳离子化多糖，所述miRNA的序列如SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2所示。

优选的，所述药物载体选自经过聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐。

优选的，所述多糖选自阳离子化葡甘聚糖，其通过形成纳米颗粒将miRNA包裹在内。葡甘聚糖是由分子比1:1.6～1.7的葡萄糖和甘露糖残基通过β-1，4糖苷键聚合而成的高分子杂多糖，其成分无毒无害，价格低廉，性价比优于其他多糖，如：魔芋多糖(杂质多于葡甘聚糖，粘度较高，并且价格高于葡甘聚糖)。

上述通过靶向肿瘤相关巨噬细胞抑制肿瘤生长的药物的制备方法，包括以下步骤：

1)将1g/L的miRNA生理盐水溶液与1g/L的阳离子化葡甘聚糖水溶液按体积比1:1～6混匀，得到miRNA和阳离子化葡甘聚糖的复合物溶液；

2)将所述复合物溶液与1g/L的聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐水溶液按体积比2～4:1混匀得到三聚物复合体的溶液(30～35μg miRNA/200μL)，所述三聚物复合体即为靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)并载有miRNA的药物。

优选的，所述阳离子化葡甘聚糖的制备方法包括以下步骤：

1.1)将230～270mg葡甘聚糖与10～15mL二甲基亚砜混合，得葡甘聚糖溶液；

1.2)向葡甘聚糖溶液中加入0.7～0.9g的N'N-羰基二咪唑后于15℃～25℃搅拌1～2h，得到活化葡甘聚糖溶液；

1.3)向活化葡甘聚糖溶液中加入1.2～1.4mL的乙二胺后于15℃～25℃搅拌10～16h，然后依次经透析、冷冻干燥，得到阳离子化葡甘聚糖。

优选的，所述聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐的制备方法包括以下步骤：

2.1)将100～150mg海藻酸钠与23～27mL二甲基亚砜混合，得海藻酸钠溶液；

2.2)向海藻酸钠溶液中加入230～270mg的N'N-羰基二咪唑后于15℃～25℃搅拌2～4h，得到活化海藻酸钠溶液；

2.3)向活化海藻酸钠溶液中加入480～520mg的组氨酸后于15℃～25℃搅拌10～16h，然后依次经透析、冷冻干燥，得到组氨酸修饰过的海藻酸盐；

2.4)将0.9～1.1g的吗啉乙磺酸(MES)和0.25～0.35g的氯化钠用去离子水溶解并定容到45～55mL，得混合液I；

2.5)向混合液I中加入0.08～0.12g的组氨酸修饰过的海藻酸盐，然后调节pH至5～7，得混合液II；

2.6)将0.025～0.035g的N-羟基丁二酰亚胺和0.008～0.012g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入混合液II中，然后于15℃～25℃反应12～14h，得到混合液II I；

2.7)将0.18～0.22g的聚乙二醇加入到混合液III中，然后15℃～25℃反应10～16h，反应结束后依次经透析、冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐。

上述抑制肿瘤生长的miRNA或药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述肿瘤选自肝癌。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过体外实验发现了miR-99b-5p可促进TAMs的M1型活化并抑制其M2型活化，运用靶向TAMs并递送miRNA的纳米材料包裹miR-99b-5p或miR-125a-5p，直接通过静脉输送给肝癌小鼠模型，发现靶向TAMs递送miRNA(miR-99b-5p或miR-125a-5p)可显著抑制肿瘤(肝癌肿瘤组织)的生长，而且靶向TAMs递送miR-99b-5p的抑制肿瘤生长作用优于递送其它miRNA(例如miR-125a-5p)。

附图说明

图1为聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐的红外光谱，其中，a表示修饰反应前的组氨酸海藻酸盐；b表示聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐。

图2为靶向TAMs递送miRNA的药物的构建流程图。

图3为不同细胞表面甘露糖受体相对表达量统计图，其中：***表示P＜0.001。

图4为小动物活体成像系统观察图，其中：1为肺，2为肾，3为脾，4为心，5为荷瘤肝脏。

图5为共聚焦显微镜观察结果图。

图6为荷瘤肝脏肿瘤组织生长情况统计图，其中：**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

图7为巨噬细胞mRNA表达水平，其中：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

一、靶向肿瘤相关巨噬细胞递送miRNA的纳米药物制备

1.阳离子化葡甘聚糖的制备

1)准确称取250mg的葡甘聚糖(KGM)，将其加至盛有12mL无水二甲亚砜(D MSO)的烧杯中；

2)将烧杯放在加热台均匀加热，直到葡甘聚糖彻底溶解，然后结束加热，等候其慢慢冷却到室温；

3)在冷却好的含葡甘聚糖的DMSO溶液中添加0.8g的N'N-羰基二咪唑(N,N'-Carbonyldiimidazole，CDI)，于室温搅拌1h，以使KGM的羟基基团活化；

4)在活化后的KGM的溶液中，添加1.3mL的乙二胺，室温搅拌12h；

5)选用7000Da分子量的透析袋，用去离子水室温搅拌透析4～5天，每天换水3次，然后使用真空冻干机将透析袋内液体冻干，获得阳离子化的葡甘聚糖。元素分析显示阳离子化的葡甘聚糖上的氮元素的含量为7.9％，提示修饰成功。

2组氨酸修饰海藻酸钠

1)准确称取125mg的海藻酸钠移至盛有25mL无水DMSO的烧杯中；

2)将烧杯放在加热台上均匀加热直到完全溶解，然后结束加热，等候其慢慢冷却到室温；

3)准确称取250mg的CDI试剂，将其添加至冷却好的含海藻酸钠的DMSO溶液中，在室温搅拌3h，以使海藻酸钠的羟基基团活化；

4)随后向活化的海藻酸钠的溶液里添加500mg的组氨酸，室温搅拌12h；

5)然后选用6000Da分子量的透析袋，使用去离子水室温搅拌透析4～5天，每天换水3次，然后用真空冻干机将透析袋内液体冻干，获得组氨酸修饰过的海藻酸盐，即组氨酸海藻酸盐。双波长分光光度法测定组氨酸海藻酸盐的pKa值在6.8～6.9，提示修饰成功。

3.聚乙二醇修饰组氨酸海藻酸盐

1)准确称取1.07g的吗啉乙磺酸(MES)和0.293g的氯化钠，将二者用去离子水充分溶解，定容到50mL待用，为I液；

2)准确称取0.1g的组氨酸海藻酸盐溶于10mL的I液中，用1mol/L的盐酸和/或氢氧化钠溶液调节pH在5～7，为II液；

3)准确称取0.03g的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和0.01g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入II液中，用于使组氨酸海藻酸盐的羧基和聚乙二醇的氨基发生酰胺反应，在室温反应12h，得III液；

4)称取0.2g的聚乙二醇2000加入到III液，室温搅拌，反应10h；

5)随后选用7000Da分子量的透析袋，使用去离子水透析4～5天，每天换水3次；透析完成后用真空冻干机将透析袋内液体冻干，得到聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐。通过红外光谱仪检测该修饰过程。如图1中红外光谱分析显示，相对于反应前的组氨酸海藻酸盐曲线(a)，聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐曲线(b)在3420cm^-1处出现了明显的N-H伸缩振动峰，在2350cm^-1处出现了明显的醛基C-H伸缩峰，在1680cm^-1处出现明显的C＝O伸缩振动峰。上述结果表明，聚乙二醇成功修饰组氨酸海藻酸盐。

4.miRNA&阳离子化葡甘聚糖的制备

参见图2，将100μg的miRNA溶于100μL的无菌生理盐水中，得IV液，将IV液与1g/L的阳离子化葡甘聚糖水溶液分别按体积比1:1，1:2，1:4，1:6及1:8的比例充分混匀，可见到原来清澈透亮的液体变浑浊，得到miRNA和阳离子化葡甘聚糖混合液，为V液。

检测V液中阳离子化葡甘聚糖和miRNA复合物的Zeta电位和粒径，发现当上述体积比超过1:4时，Zeta电位和粒径基本保持不变，因此确定miRNA生理盐水溶液和阳离子化葡甘聚糖溶液最佳体积比为1:4，见表1。

表1.Zeta电位和粒径分布

小鼠骨髓来源巨噬细胞按4×10⁶细胞/孔种在6孔板中，每孔2mL含M-CSF和10％胎牛血清的DMEM培养液(完全培养液)，细胞孵箱培养18～24小时后，吸弃培养液，用无菌P BS洗1遍，加入无血清的DMEM培养液和最佳混合体积比的Cy5标记的miRNA(由广州锐博生物科技有限公司合成)和阳离子化葡甘聚糖复合物，对照为只加Cy5标记的miRNA或阳离子化葡甘聚糖。6小时后吸弃培养液并更换为完全培养液。再过18～20小时后，通过流式细胞术检测miRNA递送效率，见表2。

表2.不同处理方式下miRNA递送效率

注：平均值±标准差。

以上结果显示miRNA进入巨噬细胞的效率很低，但采用上述方案的复合物能高效率地将miRNA递送至巨噬细胞内。

5.miRNA&阳离子化葡甘聚糖&聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐的制备

参见图2，将V液(miRNA生理盐水溶液和阳离子化葡甘聚糖溶液体积比为1:4)与1g/L的聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐水溶液分别按体积比1:1，2：1，4:1，6:1及8:1充分搅拌混匀得到三聚物复合体(miRNA、阳离子化葡甘聚糖和聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐)的溶液，即VI液。

检测VI液中三聚物复合体的Zeta电位和粒径，发现当体积比超过4:1时，Zeta电位和粒径基本保持不变，因此确定最佳体积比为4:1，参见表3。

表3.Zeta电位和粒径分布

在最佳体积比为4:1下，三聚物复合体(纳米颗粒)的miRNA载药率约为90.7％，其粒径约为210nm，按每只小鼠200μL(含32μg miRNA)的VI液通过尾静脉注射至小鼠体内。溶液中分布的纳米颗粒即为靶向TAMs并载有miRNA的药物。

二、靶向TAMs递送miRNA的纳米药物作用机理

2.1靶向TAMs的纳米材料

由于肿瘤内部为弱酸性环境，利用对pH敏感的材料，即聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐，该材料可包裹miRNA和阳离子化葡甘聚糖，使其在血液中保持稳定结构，而在肿瘤内部的弱酸性环境中该纳米材料解聚，释放其包裹的miRNA和阳离子化葡甘聚糖。

由于TAMs表面有甘露糖受体，阳离子化葡甘聚糖富含甘露糖残基，通过静电作用使得负电荷的miRNA与阳离子化葡甘聚糖结合，然后结合于TAMs表面的甘露糖受体，最终被巨噬细胞内吞入细胞内。

通过实时定量PCR进行检测，结果显示骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和TAMs表面均表达甘露糖受体，并且TAMs表达甘露糖受体明显高于骨髓来源的巨噬细胞，而Hepa 1-6肿瘤细胞几乎不表达甘露糖受体，如图3所示。以上结果提示，该纳米材料可靶向TAMs递送miRNA，而很少会递送给Hepa 1-6肿瘤细胞。

2.2可选择性活化M2型TAMs的miRNA

表4.miRNA序列

参见表4，本发明发现了1种可以体外选择性活化M2型TAMs的miRNA，即miR-99b-5p(参见SEQ.ID.NO.1)。miR-125a-5p(参见SEQ.ID.NO.2)为阳性参照，对照miRNA为通用无关miRNA。

三、检测纳米药物的靶向性

1.小动物活体成像系统检测药物的肿瘤靶向性

构建原位肝癌模型(具体指小鼠肝脏内接种肝癌Hepa 1-6细胞，以此构建原位肝癌模型)，尾静脉注射对照药物和治疗药物：

组I：200μL生理盐水；

组II：200μL含32μgCy5标记的miR-99b-5p的生理盐水；

组III：200μL VI液(含32μgCy5标记的miR-99b-5p&阳离子化葡甘聚糖&聚

乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐)；

6小时后解剖小鼠的肺、肾、脾、心和荷瘤肝脏，进行小动物活体成像系统观察，与组I和组II相比，组III，即运用靶向TAMs递送miRNA的纳米药物，可将miRNA递送入肿瘤内部，而在肺、肾、脾、心和正常肝脏组织中很少富集，如图4所示。

2.共聚焦显微镜观察靶向TAMs递送miRNA的纳米药物的细胞靶向性

将组II和组III的肿瘤组织进行免疫荧光染色，观察药物能否将miRNA递送至TAMs中。结果参见图5，共聚焦显微镜观察可见，与组II相比，组III，即运用靶向TAMs递送miRNA的纳米药物，可将miRNA递送入TAMs内部。

四、靶向TAMs递送miR-99b-5p具有抗肿瘤的治疗作用

1)构建小鼠原位肝癌模型，通过尾静脉注射对照药物和治疗药物，每隔4天注射一次，注射四次后观察肿瘤生长情况，药物注射如下：

组I：200μL生理盐水；

组II：200μL含32μg miR-99b-5p的生理盐水；

组III：200μL含32μg miR-125a-5p的生理盐水；

组IV：200μL VI液(含32μg对照miRNA&阳离子化葡甘聚糖&聚乙二醇修

饰的组氨酸海藻酸盐)；

组V：200μL VI液(含32μg miR-99b-5p&阳离子化葡甘聚糖&聚乙二醇修饰

的组氨酸海藻酸盐)；

组VI：200μL VI液(含32μg miR-125a-5p&阳离子化葡甘聚糖&聚乙二醇修

饰的组氨酸海藻酸盐)；

2)最后一次注射药物4天后，解剖小鼠，观察肿瘤生长情况，结果如图6所示，可见靶向TAMs递送miR-99b-5p可显著地抑制肿瘤生长。

五、选择性活化M2型TAMs的差异

将小鼠骨髓来源巨噬细胞按1×10⁶细胞/孔种在12孔板中，每孔1mL含M-CSF和10～12％胎牛血清的DMEM培养液(完全培养液)，细胞孵箱培养18～24小时后，吸弃培养液，用无菌PBS洗1遍，加入无血清的DMEM培养液和Lipofectamine^TM 2000和miR-99b-5p(由广州锐博生物科技有限公司合成)的混合液，用于将miR-99b-5p转染至巨噬细胞内，对照mi RNA序列：5'-UUUGUACUACACAAAAGUACUG，编号：MIMAT0000295。6小时后吸弃培养液并更换为完全培养液。再过18～20小时后，进行对照(PBS)、M1[脂多糖(LP S)+干扰素-γ(IFN-γ)]和M2[白介素-4(IL-4)]极化处理。再过23～25小时后检测巨噬细胞的IL-12、TNF-a、IL-6、IL-10、MR和Arg1的mRNA水平。参见图7，结果表明，mi R-99b-5p可促进巨噬细胞M1型活化并抑制其M2型活化，且不同于miR-125a-5p(miR-125a-5p可促进iNOS、TNF-α、IL-12表达，抑制MR表达)。

序列表

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 通过靶向肿瘤相关巨噬细胞递送抑制肿瘤生长的miRNA的药物及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> MIMAT0000132

<400> 1

cacccguaga accgaccuug cg 22

<210> 2

<211> 24

<212> RNA

<213> MIMAT0000135

<400> 2

ucccugagac ccuuuaaccu guga 24

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> MIMAT0000295

<400> 3

uuuguacuac acaaaaguac ug 22

Claims (1)

1.一种通过靶向肿瘤相关巨噬细胞抑制肿瘤生长的药物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将1g/L的miRNA水溶液与1g/L的阳离子化葡甘聚糖水溶液按体积比1:1～6混匀，得到miRNA和阳离子化葡甘聚糖的复合物溶液，葡甘聚糖是由分子比1:1.6～1.7的葡萄糖和甘露糖残基通过β-1，4糖苷键聚合而成的高分子杂多糖，所述miRNA的序列如SEQ.ID.NO.1所示；

2)将所述复合物溶液与1g/L的聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐水溶液按体积比2～4:1混匀得到三聚物复合体的溶液，所述三聚物复合体即为靶向肿瘤相关巨噬细胞并载有miRNA的药物；

所述阳离子化葡甘聚糖的制备方法包括以下步骤：

1.1)将230～270mg葡甘聚糖与10～15mL二甲基亚砜混合，得葡甘聚糖溶液；

1.2)向葡甘聚糖溶液中加入0.7～0.9g的N'N-羰基二咪唑后搅拌1～2h，得到活化葡甘聚糖溶液；

1.3)向活化葡甘聚糖溶液中加入1.2～1.4mL的乙二胺后搅拌10～16h，然后依次经透析、冷冻干燥，得到阳离子化葡甘聚糖；

所述聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐的制备方法包括以下步骤：

2.1)将100～150mg海藻酸钠与23～27mL二甲基亚砜混合，得海藻酸钠溶液；

2.2)向海藻酸钠溶液中加入230～270mg的N'N-羰基二咪唑后搅拌2～4h，得到活化海藻酸钠溶液；

2.3)向活化海藻酸钠溶液中加入480～520mg的组氨酸后搅拌10～16h，然后依次经透析、冷冻干燥，得到组氨酸修饰过的海藻酸盐；

2.4)将0.9～1.1g的吗啉乙磺酸和0.25～0.35g的氯化钠用去离子水溶解并定容到45～55mL，得混合液I；

2.5)向混合液I中加入0.08～0.12g的组氨酸修饰过的海藻酸盐，然后调节pH至5～7，得混合液II；

2.6)将0.025～0.035g的N-羟基丁二酰亚胺和0.008～0.012g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入混合液II中，然后于15℃～25℃反应12～14h，得到混合液III；

2.7)将0.18～0.22g的聚乙二醇加入到混合液III中，然后15℃～25℃反应10～16h，反应结束后依次经透析、冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰的组氨酸海藻酸盐。

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