CN110787301B - CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents

CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CTLA‑4 Aptamer靶向共负载PD‑1 siRNA纳米颗粒及其制备和应用，该纳米颗粒包括纳米载体和负载于其上的活性成分，所述活性成分包括CTLA‑4 Aptamer和PD‑1 siRNA。本发明的纳米颗粒将CTLA‑4 Aptamer和PD‑1 siRNA共负载于纳米递送体系，通过纳米颗粒表层的CTLA‑4 Aptamer靶向介导，靶向CTLA‑4配体细胞，同时可与负载的PD‑1siRNA联合作用于同一免疫细胞，尤其是Treg细胞，促进协同免疫反应的产生；而且，该纳米颗粒与单独的CTLA‑4 Aptamer与PD‑1 siRNA的联合应用相比，能够大大提高CTLA‑4 Aptamer与PD‑1 siRNA的联合免疫治疗效果。

Description

CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒及其制备和 应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种CTLA-4 Aptamer靶向共负载 PD-1siRNA纳米颗粒及其制备和应用。
背景技术
免疫检查点抑制剂推进了癌症免疫疗法的发展，在临床得到了广泛的应用，尤其是PD-1单抗和CTLA-4单抗，两者的联用也在黑色素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌的临床试验中取得了显著疗效。
PD-1/PD-L1途径通过抑制T细胞促进Tregs(调节性T细胞)的发育和功能行使，从而维持具有潜在致病性的自身反应性T细胞和Tregs之间的动态平衡。CTLA-4在T细胞上表达并且对T细胞活化具有抑制作用。它是CD28的同源物，和抗原递呈细胞(APCs)上的CD80、CD86结合并下调T细胞活化，增加Treg(调节性T细胞)活性。
小干扰RNA(siRNA)是一段长为20-25个碱基对的双链RNA。利用siRNA 干扰目的蛋白的表达已被用于研究治疗各种疾病，PD-1 siRNA也被证实可发挥PD-1免疫检查点抑制剂的作用。
核酸适配体(Aptamer，缩写为Apt)是一段长为10nt至100nt的具有一定空间结构的寡核苷酸，适配体具有类似于抗体的极高的亲和力和特异性，但与抗体相比，其制备过程更加简单，时间短，批次间差异小，免疫原性和毒性更小。CTLA-4 Aptamer已被证实能够有效靶向表达CTLA-4的免疫细胞，与 CTLA-4结合，刺激效应T细胞活化增殖，抑制肿瘤生长。
目前的研究显示，PD-1单抗和CTLA-4单抗的双免疫阻断作用机制主要是两者分别作用于免疫调节的启动及效应阶段，能够发挥协同作用。将两者同时或先后给药产生协同作用的原因有两种解释，一种解释是这两种药物同时作用于一个细胞，引起级联反应放大抗肿瘤效应，另一种解释是两者趋向于靶向不同类型的免疫细胞，协同增强抗肿瘤免疫反应。
但是目前尚未有将两种免疫检查点抑制剂共同负载在一个药物纳米载体上并研究其作用于同一个免疫细胞产生的抗肿瘤免疫效应的报道。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的一个目的是提供一种CTLA-4 Aptamer 靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒，包括纳米载体和负载于其上的活性成分，所述活性成分包括CTLA-4 Aptamer和PD-1 siRNA。
在本发明的一些实施方案中，所述CTLA-4 Aptamer通过吸附或化学键连接分布于所述纳米载体的表层。
在本发明的一些实施方案中，所述PD-1 siRNA通过包载分布于所述纳米载体的内部和/或通过吸附分布于所述纳米载体的表层。
在本发明的一些实施方案中，所述纳米载体由生物可吸收的聚合物与阳离子脂质(DOTAP)或其修饰物构成或由生物可吸收的聚合物、磷脂类化合物构成；所述磷脂类化合物为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)或其修饰物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或其修饰物、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE) 或其修饰物、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)或其修饰物、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)或其修饰物中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，所述生物可吸收的聚合物为PLGA、 PLGA-S-S-PEG、PLGA-PEG、PCL-PEG、PCL-S-S-PEG中的至少一种。
本发明还提供了上述CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒的制备方法，包括步骤：
将生物可吸收的共聚物与DOTAP或其修饰物混合得到杂化薄膜，然后水化，超声得到杂化纳米粒混悬液，将PD-1 siRNA和二级结构处理后的CTLA-4 Aptamer混匀，加入所述杂化纳米粒混悬液，振荡，得到表层负载有PD-1 siRNA 和CTLA-4 Aptamer的杂化纳米颗粒；或
先使磷脂类化合物与CTLA-4 Aptamer反应通过化学键连接，再与PD-1 siRNA、生物可吸收的聚合物混合，制备纳米颗粒，得到表层负载CTLA-4 Aptamer、内部负载PD-1siRNA的纳米颗粒。
在本发明的一些实施方案中，对CTLA-4 Aptamer进行二级结构处理的操作包括：将CTLA-4 Aptamer溶于DEPC水，在90-100℃下加热5-10min，缓慢降至室温，得到二级结构处理后的CTLA-4 Aptamer。
在本发明的一些实施方案中，杂化纳米粒混悬液的具体操作为：将 PLGA-S-S-PEG或PLGA-PEG与DOTAP用溶剂溶解并蒸发溶剂得到混合物薄膜，然后用DEPC水在60℃下水化处理30-60min，在冰浴条件下超声3-10min。
在本发明的一些实施方案中，所述PLGA-S-S-PEG或PLGA-PEG与阳离子脂质(DOTAP)的质量比为2-10:1。
在本发明的一些实施方案中，DOTAP或其修饰物与CTLA-4 Aptamer的质量比为2-10:1。
在本发明的一些实施方案中，N/P比为3:1以上。
本发明还提供了内部负载PD-1 siRNA表层负载CTLA-4 Aptamer的 PLGA-S-S-PEG纳米颗粒的制备方法。包括如下步骤：
(1)将DSPE-PEG与CTLA-4 Aptamer连接
将DSPE-PEG 5000-COOH溶于水，加入EDC和NHS，反应15min，羧基活化后加入氨基修饰的核酸适配体反应3-10h，水洗超滤，冻干，得到 DSPE-PEG-aptamer；
(2)制备负载siRNA和CTLA-4 Aptamer的PLGA-S-S-PEG纳米颗粒
取一定量的PLGA-S-S-PEG，按一定比例加入siRNA和 DSPE-PEG-Aptamer，采用薄膜水化法制备内部负载siRNA表层连有Aptamer 的纳米颗粒。
本发明还提供了上述CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒在制备抗肿瘤或抗癌药物中的应用。
本发明的有益效果体现在：
本发明提供了一种CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒，将CTLA-4Aptamer、PD-1 siRNA共负载于纳米递送体系，通过纳米颗粒表层的CTLA-4 Aptamer靶向介导，可靶向CTLA-4配体细胞，同时与共负载的PD-1 siRNA联合作用于同一免疫细胞，尤其Treg细胞，促进协同免疫反应的产生。
本发明的CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒与单独的 CTLA-4Aptamer与PD-1 siRNA的联合应用相比，能够大大提高CTLA-4 Aptamer与PD-1 siRNA的联合免疫治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为空纳米颗粒的透射电子显微镜成像图；
图2为CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒的透射电子显微镜成像图；
图3为CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒在被脾脏T淋巴细胞的摄取情况对比图；
图4为CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒显著促进T细胞增殖情况图；
图5为CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒治疗后显著抑制荷瘤小鼠肿瘤生长情况曲线图；
图6为CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒可显著延长荷瘤小鼠的生存期对比图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
siRNA和Aptamer作为小片段的核酸类药物，均面临着带负电不易进入细胞、在体内易被核酸酶降解、易被清除等问题，纳米递送体系无疑是解决上述问题的一种有效策略。本发明基于纳米递送体系，制备一种同时负载有PD-1 siRNA和CTLA-4 Aptamer的纳米颗粒，在CTLA-4 Aptamer的靶向作用下，通过纳米颗粒共负载，使得CTLA-4 Aptamer和PD-1siRNA同时作用于同一免疫细胞，促进协同免疫反应的产生。
作为本发明的一种具体实施方式，本发明CTLA-4 Aptamer靶向共负载 PD-1siRNA纳米颗粒的表层分布有CTLA-4 Aptamer，以靶向CTLA-4配体细胞，PD-1 siRNA负载于纳米颗粒表层或内部。
下面将结合具体实施例对本发明的CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒进行具体介绍。
本实施例中的PD-1 siRNA由苏州吉玛基因股份有限公司合成。
CTLA-4 Aptamer由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例1
表层共负载PD-1 siRNA和CTLA-4 Aptamer的PLGA-S-S-PEG/DOTAP杂化纳米颗粒的制备。包括如下步骤：
(1)将CTLA-4 Aptamer溶于DEPC水，95℃保温5min，然后缓慢降至室温，得到二级结构处理后的CTLA-4 Aptamer；
(2)将9mL PLGA-S-S-PEG和2mg阳离子脂质DOTAP用二氯甲烷溶解，旋转蒸发二氯甲烷，使材料形成一层薄膜，用DEPC水在60℃下水化50min，随后用超声波细胞破碎仪在冰浴条件下超声5min，得PLGA-S-S-PEG/DOTAP 杂化纳米粒混悬液；
(3)按N/P比3：1加入5OD的PD-1 siRNA和2.2OD二级结构处理后的 CTLA-4Aptamer，混匀，加入上述杂化纳米粒混悬液，振荡30min，得共负载PD-1 siRNA和CTLA-4Aptamer的杂化纳米颗粒。
本实施例中PLGA-S-S-PEG的制备方法包括步骤：
S1、称取200mg PEG-SCM溶于3ml DMSO，称取90mg胱胺二盐酸盐溶于1ml DMSO并加入3μl三乙胺，将上述物质混合均匀，室温下磁力搅拌反应24h，然后用1000分子量的透析袋透析2天，冻干备用；
S2、称取80mg PLGA(羧基端75:25MW:4000-15000)和7.7mg EDC，分别用二氯甲烷溶解，称取2.3mg NHS溶于80μl DMSO，混合上述物质， EDC、NHS活化PLGA羧基2h，然后加入一定量的步骤(1)所得反应产物，室温下磁力搅拌反应24h，旋转蒸发除去二氯甲烷，然后用DMSO溶解反应产物，8000分子量的透析袋透析2天，冻干，得PLGA-S-S-PEG。
图1为本发明未负载药物的PLGA-S-S-PEG/DOTAP杂化纳米粒的透射电镜成像图，图2为实施例1共负载PD-1 siRNA和CTLA-4 Aptamer的杂化纳米颗粒的透射电镜成像图。
实施例2
CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒在体外被脾脏T淋巴细胞摄取情况研究。
无菌环境下取C57小鼠脾脏，置于4ml小鼠淋巴细胞分离液中研磨，制备单细胞悬液，然后转移至15ml离心管，在分离液上方加入500μl 1640培养基，800g离心30min(加速度和减速度均设为1)，吸取淋巴细胞层于10 ml 1640培养基中，250g离心10min洗涤，1640全培养基重悬细胞，以1×106个/ml的细胞浓度铺于24孔板中，每孔1ml，孵育6h后，分别向各处理组加入适量free siRNA、PDNp、PDNp&PDNc及PDNpc，即依次为游离的PD-1 siRNA组、PD-1 siRNA单载组、PD-1 siRNA单载与CTLA-4 Aptamer单载混合组、PD-1 siRNA与CTLA-4Aptamer共载组。其中，siRNA用FAM标记。孵育2h后，收集细胞，CD3、CD4及CD8染色，流式检测。检测结果如图 3所示，其中A对应于CD3+CD4+T细胞，B对应于CD3+CD8+T细胞。
从图3可知，无论是对CD3+CD4+T细胞还是对CD3+CD8+T细胞， PDNp组的平均荧光强度(MFI)显著高于游离的siRNA，说明纳米载体负载的siRNA更容易进入细胞。更重要的是，PDNpc组的MFI显著高于PDNp& PDNc组，说明共负载组的CTLA-4 Aptamer可以发挥靶向作用，可有效促进 T细胞对siRNA的摄取。
实施例3
CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒在体外对脾脏T淋巴细胞的刺激增殖情况研究。
无菌环境下取C57小鼠脾脏，置于4ml小鼠淋巴细胞分离液中研磨，制备单细胞悬液，然后转移至15ml离心管，在分离液上方加入500μl 1640培养基，800g离心30min(加速度和减速度均设为1)，吸取淋巴细胞层于10 ml 1640培养基中，250g离心10min洗涤，1640全培养基重悬细胞，以1×106个/ml的细胞浓度铺于anti-CD3及anti-CD28抗体包被过的24孔板中，每孔 1ml，孵育6h后加入PBS、free siRNA、freeAptamer、free siRNA&Aptamer、PDNp、PDNc、PDNp&PDNc及PDNpc，即依次为不加药物的空白组、游离 PD-1 siRNA组、游离CTLA-4 Aptamer组、游离PD-1 siRNA与游离CTLA-4 Aptamer混合组、PD-1 siRNA单载组、CTLA-4 Aptamer单载组、PD-1 siRNA 单载与CTLA-4 Aptamer单载混合组、PD-1 siRNA与CTLA-4 Aptamer共载组，每组siRNA的终浓度为200nM，Aptamer终浓度为100nM，孵育72h后，收集细胞，CD3、CD4及CD8染色，流式检测。检测结果如图4所示。
从图4可知，游离的PD-1 siRNA及CTLA-4 Aptamer刺激T细胞增殖的程度较弱，而经纳米载体负载后能显著刺激CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+ T细胞增殖。当PD-1 siRNA和CTLA-4 Aptamer载药纳米粒联合应用时，增殖效果增强，更重要地，共负载PD-1 siRNA与CTLA-4 Aptamer的纳米颗粒制剂的刺激增殖效果显著高于单载药物混合组。
实施例4
CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒的体内抗肿瘤效果评估。
收集对数生长期的MC38结肠癌细胞，PBS洗2次去除血清，用PBS重悬成2×107个细胞/ml的细胞悬液，在6-8周龄C57BL/6雌性小鼠皮下接种 50μl，建立小鼠MC38结肠癌皮下肿瘤模型，待肿瘤体积约为50mm3时尾静脉给药，分组为PBS组、PDNp组、PDNc组、PDNp&PDNc组及PDNpc 组，每5天给药一次，共3次，给药剂量为4nmol PD-1 siRNA/只，2nmol CTLA-4Aptamer/只。自第一次给药起，每隔一天测量肿瘤的长和宽，按以下公式计算肿瘤体积，肿瘤体积＝(长*宽^2)/2。记录小鼠生存时间，绘制生存曲线，死亡或肿瘤体积大于2000mm3，均记为死亡。所得结果如图5和图6所示。
从图5可知，PD-1 siRNA和CTLA-4 Aptamer共载组以及两者单载混合组的肿瘤体积明显小于PD-1 siRNA单载组和CTLA-4 Aptamer单载组，尤其共载组对肿瘤生长的抑制效果最好。
从图6可知，相比PD-1 siRNA单载组和CTLA-4 Aptamer单载组，两者共载组以及两者单载混合组延长了生存期，且共载组对生存期的延长更为显著。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (8)

1.一种CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA的纳米颗粒，其特征在于，包括纳米载体和负载于其上的活性成分，所述活性成分包括CTLA-4Aptamer和PD-1siRNA；所述CTLA-4Aptamer通过吸附或化学键连接分布于所述纳米载体的表层；所述PD-1siRNA通过包载分布于所述纳米载体的内部和/或通过吸附分布于所述纳米载体的表层。
2.根据权利要求1所述的CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米载体由生物可吸收的聚合物与阳离子脂质(DOTAP)或其修饰物构成或由生物可吸收的聚合物、磷脂类化合物构成；所述磷脂类化合物为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)或其修饰物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或其修饰物、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)或其修饰物、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)或其修饰物、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)或其修饰物中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA的纳米颗粒，其特征在于，所述生物可吸收的聚合物为PLGA、PLGA-S-S-PEG、PLGA-PEG、PCL-PEG、PCL-S-S-PEG中的至少一种。
4.权利要求1-3任意一项所述的CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将生物可吸收的聚合物与DOTAP或其修饰物混合得到杂化薄膜，然后水化，超声得到杂化纳米粒混悬液，将PD-1siRNA和二级结构处理后的CTLA-4Aptamer混匀，加入所述杂化纳米粒混悬液，振荡，得到表层负载有PD-1siRNA和CTLA-4Aptamer的杂化纳米颗粒；或
先使磷脂类化合物与CTLA-4Aptamer反应通过化学键连接，再与PD-1siRNA、生物可吸收的聚合物混合，制备纳米颗粒，得到表层负载CTLA-4Aptamer、内部负载PD-1siRNA的纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，对CTLA-4Aptamer进行二级结构处理的操作包括：将CTLA-4Aptamer溶于DEPC水，在90-100℃下加热5-10min，缓慢降至室温，得到二级结构处理后的CTLA-4Aptamer。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述生物可吸收的聚合物为PLGA-S-S-PEG或PLGA-PEG；
杂化纳米粒混悬液的具体操作为：将PLGA-S-S-PEG或PLGA-PEG与DOTAP用溶剂溶解并蒸发溶剂得到混合物薄膜，然后用DEPC水在60℃下水化处理30-60min，在冰浴条件下超声3-10min。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述生物可吸收的聚合物为PLGA-S-S-PEG或PLGA-PEG；
所述PLGA-S-S-PEG或PLGA-PEG与DOTAP或其修饰物的质量比为2-10：1；DOTAP或其修饰物与CTLA-4Aptamer的质量比为2-10：1；N/P比为3:1以上。
8.权利要求1-3任意一项所述的CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA的纳米颗粒在制备抗肿瘤或抗癌药物中的应用。
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