CN110613844B - 一种迷你联合佐剂纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以两亲性单体分子为基元通过自组装制备而成的联合佐剂纳米颗粒，所述两亲性单体分子为疏水性佐剂分子和亲水性佐剂分子反应得到。该联合佐剂纳米颗粒的刺激作用相对于游离状态下联合应用亲水性佐剂和疏水性佐剂产生的作用更强。而且，联合佐剂纳米颗粒还可作为纳米载体递送抗原至抗原提呈细胞，促进抗原提呈细胞对抗原的摄取，实现抗原与佐剂的共递送，产生协同性免疫应答，能够大大增强抗肿瘤、结核等疫苗的免疫疗效。

Description

一种迷你联合佐剂纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种自组装制备而成的联合佐剂纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

佐剂是先于抗原或同时注射于动物体内，能非特异性改变机体对抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身并无抗原性的物质。佐剂的主要作用是递呈抗原和增强免疫系统的刺激。免疫增强剂直接(如细胞因子)或通过模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR) (如细菌组分)激活固有免疫，而递送系统浓缩抗原并展示抗原，将疫苗抗原靶向抗原呈递细胞，帮助抗原和免疫增强剂共定位。目前，我国常用的佐剂有铝盐、油乳、蜂胶、多糖、微生物氟氏(FA)佐剂、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(Interleuki-ns,ILs)、免疫刺激复合物(ISCOMs)、糖苷及复方中药佐剂等，新型免疫佐剂有核酸、CpG、补体、纳米、脂质体(LIP)等。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种联合佐剂纳米颗粒。

在一个方面，本发明提供了一种联合佐剂纳米颗粒，所述联合佐剂纳米颗粒为两亲性单体分子通过自组装制备而成，所述两亲性单体分子为疏水性佐剂分子和亲水性佐剂分子反应得到。

在一些实施方案中，所述联合佐剂纳米颗粒的直径为100-200nm。

在一些实施方案中，所述疏水性佐剂分子为单磷脂酰脂质A或其类似物。

在一些实施方案中，所述亲水性佐剂分子为寡聚核苷酸或寡聚脱氧核苷酸。优选地，所述亲水性佐剂分子为CPG-ODN。

在另一个方面，本发明提供了一种联合佐剂纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

S1：将单磷脂酰脂质A或其类似物进行叠氮化基团修饰，透析、冻干；

S2：将S1所得物质与寡聚脱氧核苷酸混合，室温下搅拌12-18h，然后透析、冻干，得到所述联合佐剂纳米颗粒。

在一些实施方案中，加入叠氮磷酸二苯酯和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳 -7-烯进行叠氮化基团修饰，20℃搅拌反应24～48h后透析、冻干；所述单磷脂酰脂质A的质量与叠氮磷酸二苯酯的体积、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯的体积的比值(2.0～4.0)mg:(3.0～6.0)μl：(2.0～4.0)μl。

在一些实施方案中，步骤S2中，S1所得物质的质量与寡聚脱氧核苷酸的体积比为(1.0～2.0)mg:(100～200)μl。

具体地，采用透析袋进行透析，透析时收集分子量较大的物质。

在一些实施方案中，所述带负载物选自药物、抗原。优选为鸡卵清蛋白。当然也可以为其他抗原或药物

在又一个方面，本发明提供了上述联合佐剂纳米颗粒在制备负载药物、抗原的复合物中的应用。

在又一个方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其含有有效量抗原和上述的联合佐剂纳米颗粒。

在一些实施方案中，将S2得到的物质与待负载物混合，室温下搅拌反应 8-10h，得到免疫原性组合物纳米颗粒。所述待负载物可以为鸡卵清蛋白或其它抗原或药物。当所述待负载物为鸡卵清蛋白时，所述S2得到的物质与所述待负载物的质量比为1:1-2。

本发明还提供了上述组合物在制备治疗或预防肿瘤、结合的疫苗中的应用。

本发明的有益效果体现在：

本发明的联合佐剂纳米颗粒以亲水性佐剂分子和疏水性佐剂分子形成的两亲性单体分子作为基元，通过自组装制备而成；该联合佐剂纳米颗粒的刺激作用相对于游离状态下联合应用亲水性佐剂和疏水性佐剂产生的作用更强。而且，联合佐剂纳米颗粒还可作为纳米载体递送抗原至抗原提呈细胞，促进抗原提呈细胞对抗原的摄取，实现抗原与佐剂的共递送，产生协同性免疫应答，能够大大增强抗肿瘤、结核等疫苗的免疫疗效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为联合佐剂纳米颗粒动态光散射粒径检测结果图；

图2为联合佐剂纳米颗粒透射电子显微镜图；

图3为纳米颗粒作用于DC后的细胞活力检测图；

图4为DC细胞摄取纳米颗粒共聚焦成像结果图；

图5为纳米颗粒对DC细胞的促成熟情况图；

图6为DC细胞与纳米颗粒孵育后细胞因子的分泌情况图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

下面的实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明提供一种联合佐剂纳米颗粒，其采用两亲性单体分子作为自组装基元通过自组装制备而成，该两亲性单体分子为疏水佐剂分子和亲水性佐剂分子反应得到。

作为本发明的一个实施例，亲水性佐剂分子为寡聚脱氧核苷酸CPG-ODN。

作为本发明的一个实施例，疏水性佐剂分子为单磷脂酰脂质A(MPLA) 或其类似物。

作为本发明的一个实施例，亲水性佐剂分子为寡聚脱氧核糖核苷酸 CPG-ODN。优选为C型2395，CPG-ODN的序列(SEQ ID NO.1)为：5’ -TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG-3’，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

作为本发明的一个实施例，疏水性佐剂分子与叠氮磷酸二苯酯(DPPA) 和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)反应以对疏水性佐剂分子进行叠氮化基团修饰。

疏水性佐剂分子为单磷脂酰脂质A时，单磷脂酰脂质A(MPLA)的质量与DPPA、DBU的体积比为：(2.0～4.0)mg:(3.0～6.0)μl：(2.0～4.0)μl。单磷脂酰脂质A叠氮化的物质的质量与CPG-ODN的体积比为(1.0～2.0)mg:(100～200) μl。

实施例1

如图1所示，为本发明一个实施例的单磷脂酰脂质A(MPLA)与CPG-ODN (序列为SEQID NO.1)的合成结构路线。

其中，

联合佐剂纳米颗粒制备的具体步骤包括：

S1：将4.0mg单磷脂酰脂质A(MPLA)、6.0μl叠氮磷酸二苯酯(DPPA) 和4.0μl 1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)混合，20℃下搅拌反应 48h，对所得产物用透析袋进行透析，收集分子量大于1000kD的物质，冻干；

S2：将2.0mg冻干后的物质与200μl功能性寡聚脱氧核苷酸CPG-ODN 混合，室温下搅拌过夜，然后透析袋进行透析，收集分子量大于2000kD的物质，冻干，得到MPLA-CPG联合佐剂纳米颗粒。

图1为实施例1制备得到的联合佐剂纳米颗粒动态光散射粒径检测结果图，图2为该联合佐剂纳米颗粒投射电子显微镜图。

得到的联合佐剂纳米颗粒的直径为136.9-138.6nm。联合佐剂纳米颗粒的分散度指数为0.11-0.16。

实施例2

将1.0mg MPLA-CPG纳米颗粒与1.0mg鸡卵清蛋白合(OVA)，室温下搅拌反应10h，得到MPLA-CPG-OVA纳米颗粒。

实施例3

1、细胞活力实验

取6～8周龄的C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞(Bone Marrow DerivedDendritic Cell,BMDC)，置于5％CO₂的37℃培养箱中进行培养，第七天，轻柔吹打培养液，收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞，接种于96孔板中，培养箱中过夜，每孔加入浓度分别为0、1、5、10、20、30μg/ml负载OVA(鸡卵清蛋白)的MPLA-CPG纳米颗粒，继续培养24小时，每孔加入10μl CCK-8 检测液，培养箱中继续培养1～4h，利用多功能全波长酶标仪(ThermoVarioskan Flash3001)测定450nm处吸光度。用同浓度的游离OVA和OVA+MPLA+CPG 三者的混合物作对照。纳米颗粒作用于DC细胞后所得结果如图3所示。

2、细胞摄取实验

为了观察BMDCs对于纳米颗粒的摄取情况，OVA用FITC进行标记，将细胞铺于共聚焦皿中，BMDCs与负载FITC-OVA的MPLA-CPG纳米颗粒共孵育6h后(按照OVA的浓度10μg/ml计算给药量)，PBS进行洗涤，固定液进行固定，用Lyso-Tracker Red染溶酶体，DAPI染细胞核，利用激光共聚焦显微镜(Leica,TCS SP5)观察负载FITC-OVA的MPLA-CPG纳米颗粒在 BMDCs中分布状况，全程避光操作。用同浓度的游离FITC-OVA作对照，DC 细胞摄取纳米颗粒共聚焦成像结果如图4所示。结果显示，BMDCs对 MPLA-CPG-OVA纳米颗粒的摄入量显著。

3、纳米颗粒对BMDCs成熟的影响

采用流式细胞术检测纳米颗粒对于BMDCs细胞促成熟情况，BMDC与负载OVA的MPLA-CPG纳米颗粒共孵育8小时(按照OVA的浓度10μg/ml 计算给药量)，收集细胞，标记CD11C、CD40及CD80等流式抗体，用流式细胞仪进行检测。用PBS、同浓度的游离OVA和OVA+MPLA+CPG三者的混合物作对照。纳米颗粒对DC细胞的促成熟结果如图5所示，其中Free OVA用Free O表示，Free MPLA+CPG+OVA用Free MCO表示，MPLA-CPG-OVA NPs用MCO NPs表示。

采用ELISA法测定纳米颗粒对BMDCs细胞因子分泌的影响：收集 BMDCs，接种于96孔板中。BMDC与负载OVA的MPLA-CPG纳米颗粒共孵育8小时(按照OVA的浓度10μg/ml计算给药量)后，离心弃上清培养基，更换新培养基，继续培养24h，按照ELISA试剂盒说明书方法对BMDCs上清液进行细胞因子IFN-γ(Interferon-γ，干扰素-γ)和TNF-α(Tumor NecrosisFactor-α，肿瘤坏死因子-α)的含量测定。使用酶标仪测定450nm处的吸光度OD值，根据标准品吸光度与浓度绘制标准曲线，计算样品浓度。用PBS、同浓度的游离OVA和OVA+MPLA+CPG三者的混合物作对照，DC 细胞与纳米颗粒孵育后细胞因子的分泌情况如图6所示。结果显示，MPLA-CPG-OVA纳米颗粒可显著促进BMDCs细胞因子分泌，具有促进抗原提呈细胞活化的作用。

从图3至图6的结果可知，该纳米颗粒的亲水性佐剂分子和疏水性佐剂分子游离状态下联用也具有协同刺激作用，但将二者连接制备成联合佐剂纳米颗粒后，比游离状态下联合应用产生的协同作用的程度大大增强。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院生物医学工程研究所

<120> 一种迷你联合佐剂纳米颗粒及其制备方法和应用

<130> 2019.10.23

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

Claims (4)

1.一种联合佐剂纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述联合佐剂纳米颗粒为两亲性单体分子通过自组装制备而成，所述两亲性单体分子为疏水性佐剂分子和亲水性佐剂分子反应得到；所述联合佐剂纳米颗粒的直径为100-200nm；所述疏水性佐剂分子为单磷脂酰脂质A；所述亲水性佐剂分子为寡聚脱氧核苷酸；所述联合佐剂纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：S1：将单磷脂酰脂质A进行叠氮化基团修饰，透析、冻干；S2：将S1所得物质与寡聚脱氧核苷酸混合，室温下搅拌12-18h，然后透析、冻干，得到所述联合佐剂纳米颗粒；

步骤S1中，加入叠氮磷酸二苯酯和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯进行叠氮化基团修饰，20℃搅拌反应24～48h后透析、冻干；所述单磷脂酰脂质A的质量与叠氮磷酸二苯酯的体积、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯的体积的比值(2.0～4.0)mg:(3.0～6.0)μl：(2.0～4.0)μl；步骤S2中，S1所得物质的质量与寡聚脱氧核苷酸的体积比为(1.0～2.0)mg:(100～200)μl。

2.权利要求1所述的联合佐剂纳米颗粒的制备方法制备得到的联合佐剂纳米颗粒在制备负载药物、抗原的复合物中的应用。

3.一种免疫原性组合物，其特征在于，含有有效量的抗原和权利要求1所述的联合佐剂纳米颗粒的制备方法制备得到的联合佐剂纳米颗粒。

4.权利要求3所述的免疫原性组合物在制备治疗或预防肿瘤、结核的疫苗中的应用。