JP2021503286A - Msc由来エキソソームの製造方法 - Google Patents

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Abstract

間葉系幹細胞(MSC)に由来する臨床グレードのエキソソームを製造する方法が本明細書に提供される。さらに、siRNAのような治療剤をエキソソームに搭載する方法が提供される。臨床グレードのエキソソームを投与することによって疾患を治療する方法もまた、本明細書中に提供される。【選択図】図1C

Description

本出願は2017年11月16日に出願された米国仮特許出願第62/587,408号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[技術分野]
本発明は一般に、分子生物学及び医学の分野に関する。より詳細には、本発明がGMP(good manufacturing practice)準拠エキソソームの大規模生産のための方法に関する。
エキソソームやマイクロベシクルを含む細胞外小胞(EV)は、いくつかの生理学的過程に関与するナノサイズの細胞間コミュニケーション媒体である。具体的にはエキソソームは細胞によって放出されるナノサイズの小胞であり、細胞成分及び産物の細胞間交換の様式を構成し、これは治療的送達剤としてのそれらの有用性への新たな関心を促した。それらの人工的な対応物とは異なり、これらの自然に製造された、細胞間の特殊化されたシャトルサービスの特徴は、治療ペイロードの効率的な送達のための独特の利点を提供し得る。エキソソーム産生と細胞取り込みに関連するエキソソームと調節機構のこのような特徴は、さらに研究されるべき状態にとどまる。にもかかわらず、癌を含む疾患の治療的管理のためのエキソソームの使用は、既に有望な結果を示している。
それらの生物学的特性のために、エキソソームは免疫障害の治療、並びに治療化合物(例えば、サイトカイン、化学療法剤、核酸及びウイルスベクター)の全身送達のための有望な候補である。しかしながら、それらの低い産生収率により、臨床での潜在的な使用可能性が限定される。従って、治療に使用され得るエキソソームを産生するための効率的な方法については、未だ満たされないニーズが存在する。
第1の実施形態では、ヒト血小板溶解物(PLT)を含む培地中で間葉系幹細胞(MSC)をコンフルエンシー(例えば、75〜95%又は80〜90%コンフルエンス、約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、又は90%コンフルエンス)まで機能的に閉鎖されたバイオリアクター中で培養すること;さらにPLTを本質的に含まない(例えば、PLTを含まない)培地中で細胞を培養すること;バイオリアクターから馴化培地画分を採集すること;及び馴化培地画分からエキソソームを単離することを含む、MSCからエキソソームを製造する方法が提供される。
いくつかの態様では、各馴化培地画分が、採集後に−80℃で保存される。特定の態様において、馴化培地画分は、単離の前に解凍され、そしてプールされる。
特定の態様では、MSCは、骨髄由来MSCとしてさらに定義される。特定の態様では、MSCは、脂肪由来MSCとしてさらに定義される。
さらなる態様では、本方法は、バイオリアクター中でMSCを培養する前に、バイオリアクターに少なくとも1×10のMSCを播種することをさらに含む。一部の態様では、MSCは、約400〜500細胞/cmの濃度で播種される。
特定の態様では、密閉バイオリアクターが中空繊維バイオリアクターである。いくつかの態様では、中空繊維バイオリアクターがテルモ細胞増殖システムである。
いくつかの態様では、PLTは、MSC培養物の培地中で5%の濃度である。PLTの濃度は、約2〜10%、例えば3、4、5、又は6%であってもよい。特定の態様では、新鮮な培地が、バイオリアクター中のMSCに連続的に添加される。特定の態様において、細胞は、5%酸素で培養される。いくつかの態様において、工程(a)の培養は5〜10日間(例えば、6、7、8、又は9日間)である。特定の態様において、工程(a)の培養は8日間である。
特定の態様では、MSCは、85%〜90%コンフルエンシー、例えば、85%、86%、87%、88%、89%、又は90%コンフルエンシーまで培養される。コンフルエンシーは、グルコース及びラクトースレベルをモニターすることによって測定され得る。例えば、ラクトースのレベルは約2〜6mmol/L、例えば、約2、3、4、5、又は6mmol/Lであり得、グルコースのレベルは約80〜140mg/dL、例えば、約80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、又は140mg/dLであり得る。
いくつかの態様では、本質的にPLTを含まない培地での培養が、24〜72時間、例えば、24〜48、36〜50、48〜60、又は50〜72時間、約36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51又は52時間である。特定の態様において、培養はPLTを本質的に含まない培地であり、約48時間である。特定の態様において、さらなる培養工程の培地は、PLTを含まない。
特定の態様において、MSCは、PLTでの培養と、本質的にPLTを含まないか又は含まない培地中での培養との間で、洗浄される。いくつかの態様において、MSCは、無血清の規定培地中で培養される。特定の態様において、完全な方法は、無血清条件下で実施される。
特定の態様において、馴化培地画分は、密封バッグに採集される。特定の態様において、馴化培地画分は、24〜72時間ごとに採集される。いくつかの態様において、馴化培地画分は、40〜50時間ごとに採集される。特定の一態様では、馴化培地画分は、48時間毎に採集される。
いくつかの態様では、馴化培地画分は、200〜250又は250〜300mLなど、200〜300mLの容量である。特定の態様において、馴化培地画分は、10〜14日間(例えば、10、11、12、13、又は14日間)採集される。特定の態様では、馴化培地画分は12日間採集される。特定の態様では、少なくとも5つの馴化培地画分が採集される。特定の態様において、この方法は、3週間未満で行われる。
いくつかの態様において、各々の馴化培地画分は、9×1011から50×1011のエキソソームを含む。特定の態様において、少なくとも10×1012のエキソソームが、採集された培地画分において単離される。特定の態様において、少なくとも15×1012のエキソソームが、採集された培地画分において単離される。少なくとも10×1011、15×1011、20×1011、25×1011、30×1011、35×1011、40×1011、45×1011、50×1011、60×1011、70×1011、80×1011、90×1011、10×1012、15×1012、20×1012、又は25×1012のエキソソームを単離することができる。
特定の態様において、単離は、プールされた画分の濾過及び超遠心分離を含み、エキソソーム含有ペレットを得、そしてエキソソーム含有ペレットを緩衝液中に再懸濁する。いくつかの態様において、単離は、ポンプ及びヒートシールされたチューブを用いて、機能的に閉鎖された様式で行われる。いくつかの態様において、濾過はさらに、プールされた画分を、0.2μmフィルターのようなフィルターに通すこととして定義される。さらなる態様において、単離は、大きな細胞残屑を除去するための濾過の前の遠心分離工程をさらに包含する。特定の態様において、単離は4℃で行われる。
特定の態様では、緩衝液が約0.01〜0.1M、例えば約0.08、0.09、又は0.1M、特に約0.1〜0.5M、例えば約0.1、0.2、又は0.3Mの塩化ナトリウム、約0.1〜0.5M、例えば約0.1、0.2、又は0.3M、特に約0.23Mのグルコン酸ナトリウム、約0.1〜0.5、例えば0.1、0.2又は0.3M、特に約0.27Mの酢酸ナトリウム三水和物、1〜10mM、例えば約6〜7mM、特に約5mMの塩化カリウム、及び約1〜5mM、例えば約2〜4mM、特に約3mMの塩化マグネシウムを含む。いくつかの態様では、緩衝液が約6〜8、例えば、約6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、又は7.6、特に約7.4などのpHを有する。特定の態様では、緩衝液はPLASMALYTE−A(登録商標)である。
さらなる態様において、この方法は、エキソソームに治療剤を搭載する工程をさらに包含する。いくつかの態様において、治療剤は、1つ以上のサイトカイン、化学療法剤、核酸、小分子、又はタンパク質を含む。特定の態様において、核酸は、DNA及び/又はRNAを含む。いくつかの態様において、RNAはsiRNA、miRNA、又はshRNAである。特定の態様では、RNAはsiRNAである。いくつかの態様において、搭載は、エキソソームをエレクトロポレーションすることを包含する。特定の態様において、エレクトロポレーションは、PLASMALYTE−A(登録商標)中で行われる。特定の態様において、この方法は、エキソソームを単離する工程とエレクトロポレーションする工程との間で、エキソソームを洗浄する工程、又は緩衝液を交換する工程を包含しない。特に、エキソソームを単離する段階から搭載されたエキソソームの数までのエキソソームの数は20%以上減少しない。
別の実施形態では、実施形態の方法(例えば、ヒト血小板溶解物(PLT)を含む培地中で、80〜90%コンフルエンシーまで機能的に閉鎖されたバイオリアクター中でMSCを培養すること;PLTを本質的に含まない(例えば、PLTを含まない)培地中で細胞をさらに培養すること;バイオリアクターから馴化培地画分を採集すること;及び馴化培地画分からエキソソームを単離すること)によって産生されるエキソソームを含む医薬組成物が提供される。
さらに別の実施形態において、癌を治療するための方法が提供され、これは、実施形態の方法に従って産生された有効量のエキソソームを投与すること(例えば、ヒト血小板溶解物(PLT)を含む培地中で、80〜90%コンフルエンシーまで、機能的に閉鎖されたバイオリアクター中でMSCを培養すること;PLTを本質的に含まない(例えば、PLTを含まない)培地中で細胞をさらに培養すること;バイオリアクターから馴化培地画分を採集すること;及び馴化培地画分からエキソソームを単離すること)を包含する。いくつかの態様では、対象はヒトである。
特定の態様において、エレクトロポレーションされたエキソソームは、対象に直接注入される。追加の態様では、方法が少なくとも第2の抗癌療法を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、少なくとも第2の抗癌治療は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法又は免疫療法を含む。
別の実施形態において、本実施形態の方法(例えば、ヒト血小板溶解物(PLT)を含む培地中で、80〜90%コンフルエンシーまで、機能的に閉鎖されたバイオリアクター中でMSCを培養する工程;さらに、細胞を、本質的にPLTを含まない(例えば、PLTを含まない)培地中で培養する工程;バイオリアクターから馴化培地画分を採集する工程;馴化培地画分からエキソソームを単離する工程;及び単離されたエキソソームにRNAを搭載し、それによってRNA搭載エキソソームを産生する工程)によって産生される、有効量のRNAが搭載されたエキソソームを細胞に送達する工程を含む、RNAを細胞に送達する方法が提供される。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。特に、細胞は癌細胞又はT細胞である。
さらなる実施形態において、それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法が提供され、これは、本実施形態の方法(例えば、ヒト血小板溶解物(PLT)を含む培地中で80〜90%コンフルエンシーまで機能的に閉鎖されたバイオリアクター中でMSCを培養すること;PLTを本質的に含まない(例えば、PLTを含まない)培地中で細胞をさらに培養すること;バイオリアクターから馴化培地画分を採集すること;及び馴化培地画分からエキソソームを単離すること)によって産生された有効量のエキソソームを投与することを含む。いくつかの態様において、エキソソームは、siRNA又はmiRNAを搭載している。特定の態様において、エキソソームは、KRAS siRNAが搭載される。いくつかの態様では、対象はヒトである。
いくつかの態様において、疾患又は障害は、癌、炎症性障害、又は免疫関連障害である。特定の態様では、癌は肺癌である。
特定の態様において、エキソソームは、経口的に、局所的に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、内視鏡的に、経皮的に、皮下的に、局所的に、又は直接注射によって投与される。いくつかの態様において、エキソソームは静脈内に投与される。
追加の態様では、方法は、少なくとも第2の治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも第2の治療剤が抗癌剤である。特定の態様において、抗癌剤は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法又は免疫療法である。
別の実施形態では、前記疾患に罹患している対象における免疫介在性炎症性疾患を治療する方法であって、前記対象に、本方法(例えば、ヒト血小板溶解物(PLT)を含む培地中で80〜90%コンフルエンスになるように機能的に閉じたバイオリアクター中でMSCを培養すること;PLTを本質的に含まない(例えば、PLTを含まない)培地中で細胞をさらに培養すること;バイオリアクターから馴化培地画分を採集すること;及び馴化培地画分からエキソソームを単離すること)に従って産生された治療有効量のMSC由来エキソソームを投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、免疫介在性炎症性疾患は、関節リウマチ(RA)、炎症性腸疾患(IBD)、及びクローン病からなる群から選択される。特定の態様において、MSCは同種異系である。いくつかの態様において、エキソソームは、全身的又は局所的に投与される。特定の態様において、エキソソームは、直腸、鼻腔内、口腔内、膣内、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病変内、又は頭蓋内経路を介して、又は埋め込み型のリザーバーを介して投与される。いくつかの態様において、エキソソームは、少なくとも1つのさらなる治療剤と一緒に投与される。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、下記の詳細な説明によって明かとなる。しかしながら、本発明の詳細な説明、特異的な実施例及び好適な実施例は例示として行われるものであって、この詳細な説明によって当業者に明らかになる各種の変更や修正は、本発明の精神及び範囲内にあることを理解しなくてはならない。
以下の図面は本明細書の一部を掲載し、本発明のある態様をさらに示すために含まれる。本発明は、ここに提示される特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の1以上を参照することによって良好に理解されるのであろう。
図1A〜1D:(図1A)Turumo Cell Expansion System(Bioreactor)を用いて間葉系幹細胞(MSC)からEVを産生するように設計された概略手順。(図1B)エキソソームの採集のためのMSCバイオリアクター培養の手順を詳述する模式図。(図1C)MSC馴化培地からのエキソソームの単離及びエレクトロポレーション手順の概略図。(図1D)MSC由来エキソソームの生成を示す概略図。
図2は、バイオリアクター上で培養されたMSCからのEVを含有する馴化培地の生産のための戦略の概略図である。
図3:バイオリアクター上で培養されたMSC馴化培地からのEVの単離のための戦略の概略図。
図4A〜4B:バイオリアクター中で産生されたMSC由来エキソソームの同定。(図4A)エキソソームマーカーの発現を示す、各採取時にバイオリアクター中で産生されたMSC由来エキソソームのフローサイトメトリー。(図4B)エキソソームの典型的な形態を示す、各採取物からの代表的なTEM。
図5A〜5E:各採取時にのバイオリアクター中で産生されたエキソソームの定量。(図5A)microBCA及びNanoSightによって決定された量子において産生されたMSC由来エキソソームの数。(図5B)NanoSightを用いた各収穫測度の粒度分布。(図5C)エキソソーム産生の間のバイオリアクター中のグルコース及びラクトースのレベル。(図5D)異なる時点でMSC馴化培地から単離され、NanoSightによって定量化された細胞当たりに産生されたエキソソームの数。(図5E)24時間及び48時間で単離されたMSC由来エキソソーム上のエキソソームマーカーの代表的なフローサイトメトリー。
図6A〜6B:ヒト血小板溶解物(hPLT)又は無血清条件を補充した培地中で産生されたMSC由来エキソソームの定量。(図6A)NanoSightによって分析されたhPLTを伴って又は伴わずに培養されたMSCの馴化培地から単離された、細胞当たりのエキソソームの数。(図6B)培地単独対ヒト血小板溶解物(hPLT)を補充した培地を使用して産生されたMSC由来エキソソームのフローサイトメトリーであり、無血清培地上で産生されたエキソソームの純度を示す。
図7:16の異なるnucleofactorプログラム及び3つの異なるnucleofactor溶液を用いたMSC由来エキソソームエレクトロポレーションの評価。エレクトロポレーションの効率を、48時間後にレシピエント細胞上でMSC由来エキソソームによるsiRNA送達によって誘導されるアポトーシスによって評価した。
図8A〜8C:5つの異なる溶液を用いたMSC由来エキソソームエレクトロポレーションの評価。(図8A)エレクトロポレーションの効率を、48時間後にレシピエント細胞上のMSC由来エキソソームによるsiRNA送達によって誘導されるアポトーシスによって評価した。(図8B)研究用緩衝液(RB)又は臨床用緩衝液(CB;すなわち、血小板溶解物(PLT))のいずれかを使用する、エレクトロポレーション後のMSCエキソソームの代表的な透過型電子顕微鏡写真であり、エレクトロポレーション後のエキソソーム完全性の維持を示す。(図8C)Lonza装置及びPLASMALYTE−A(登録商標)溶液を用いてエレクトロポレーションしたMSC由来エキソソームを用いたsiRNAの送達によって誘導された、レシピエント細胞における遺伝子転写のサイレンシング。
図9:超遠心分離前及び超遠心分離後のエキソソームの数。研究用緩衝液を使用したエキソソームのエレクトロポレーションには、第2の洗浄工程を含み、これは、サンプルの少なくとも50%の損失をもたらし得る。
図10A〜10D:バイオリアクターにおいて産生されてマウスに注射された、予め標識されたMSC由来のエキソソームの生体内分布)。WTヌードマウスにおける8×10の標識エキソソームの腹腔内(図10A、10B)又は静脈内(図10C、10D)投与の6時間後におけるDIR標識MSCエキソソームの蛍光。(A、C)解剖された臓器。(B、D)脾臓及び肝臓を伴わない解剖された臓器。
ヒト治療のためのエキソソームを処方するためには、その製造のいくつかの態様がGMP(good manufacturing practice)基準に準拠したエキソソームの大規模生産を含む、慎重な検討を必要とする。そこで、本研究は、GMP準拠エキソソームを生成するための、革新的な手順及び関連する系統的分析に関するものである。
したがって、特定の実施形態では、本開示がテルモ細胞増殖システムなどの機能的に閉鎖されたバイオリアクターを使用して、間葉系間質細胞(MSC)からエキソソームなどのEVを産生するための効率的かつ臨床的に関連する戦略を提供する。本明細書で提供される方法は、約3週間などの短時間で少なくとも10×1012のEVを産生することができる。本発明の方法は、機能的に閉鎖された無血清系における臨床グレードのEVの大規模な産生及び単離を含む。EVは骨髄由来MSCなどから、臨床的に適切な用量で製造される。
好ましい実施形態では、全方法は無血清であり、したがって、血清中のエキソソームからのMSC由来EVの汚染は本質的にない。具体的には、この方法は、バイオリアクターにおけるMSCの初期培養におけるヒト血小板溶解物(PLT)の使用を含み得る。本発明者らは、MSCを約80〜90%、例えば約85%コンフルエンスまで培養すると、EVの効率的な産生が得られることを見出した。従って、MSCは次いで、EVを含む馴化培地の採集の前に、約24〜72時間(例えば、約24時間又は48時間)、PLTを含まない培地に切り替えられ得る。馴化培地画分は、約48時間毎に採集され、EVの単離まで、約−80℃などで凍結されてもよい。馴化培地画分は、約4〜10回、例えば約5、6、7、又は8回、特に約6回採集することができる。従って、バイオリアクターへのMSCの播種から最終採集までの期間は、約15〜30日、例えば約20日であり得る。各馴化培地画分は、少なくとも1×1011のエキソソーム、例えば、少なくとも9×1011、特に約3×1012のエキソソームを含むことができる。
好ましくは、EVの単離の前に、採集した培地画分を解凍しプールする。エキソソームの単離は最初の遠心分離工程(例えば、1,000g)、続いて超遠心分離(例えば、約100,000g)を含み得る。エキソソームペレットを生成するために、3ラウンドなどの複数ラウンドの超遠心分離があってもよい。いくつかの態様では、エキソソームペレットがPLASMALYTE−A(登録商標)などのGMP準拠の緩衝液に再懸濁される。エキソソームは超遠心分離の前に、0.2μmフィルターなどの濾過にさらに供してもよい。この手法は、9〜10×1012かそれ以上のエキソソーム、例えば15×1012の総エキソソームの生成をもたらし得る。
さらに、エキソソームは治療剤(例えば、サイトカイン、化学療法剤、又は核酸)を搭載され得る。従って、本方法によって産生されるようなエキソソームを、PLASMALYTE−A(登録商標)のようなFDA認可緩衝液中でのエレクトロポレーションによって搭載するための方法が提供される。エレクトロポレーションは、フロースルーエレクトロポレーションシステム(例えば、4D−Nucleofactor LV Large Scale Transfection System、Lonza)で実施され得る。各々のエレクトロポレーションランは、少なくとも2×1012のエキソソームを含むことができる。エキソソームには、siRNAなどの核酸を搭載することができる。緩衝液は、患者における使用のためにFDA承認され、滅菌され、そして非発熱性であり、患者に直接注入できるため、患者への投与の前に緩衝液を交換するための洗浄工程は必要ない。従って、従来の方法においてエキソソームの約50%の損失をもたらし得るような、追加の洗浄工程からのエキソソームの損失はない。この緩衝液は、エレクトロポレーション後のエキソソームの完全性を維持し得る。
さらに、患者における免疫関連疾患及び癌などの疾患の治療のための、siRNAを搭載したエキソソームなどのエキソソームの使用方法が本明細書に提供される。
[I.定義]
本明細書で使用される場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、本明細書では特定の成分のいずれも組成物に意図的に配合されておらず、かつ/又は汚染物質としてのみ又は微量で存在することを意味するために使用される。したがって、組成物の意図しない汚染から生じる特定の成分の総量は0.05%をはるかに下回り、好ましくは0.01%を下回る。最も好ましいのは、標準的な分析方法で特定の成分の量を検出することができない組成物である。
ここでいう「a」又は「an」とは一つ又は複数を意味する場合があるが、ここでいう請求権において、「含む」と併用する場合には「a」又は「an」とは一又は複数を意味する場合がある。
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は代替物のみを指すことが明示的に示されない限り、「及び/又は」を意味するために使用されるが、本開示は代替物及び「及び/又は」のみを指す定義を支持するが、本明細書で使用される「別の」は少なくとも後者又はそれ以上を意味してもよく、「約」、「実質的に」及び「ほぼ」という用語は一般に、記載された値のプラス又はマイナス5%を意味する。
「細胞外小胞」及び「EV」は、クラスとして、エキソソーム、エキソソーム様小胞、エクトソーム(細胞膜から直接小胞の出芽に起因する)、微粒子、微小小胞、分泌マイクロベシクル(shedding microvesicles;SMV)、ナノ粒子及びさらには(大型の)アポトーシス性小胞又は小体(細胞死に起因する)又は膜粒子を含む、細胞由来及び細胞分泌性マイクロベシクルである。
本明細書中で使用される場合、用語「マイクロベシクル」及び「MV」は、典型的には直径が約100nm〜約1,000nm、又は血漿中で約100nm〜約400nmであるリン脂質二重層によって囲まれた、より大きな細胞外小胞又は構造を意味する。マイクロベシクル/MVは、細胞膜の出芽やブレブ形成(blebbing)によって調節された放出によって形成される。
細胞外小胞のクラス内で、重要な成分は「エキソソーム」それ自体であり、これは、直径が、好ましくは約40〜120nm(例えば、50〜100nm)であり、そして膜性小胞(すなわち、エキソサイトーシス的融合、又は多小胞体(MVB)の「エキソサイトーシス」から生じる、エンドサイトーシス起源のリン脂質二重層によって取り囲まれた小胞)である。エキソソームは哺乳動物由来の任意の適当な生物学的試料から単離されてもよく、これには全血、血清、血漿、尿、唾液、母乳、脳脊髄液、羊水、腹水、骨髄及び培養哺乳動物細胞(例えば、未成熟樹状細胞(野生型又は不死化)、誘導及び非誘導多能性幹細胞、線維芽細胞、血小板、免疫細胞、網状赤血球、腫瘍細胞、間葉系幹細胞、衛星細胞、造血幹細胞、膵臓幹細胞、白色及び褐色脂肪前駆細胞など)が含まれるが、これらに限定されない。当業者が理解するように、培養細胞サンプルは、(エキソソームを含まない血清を使用して)細胞に適切な培養培地中にある。
エキソソームは、テトラスパニンなどの表面マーカー、例えばCD9、CD37、CD44、CD53、CD63、CD81、CD82及びCD151;
インテグリン、ICAM−1、EpCAMや、アネキシン、TSG101、ALIXなどの標的化マーカー又は膜融合マーカー;及びRab5b、HSP70、LAMP2(lysosome−associated membrane protein)及びLIMP(lysosomal integral membrane protein)などの他のエキソソーム膜貫通蛋白質
などの、他の小胞に存在しない特定の表面マーカーを含む。
用語「間葉系幹細胞」又は「MSC」は、本明細書で使用される場合、自己再生能力、及び特に結合組織、骨髄の間質、脂肪細胞、真皮及び筋肉を含む大きな表現型の多様性を有する子孫細胞を産生する分化能力を有する、中胚葉に由来する多能性体性幹細胞を指す。MSCは一般に、マーカーCD19、CD45、CD14及びHLA−DRに対して陰性であり、マーカーCD105、CD106、CD90及びCD73に対して陽性であることを特徴とする細胞マーカー発現プロファイルを有する。MSCは、任意のタイプの組織から単離され得る。一般に、MSCは、骨髄、脂肪組織、臍帯、又は末梢血から単離され得る。特定の実施形態では、MSCは骨髄由来幹細胞である。
エキソソームが由来するMSCは、自家、同種又は異種であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「自己」は、MSCのドナー及び前記MSCに由来するエキソソーム(又は単離されたエキソソーム集団)のレシピエントが同じ対象であることを意味する。用語「同種」がMSCのドナー及び前記MSCに由来するエキソソーム(又は単離されたエキソソーム集団)のレシピエントが異なる対象であることを意味する。用語「異種」がMSCのドナー及び前記MSCに由来するエキソソーム(又は単離されたエキソソーム集団)のレシピエントが異なる種の対象であることを意味する。特定の実施形態において、エキソソームが由来するMSCは同種異系である。
用語「脂肪組織由来幹細胞」又は「ASC」は、本明細書中で使用される場合、脂肪組織に由来するMSCを指す。ASCは当該分野で公知の方法(例えば、「ヒト脂肪間葉系幹細胞単離及び増殖」の下で以下に記載される方法)によって、脂肪組織から単離され得る。「脂肪組織」は、任意の脂肪組織を意味する。脂肪組織は例えば、皮下、大網/内臓、乳房、性腺、臓器周囲又は他の脂肪組織部位に由来する、褐色又は白色脂肪組織であってもよい。好ましくは、脂肪組織は皮下白色脂肪組織である。脂肪組織は、初代細胞培養物又は不死化細胞株を含み得る。脂肪組織は、脂肪組織を有する任意の生物に由来し得る。いくつかの実施形態では脂肪組織は哺乳動物であり、さらなる実施形態では脂肪組織はヒトである。脂肪組織の便利な供給源は脂肪吸引手術である。しかしながら、脂肪組織の供給源も、脂肪組織の単離方法も、本発明にとって重要ではないことが理解されるのであろう。特定の実施形態において、ASCは、対象の脂肪吸引物から単離される。
MSCは任意の動物、好ましくは非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット又はマウス)及び霊長類(例えば、サル又はヒト)を含む哺乳動物に由来し得る。特定の実施形態では、MSCはヒトである。
用語「機能的に閉鎖された」は、システム全体を気密封止することによって、又は採集システムへのすべての接続部に無菌バリアフィルタを提供することによって、流体の無菌性を保証するように封止されたシステムを指す。
用語「バイオリアクター」は、細胞に栄養素を提供し、代謝産物を除去し、閉鎖滅菌系において細胞増殖を導く生理化学的環境を提供する大規模細胞培養系を指す。特定の態様において、生物学的プロセス及び/又は生化学的プロセスは、監視及び制御された環境条件及び操作条件(例えば、pH、温度、圧力、栄養供給及び老廃物除去)下で発生する。本開示によれば、本方法と共に使用するのに適した基本的なクラスのバイオリアクターは、中空繊維バイオリアクターを含む。
用語「中空繊維」は、バイオリアクター内に含まれる細胞に栄養素(溶液中)を送達する際に使用するため、及びバイオリアクター内に含まれる細胞から廃棄物質(溶液中)を除去するために、規定されたサイズ、形状及び密度の孔を含む(任意の形状の)中空構造を含むことが意図される。本開示の目的のために、中空繊維は、再吸収性又は非再吸収性材料から構築されてもよい。繊維は管状構造を含むが、これに限定されない。
本明細書中で使用される場合、用語「患者」又は「対象」は、生きている哺乳動物生物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、又はそれらのトランスジェニック種を指す。特定の実施形態では、患者又は対象は霊長類である。ヒト患者の非限定的な例は、成人、若者、乳児及び胎児である。
「治療」又は「治療すること」は、(1)疾患の病理又は症状を経験又は表示する対象又は患者における疾患の阻害(例えば、病理及び/又は症状のさらなる発達を停止すること)、(2)疾患の病理又は症状を経験又は表示する対象又は患者における改善(例えば、病理及び/又は症状を逆転する)、及び/又は(3)疾患の病理又は症状を経験又は表示する対象又は患者における疾患のあらゆる測定可能な減少をもたらすこと、を含む。
用語「有効である」はその用語が本明細書及び/又は請求項において使用される場合、所望の、予想される、又は意図される結果を達成するのに十分であることを意味する。「有効量」、「治療有効量」又は「薬学的有効量」は、患者又は対象を化合物で処置する文脈において使われる場合、疾患を処置又は予防するために対象又は患者に投与した場合に、そのような疾患の処置又は予防に影響を及ぼすのに十分な量である化合物の量を意味する。
本明細書で使用される用語「癌」は、固形腫瘍、転移性癌、又は非転移性癌を記述するために使用され得る。特定の実施形態では、癌は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸(colon)、直腸(rectum)、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮に由来し得る。
用語「接触された」及び「曝露された」は、細胞に適用される場合、治療剤が標的細胞に送達されるか、又は標的細胞と直接並置されるプロセスを記載するために本明細書中で使用される。細胞殺傷を達成するために、例えば、1つ以上の薬剤が、細胞を殺傷するか、又は細胞が分裂するのを妨げるのに有効な量で細胞に送達される。
患者の有効な応答又は患者の「応答性」とは、疾患又は障害のリスクがあるか、又はそれに罹患している患者に与えられる臨床的又は治療的利益をいう。このような便益には、細胞又は生物学的反応、完全応答、部分応答、安定した疾患(進行又は再燃を伴わない)、又は後に再燃を伴うが応答が含まれる。例えば、有効な応答は、癌と診断された患者における腫瘍サイズの減少又は無増悪生存であり得る。
本明細書で使用される「治療剤」は、疾患又は健康関連状態の治療上の利益を得る目的で、対象に投与することができる任意の薬剤を指す。例えば、治療剤を含むナノ粒子は、腫瘍のサイズを減少させる、腫瘍の局所侵襲性を減少させるか又は阻害する、又は転移の発生のリスクを減少させる目的で、対象に投与され得る。
本明細書中で使用される「診断剤」は、対象における疾患又は健康関連状態を診断する目的のために対象に投与され得る任意の薬剤を指す。診断には、病気があるかどうか、病気が進行しているかどうか、病状に何らかの変化があるかどうかを判断することが含まれる。
治療剤又は診断剤は、小分子、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、DNA、又はRNAであり得る。特定の実施形態では、治療剤又は診断剤はsiRNAである。
本明細書で使用される「核酸」とは一般に、核酸塩基を含む、DNA、RNA又はその誘導体又は類似体の分子(すなわちストランド)を指す。核酸塩基は、例えば、DNAに見られる天然に存在するプリン又はピリミジン塩基(例えば、アデニン「A」、グアニン「g」、チミン「T」又はシトシン「C」)又はRNAに見られる天然に存在するプリン又はピリミジン塩基(例えば、A、G、ウラシル「U」又はC)を含む。用語「核酸」は、それぞれが「核酸」という用語の亜種である「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」を包含する。用語「オリゴヌクレオチド」は、長さが3〜約100核酸塩基の分子を指す。用語「ポリヌクレオチド」は、長さが約100核酸塩基よりも大きい少なくとも1つの分子を指す。
これらの定義は、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。二本鎖核酸は完全に相補的な結合によって形成されるが、いくつかの実施形態において、二本鎖核酸は部分的又は実質的な相補的な結合によって形成され得る。したがって、核酸は、典型的には分子を含む、特定の配列の1つ以上の相補鎖又は「相補物」を含む二本鎖分子を包含し得る。本明細書で使用するように、一本鎖核酸は接頭辞「ss」で、二本鎖核酸は接頭辞「ds」で表すことができる。
本明細書で使用する「ヌクレオチド」とは「骨格部分」をさらに含むヌクレオシドを指す。骨格部分は、一般に、ヌクレオチドを、ヌクレオチドを含む別の分子に、又は核酸を形成する別のヌクレオチドに、共有結合的に接続させる。天然に存在するヌクレオチドにおける「骨格部分」は、典型的には五炭糖に共有結合的に付着したリン部分を含む。骨格部分の結合は、典型的には五炭糖の3′−又は5′−位置のいずれかで起こる。しかしながら、特にヌクレオチドが天然に存在する五炭糖又はリン部分の誘導体又は類似体を含む場合、他のタイプの接続が当技術分野で知られている。
核酸は、天然に存在する核酸中に存在し得る、核酸塩基、核酸塩基リンカー部分及び/又は骨格部分の誘導体又は類似体を含み得るか、又はそれらから完全に構成され得る。本明細書で使用される「誘導体」(derivative)は、天然に存在する分子の化学的に修飾された形態又は改変された形態を指し、用語「模倣」(mimic)又は「類似体」(analog)は天然に存在する分子又は部分に構造的に類似していてもよく、又は類似していなくてもよいが、類似の機能を有する分子を指す。本明細書で使用される「部分」(moiety)は一般に、より大きな化学的又は分子構造のより小さな化学的又は分子成分を指す。核酸塩基、ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体又は誘導体は、当技術分野で周知である。
用語「siRNA」(短い干渉RNA)は、短い二本鎖RNA複合体(典型的には19〜28塩基対長)をいう。換言すれば、siRNAは2つのヌクレオチド鎖を含む二本鎖核酸分子であり、各鎖は約19〜約28ヌクレオチド(すなわち、約19、20、21、22、23、24、25、26、27、又は28ヌクレオチド)を有する。この複合体はしばしば、3′−オーバーハングを含む。siRNAは当業者に公知の技術を使用して作製され得、そして多種多様なsiRNAはIntegrated DNA Technologies、Inc.(Coralville, Iowa)のような供給者から商業的に入手可能である。一実施形態では、本明細書に記載のTNF−αに対する2′−O−メチル修飾siRNA二重鎖をナノ粒子に組み込むことができ、アンチセンス鎖上の2′−O−メチル修飾はオフターゲット効果を排除し、非特異的免疫応答を最小限にし、siRNA安定性を改善する。
「マイクロRNA(miRNA)」は3′−UTRエレメントを介してタンパク質コード遺伝子を標的化し、実質的にサイレンシングすることができる、短い非コードRNAである。miRNAは長さが約21〜22ヌクレオチドであり、非タンパク質コード遺伝子から転写されるより長い前駆体から生じる。
「免疫障害」、「免疫関連障害」又は「免疫介在性障害」とは、免疫応答が疾患の発症又は進行において役割を果たす障害を指す。免疫介在性疾患には、自己免疫疾患、同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病及び炎症性及びアレルギー性状態が含まれる。
「自己免疫疾患」とは、免疫系が正常宿主の一部である抗原(すなわち自己抗原)に対して免疫応答(例えば、B細胞又はT細胞応答)を生じ、その結果として組織が傷害される疾患を指す。自己抗原は、宿主細胞に由来し得るか、又は粘膜表面に通常コロニー形成する微生物(共生生物として知られる)のような共生生物に由来し得る。
本明細書で使用される「コンフルエンシー」という用語は、バイオリアクターの中空繊維などの表面を覆う細胞のパーセンテージを指す。コンフルエンシーは、細胞が培養される培地中のグルコース及び/又はラクトースのレベルによって測定され得る。
[II.エキソソームの産生]
本開示の特定の実施形態は、バイオリアクター、特に中空繊維バイオリアクターなどの機能的に閉鎖された系の使用による、臨床グレードEV、特にエキソソームの大規模生産のための方法に関する。重要なことに、エキソソーム産生の全プロセスは、その後の治療剤の搭載を含めて、無血清であり得る。
(A.間葉系幹細胞)
EVの産生のための細胞は、脂肪由来又は骨髄由来MSCなどのMSCであってもよい。特定の態様において、MSCは、自己又は同種異系であり得るヒトMSCである。
MSCは、約100〜1,000細胞/cm、例えば約150細胞/cm、約200細胞/cm、約250細胞/cm、約300細胞/cm、例えば約350細胞/cm、例えば約400細胞/cm、例えば約450細胞/cm、例えば約500細胞/cm、例えば約550細胞/cm、例えば約600細胞/cm、例えば約650細胞/cm、例えば約700細胞/cm、例えば約750細胞/cm、例えば約800細胞/cm、例えば約850細胞/cm、例えば約900細胞/cm、例えば約950細胞/cm、又は約1,000細胞/cmの密度でバイオリアクターに播種することができる。特に、細胞は、約400〜500細胞/cm、例えば約450細胞/cmの細胞密度で播種することができる。
バイオリアクター中に播種される細胞の総数は、約1.0×10〜約1.0×10細胞、例えば、約1.0×10〜5.0.0×10、5.0×10〜1.0×10、1.0×10〜5.0×10、5.0×10〜1.0×10細胞であり得る。特定の態様では、バイオリアクターに播種される細胞の総数は、約1.0×10〜約3.0×10、例えば約2.0×10細胞である。
細胞は、任意の適切な細胞培養培地に播種され得、その多くは商業的に入手可能である。例示的な培地には、DMEM、RPMI、MEM、Media 199、HAMSなどが含まれる。一実施形態では、培地がαMEM培地、特にL−グルタミンを補充したαMEMである。培地には、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、又はB27、抗生物質、ビタミン及び/又は低分子薬物のうちの1つ以上を添加することができる。特に、培地は無血清であってもよい。
いくつかの実施形態では、細胞を室温でインキュベートすることができる。インキュベータは加温され、約5%CO及び約1%Oの大気を有することができる。いくつかの実施形態では、CO濃度が約1〜20%、2〜10%、又は3〜5%であってもよい。いくつかの実施形態では、O濃度が約1〜20%、2〜10%、又は3〜5%であってもよい。
特定の実施形態では、細胞を無血清培地に播種し、培養する。培地には、血小板溶解物、特にヒト血小板溶解物(PLT)を補充することができる。PLTは、約1〜10%、例えば約1〜4%、2〜5%、3〜6%、4〜7%、5〜8%、又は6〜10%、例えば約4%、5%、又は6%、特に約5%の濃度で培地中に存在してもよい。
MSCは、播種後約5〜10日間、例えば約5、6、7、8、9、又は10日間、特に約7、8、又は9日間、バイオリアクター中で初期培養することができる。具体的には、MSCは、約75〜95%コンフルエンシー、例えば約75〜80%、80〜85%、85〜90%、又は90〜95%コンフルエンシーまで、特に約85〜90%、例えば85%、86%、87%、88%、89%、又は90%コンフルエンシーまで、PLTを含む培地中で初期培養することができる。細胞が意図したコンフルエンシーに到達したら、細胞を、PLTを含まない培地に移すことができる。細胞は、PLTを含まない培地に移す前に、PBSなどの緩衝液で少なくとも1回洗浄することができる。
PLTを含まない培地中での細胞の培養は、PLT中に存在し得るエキソソームによるMSC由来エキソソームの汚染又は希釈を防止するために使用される。いくつかの態様では、PLTを遠心分離にかけてエキソソームを除去し、エキソソームを含まないPLTを得ることができる。
細胞は、PLTを含まない培地中で、約8〜100時間、例えば12〜72時間、例えば約12〜15、15〜20、20〜25、25〜30、35〜40、40〜45、45〜50、50〜55、55〜60、65〜70、又は70〜72時間、培養することができる。特に、細胞は、PLTを含まない培地中で、約24〜48時間、例えば、約48時間、エキソソームの採集の前に培養され得る。
(B.バイオリアクター)
バイオリアクターは、静的バイオリアクター、撹拌フラスコバイオリアクター、回転壁容器バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター及び直接潅流バイオリアクターを含む一般的なカテゴリーに従って分類することができる。バイオリアクター内で、細胞は、遊離であるか、又は固定化され、多孔性3次元足場(ヒドロゲル)上に播種され得る。
培養中の物質移動を促進するために、中空繊維バイオリアクターを使用することができる。中空繊維バイオリアクターは、10〜30kDaの典型的な分子量カットオフ(MWCO)範囲で平行に配列された小さい半透過性毛細管膜である中空繊維をベースとした3D細胞培養システムである。これらの中空繊維膜はしばしば、管状ポリカーボネートシェル内に束ねられ、収容されて、中空繊維バイオリアクターカートリッジを形成する。カートリッジ内には2つの区画、すなわち、中空繊維内の毛細管内(IC)空間と、中空繊維を取り囲む毛細管外(EC)空間とがあり、これらの区画にはインレットポート及びアウトレットポートも取り付けられている。
このように、本開示では、バイオリアクターは中空繊維バイオリアクターであってもよい。中空繊維バイオリアクターは、細胞が繊維の管腔内に埋め込まれ、培地が管腔外空間を潅流することができ、又は代わりに、中空繊維を通して気体及び培地潅流を提供し、細胞は管腔外空間内で増殖することができる。本開示に適した中空繊維バイオリアクターは、当技術分野で公知であり、Caridian(Terumo)BCT Quantum Cell Expansion Systemを含むことができるが、これに限定されない。
中空繊維は、バイオリアクターにおける栄養素の送達及び老廃物の除去に適しているべきである。中空繊維は任意の形状であってもよく、例えば、円形及び管状であってもよく、又は同心リングの形態であってもよい。中空繊維は、吸収性又は非吸収性の膜から構成されてもよい。例えば、中空繊維の適切な成分としては、ポリジオキサノン、ポリラクチド、ポリグラクチン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸/トリメチレンカーボネート、セルロース、メチルセルロース、セルロースポリマー、セルロースエステル、再生セルロース、プルロニック(登録商標)、コラーゲン、エラスチン、及びこれらの混合物が挙げられる。
バイオリアクターは、細胞の播種の前にプライミングされ得る。プライミングは、PBSなどの緩衝液でフラッシングすることを含んでもよい。プライミングはまた、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質でバイオリアクターをコーティングすることを含んでもよい。次いで、バイオリアクターはPLT培地(例えば、αMEM)で洗浄され得る。
(C.馴化培地の採集)
PLTフリーの培地中で培養された細胞からの馴化培地は、8〜100時間ごと、例えば12〜72時間ごと、例えば約12〜15、15〜20、20〜25、25〜30、35〜40、40〜45、45〜50、50〜55、55〜60、65〜70、又は70〜72時間ごとに採集することができる。特に、馴化培地画分は、約24〜48時間ごとに採集することができる。
馴化培地画分は、約100〜500mL、例えば、約100〜150、150〜200、250〜300、350〜400、400〜450、又は450〜500mL、特に約250mLの容量を含むことができる。画分を密封バッグに集め、エキソソームが単離されるまで約−70℃〜約−90℃、例えば約−80℃で凍結保存することができる。
特定の態様において、馴化培地は、各ランについて、少なくとも4回、例えば4〜10回、特に5、6、7、8、又は9回、特に6回採集される。個々の画分を、例えば4℃で一晩、例えば2〜6℃で約10〜20時間解凍することができる。
(D.エキソソームの単離)
次いで、プールした馴化培地画分を、特に4℃でエキソソーム単離に供することができる。馴化培地は約2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、又は26℃の温度で遠心分離することができ、一実施形態では、馴化培地が約4℃の温度で遠心分離される。エキソソーム単離は、エキソソーム単離のための当該分野で公知の方法によって実施され得る。好ましくは、エキソソームの単離はまた、上記のエキソソームの産生と同様に、閉鎖系において行われる。これは、ポンプ及び密閉されたチューブの使用によって達成され得る。
単離は、大きな破片を除去するための遠心分離工程と、それに続く濾過と、1つ以上の超遠心分離工程とを含んでもよい。単離方法はプールされた培地画分の全てを処理するために、複数回(例えば、3回)実施され得る。
遠心分離工程は約500〜2,000g(例えば、約1,000g)で約5〜25分間(例えば、約15分間)の遠心分離を含み得る。馴化培地は、約1,000g、2,000g、4,000g、6,000g、8,000g; 10,0000g; 12,000g、14,000g、16,000g、又は18,000gで遠心分離され得る。遠心分離は、10〜30分、12〜28分、14〜24分、又は15〜20分などの期間であってもよい。当業者が理解するように、適切な市販の実験室用遠心分離機、例えば、THERMO−SCIENTIFIC(商標)又はCOLE−PARMER(商標)が、この遠心分離工程を行うために使用される。特に、遠心分離は、Cobe 2991 Cell Processor(Terumo)のような閉鎖系で行うことができる。低速遠心分離は生きた細胞、死んだ細胞、及びより大きな細胞残屑を除去するために、2回以上実施され得る。
濾過工程はより大きなマイクロベシクルのような破片を除去するために、0.1〜0.3ミクロンフィルター、例えば0.2ミクロンフィルターなどの、サブミクロンフィルターを有する濾過バッグの使用を含んでもよい。次いで、上清を、チューブに直接接続されたラインを用いて、チューブ(例えば、ポリカーボネートチューブ)に移すことができる。濾過は、2回以上繰り返すことができる。濾過は同じサイズのフィルター、例えば、0.2ミクロンフィルターを1回以上通過させることによって行うことができる。あるいは、同じ又は減少するサイズのフィルター(例えば、40〜50ミクロンフィルターを通る1つ以上のパス、20〜30ミクロンフィルターを通る1つ以上のパス、10〜20ミクロンフィルターを通る1つ以上のパス、0.2〜10ミクロンフィルターを通る1つ以上のパスなど)を使用した、2つ以上のフィルターを使用する濾過が行われ得る。この工程で使用するのに適したフィルターには、0.45及び0.22ミクロンのフィルターの使用が含まれる。
超遠心分離は75,000〜150,000g、例えば、100,000〜170,000g、例えば、約100,000gで、約2〜6時間、例えば、1〜3時間、例えば、約4又は5時間行うことができる。このステップを実行するために、THERMO−SCIENTIFIC又はBeckmanなどの市販の超遠心分離機を使用することができる。具体的には、超遠心分離は、限定されないが、タイプ45 Tiローター(Beckman−Coulter)などの、任意の閉鎖系遠心法を用いて実施することができる。この超遠心分離工程は結果を向上させるために、任意で、例えば、2回以上繰り返されてもよい。エキソソーム含有ペレットを、確立された技術を使用して上清から除去し、そして適切な生理学的溶液中に再懸濁する。
当業者が理解するように、遠心分離又は超遠心分離工程のいずれかからのエキソソームペレットは、適切な生理学的溶液(例えば、滅菌PBS、滅菌0.9%生理食塩水又は滅菌炭水化物含有0.9%生理食塩水緩衝液)を使用して、遠心分離工程の間に洗浄され得る。
遠心分離後、溶液を除去し、エキソソームをPBSなどの適切な緩衝液に再懸濁する。緩衝液のpHは試料に適合する任意のpHであってよいが、典型的な範囲は6〜8である。緩衝液は、4〜10、4〜6、4〜8、6〜10、6〜8、又は8〜10のpHを有し得る。特に、エキソソームペレットは、例えば、約7.4の生理学的pHで、臨床グレードの緩衝液(例えば、PLASMALYTE−A(登録商標))中に再懸濁され得る。緩衝液の容量は、約0.01体積〜約0.09体積、約0.02体積〜約0.08体積、約0.03体積〜約0.07体積の沈殿溶液であり得る。採集されたエキソソームはエレクトロポレーション又は治療のためなどに直ちに使用され得るか、又は凍結され、そして後の使用のために、例えば、−20℃で保存され得る。
本明細書中で使用される場合、分析はエキソソームの直接的又は間接的な可視化を可能にし、そしてインビボ又はエクスビボであってもよい、任意の方法を含む。例えば、分析は、限定されないが、固体基質に結合したエキソソームのエクスビボ顕微鏡又はサイトメトリー検出及び可視化、フローサイトメトリー、蛍光イメージングなどを含み得る。例示的な態様において、癌細胞由来エキソソームは、グリピカン1に対する抗体を使用して検出され、続いて固体基質に結合され、そして顕微鏡又はサイトメトリー検出を使用して可視化される。エキソソームは、エキソソーム表面マーカー:CD63、CD47、CD9及びCD81のフローサイトメトリー発現、及び/又は透過型電子顕微鏡(TEM)によって分析され得る。さらに、ナノ粒子追跡分析及びマイクロBCAアッセイを使用して、エキソソームを定量し得る。
従って、バイオリアクターへのMSCの播種から最終採集までの期間は、約15〜30日、例えば16、17、18、19、20、21、22、23、又は24日、例えば約19又は20日であり得る。各馴化培地画分は、少なくとも1×1012のエキソソーム、例えば少なくとも2×1012のエキソソーム、特に約3×1012のエキソソームを含み得る。本方法は、少なくとも10×1012のエキソソーム、例えば少なくとも11×1012のエキソソーム、例えば少なくとも12×1013のエキソソーム、例えば少なくとも13×1012のエキソソーム、例えば少なくとも14×1012のエキソソーム、例えば少なくとも15×1012のエキソソーム、例えば少なくとも16×1012のエキソソーム、例えば少なくとも17×1012のエキソソーム、例えば少なくとも18×1012のエキソソーム、例えば少なくとも19×1012のエキソソーム、又は例えば、少なくとも17×1012のエキソソームの、全エキソソームの産生を生じ得る。
(E.エキソソームの搭載)
本発明の方法によって産生されるエキソソームは、治療剤又は診断剤のようなカーゴを搭載され得る。本発明のエキソソームを使用して送達され得るカーゴの例は、DNA(核DNA及びミトコンドリアDNAの両方)のような核酸分子、mRNA、tRNA、miRNA、及びsiRNAのようなRNA、アプタマー及び他の核酸含有分子、ペプチド、タンパク質、リボザイム、炭水化物、ポリマー、治療薬、小分子などのような、エキソソーム中に天然に存在しない(外部ソースに由来する)外因性物質を含むが、これらに限定されない。
一実施形態では、本発明の単離されたエキソソームは、二次構造を有する化合物(例えば、miRNA、mRNA、タンパク質/ペプチド)、並びに大きな化合物(例えば20塩基対を超える、例えば50塩基対を超える、又は100塩基対を超える塩基対、ペプチド、タンパク質などを含む核酸分子)の送達に特に有用である。
カーゴは、細胞へのカーゴの導入のために当該分野で確立された方法を使用して、本エキソソームに導入され得る。従って、例えば、約20〜1000V/cmの範囲の電圧を印加するエレクトロポレーションを使用して、カーゴをエキソソームに導入し得る。
カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用するトランスフェクションもまた、カーゴをエキソソームに導入するために使用され得る。適切なトランスフェクション試薬の例としてはLipofectamine MessengerMAXTm Transfection Reagent、Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent、Lipofectamine 3000 Transfection Reagent又はLipofectamine LTX Reagent with PLUSTM Reagentが挙げられるが、これらに限定されない。カーゴ搭載のために、適切な量のトランスフェクション試薬が使用されるが、当該量は試薬、サンプル及びカーゴによって変化し得る。例えば、Lipofectamine MessengerMAXTm Transfection Reagentを使用する場合、約0.15uL〜10uLの範囲の量を使用して、100ng〜2500ngのmRNA又はタンパク質をエキソソームに搭載し得る。他の方法、例えば、タンパク質導入のための細胞浸透性ペプチドの使用もまた、カーゴをエキソソームに導入するために利用され得る。
特定の実施形態では、siRNA等の核酸等のカーゴは、エキソソームにエレクトロポレーション(例えば、FDA承認の緩衝液(例えば、PLASMALYTE−A)中のエレクトロポレーション)を用いて搭載される。エレクトロポレーションは、フロースルーエレクトロポレーションシステム(例えば、4D−Nucleofactor LV Large Scale Transfection System、Lonza)で実行される。各々のエレクトロポレーションのランは、少なくとも2×1012のエキソソームを含むことができる。緩衝液は、患者における使用のためにFDA承認され、滅菌され、そして非発熱性であり、患者に直接注入され得るので、患者への投与の前に緩衝液を交換するために必要とされる洗浄工程は必要ない。従って、エキソソームの約50%の損失をもたらし得る、従来の方法におけるような追加の洗浄工程によるエキソソームの損失はない。
特定の実施形態では、治療薬がsiRNA、shRNA、プラスミド、mRNA、miRNA、又はncRNAなどのRNA、特にsiRNA又はmiRNA治療薬であってもよい。miRNAは、miRNA模倣体又はmiRNA前駆体であり得る。エキソソームに搭載されるRNAのサイズは、100ヌクレオチド長未満、例えば75ヌクレオチド長未満、特に50ヌクレオチド長未満であり得る。例えば、RNAは約10〜100ヌクレオチド(例えば、20〜50ヌクレオチド、特に10〜20、15〜25、20〜30、25〜35、30〜40、又は45〜50ヌクレオチド)の長さを有し得る。
RNAは、修飾されていても、修飾されていなくてもよい。RNAは、1つ以上のヌクレオチドの改変を含み得る。このような改変は非ヌクレオチド物質の付加(例えば、RNAの末端又は内部(RNAの1つ以上のヌクレオチドにおける))を含み得る。特定の態様において、RNA分子は、3′−ヒドロキシル基を含む。本開示のRNA分子中のヌクレオチドはまた、非天然ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準ヌクレオチドを含み得る。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は当技術分野で公知の他の修飾された骨格を含有してもよく、又は非天然ヌクレオシド間結合を含み得る。siRNAのさらなる修飾(例えば、2′−O−メチルリボヌクレオチド、2′−デオキシ−2′−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5−C−メチルヌクレオチド、1以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び逆位デオキシ脱塩基の残基取り込み(inverted deoxyabasic residue incorporation))は、米国公開第20040019001号及び米国特許第6,673,611号に見出すことができる(これらの各々がその全体が参考として組み込まれている)。総称して、上記のこのような改変された核酸又はRNAは、全て、修飾siRNAと呼ばれる。
好ましくは、RNAiは、タンパク質の発現を、少なくとも10%、20%、30%、又は40%、より好ましくは少なくとも50%、60%、又は70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、80%、90%、95%、又はそれ以上減少させることができる。
本明細書中に記載される方法又は組成物において使用されるsiRNAは、記載された遺伝子/タンパク質のNCBI参照配列によってコードされるmRNA配列に相補的な部分を含み得る。一実施形態では、siRNAは二本鎖部分(二重鎖)を含む。一実施形態では、siRNAは、20〜25ヌクレオチド長である。一実施形態では、siRNAが一方又は両方の鎖上に独立して1つ又は2つのヌクレオチド3′オーバーハングを有する19〜21コアRNA二重鎖を含む。一実施形態では、オーバーハングはUUである。siRNAは5′リン酸化されていてもされていなくてもよく、ヌクレアーゼ分解に対する効力及び/又は耐性を改善するために、当該分野で公知の修飾のいずれかで修飾され得る。非限定的な実施形態において、siRNAは、1つ以上の細胞にトランスフェクトされるように投与され得る。一実施形態ではsiRNAが第1及び第2鎖を含む二本鎖RNAを含むことができ、ここで、RNAの一方の鎖は遺伝子のRNA転写物の一部に80、85、90、95又は100%相補的である。
一実施形態では、本開示のsiRNAの一本鎖成分は、14〜50ヌクレオチド長である。別の実施形態において、siRNAの一本鎖成分は、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、又は28ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態において、本開示のsiRNAの一本鎖成分は、21ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態において、本開示のsiRNAの一本鎖成分は、22ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、本開示のsiRNAの一本鎖成分が23ヌクレオチド長である。一実施形態では、本開示のsiRNAが28〜56ヌクレオチド長である。
標的遺伝子は一般に、ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、又はポリペプチドの発現に重大な複製、転写若しくは翻訳若しくは他のプロセスを調節するポリヌクレオチド領域、又はポリペプチドをコードする領域と発現を調節するポリペプチドに作動可能に連結された領域との両方を含むポリヌクレオチドを意味する。標的遺伝子は、染色体(ゲノム)又は染色体外であり得る。それは、細胞に対して内因性である場合もあれば、外来遺伝子(導入遺伝子)である場合もある。外来遺伝子は宿主ゲノムに組み込まれ得るか、又はプラスミド又はコスミドのような染色体外遺伝的構築物上に存在し得る。また、標的遺伝子は病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌又は原虫に由来することができ、それらは、生物又は細胞に感染することができる。標的遺伝子は、レトロウイルス遺伝子のようなインターフェロン応答を誘発しないウイルス性及びプロウイルス性遺伝子であり得る。標的遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子、又はリボソームRNA、スプライソソームRNA、tRNAなどをコードする遺伝子のような非タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
細胞内で発現されている任意の遺伝子を標的とすることができる。好適には、標的遺伝子が疾患に重要な、又は研究対象として特に興味深い細胞活性の進行に関与するか、又は関連するものである。従って、例として、以下は標的遺伝子発現を調節又は弱めるために本開示の方法において使用され得る可能な標的遺伝子のクラスである:発生遺伝子(例えば、接着分子、サイクリンキナーゼインヒビター、Wntファミリーメンバー、Winged helixファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン/リンホカイン及びそれらの受容体、成長因子又は分化因子及びそれらの受容体、神経伝達因子とその受容体)、腫瘍抑制遺伝子(例えば、APC、CYLD、HIN−1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、ウテログロビン、Skp2、BRCA−1、BRCA−2、CHK2、CHKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C−CAM、CTS−1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、Gene 26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca−1(HYAL1)、Luca−2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene 21(NPRL2)又はSEM A3ポリペプチドをコードする遺伝子)、プロアポトーシス遺伝子(例えば、CD95、カスパーゼ−3、Bax、Bag−1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP−7、PARP、bad、bcl−2、MST1、bbc3、Sax、BIK、及びBID)、サイトカイン(例えば、GM−CSF、G−CSF、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−25、IL−26、IL−27、IL−28、IL−29、IL−30、IL−31、IL−32、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、MIP−1α、MIP−1β、TGF−β、TNF−α、TNF−β、PDGF、及びmda7)、癌遺伝子(例えば、ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRBB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3及びYES)、並びに酵素(ACP−デサチュラーゼ及びヒドロキシラーゼ、ADP−グルコースピロホリラーゼ、ATPアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、DNA及びRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、GTPase、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プラナーゼ(pullanases)、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ)が挙げられる。
当業者には理解されるように、本発明のエキソソームは、カーゴを搭載する前又は後に、カーゴの送達のためのビヒクルとしてのその有用性を増強するために、標的化部分を含めることによってさらに改変され得る。この点に関して、エキソソームは、特定の細胞を組織型に特異的に標的化する実体を組み込むように操作され得る。この標的特異的実体(例えば、標的細胞又は組織上の受容体又はリガンドに対して親和性を有するペプチド)は例えば、当該分野で十分に確立された方法を使用して、エキソソーム膜マーカーへの融合によって、エキソソーム膜内に組み込まれ得る。
[III.使用方法]
いくつかの実施形態では、本開示が細胞へのRNAiなどの治療薬の送達のために本明細書で提供されるエキソソームの使用方法を提供する。送達のためにエキソソームによって標的化され得る追加の免疫細胞は、樹状細胞、NK細胞、及び/又はB細胞を含む。さらなる実施形態において、本開示のエキソソームによって送達される治療剤は、小分子、ペプチド、ワクチン、又は抗原であり得る。細胞は、インビボ又はエクスビボであり得る。一実施形態では、RNAiを含む有効量のエキソソームを細胞に投与することを含む、RNAを細胞に送達する方法が提供される。細胞は、T細胞のような免疫細胞、又はKRAS陽性癌細胞のような癌細胞であってもよい。
さらなる実施形態において、RNAを封入するエキソソームの有効量を対象に投与することを含む、生物を免疫刺激する方法が提供される。RNAは免疫調節性RNAであってもよい。別の実施形態において、本開示のエキソソームの有効量を投与すること含む、疾患又は障害を有する対象を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、疾患又は障害の治療のための、又は対象を免疫刺激するための、本開示のエキソソームの使用が提供される。
インビボ細胞は、哺乳動物などの任意の対象に存在し得る。例えば、対象は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、霊長類、又は鳥類であり得る。特定の実施態様において、対象はヒトを指す。例えば、ヒトは、疾患を有する対象であり得る。疾患は、炎症性疾患、過剰増殖性疾患、感染症、又は変性疾患など、対象を苦しめるあらゆる疾患であってもよい。特定の実施形態では、疾患が癌などの過剰増殖性疾患である。例えば、癌は、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌細胞、肝臓癌、子宮頸癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、悪性リンパ腫、胃癌、膵臓癌、精巣癌、腸癌、リンパ腫、又は白血病であり得る。特定の実施形態では、癌は卵巣癌である。
別の実施形態では、本開示のエキソソームの治療有効量を前記対象に投与することを含む、前記疾患に罹患している対象における免疫介在性炎症性疾患を治療する方法が提供される。
癌は、これらに限定されないが、具体的には以下の組織学的タイプのものであり得る:新生物、悪性;癌腫(carcinoma);癌腫(carcinoma)、未分化;巨大及び紡錘細胞癌;小細胞癌;乳頭癌;扁平上皮癌;リンパ上皮癌;基底細胞癌;毛母癌;移行上皮癌;乳頭状移行上皮癌;腺癌;ガストリノーマ、悪性;胆管癌;肝細胞癌;肝細胞癌と胆管癌の合併;索状癌;腺様嚢胞癌;腺腫様ポリープにおける腺癌;腺癌、家族性ポリポーシス;固形癌腫;カルチノイド腫瘍、悪性;腺房細胞腺癌;乳頭腺癌;色素嫌性癌腫;好酸性癌;好酸性腺癌;好塩基性癌;明細胞腺癌;顆粒細胞癌;濾胞腺癌;乳頭状及び濾胞状腺癌;非被包性硬化性癌;副腎皮質癌;子宮内膜癌;皮膚付属器癌;アポクリン腺癌;皮脂腺癌;精巣腺癌;粘表皮癌;嚢胞腺癌;乳頭状嚢胞腺癌;乳頭状漿液性嚢胞腺癌;粘液性嚢胞腺癌;粘液性腺癌;印環細胞癌;浸潤性導管癌;髄様癌;小葉癌;炎症性癌;パジェット病、乳房;腺扁平上皮癌;扁平上皮化を伴う腺癌;胸腺腫、悪性;卵巣間質腫瘍、悪性;莢膜細胞腫(thecoma);顆粒膜細胞腫、悪性;男性胚細胞腫(androblastoma)、悪性;セルトリ細胞癌;ライディッヒ細胞腫瘍、悪性;脂質細胞腫瘍、悪性;傍神経節腫、悪性;乳房外傍神経節腫、褐色細胞腫;悪性黒色腫;メラニン欠乏性黒色腫;表層拡大型黒色腫;巨大色素性母斑における悪性黒色腫;類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;胞巣状横紋筋肉腫;間質肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー管混合腫瘍;腎芽腫;肝芽腫;癌肉腫;間葉腫、悪性;ブレナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;胎児性癌;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛癌;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管外皮腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨性骨肉腫;軟骨肉腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨の巨細胞腫;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル上皮肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星細胞腫;原形質星細胞腫;原線維性星細胞腫;星芽細胞腫;膠芽腫;乏突起神経膠腫;乏突起膠芽腫;原始神経外胚葉;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫;嗅神経原性腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞腫、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキン側肉芽腫;小リンパ球性悪性リンパ腫;びまん性大細胞型悪性リンパ腫;濾胞型悪性リンパ腫;菌状息肉腫;その他の特定の非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;マスト細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;形質細胞白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;マスト細胞白血病;巨核芽球性白血病;骨髄肉腫;及び有毛細胞白血病。
いくつかの実施形態では、治療剤を搭載した有効量のエキソソームを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における疾患又は障害を治療する方法が提供される。この疾患は、自己免疫疾患のような免疫関連疾患であり得る。自己免疫疾患の非限定的な例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アディソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎及び睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック・スパート皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーヴス病、ギラン−バレー病、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgAニューロパチー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、1型又は免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群(微小変化型疾患、巣状糸球体硬化症、又は膜性腎症など)、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎(結節性多発動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞動脈炎又は疱疹状皮膚血管炎など)、白斑及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書に開示される方法を用いて治療することができる自己免疫疾患のいくつかの例には、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病、クローン病;潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、血管炎、又は乾癬を含むが、これらに限定されない。また、対象は喘息のようなアレルギー性疾患を有することができる。
治療結果は予測及びモニターすることができ、かつ/又は、そのような治療から利益を得る患者は、本明細書に記載の方法を介して特定又は選択することができる。
腫瘍性状態の治療に関しては、腫瘍性病態の段階に応じて、腫瘍性状態の治療は、腫瘍性組織を除去するための手術、放射線療法及び化学療法などの治療法を1つ又は複数組み合わせて行う。他の治療レジメンは抗癌剤、例えば、治療組成物及び化学療法剤の投与と組み合わせることができる。例えば、このような抗癌剤で治療される患者は、放射線療法を受けてもよく、及び/又は外科手術を受けてもよい。
疾患の治療のために、治療組成物の適切な投与量は上記に定義されるように、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、患者の病歴及び薬剤に対する応答、そして主治医の判断に依存するのであろう。薬剤は一度に、又は一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。
治療的及び予防的方法及び組成物は、所望の効果を達成するのに有効な組み合わせ量で提供され得る。組織、腫瘍、又は細胞は、1つ以上の薬剤を含む1つ以上の組成物又は薬理学的製剤と接触させることができ、又は組織、腫瘍、及び/又は細胞を2つ以上の別個の組成物又は製剤と接触させることによって接触させることができる。また、このような併用療法は、化学療法、放射線療法、外科的療法、又は免疫療法と併用することができると考えられる。
併用投与は、同じ投薬形態での2つ以上の薬剤の同時投与、別々の投薬形態での同時投与、及び別々の投与を含み得る。すなわち、本発明の治療組成物及び別の治療剤は、同じ投薬形態で一緒に処方され得、そして同時に投与され得る。あるいは、対象の治療組成物及び別の治療剤を同時に投与することができ、ここで、両方の薬剤は別々の製剤中に存在する。別の代替において、治療剤は、他の治療剤の直後に投与され得るか、又はその逆であり得る。別個の投与プロトコルにおいて、対象の治療組成物及び別の治療剤は、数分間隔で、又は数時間間隔で、又は数日間隔で投与され得る。
本明細書中に記載されるエキソソームは、治療、研究及び診断適用において使用され得る。例えば、以下に記載されるエキソソームは細胞の1つ以上の表現型特性を増強するために、細胞培養物に添加され得る。本発明のエキソソームは細胞の1つ以上の表現型特性を阻害するために、細胞培養物に添加され得る。本発明のエキソソームは、細胞培養物に添加されて、細胞の新しい表現型特性を提供し得る。
(A.医薬組成物)
本明細書中に記載される特定の方法は、本開示のエキソソームを含む組成物の薬学的に有効な量の投与を含む方法に関する。
本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能な担体」は、当業者に公知であるように、任意及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤(例えば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料などの材料及びそれらの組み合わせを含む(Remington’s,1990)。任意の従来の担体が活性成分と不適合である限りを除いて、治療又は医薬組成物におけるその使用が意図される。本開示において使用される組成物は、固体、液体又はエアロゾル形態で投与されるべきかどうか、及び注射のような投与経路のために滅菌される必要があるかどうかに依存して、異なる型の担体を含み得る。
医薬活性物質のためのそのような媒体及び剤の使用は当該分野でよく知られている。任意の従来的な媒体又は薬剤が活性成分と不適合な場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。補助活性成分も組成物に組み込むことができ、これらは以下でより詳細に論じる。ヒトへの投与のために、調製物はFDA生物学局の標準によって要求されるように、無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度の標準を満たすことが好ましい。
エキソソームを含む組成物は、必要に応じて、所望されない低分子量分子を除去するために広範囲に透析され得、及び/又は所望のビヒクルへのより容易な処方のために凍結乾燥され得る。特に、本開示のエキソソームを構成する組成物(例えば、PLASMALYTE−A)は、一切の加工を必要とせず、対象に直接注入することができる。次いで、活性化合物は一般に、任意の公知の経路(例えば、非経口投与)による投与のために処方される。投与方法は、以下により詳細に議論される。
本開示は、血管内注射のための、又は以下により詳細に議論されるような任意の他の経路による適用のための、無菌溶液である組成物を使用する方法を意図する。当業者は、任意の他の経路による注射又は適用のための無菌溶液を生成するための技術に精通している。滅菌注射用溶液は必要量の活性化合物を適切な溶媒中に、当業者によく知られている種々の他の成分と共に組み込むことによって調製される。
組成物の処方は、投与経路に依存して変化し得る。水溶液中での非経口投与のためには、例えば、溶液は適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされるべきである。これに関連して、使用できる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に知られているであろう。
他の薬学的に許容される形態には、静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物に加えて、埋め込み型の薬物送達デバイスを介した投与のための製剤、及び任意の他の形態が含まれる。本開示では、点鼻液又はスプレー、エアロゾル又は吸入剤を使用することもできる。
経口処方は例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤又は粉末の形態をとる。当業者は、経口製剤の調製のための周知の技術に精通しているであろう。
特定の実施形態では、医薬組成物が少なくとも約0.1重量%の活性薬剤を含む。組成物は例えば、約0.01%を含むことができる。他の実施形態では、医薬組成物が例えば、組成物の約2重量%〜約75重量%、又は組成物の約25重量%〜約60重量%、及びその中で導出可能な任意の範囲を含む。
医薬組成物は、1つ以上の成分の酸化を遅らせるために種々の抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用の防止はパラベン(例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、種々の抗菌剤及び抗真菌剤などの防腐剤によってもたらされ得る。この組成物は製造及び貯蔵の条件下で安定であり得、そして微生物(例えば、細菌及び真菌)の汚染作用に対して保存され得る。外毒素汚染は安全なレベル、例えば、0.5ng/mgタンパク質未満に最小限に保たれるべきであることが理解される。
組成物が液体形態である実施形態において、担体は水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、脂質(例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム)、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない溶媒又は分散媒体であり得る。多くの場合、例えば、糖、塩化ナトリウム又はそれらの組み合わせ、などの等張剤を含むことが好ましい。
他の実施形態では、本開示において、点鼻液又はスプレー、エアロゾル又は吸入剤を使用してもよい。点鼻液は、点滴又はスプレーで経鼻通路に投与されるように設計された水溶液であってもよい。
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、必要な量のナノ粒子を、上記に列挙した種々の他の成分と共に適切な溶媒中に組み込み、続いて滅菌することによって調製される。
処方時に、エキソソームは、投薬処方と適合性のある様式で、そして治療的に有効であるような量で投与される。
ナノ粒子は、当業者に公知の任意の方法を用いて対象に投与することができる。例えば、エキソソームを含む医薬有効量の組成物を、静脈内、脳内、頭蓋内、髄腔内、黒質又は黒質の領域に、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、気管内、鼻腔内、局所的に、筋肉内、腹腔内、皮下、経口、局所的に、部分的に、吸入(例えば、エアロゾル吸入)、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接局所潅流浴、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物(例えば、リポソーム)中で、又は当業者に公知であるような他の方法若しくは上記の任意の組み合わせによって投与することができる(Remington’s、1990)。特定の実施形態では、組成物が薬物送達デバイスを使用して対象に投与される。
他の実施形態において、エキソソームは経口、鼻腔内、経腸、局所、舌下、動脈内、髄内、髄腔内、吸入、眼、経皮、膣又は直腸経路を含むが、これらに限定されない経路による投与のために処方され、各場合に適切な担体を含む。例えば、局所適用のためのエキソソーム組成物は、適切な担体を含んで調製され得る。クリーム、ローション及び軟膏は、トリグリセリド基剤などの適切な基剤を使用して局所適用のために調製することができる。このようなクリーム、ローション及び軟膏はまた、界面活性剤を含み得る。エアゾール製剤はまた、適切な噴射剤アジュバントが使用されるように調製されてもよい。他のアジュバントもまた、それがどのように投与されるかにかかわらず、組成物に添加され得、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、及び他の防腐剤が、長期の貯蔵期間にわたる微生物の増殖及び/又は分解を防ぐために組成物に添加され得る。
ナノ粒子の薬学的に有効な量は、意図される目標、例えば細胞死の阻害に基づいて決定される。投与される量は、治療の回数及び用量の両方に従って、治療される対象、対象の状態、所望の保護、及び投与経路に依存する。治療薬の正確な量はまた、開業医の判断に依存し、そして各個体に特有である。
例えば、治療薬の用量は、1用量当たり約0.0001ミリグラム〜約1.0ミリグラム、又は約0.001ミリグラム〜約0.1ミリグラム、又は約0.1ミリグラム〜約1.0ミリグラム、さらには約10ミリグラム程度であってもよい。反復投与も可能である。いくつかの実施形態において、用量は、少なくとも約0.0001ミリグラムである。さらなる実施形態において、用量は、少なくとも約0.001ミリグラムである。なおさらなる実施形態において、用量は、少なくとも0.01ミリグラムである。なおさらなる実施形態において、用量は、少なくとも約0.1ミリグラムである。より具体的な実施形態では、用量が少なくとも1.0ミリグラムであり得る。さらにより具体的な実施形態では、用量が少なくとも10ミリグラムであってもよい。さらなる実施形態において、用量は、少なくとも100ミリグラム以上である。
他の非限定的な例において、用量はまた、約1マイクログラム/kg体重、約5マイクログラム/kg体重、約10マイクログラム/kg体重、約50マイクログラム/kg体重、約100マイクログラム/kg体重、約200マイクログラム/kg体重、約350マイクログラム/kg体重、約500マイクログラム/kg体重、約1ミリグラム/kg体重、約5ミリグラム/kg体重、約10ミリグラム/kg体重、約50ミリグラム/kg体重、約100ミリグラム/kg体重、約200ミリグラム/kg体重、約350ミリグラム/kg体重、約500ミリグラム/kg体重、約1000mg/kg体重、又はそれ以上/投与、及びそこで誘導可能な任意の範囲を含んでもよい。本明細書中に列挙される数から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約5mg/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重〜約500ミリグラム/kg/体重などの範囲が、上記の数に基づいて投与され得る。
用量は、当業者によって決定されるように反復することができる。従って、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態において、単回用量が意図される。他の実施形態において、2つ以上の用量が意図される。2回以上の用量が対象に投与される場合、用量間の時間間隔は、当業者によって決定される任意の時間間隔であり得る。例えば、用量間の時間間隔は、約1時間〜約2時間、約2時間〜約6時間、約6時間〜約10時間、約10時間〜約24時間、約1日〜約2日、約1週間〜約2週間、又はそれ以上、又はこれらの列挙された範囲のいずれかの中で導出可能な任意の時間間隔であり得る。
特定の実施形態では、本方法が医薬組成物の患者への連続供給を提供することができる。これは、カテーテル法、続いて治療剤の連続投与によって達成され得る。投与は術中又は術後であり得る。
(B.併用療法)
本開示の特定の実施形態は、疾患の治療又は予防のための治療の1つ以上の二次形態の投与又は適用を提供する。例えば、疾患は、癌などの過剰増殖性疾患であってもよい。
二次的治療形態は、癌の治療又は予防に適用できる1つ以上の二次的薬理学的製剤の投与であってもよい。
二次治療が薬理学的製剤である場合、それは、ナノ粒子の投与の前、同時、又は後に投与され得る。
エキソソームの投与と二次治療との間の間隔は、当業者によって決定される任意の間隔であり得る。例えば、間隔は数分から数週間であってもよい。薬剤が別々に投与される実施形態では、一般に、各治療剤が対象に対して有利に組み合わされた効果をなお発揮することができるように、各送達の時間の間に長期間が経過しないことを保証する。例えば、治療薬間の間隔は互いに約12時間〜約24時間であってもよく、より好ましくは互いに約6時間〜約12時間以内であってもよい。しかし、いくつかの状況では、治療期間を延長することができ、その場合、それぞれの投与の間に数日(2、3、4、5、6又は7)から数週間(1、2、3、4、5、6、7又は8)が経過する。いくつかの実施形態において、二次治療剤の投与のタイミングは、ナノ粒子に対する対象の応答に基づいて決定される。
様々な組み合わせを用いることができる。以下の例では、エキソソーム組成物は「A」であり、抗癌療法は「B」である:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
本開示の任意の化合物又は治療の患者への投与は、薬剤の毒性(存在する場合)を考慮して、このような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因する毒性をモニタリングするステップがある。治療サイクルを繰り返すことができることが期待される。また、種々の標準的療法、並びに外科的介入は、記載された療法と組み合わせて適用することができると考えられる。
特定の態様において、標準的な療法は化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的療法又は遺伝子療法を含み、そして本明細書中に記載されるように、遺伝子発現療法の阻害剤、抗癌療法、又は遺伝子発現療法の阻害剤及び抗癌療法の両方と組み合わせて使用され得ることが意図される。
(1.化学療法)
本実施形態によれば、多種多様な化学療法剤を使用することができる。「化学療法」という用語は癌を治療するための薬物の使用を指し、「化学療法剤」は、癌の治療において投与される化合物又は組成物を意味するために使用される。これらの薬剤又は薬物は例えば、それらが細胞周期に影響を及ぼすかどうか、及びどの段階で影響を及ぼすかといった、細胞内でのそれらの活性の様式によって分類される。あるいは、薬剤がDNAを直接架橋する能力、DNAに挿入する能力、又は核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体及び有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられ得る。
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤;ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート;ベンゾドパ、カルボコン、メトレドパ、及びウレドパなどのアジリジン;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチルオロメラミンを含むエチレンイミン及びメチルアメラミン;アセトゲニン(特に、ブラタシン及びブラタシノン);カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン;CC−1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む);クリプトフィシン(特に、クリプトフィシン1及びクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成類似体、KW−2189及びCB1−TM1を含む);エレウテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチン;スポンギスタチン;クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード;カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンなどのニトロソウレア;エネジイン抗生物質(カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマI及びカリケアマイシンオメガI1)などの抗生物質;ダイネミシンAを含むダイネミシン;クロドロネートなどのビスホスホネート;エスペラマイシン;同様にネオカルジノスタチン発色団及び関連する発色団、ネオカルジノスタチン発色団、アクチノマイシン、アクチノマイシン、オートラルニシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ドキソルビシン(モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、2−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラルマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポチロマイシン(potfiromycin)、ビューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン及びゾルビシンなどのマイトマイシン;メトトレキサート及び5−フルオロウラシル(5−FU)などの代謝拮抗剤;デノプテリン、プテロプテリン、及びトリメトレキサートなどの葉酸類似体;フルダラビン、6−メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンなどのプリン類似体;アンシタビン、アザシチジン、6−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン及びフロクスウリジンなどのピリミジン類似体;カルステロン、プロピオン酸ドロナノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン;ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎;フロリン酸などの葉酸補充剤;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸、エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキサート;デホファミン;デメコルシン;エルホルミシン(elformithine);エリプチニウムアセテート;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダイニン;メイタンシン及びアンサマイトシンなどのメイタンシノイド;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール;ニトラエリン(nitraerine);ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸; 2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSKポリサッカライド複合体;ラゾキサン;リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2’,2”−トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特にT−2毒素、ベラクリンA、ロリジンA及びアンギジン);ウレタン;ビンデシン;ダカルバイジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン;6−チオグアニン;メルカプトプリン;シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP−16);イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキサート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;イリノテカン(例えば、CPT−11)トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000;ジフルオロメチルヒロルニチン(DMFO);レチノイド(レチノイン酸など);カペシタビン;カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナム、及び上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。
(2.放射線療法)
DNA損傷を引き起こし、広範に使用されている他の因子には、γ線、X線、及び/又は放射性同位元素の腫瘍細胞への指向性送達として知られているものが含まれる。マイクロ波、陽子ビーム照射(米国特許第5,760,395号及び第4,870,287号)、及びUV照射のような他の形態のDNA損傷因子もまた意図される。これらの因子はすべて、DNA上、DNAの前駆体上、DNAの複製と修復、及び染色体の集合と維持、広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が高い。X線の線量範囲は長時間の(3ないし4週間の)50〜200レントゲンの1日線量から、2000〜6000レントゲンの単回線量に及ぶ。放射性同位体の線量範囲は広く変化し、同位体の半減期、発せられる放射線の強度及びタイプ、及び腫瘍細胞による取込に依存する。
(3.免疫療法)
当業者は、さらなる免疫療法が実施形態の方法と組み合わせて、又は組み合わせて使用され得ることを理解する。癌治療との関連では、免疫治療薬が癌細胞を標的とし、破壊するための免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存し得る。リツキシマブ(RITUXAN(登録商標))がそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独では、治療のエフェクターとして役立つか、又は他の細胞を動員して、実際に細胞殺傷に影響を及ぼすかもしれない。抗体はまた、薬物又は毒素(化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など)に結合され得、そして標的化剤として役立ち得る。別法として、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的に又は間接的に相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であってもよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性T細胞及びNK細胞が含まれる。
抗体−薬物コンジュゲート(ADC)は、細胞殺傷薬物に共有結合したモノクローナル抗体(MAb)を含む。このアプローチは、それらの抗原標的に対するMAbの高い特異性を、非常に強力な細胞毒性薬物と組み合わせ、その結果、ペイロード(薬物)を、豊富なレベルの抗原で腫瘍細胞に送達する「武装」MAbをもたらす。薬物の標的送達はまた、正常組織におけるその曝露を最小限にし、毒性の減少及び治療指数の改善をもたらす。ADC治療薬2剤、ADCETRIS(登録商標)(ブレンツキシマブ ベドチン)を2011年に、KADCYLA(登録商標)(トラスツズマブ エムタンシン又はT−DM1)を2013年にFDAが承認したことにより、このアプローチの妥当性が検証された。このアプローチでは、抗原に対して、MAbの高い特異性を組み合わせている。現在、がん治療のための様々な段階の臨床試験において、30を超えるADC薬候補が存在する。抗体工学及びリンカー−ペイロード最適化がますます成熟することにつれて、新しいADCの発見及び開発は、このアプローチに適切な新しい標的の同定及び確認、並びに標的MAbの生成にますます依存している。ADC標的の2つの基準は、腫瘍細胞における発現のアップレギュレート/高レベル及びロバストな内在化である。
免疫療法の1つの態様において、腫瘍細胞は標的化しやすい、すなわち、他の細胞の大部分に存在しない、いくつかのマーカーを担持することができる。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれも、本実施形態の文脈において標的化に適する可能性がある。一般的な腫瘍マーカーには、CD20、癌胎児性抗原、チロシナーゼ(p97)、gp68、TAG−72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、ラミニン受容体、erb B及びp155が含まれる。免疫療法の代替態様は、抗癌効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。免疫刺激分子には、IL−2、IL−4、IL−12、GM−CSF、γ−IFNなどのサイトカイン、MIP−1、MCP−1、IL−8などのケモカイン、及びFLT3リガンドなどの成長因子も含まれる。
現在研究中又は使用中の免疫療法の例は免疫アジュバント、例えば、Mycobacterium bovis、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物;サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、及びγ、IL−1、GM−CSF、及びTNF;遺伝子療法、例えば、TNF、IL−1、IL−2、及びp53;並びにモノクローナル抗体、例えば、抗CD20、抗ガングリオシドGM2、及び抗p185である。1つ以上の抗癌療法が、本明細書中に記載される抗体療法と共に使用され得ることが意図される。
いくつかの実施形態では、免疫療法が免疫チェックポイント阻害剤であってもよい。免疫チェックポイントはシグナル(例えば、共刺激分子)を上昇させるか、又はシグナルを低下させる免疫系における分子である。免疫チェックポイント遮断の標的となりうる抑制性チェックポイント分子には、アデノシンA2A受容体(A2AR)、B7−H3(CD276としても知られる)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA−4、CD152としても知られる)、インドールアミン2,3−ジオキシゲナーゼ(IDO)、キラー細胞免疫グロブリン(KIR)、リンパ球活性化遺伝子−3(LAG3)、プログラムドデス1(PD−1)、T細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン3(TIM−3)及びT細胞活性化VドメインIg抑制因子(VISTA)がある。特に、免疫チェックポイント阻害剤はPD−1軸及び/又はCTLA−4を標的とする。
免疫チェックポイント阻害剤は小分子、リガンド又はレセプターの組換え形態などの薬物であってもよく、又は特に、ヒト抗体などの抗体であってもよい(例えば、国際特許公開第WO2015016718号;両方とも参照により本明細書に組み込まれる)。免疫チェックポイントタンパク質又はそのアナログの公知のインヒビターが使用され得、特に、抗体のキメラ化形態、ヒト化形態又はヒト形態が使用され得る。当業者が知るように、代替及び/又は同等の名称が、本開示において言及される特定の抗体のために使用され得る。そのような代替及び/又は同等の名前は、本開示の文脈において交換可能である。例えば、ランブロリズマブはまた、MK−3475及びペンブロリズマブの代替及び同等の名称で知られていることが知られている。
いくつかの実施形態では、PD−1結合アンタゴニストがPD−1のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、PD−1リガンド結合パートナーは、PDL1及び/又はPDL2である。別の実施形態において、PDL1結合アンタゴニストは、その結合パートナーへのPDL1の結合を阻害する分子である。特定の態様において、PDL1結合パートナーは、PD−1及び/又はB7−1である。別の実施形態において、PDL2結合アンタゴニストは、その結合パートナーへのPDL2の結合を阻害する分子である。特定の態様では、PDL2結合パートナーはPD−1である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許番号に記載されている。8,735,553、8,354,509及び8,008,449(すべて参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。本明細書中に提供される方法において使用するための他のPD−1軸アンタゴニストは米国特許出願第20140294898号、同第2014022021号、及び同第20110008369号(全て、本明細書中に参考として援用される)に記載されるように、当該分野で公知である。
いくつかの実施形態では、PD−1結合アンタゴニストは、抗PD−1抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体)である。いくつかの実施形態では、抗PD−1抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ及びCT−011からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、PD−1結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン(例えば、定常領域(例えば、免疫グロブリン配列のFc領域)に融合されたPDL1又はPDL2の細胞外又はPD−1結合部分を含むイムノアドヘシン)である。いくつかの実施形態では、PD−1結合アンタゴニストはAMP224である。ニボルマブはMDX−1106−04、MDX−1106、ONO−4538、BMS−936558、及びOPDIVO(登録商標)としても知られており、WO2006/121168に記載されている抗PD−1抗体である。ペンブロリズマブは、MK−3475、Merck 3475、ランブロリズマブ、KEYTRUDA(登録商標)及びSCH−900475とも呼ばれ、WO2009/114335に記載されている抗PD−1抗体である。CT−011、hBAT又はhBAT−1としても知られ、WO2009/101611に記載されている抗PD−1抗体である。AMP−224は、B7−DCIgとしても知られており、WO2010/027827及びWO2011/066342に記載されているPDL2−Fc融合可溶性受容体である。
本明細書中に提供される方法において標的化され得る別の免疫チェックポイントは、CD152としても知られる細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA−4)である。ヒトCTLA−4の完全なcDNA配列は、Genbankアクセッション番号L15006を有する。CTLA−4は、T細胞の表面上に見出され、抗原提示細胞の表面上のCD80又はCD86に結合すると「オフ」スイッチとして機能する。CTLA4は免疫グロブリンスーパーファミリーの一員で、ヘルパーT細胞の表面に発現し、T細胞に抑制性シグナルを伝達する。CTLA4はT細胞共刺激タンパク質であるCD28と類似しており、両分子は抗原提示細胞上で、CD80及びCD86(それぞれB7−1及びB7−2とも呼ばれる)に結合する。CD28は刺激性シグナルを伝達するのに対し、CTLA4はT細胞に抑制性シグナルを伝達する。細胞内CTLA4は制御性T細胞にも認められ、その機能に重要であると考えられる。T細胞レセプターとCD28を介するT細胞の活性化は、B7分子の阻害レセプターであるCTLA−4の発現を増加させる。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA−4抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドである。
本方法での使用に適した抗ヒトCTLA−4抗体(又はそれに由来するVH及び/又はVLドメイン)は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認識されている抗CTLA−4抗体を使用することができる。例えば、米国特許第8,119,129号、国際公開第01/14424号、国際公開第98/42752号;国際公開第00/37504号(CP675,206、トレメリムマブとしても知られている;以前はチシリムマブ)、米国特許第6,207,156号に開示されている抗CTLA−4抗体を、本明細書に開示されている方法において使用することができる。上記の各出版物の教訓は、ここでは参考までに取り込んでいる。CTLA−4への結合のためにこれらの技術的に認識された抗体のいずれと競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化CTLA−4抗体は国際特許出願第WO2001014424号、WO2000037504号、及び米国特許第8,017,114号に記載されており、すべて参照により本明細書に組み込まれる。
例示的な抗CTLA−4抗体は、イピリムマブ(10D1、MDX010、MDX101、及びYervoy(登録商標)としても知られる)又はその抗原結合フラグメント及び変異体である。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖及び軽鎖CDR又はVRを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのVH地域のCDR1、CDR2、及びCDR3ドメイン、並びにイピリムマブのVL地域のCDR1、CDR2、及びCDR3ドメインを含む。別の実施形態では、抗体が上述の抗体と同じCTLA−4上のエピトープとの結合及び/又は結合について競合する。別の実施形態において、抗体は、上記の抗体と少なくとも約90%の可変領域アミノ酸配列同一性(例えば、イピリムマブと少なくとも約90%、95%、又は99%の可変領域同一性)を有する。
CTLA−4を調節するための他の分子には、米国特許番号US5844905号、US5885796号、国際特許出願番号WO1995001994及びWO1998042752に記載されているようなCTLA−4リガンド及びレセプターが含まれる。;すべて参照により本明細書に組み込まれる;及び米国特許第US8329867号に記載されるような免疫接着(参照により本明細書に組み込まれる)。
(4.手術)
癌を有する人の約60%が、予防的、診断的又は病期分類、治癒的及び緩和的手術を含む何らかの種類の手術を受ける。治癒的手術は、癌性組織の全て又は一部が物理的に除去され、切除され、及び/又は破壊され、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び/又は代替療法などの他の療法と併用され得る。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去をいう。腫瘍切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡的に制御された手術(モース手術)が含まれる。
癌性細胞、組織、又は腫瘍の一部又は全部を切除すると、体内に空洞が形成され得る。治療は、潅流、直接注射、又は追加の抗癌治療を伴う領域の局所適用によって達成され得る。そのような治療は例えば、1、2、3、4、5、6、7日毎に、又は1、2、3、4及び5週間毎に、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12ヶ月毎に反復することができる。これらの治療は、同様に様々な投与量であり得る。
(5.その他の薬剤)
治療の治療効果を改善するために、他の薬剤を本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用してもよいことが企図される。したがって、さらなる例を考えることができる。これらの追加の薬剤には、細胞表面受容体及びギャップ結合のアップレギュレーションに影響する薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる薬剤、又は他の生物学的薬剤が含まれる。ギャップ結合の数を増加させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖作用を増加させるのであろう。他の実施形態において、細胞増殖抑制剤又は分化剤は治療の抗過剰増殖効力を改善するために、本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用され得る。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の効力を改善することが意図される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ(FAK)阻害剤及びロバスタチンである。さらに、抗体c225のような、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる他の薬剤が治療効力を改善するために、本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用され得ることがさらに意図される。
[キット]
実施形態の様々な態様において、治療剤及び/又は他の治療剤及び送達剤を含有するキットが想定される。いくつかの実施形態において、本実施形態は、実施形態のエキソソーム組成物を調製及び/又は投与するためのキットを意図する。キットは、本実施形態の医薬組成物のいずれかを含有する1つ以上の密封バイアルを含み得る。このキットは例えば、エキソソーム、並びに実施形態の成分を調製、処方及び/又は投与するための試薬、又は本発明の方法の1つ以上の工程を実行するための試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、キットはまた、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、又はチューブなどのキットの構成要素と反応しない容器である適切な容器を含んでもよい。容器は、プラスチック又はガラスなどの滅菌可能な材料から作製されてもよい。
キットは、本明細書に記載される方法の手順のステップを概説し、本明細書に記載される手順と実質的に同じ手順に従うか、又は当業者に公知である、説明書をさらに含んでもよい。取扱説明は、コンピュータを使用して実行されると、薬学的に有効な量の治療薬を送達する実際の又は仮想の手順の表示を引き起こす、機械可読命令を含むコンピュータ可読媒体中にあってもよい。
[V.実施例]
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を実証するために含める。以下の実施例において開示される手法が本発明の実施において十分に機能することが発明者らによって見いだされた技術を表し、従って、本発明の実践において十分に機能することが当業者には理解されるはずである。しかしながら、当業者であれば、本発明の開示を考慮して、開示されかつ同様の結果を得られる特定の実施例において、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であることは理解できるのであろう。
[例1−エキソソームの生産と特性化]
MSCから大量のエキソソームを生成するために、骨髄由来MSCのバイオリアクター培養物を、馴化培地の250mL採集物の採集を可能にするように適合させた。Terumo Quantum Cell Expansion systemは、細胞のGMP準拠性産生のために設計された自動中空繊維細胞培養プラットフォームである。
MSCを、約450細胞/cmの濃度で、約2.0×10MSCと共にバイオリアクターに播種した。細胞を、MSC増殖及び接着のために、L−グルタミン+ヒト血小板溶解物(PLT)を補充したαMEM培地を使用して、5%酸素中で8日間培養した。
他者によって報告されていない本発明の方法における独特の工程はバイオリアクターにおける最適なMSCコンフルエンスのための血小板溶解物の最初の使用、続いて、バイオリアクターにおけるMSCが85%以上のコンフルエンスに達したら、増殖培地を無血清馴化培地と交換する次の工程を含む。この工程は、血小板溶解物中に大量に見出され、そうでなければMSC由来エキソソームを希釈するエキソソームで最終産物を汚染することを回避する。馴化培地をバイオリアクター中に48時間放置し、次いでEV精製のために採集した(図1)。バイオリアクターは、6つの採集(48時間毎に1つ)を含むEVを12日間連続的に産生した(図2)。
このアプローチを用いて、約6億MSCからEVを逐次採集することによりシステムを最適化した。21日後、48時間毎に採集され、−80oCで保存された馴化培地画分を解凍し、プールし、機能的に閉鎖された系で濾過した(図3)。
ポンプ(Baxter)を、このプロセスのためのバッグチューブのヒートシール後の濾過のために使用し、これは、臨床細胞治療手順に必要とされるGMPコンプライアンスと一致した。XE−90 Ultracentrifuge(Beckman Coulter)を用いて、100,000gで4時間、4℃で超遠心分離することにより、EVを馴化培地からエキソソームとして単離した。Baxterポンプ及びヒートシールされたチューブを使用して、最高品質の臨床製品のために機能的に閉鎖された様式で超遠心分離機からエキソソームを除去した。
エキソソームはろ過及び限外遠心により濃縮され、エキソソーム数は1回の採集当たり9000億〜4兆5000億の範囲であった。生成されたエキソソームの総数は、バイオリアクター実行当たり9.8〜15.1兆の範囲である。バイオリアクター実験の6つの収穫物全てからのエキソソームのモードサイズは、約170nmに特徴的なピークを示した。エキソソーム蛋白質含量の測定値は、NanoSight分析により決定したエキソソーム数に近似した。特に、馴化培地の代謝収穫(metabolic harvests)は一定のままであり、MSCが生存したままであることを支持した。
精製されたエキソソームを、エキソソーム表面マーカー:CD63、CD47、CD9及びCD81のフローサイトメトリー発現;並びに透過型電子顕微鏡法(TEM)によって同定した(図4)。さらに、ナノ粒子追跡分析及びマイクロBCAアッセイを使用して、エキソソームを定量した(図5)。1回のバイオリアクター実行からの収率は100 T−225フラスコからのおおよそのエキソソーム収率に等しい、最低10×1012エキソソームであった。従って、本発明の方法は、エキソソームの効率的な臨床グレードの産生を可能にする。
[実施例2−エキソソームのエレクトロポレーション]
4D Nucleofactorシステムは実施例1に由来するエキソソームのような、2.5×1010〜2.5×1012の範囲の大規模エキソソーム数の閉鎖された、効率的かつスケーラブルなインビトロトランスフェクションを可能にするために、LVユニットと適合された。4D Nucleofactorデバイスは3つの異なる核内因子溶液であるSE、SF、及びSGを含み、これらの各々は、MSC由来エキソソーム及び特異的siRNAを使用して、16の異なる核内因子プログラムと組み合わせて試験された。siRNAをMSC由来エキソソームに効率的に組み込むための各条件の効率を、siRNAを有するMSCエキソソームによって誘導されたレシピエント細胞のアポトーシスアッセイによって評価した(図7)。
以前は規定されたエレクトロポレーション緩衝液(研究用緩衝液、「RB」)を使用して、siRNAをエキソソームに導入したが、これは、その緩衝液がヒトの使用に対して承認されていないため。細胞又はマウスを治療する前に、エキソソームの洗浄工程を必要とした。洗浄工程はエキソソームの損失に関連し、これは、siRNAのエキソソームへの首尾よいエレクトロポレーションを可能にし、そして細胞又はマウスに直接投与され得る希釈剤の使用によって軽減され得る。臨床緩衝液(PLASMALYTE−A(登録商標)、「CB」)、ヒト使用のためのFDA承認希釈剤(これは、MSC及び患者への多くの他の細胞産物注入のために使用される)を、エレクトロポレーションについて試験した。MSC由来エキソソームのエレクトロポレーションに続いて、電子顕微鏡分析は、最初に処方された研究用緩衝液(RB)又はPLASMALYTE−A(登録商標)(図8B)のいずれかを使用して、完全なエキソソームの存在を確認した。
[実施例3−エキソソーム製造における条件の最適化]
MSC培養物からエキソソームを産生するための最良の時間を決定するために、馴化培地の採集を異なる時間で行った(図5D)。ナノサイトから得られたデータ(すなわち、粒子の数)を、フローサイトメトリーについて得られたデータ(すなわち、エキソソームマーカーのパーセンテージ)と合わせた。結果は、MSCからの粒子の数が24時間で最高レベルに達し、48時間まで維持されることを示した。その後、粒子の数は有意に減少した。フローデータは、エキソソームマーカーのパーセンテージが24時間でのパーセンテージと比較して、48時間で濃縮されたことを示した(図5E)。24時間と48時間との間の粒子の数は有意に異ならなかったので、48時間の時点を採集のための時点として選択した。
次に、培養中のMSCからエキソソームを産生するための理想的な条件を決定するために、PLTを含有する培地の有無にかかわらず、24時間の培養後に、馴化培地からMSC由来エキソソームを単離した。結果は、PLTを有する培地から単離された粒子の数が無血清培地よりも多いことを示した(図6A)。しかしながら、エキソソームマーカーのフローサイトメトリーはおそらくPLT中のタンパク質及び脂質の数が多いために、エキソソームのパーセンテージが低いことを示した(図6B)。
従って、核酸又はタンパク質の小配列のエキソソームへのエレクトロポレーションのプロセスは無菌溶液(すなわち、PLASMALYTE−A(登録商標))(図8A)を使用して最適化され、これは、ヒトにおいて直接注入され得、操作、材料の損失、及び治療のコストを減少させた(図9)。PLASMALYTE−A(登録商標)が最適なエレクトロポレーション結果を生じることを実証する前に、5つの異なる研究用緩衝液を試験した(図8A)。さらに、このストラテジーによって産生されたMSC由来エキソソームの、いくつかの組織を標的とする能力が、インビボで実証された(図10)。
従って、本研究は、レシピエント細胞における標的RNAのインビトロ発現をサイレンスし得るKRAS siRNAを保有するMSC−エキソソームの効率的な大規模生産を実証した(図8C)。このアプローチは、以前の方法と比較して、より多くの数のEVを1対数より多く生成する。さらに、本発明の方法は洗浄又は他の操作なしに、操作されたエキソソームの直接注入を可能にする。
[実施例4−材料及び方法]
細胞:MDアンダーソン癌センターのCell Therapy Laboratoryから得た骨髄由来MSC(継代3)を、1%L−グルタミン、5%ヒト血小板溶解物、1%ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したαMEM(完全培地)で培養した。3つの異なるドナー由来のMSCを評価し、次いで、その高いエキソソーム産生収率に基づいて単一のドナーを選択した。インビトロトランスフェクションのために、6ウェルプレートのウェルあたり250,000個のPanc−1細胞を一晩播種した。エキソソーム処理の前に、単層を1mlのPBSで2回洗浄し、次いで、1mlの無血清培地(1%ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したRPMI)中のエキソソームで、各アッセイについて記載したような指示された時点で処理した。
臨床緩衝液(PLASMALYTE−A(登録商標)pH 7.4又は「CB」)は、0.09M塩化ナトリウム、0.23Mグルコン酸ナトリウム;0.27M酢酸ナトリウム三水和物、5mM塩化カリウム、3mM塩化マグネシウムから構成される。抗菌剤を含まない。水酸化ナトリウムでpHを7.4に調整する。
臨床グレードのエキソソームは、MDアンダーソン癌センターのCell Therapy LaboratoryのGMP施設で培養したMSCから厳密に調製した。Quantumバイオリアクター培養系(Terumo BCT)を1Lの1×PBSでプライミングし(自動化プロセス)、250mlの1×PBS中に希釈した5mgのヒトフィブロネクチン(BD Biosciences、ドイツ)で24時間コーティングした。次いで、バイオリアクターを、1%L−グルタミン、5%ヒト血小板溶解物、及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(完全培地)を添加した培養済みαMEM500mlで洗浄し、25mlの完全培地中で希釈した20×10MSC(継代3)をロードし、完全培地を使用して9日間増殖させた。新鮮な完全培地を連続的に細胞に添加し、毎日のグルコース及び乳酸塩の測定によって規定されるように、注入速度を調節した。9日後、細胞が約80%コンフルエンスに達したとき(グルコース及びラクトース測定によって確認される)、細胞を2Lの1×PBSで洗浄して、完全培地をPLTを含まない培地(1%L−グルタミン及び1%ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したαMEM)に交換した。次いで、バイオリアクター馴化培地(250ml)を、密封バッグ(閉鎖系)中に48時間ごとに採集し、全部で6回の採集(回収)を行った。これらの12日間、培養物は、毎日測定される一定のグルコースレベルに基づいて拡大しなかった。従って、エキソソームを、12日間にわたって48時間毎に連続的に採集した。収穫物を、さらなる処理のために−80℃で保存した。各収穫物を、無菌性(嫌気性及び好気性細菌について陰性であることが確認された)、エンドトキシン(<1EU/ml)及びマイコプラズマ(PCR、陰性)の試験を行った。次いで、採集物を4℃で一晩解凍し、プールし、Cobe 2991 Cell Processor(Terumo BCT)を使用した閉鎖系において、1,000gで15分間遠心分離した。遠心分離(4℃で15分間、1,000g)によって大きな細胞残屑を除去した後、馴化培地を、0.2μmフィルター(Terumo BCT)の濾過バッグを使用して閉鎖系で濾過した。次いで、600mlの上清を、シリンジ及びポリカーボネートチューブ(Beckman Coulter)に直接接続されたラインを使用して、半閉鎖系で6つの透明なポリカーボネートチューブ(各チューブは100mlの容量を有する)に移し、密封し、45型Tiローター(Beckman−Coulter)中で、100,000gで3時間遠心分離した。全ての採集物が遠心されるまで、このプロセスを3回繰り返した(合計1500ml)。次に、ポンプに接続した16Gシリンジ(BD Biosciences、カタログ番号14−826−18B)を用いて上清を吸引した。エキソソームペレットを、18Gシリンジ(BD、カタログ番号408360)を使用して、4ml(チューブ当たり)の臨床緩衝液中に手動で再懸濁し、そして滅菌ガラス容器(APP Pharma、容量30ml)に移した。これを、全ての遠心分離が完了するまで、4℃で72時間まで維持した。全ての遠心分離が完了したとき、再懸濁されたエキソソームの最終プール容量は72mlであった。プールされたMSCエキソソームを、NanoSightTM(0.5ml)、フローサイトメトリー(1ml)によって分析し、そしてエンドトキシン(プールされたサンプル0.5mlを使用して)及び無菌性(上記に詳述されるように、プールされたサンプル1mlを使用して)を試験した。最後に、エキソソーム(最終容量69ml)を、各々(2ml)を含むクライオガラスバイアルに分け、−80℃で保存した。将来の臨床製品の製造のために、エキソソームは、大規模エレクトロポレーションのために直接処理され(詳細については以下を参照のこと)、次いで、分注され、−80℃で保存される。
NTAによる粒子サイズ及び濃度分布の測定:単離されたエキソソーム懸濁液を、NanoSightTM LM 10機器(NanoSight Ltd)を使用して分析した。分析設定を最適化し、サンプル間で一定に保ち、各ビデオを分析して、各粒子サイズの平均、モード、中央値及び推定濃度を得た。
microBCAアッセイによるエキソソームの定量:CBに再懸濁したMSCエキソソームを1×PBSで洗浄し、SW 41型Tiトーター(Beckman Coulter)中で100,000gで3時間超遠心分離した。次いで、洗浄したMSCエキソソームを、NanoSightTMによって再び測定し、そしてmicroBCAタンパク質アッセイ試薬キット(Thermo Scientific)を使用して、製造元の仕様に従って、総タンパク質含量を分析した。
エキソソームのエレクトロポレーション:総数で0.5×1012個のMSC由来エキソソーム及び0.5mgのsiRNAソース2(Avecia)を、20mlの臨床緩衝液中で混合した。これらのエキソソームを、4D Nucleofator LVユニット(Lonza)を使用して、閉鎖系においてエレクトロポレーションした。LV NucleocuvetteTMカートリッジは、20mlまでのエレクトロポレーションを可能にする新しいキュベットシステムである。カートリッジは、2つのリザーババッグ(入口及び出口)と、1時間当たり1mlでカートリッジを満たす蠕動ポンプとに接続される。全ての手順の間、アウトレットバッグは氷上に維持され、手順を完了するのに約10分かかる。エレクトロポレーション後、エキソソームをNanoSightTMによって分析し、エンドトキシン及び無菌性について試験し(上記に詳述したように)、凍結バイアルに分注し、−80℃で保存した。次に、これらのエキソソームを氷上で解凍し、その後のin vitro及びin vivo実験に使用した。インビトロ実験のために、エキソソームを、以下に詳述する下流の適用のために希釈した。インビボ実験のために、109のエレクトロポレーションされたエキソソームを、100μLの研究用緩衝液又は臨床緩衝液中で希釈した。
電子顕微鏡:最適濃度で固定した標本を300メッシュのカーボン/ホルムバール被覆グリッド上に置き、最低1分間ホルムバールに吸収させた。グリッドをPBSですすぎ、0.1Mリン酸緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒド中に15分間置いた。PBS及び蒸留水でリンスした後、グリッドを乾燥させ、酢酸ウラニルを用いてコントラストを染色した。サンプルをTecnai Bio Twin透過型電子顕微鏡(FEI、Hillsboro、OR)で観察し、画像をAMT CCDカメラ(Advanced Microscopy Techniques、Danvers、MA)で撮影した。
エキソソームのフローサイトメトリー分析:MSCからのエキソソームを上記のように単離し、200μlのPBSに再懸濁した。アルデヒド/硫酸塩ビーズ(10μl、Life Technologies)を溶液に添加し、ビーズ及びエキソソーム混合物を、卓上ローテーターを用いて室温で15分間混合した。次いで、PBS(600μl)を溶液に添加し、4℃で混合を一晩続け、1Mグリシン(400μl)を添加し、室温で混合を1時間続けた。次に、混合物を8,000gで1分間スピンダウンした。次いで、沈殿物をPBS中10% BSA100μLに再懸濁し、室温で45分間混合した。混合物を8,000gで1分間スピンダウンし、上清を吸引した。次いで、エキソソームが付着したビーズ(ペレット)を、PBS中の20μlの2% BSAに再懸濁し、そしてCD47、CD63、CD81、CD9、CD29、CD90又はアイソタイプ・コントロールについて免疫標識した。ビーズに結合したエキソソームを、1μlの抗CD47抗体(eBiosciences、カタログ番号14−0479)又は1μlの抗CD63(BD biosciences、カタログ番号556019)、又は1μlの抗CD−81抗体(BD Biosciences、カタログ番号555675)、又は1μlの抗CD9抗体(Sigma、カタログ番号SAB4700092)又は1μlの抗CD29免疫(Biolegend、カタログ番号303001)、又は1μlの抗CD90免疫a(Biolegend、カタログ番号328101)、又は1μlのマウスIgG1、κアイソタイプ・コントロール免疫(BD Biosciences、カタログ番号555746)と20μl容量でインキュベートし、室温で30分間混合した。次に、混合物を8,000gで1分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットをPBS中の2% BSA20μlに再懸濁した。次いで、1μlの二次抗体(Invitrogen、カタログ番号A21202)を試料及びアイソタイプ・コントロールに添加した。次いで、全てのサンプルを室温で1時間混合した。次いで、サンプルを8,000gで1分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットをPBS中の2%BSA 200μlに再懸濁した。ビーズに結合したエキソソームを、PBS中の2% BSAで3回洗浄した。エキソソームマーカー(CD9、CD63及びCD81、CD47、及び間葉系マーカー(CD29及びCD90)の発現を、LSR Fortessa X−20セルアナライザーを用いて分析した。データは、FlowJoRソフトウェア(TreeStar Inc.)を用いて分析した。フローサイトメトリーデータは、アイソタイプ対照及び各実験のサンプルの両方について並べて取得した。同じエキソソーム調製物を用いて、フローサイトメトリー実験を独立して2回繰り返した。
本明細書に開示され、特許請求される方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく、作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び方法のステップ又はステップのシーケンスに変形を適用できることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤で本明細書中に記載の薬剤を代用し、同じ又は類似の結果が達成され得ることが理解されるのであろう。当業者に明らかなすべてのそのような同様な置換及び修飾は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念内にあるとみなされる。
[参考文献]
以下の参考文献は、それらが本明細書に示されるものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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米国特許8,735,553号
米国公開特許番号20110008369号
米国公開特許番号2014022021号
米国公開特許番号20140294898号

Claims (77)

  1. 間葉系幹細胞(MSC)からエキソソームを製造する方法であって:
    (a)MSCを機能的に閉鎖されたバイオリアクター中で、ヒト血小板溶解物(PLT)を含む培地中で75〜95%コンフルエンシーまで培養すること;
    (b)細胞を、さらにPLTを本質的に含まない培地中で培養すること;
    (c)前記バイオリアクターからの馴化培地画分を採集すること;及び
    (d)前記馴化培地画分からエキソソームを単離すること
    を含む、方法。
  2. 各馴化培地画分が、採集後に−80℃で保存される、請求項1に記載の方法。
  3. 前記馴化培地画分を解凍し、工程(d)の前にプールする、請求項2に記載の方法。
  4. MSCが、骨髄由来MSCとしてさらに定義される、請求項1に記載の方法。
  5. MSCが脂肪由来MSCとしてさらに定義される、請求項1に記載の方法。
  6. 工程(a)の前に、前記バイオリアクターに少なくとも1×10個のMSCを播種することをさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記MSCが、約400〜500細胞/cmの密度で播種される、請求項6に記載の方法。
  8. 前記閉鎖されたバイオリアクターが中空繊維バイオリアクターである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 中空繊維バイオリアクターが、テルモ細胞増殖システムである、請求項8に記載の方法。
  10. 工程(a)の培地において、PLTが5%の濃度である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 新鮮な培地が、前記バイオリアクター中のMSCに連続的に添加される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 細胞が、5%酸素で培養される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 工程(a)の培養が5〜10日間である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 工程(a)の培養が、8日間である、請求項13に記載の方法。
  15. MSCが80〜90%コンフルエンシーまで培養される、請求項1に記載の方法。
  16. MSCが85〜90%コンフルエンシーまで培養される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
  17. 工程(b)の培養が24〜72時間である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 工程(b)の培養が48時間である、請求項17に記載の方法。
  19. 工程(b)の培地がPLTを含まない、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  20. MSCが工程(a)と(b)との間で洗浄される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  21. MSCが無血清の規定培地中で培養される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 工程(a)〜(d)が無血清条件下で行われる、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記馴化培地画分が、密封バッグに採集される、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記馴化培地画分が24〜72時間毎に採集される、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記馴化培地画分が40〜50時間毎に採集される、請求項24に記載の方法。
  26. 馴化培地画分が48時間毎に採集される、請求項24に記載の方法。
  27. 前記馴化培地画分が、それぞれ200〜300mLの体積である、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記馴化培地画分を10〜14日間採集する、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記馴化培地画分を12日間採集する、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
  30. 少なくとも5つの馴化培地画分が採集される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
  31. 工程(a)〜(d)が3週間未満で行われる、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 各馴化培地画分が、9×1011〜50×1011個のエキソソームを含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
  33. 工程(c)で、少なくとも10×1012個のエキソソームが単離される、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
  34. 工程(c)で、少なくとも15×1012個のエキソソームが単離される、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
  35. 単離が、エキソソーム含有ペレットを得るためのプールされた画分の濾過及び限外遠心と前記エキソソーム含有ペレットを緩衝液中に再懸濁することを含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 隔離が、ポンプ及びヒートシールされた管を使用して、機能的に閉鎖された様式で行われる、請求項35に記載の方法。
  37. 濾過が、プールされた画分を0.2μmフィルターに通すこととしてさらに定義される、請求項35に記載の方法。
  38. 単離がさらに、大きな細胞残屑を除去するための、濾過の前の遠心分離工程をさらに含む、請求項35に記載の方法。
  39. 単離が4℃で行われる、請求項35〜38のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記緩衝液が、0.09M塩化ナトリウム、0.23Mグルコン酸ナトリウム、0.27M酢酸ナトリウム三水和物、5mM塩化カリウム、及び3mM塩化マグネシウムを含む、請求項35に記載の方法。
  41. 前記緩衝液のpHが7.4である、請求項35又は40に記載の方法。
  42. 前記緩衝液がPLASMALYTE−A(登録商標)である、請求項41に記載の方法。
  43. 前記エキソソームに治療剤を搭載することをさらに含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記治療剤が、1つ以上のサイトカイン、化学療法剤、核酸、小分子、又はタンパク質を含む、請求項43に記載の方法。
  45. 前記核酸がDNA及び/又はRNAを含む、請求項44に記載の方法。
  46. RNAがsiRNA、miRNA、又はshRNAである、請求項45に記載の方法。
  47. RNAがsiRNAである、請求項45に記載の方法。
  48. 搭載が、前記エキソソームをエレクトロポレーションすることを含む、請求項43〜47のいずれか一項に記載の方法。
  49. エレクトロポレーションが、PLASMALYTE−A(登録商標)で実行される、請求項48に記載の方法。
  50. 前記方法が工程(d)とエレクトロポレーションとの間で、エキソソームを洗浄すること又は緩衝液を交換することを含まない、請求項49に記載の方法。
  51. 工程(d)から搭載されたエキソソームの数までのエキソソームの数が20%を超えて減少しない、請求項50に記載の方法。
  52. 請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法によって産生されたエキソソームを含む、医薬組成物。
  53. 請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法によって産生されたエキソソームの有効量を対象に投与することを含む、癌を治療するための方法。
  54. 対象がヒトである、請求項53に記載の方法。
  55. 前記エレクトロポレーションされたエキソソームが、前記対象に直接注入される、請求項53又は54に記載の方法。
  56. 少なくとも第2の抗癌治療を施すことをさらに含む、請求項53〜55のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記少なくとも第2の抗癌療法が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法又は免疫療法を含む、請求項56に記載の方法。
  58. 請求項43〜51のいずれか一項に記載の方法によって産生された有効量のRNA搭載エキソソームを細胞に投与することを含む、RNAを細胞に送達する方法。
  59. 前記細胞がヒト細胞である、請求項58に記載の方法。
  60. 前記細胞が癌細胞又はT細胞である、請求項59に記載の方法。
  61. 請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法によって産生された有効量のエキソソームを対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法。
  62. 前記エキソソームにsiRNA又はmiRNAを搭載する、請求項61に記載の方法。
  63. 前記疾患又は障害が、癌、炎症性障害、又は免疫関連障害である、請求項61又は62に記載の方法。
  64. 癌が肺癌である、請求項61〜63のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記エキソソームにKRAS siRNAが搭載される、請求項61〜64のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記対象がヒトである、請求項61〜65のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記エキソソームが、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、内視鏡的、経皮的、皮下、局所的、又は直接注射によって投与される、請求項61〜66のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記エキソソームが静脈内に投与される、請求項67に記載の方法。
  69. 少なくとも第2の治療剤を投与することをさらに含む、請求項61〜68のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記少なくとも第2の治療剤が抗癌剤である、請求項69に記載の方法。
  71. 抗癌剤が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法又は免疫療法である、請求項70に記載の方法。
  72. 免疫介在性炎症性疾患に罹患している対象における、該疾患を治療する方法であって、該対象に治療有効量の請求項1に記載のMSC由来エキソソームを投与することを含む、方法。
  73. 免疫介在性炎症性疾患が、関節リウマチ(RA)、炎症性腸疾患(IBD)、及びクローン病からなる群より選択される、請求項72記載の方法。
  74. MSCが同種異系である、請求項72又は73に記載の方法。
  75. エキソソームが全身的又は局所的に投与される、請求項72〜74のいずれか一項に記載の方法。
  76. エキソソームが、直腸、鼻、頬、膣、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病変内、又は頭蓋内経路を介して、又は埋め込み型のリザーバーを介して投与される、請求項72〜75のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記エキソソームが、少なくとも1つのさらなる治療剤と組み合わせて投与される、請求項72〜76のいずれか一項に記載の方法。
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