KR20200088408A - Msc 유래의 엑소좀의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 유래된 임상 등급 엑소좀의 제조 방법이 본원에 제공된다. 상기 엑소좀에 치료제, 예컨대 siRNA를 로딩하는 방법도 추가로 제공된다. 상기 임상 등급의 엑소좀을 투여하여 질병을 치료하는 방법도 본원에 제공된다.

Description

MSC 유래의 엑소좀의 제조 방법

본 출원은 2017년 11월 16일에 출원된 미국 가특허출원 62/587,408호에 대한 이익을 주장하며, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP)을 충족하는 엑소좀의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

엑소좀 및 미세소포를 포함하는 세포외 소포 (EV)는 여러 생리학적 과정에 참여하는 나노 크기의 세포간 교신 비히클(communication vehicle)이다. 구체적으로, 엑소좀은 세포에 의해 방출된 나노 크기의 소포로서, 이들은 세포 성분들과 생성물의 세포간 교환 방식을 구성하고 있어 이들의 치료제 전달 제제로서의 유용성에 새로운 관심을 불러 일으켰다. 이들에 상응하는 인공적으로 제조된 대응물과는 달리, 세포들 간에 자연적으로 생성된 이러한 특수화된 왕복운행 체제(shuttle service)의 특징은 치료제 탑재물의 효율적인 전달에 있어서 특유의 이점을 제공할 수 있다. 이러한 엑소좀 제조 및 세포 흡수와 관련된 엑소좀 및 조절기구의 특징들은 더 연구되어야 한다. 그럼에도 불구하고, 암을 비롯한 질병의 치료적 제어를 위한 엑소좀의 사용은 이미 장래성이 기대되는 결과를 보여주었다.

엑소좀은 이들의 생물학적 특성 덕분에, 면역 질환의 치료 및 치료 화합물, 예컨대 사이토카인, 화학요법제, 핵산 및 바이러스 벡터의 전신적 전달을 위한 유망한 후보물질이 되었다. 그러나, 이들의 제조 수율이 낮으면 진료소에서 활용될 수 있는 가능성이 제한을 받게 된다. 따라서, 치료제로 사용될 수 있는 엑소좀을 제조하기 위한 효율적인 방법이 필요한 실정이다.

제1 실시양태에서, 기능적으로 폐쇄된 생물반응기에서 중간엽 줄기 세포(MSC)를 인간 혈소판 용해물 (PLT)을 포함하는 배지 중에서 전면생장률(confluency) (예컨대, 75-95% 또는 80-90%의 전면생장률, 예컨대 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90%)까지 배양하는 단계; 본질적으로 PLT를 함유하지 않는 (예컨대, PLT가 없는) 배지 중에서 상기 세포를 추가로 배양하는 단계; 상기 생물반응기로부터 조정된 배지(conditioned media) 분획을 수집하는 단계; 및 상기 조정된 배지 분획으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 엑소좀을 제조하는 방법이 제공된다.

일부 양태에서, 각각의 조정된 배지 분획을 수집한 후 -80℃로 보관한다. 특정 양태에서, 상기 조정된 배지 분획을 분리하기 전에 해동하여 모아둔다.

특정 양태에서, MSC는 골수 유래의 MSC로서 추가로 정의된다. 특정 양태에서, MSC는 지방 유래의 MSC로서 추가로 정의된다.

추가의 양태에서, 상기 방법은 생물반응기 중에서 MSC를 배양하기 전에 상기 생물반응기에 적어도 1×10⁷ 개의 MSC를 분주하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, MSC는 약 400-500개의 세포/cm²의 밀도로 분주된다.

특정 양태에서, 상기 폐쇄된 생물반응기는 중공사 생물반응기이다. 일부 양태에서, 상기 중공사 생물반응기는 테루모(Terumo) 세포 증식 시스템이다.

일부 양태에서, 상기 PLT는 MSC 배양 배지 중에 5%의 농도로 존재한다. 상기 PLT의 농도는 약 2-10%, 예컨대 3, 4, 5 또는 6%일 수 있다. 특정 양태에서, 새로운 배지를 생물반응기의 MSC에 연속적으로 첨가한다. 특정 양태에서, 상기 세포를 5%의 산소에서 배양한다. 일부 양태에서, 단계 (a)의 배양은 5-10일, 예컨대 6, 7, 8 또는 9일 동안 이루어진다. 특정 양태에서, 단계 (a)의 배양은 8일 동안 이루어진다.

특정 양태에서, 상기 MSC는 85-90% 전면생장률, 예컨대 85, 86, 87, 88, 89 또는 90%의 전면생장률까지 배양된다. 전면생장률은 글루코스와 락토스 농도를 모니터링하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 락토스의 수준은 약 2-6 mmol/L, 예컨대 약 2, 3, 4, 5 또는 6 mmol/L일 수 있고, 글루코스의 수준은 약 80-140 mg/dL, 예컨대 약 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135 또는 140 mg/dL일 수 있다.

일부 양태에서, 본질적으로 PLT가 없는 배지 중에서의 배양은 24-72시간, 예컨대 24-48, 36-50, 48-60 또는 50-72시간, 예컨대 약 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52시간 동안 수행된다. 특정 양태에서, 본질적으로 PLT가 없는 배지 중에서의 배양은 약 48시간 동안 수행된다. 특정 양태에서, 상기 추가 배양 단계에서의 배지에는 PLT가 없다.

특정 양태에서, PLT를 이용한 배양 단계와 PLT가 본질적으로 없거나 전혀 없는 배지에서의 배양 단계 사이에 상기 MSC를 세척한다. 일부 양태에서, 상기 MSC는 무혈청의 합성(defined) 배지에서 배양한다. 특정 양태에서, 상기 전 과정을 무혈청 조건 하에 수행한다.

특정 양태에서, 상기 조정된 배지 분획을 밀봉한 백(bag)에 수집한다. 특정 양태에서, 상기 조정된 배지 분획을 매 24-72시간마다 수집한다. 일부 양태에서, 상기 조정된 배지 분획을 매 40-50시간마다 수집한다. 한 특정 양태에서, 상기 조정된 배지 분획을 매 48시간마다 수집한다.

일부 양태에서, 상기 조정된 배지 분획은 각각 200-300 mL의 부피, 예컨대 200-250 mL 또는 250-300 mL이다. 특정 양태에서, 상기 조정된 배지 분획은 10-14일, 예컨대 10, 11, 12, 13 또는 14일 동안 수집한다. 특정 양태에서, 상기 조정된 배지 분획은 12일간 수집한다. 특정 양태에서, 적어도 5개의 조정된 배지 분획을 수집한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 3주 미만으로 수행한다.

일부 양태에서, 각각의 조정된 배지 분획은 9×10¹¹ 내지 50×10¹¹ 개의 엑소좀을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 10×10¹² 개의 엑소좀이 상기 수집된 배지 분획에서 분리된다. 특정 양태에서, 적어도 15×10¹² 개의 엑소좀이 상기 수집된 배지 분획에서 분리된다. 적어도 10×10¹¹, 15×10¹¹, 20×10¹¹, 25×10¹¹, 30×10¹¹, 35×10¹¹, 40×10¹¹, 45×10¹¹, 50×10¹¹, 60×10¹¹, 70×10¹¹, 80×10¹¹, 90×10¹¹, 10×10¹², 15×10¹², 20×10¹² 또는 25×10¹² 개의 엑소좀이 분리될 수 있다.

특정 양태에서, 분리는 모아둔 분획들을 여과 및 초원심분리하여 엑소좀 함유 펠릿을 수득하고, 상기 엑소좀 함유 펠릿을 버퍼 중에 재현탁시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 분리는 펌프 및 열 밀봉 배관을 사용하여 기능적으로 폐쇄된 방식으로 수행한다. 일부 양태에서, 여과는 모아둔 분획들을 필터, 예컨대 0.2 ㎛ 필터를 통해 통과시키는 것으로 추가로 정의된다. 추가의 양태에서, 분리는 여과 전에 원심분리하여 큰 세포 잔해물을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 분리는 4℃에서 수행한다.

특정 양태에서, 상기 버퍼는 약 0.01-0.1 M, 예컨대 약 0.08, 0.09 또는 0.1 M, 특히 약 0.09 M의 염화나트륨, 약 0.1-0.5 M, 예컨대 약 0.1, 0.2 또는 0.3 M, 특히 약 0.23 M의 글루콘산나트륨, 약 0.1-0.5 M, 예컨대 약 0.1, 0.2 또는 0.3 M, 특히 약 0.27 M의 아세트산나트륨 삼수화물, 1-10 mM, 예컨대 약 6-7 mM, 특히 약 5 mM의 염화칼륨, 및 약 1-5 mM, 예컨대 약 2-4 mM, 특히 약 3 mM의 염화마그네슘을 포함한다. 일부 양태에서, 버퍼의 pH는 약 6-8, 예컨대 약 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 또는 7.6, 특히 약 7.4이다. 특정 양태에서, 상기 버퍼는 PLASMALYTE-A®이다.

추가의 양태에서, 상기 방법은 엑소좀에 치료제를 로딩하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 치료제는 하나 이상의 사이토카인, 화학요법제, 핵산, 소분자 또는 단백질을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 RNA는 siRNA, miRNA 또는 shRNA이다. 특정 양태에서, 상기 RNA는 siRNA이다. 일부 양태에서, 로딩은 엑소좀을 전기천공하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 전기천공은 PLASMALYTE-A® 중에서 수행한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 엑소좀을 분리하는 단계와 전기천공 단계 사이에 엑소좀 세척 단계 또는 버퍼 교환 단계를 포함하지 않는다. 특정 양태에서, 엑소좀을 분리하는 단계에서의 엑소좀의 개수에서 로딩된 엑소좀의 개수까지는 20% 이상 감소하지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 본 실시양태의 방법 [기능적으로 폐쇄된 생물반응기에서 MSC를 인간 혈소판 용해물 (PLT)을 포함하는 배지 중에서 80-90%의 전면생장률까지 배양하는 단계; 본질적으로 PLT를 함유하지 않는 (예컨대, PLT가 없는) 배지 중에서 상기 세포를 추가로 배양하는 단계; 상기 생물반응기로부터 조정된 배지 분획을 수집하는 단계; 및 상기 조정된 배지 분획으로부터 엑소좀을 분리하는 단계]에 의해 제조된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

또 다른 실시양태에서, 본 실시양태의 방법 [기능적으로 폐쇄된 생물반응기에서 MSC를 인간 혈소판 용해물 (PLT)을 포함하는 배지 중에서 80-90%의 전면생장률까지 배양하는 단계; 본질적으로 PLT를 함유하지 않는 (예컨대, PLT가 없는) 배지 중에서 상기 세포를 추가로 배양하는 단계; 상기 생물반응기로부터 조정된 배지 분획을 수집하는 단계; 및 상기 조정된 배지 분획으로부터 엑소좀을 분리하는 단계]에 따라 제조된 엑소좀의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 대상체는 인간이다.

특정 양태에서, 상기 전기천공된 엑소좀을 대상체에 직접 주입한다. 추가의 양태에서, 상기 방법은 적어도 제2 항암 요법을 실시하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 적어도 제2 항암 요법은 화학요법, 방사선요법, 유전자 요법, 수술, 호르몬 요법, 항혈관형성 요법 또는 면역요법을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 실시양태의 방법 [기능적으로 폐쇄된 생물반응기에서 MSC를 인간 혈소판 용해물 (PLT)을 포함하는 배지 중에서 80-90%의 전면생장률까지 배양하는 단계; 본질적으로 PLT를 함유하지 않는 (예컨대, PLT가 없는) 배지 중에서 상기 세포를 추가로 배양하는 단계; 상기 생물반응기로부터 조정된 배지 분획을 수집하는 단계; 상기 조정된 배지 분획으로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 상기 분리된 엑소좀에 RNA를 로딩하여 RNA가 로딩된 엑소좀을 제조하는 단계]에 의해 제조된 유효량의 RNA가 로딩된 엑소좀을 투여하는 단계를 포함하는, 세포 내로 RNA를 전달하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 특정 양태에서, 상기 세포는 암세포 또는 T 세포이다.

추가의 실시양태에서, 본 실시양태의 방법 [기능적으로 폐쇄된 생물반응기에서 MSC를 인간 혈소판 용해물 (PLT)을 포함하는 배지 중에서 80-90%의 전면생장률까지 배양하는 단계; 본질적으로 PLT를 함유하지 않는 (예컨대, PLT가 없는) 배지 중에서 상기 세포를 추가로 배양하는 단계; 상기 생물반응기로부터 조정된 배지 분획을 수집하는 단계; 및 상기 조정된 배지 분획으로부터 엑소좀을 분리하는 단계]에 의해 제조된 엑소좀의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체의 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 엑소좀에 siRNA 또는 miRNA를 로딩한다. 특정 양태에서, 엑소좀에 KRAS siRNA를 로딩한다. 일부 양태에서, 상기 대상체는 인간이다.

일부 양태에서, 상기 질병 또는 장애는 암, 염증성 질환 또는 면역 관련 장애이다. 특정 양태에서, 상기 암은 폐암이다.

특정 양태에서, 상기 엑소좀은 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 내시경, 경피, 피하, 국지 또는 직접 주사에 의해 투여된다. 일부 양태에서, 상기 엑소좀은 정맥내 투여된다.

추가의 양태에서, 상기 방법은 적어도 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 적어도 제2 치료제는 항암제이다. 특정 양태에서, 상기 항암제는 화학요법제, 방사선요법제, 유전자 요법제, 수술, 호르몬 요법제, 항혈관형성 요법제 또는 면역요법제를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 방법 [기능적으로 폐쇄된 생물반응기에서 MSC를 인간 혈소판 용해물 (PLT)을 포함하는 배지 중에서 80-90%의 전면생장률까지 배양하는 단계; 본질적으로 PLT를 함유하지 않는 (예컨대, PLT가 없는) 배지 중에서 상기 세포를 추가로 배양하는 단계; 상기 생물반응기로부터 조정된 배지 분획을 수집하는 단계; 및 상기 조정된 배지 분획으로부터 엑소좀을 분리하는 단계]에 따라 제조된 치료적 유효량의 MSC 유래의 엑소좀을 면역 매개성 염증성 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체의 면역 매개성 염증성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 면역 매개성 염증성 질환은 류머티스 관절염 (RA), 염증성 장질환 (IBD) 및 크론병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 양태에서, 상기 MSC는 동종이계성이다. 일부 양태에서, 상기 엑소좀을 전신 또는 국소적으로 투여한다. 특정 양태에서, 상기 엑소좀은 직장, 비강, 협측, 질, 피하, 피부내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척수강내, 병변내 또는 두개내 경로를 통해, 또는 이식된 저장소를 통해서 투여된다. 일부 양태에서, 상기 엑소좀은 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 투여된다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명으로부터 본 발명의 사상과 범위 내에서 다양한 변경과 변형이 당업계의 통상의 기술자에게 자명하기 때문에, 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내는 상기 상세한 설명과 구체적인 실시예들은 예시로서만 제공된다는 점을 이해해야 한다.

하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 양태들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 여기에 제공되는 특정 실시양태들에대한 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조하면 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1a-1d: (도 1a) 테루모 세포 증식 시스템 (생물반응기)을 사용하여 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 EV를 제조하기 위해 설계된 개략적인 절차. (도 1b) 엑소좀 수집을 위한 MSC 생물반응기 배양 절차를 상세히 설명한 개략도. (도 1c) MSC 조정 배지로부터 엑소좀을 분리하여 전기천공하는 절차의 개략도. (도 1d) MSC 유래 엑소좀의 제조를 나타내는 개략도.
도 2: 생물반응기에서 배양된 MSC의 EV를 함유하는 조정 배지의 제조 전략을 나타낸 개략도.
도 3: 생물반응기에서 배양된 MSC 조정 배지로부터 EV를 분리하기 위한 전략을 나타낸 개략도.
도 4a-4b: 생물반응기에서 제조된 MSC 유래 엑소좀의 동정. (도 4a) 각 수확물에 있어서, 생물반응기에서 제조된 MSC 유래 엑소좀의 엑소좀 마커의 발현을 보여주는 유세포분석. (도 4b) 각 군집에서의 엑소좀의 전형적인 형태를 보여주는 예시 TEM.
도 5a-5e: 각 수확물에 있어서, 생물반응기에서 제조된 엑소좀의 정량. (도 5a) microBCA 및 Nanosight에 의해 측정된, 퀀텀에서 제조된 MSC 유래 엑소좀의 수. (도 5b) Nanosight를 사용한 각 수확물 측정치의 입자 크기 분포. (도 5c) 엑소좀 제조 동안 생물반응기에서 글루코스 및 락토스의 수준. (도 5d) 서로 다른 시점에서 MSC 조정 배지로부터 분리하여 Nanosight로 정량한 세포 1개당 제조된 엑소좀의 수. (도 5e) 24시간째 및 48시간째에 분리된 MSC 유래의 엑소좀에 대한 엑소좀 마커의 예시적 유세포 분석.
도 6a-6b: 인간 혈소판 용해물 (hPLT) 또는 무혈청 조건으로 보충된 배지 중에서 제조된 MSC 유래의 엑소좀 정량. (도 6a) Nanosight에 의해 분석된, hPLT를 사용하여 배양되거나 hPLT를 사용하지 않고 배양된 MSC의 조정 배지로부터 분리된 세포 1개당 엑소좀의 수. (도 6b) 무혈청 배지 상에서 제조된 엑소좀의 순도를 보여주는, 배지 단독 대 인간 혈소판 용해물 (hPLT)이 보충된 배지를 사용하여 생성된 MSC 유래 엑소좀에 대한 유세포 분석.
도 7: 16개의 서로 다른 뉴클레오팩터(nucleofactor) 프로그램과 3개의 서로 다른 뉴클레오팩터 용액을 사용한 MSC 유래 엑소좀 전기천공에 대한 평가. 48시간 후 수용 대상체 세포상에서 MSC 유래 엑소좀에 의한 siRNA 전달로 유도된 아폽토시스에 의해 전기천공의 효율성을 평가하였다.
도 8a-8c: 5가지 서로 다른 용액을 사용한 MSC 유래 엑소좀 전기천공에 대한 평가. (도 8a) 48시간 후 수용 대상체 세포상에서 MSC 유래 엑소좀에 의한 siRNA 전달로 유도된 아폽토시스에 의해 전기천공의 효율성을 평가하였다. (도 8b) 전기천공 후 엑소좀을 온전하게 유지함을 보여주는, 연구 버퍼 (RB) 또는 임상 버퍼 [CB; 즉, 혈소판 용해물 (PLT)]를 사용하여 전기천공한 후의 MSC 엑소좀의 투과 전자 현미경 사진의 예시. (도 8c) Lonza 장비 및 PLASMALYTE-A® 용액을 사용하여 전기천공시킨, MSC 유래 엑소좀을 이용한 siRNA의 전달로 유도된 수용 대상체 세포에서의 유전자 전사 사일런싱.
도 9: 원심분리 전과 후의 엑소좀의 개수. 연구 버퍼를 사용하는 엑소좀의 전기천공은 샘플의 적어도 50%를 손상시킬 수 있는 제2 세척 단계를 포함한다.
도 10a-10d: 생물반응기에서 제조되어 마우스에 주사한, 사전에 표지된 MSC 유래 엑소좀의 체내분포. WT 누드 마우스에서 8×10⁹ 개의 표지된 엑소좀의 복강내 (도 10a, 10b) 또는 정맥내 (도 10c, 10d) 투여 후 6시간이 지난 후 DIR 표지된 MSC 엑소좀의 형광분석. (a, c) 절개된 장기들. (b, d) 절개된 장기들 (비장과 간 없음).

인간 치료용 엑소좀을 제조하기 위해서는, 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP)에 따른 엑소좀의 대량 생산을 비롯한 여러가지 측면들이 이들을 제조하는데 있어 신중하게 고려되어야 한다. 따라서, 본 연구는 GMP를 충족하는 엑소좀을 제조하기 위한 혁신된 절차 및 관련된 체계적 분석에 관한 것이다.

따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 테루모 세포 증식 시스템과 같은 기능적으로 폐쇄된 생물반응기를 사용하여 중간엽 기질 세포 (MSC)로부터 엑소좀과 같은 EV를 제조하기 위한 효율적이고 임상적으로 적절한 전략을 제공한다. 본원에 제공된 방법은 약 3주와 같은 단시간에 적어도 10×10¹² 개의 EV를 생성할 수 있다. 본 방법은 기능적으로 폐쇄된 무혈청 시스템에서 임상 등급 EV의 대량 생산과 분리를 포함한다. EV는 예컨대 골수 유래의 MSC로부터 임상적으로 적합한 용량으로 제조된다.

바람직한 실시양태에서, 전체 방법이 무혈청으로 진행되기 때문에, 혈청 중의 엑소좀으로부터 생기는 MSC 유래 EV의 오염은 본질적으로 없다. 구체적으로, 본 방법은 생물반응기 중 MSC의 초기 배양에서 인간 혈소판 용해물 (PLT)의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명자들은 MSC를 약 80-90%, 예컨대 약 85% 전면생장률까지 배양하면 EV를 효율적으로 제조할 수 있음을 밝혀냈다. 따라서, EV를 포함하는 조정된 배지를 수집하기 전에, MSC는 약 24-72시간, 예컨대 약 24시간 또는 48시간 동안 PLT 무함유 배지로 전환될 수 있다. 상기 조정된 배지 분획은 매 약 48시간 마다 수집하여 EV가 분리될 때까지 예컨대 약 -80℃로 냉동시킬 수 있다. 상기 조정된 배지 분획은 약 4-10회, 예컨대 약 5, 6, 7, 8회, 특히 약 6회 수집될 수 있다. 따라서, MSC를 생물반응기에 분주하고 나서 최종 수집까지의 기간은 약 15일 내지 약 20일이 될 수 있다. 각각의 조정된 배지 분획은 적어도 9×10¹¹ 개의 엑소좀, 예컨대 적어도 1×10¹² 개의 엑소좀, 특히 약 3×10¹² 개의 엑소좀을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 수집된 배지 분획은 EV를 분리하기 전에 해동하여 모아둔다. 엑소좀의 분리는 1,000g에서와 같은 초기 원심분리 단계, 이후 약 100,000g에서와 같은 초원심분리를 포함할 수 있다. 엑소좀 펠릿을 제조하기 위해 수차례의 초원심분리, 예컨대 3차례의 초원심분리를 수행할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 엑소좀 펠릿을 PLASMALYTE-A®와 같은 GMP를 충족하는 버퍼 중에 재현탁시킨다. 상기 엑소좀은 초원심분리 전에 예컨대 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 추가로 여과시킬 수 있다. 상기 방법은 적어도 총 9-10×10¹² 개의 총 엑소좀, 예컨대 최대 15×10¹² 개 이상의 엑소좀을 제조할 수 있다.

또한, 상기 엑소좀에는 치료제, 예컨대 사이토카인, 화학요법제 또는 핵산이 로딩될 수 있다. 따라서, FDA 승인된 버퍼, 예컨대 PLASMALYTE-A® 중에서의 전기천공에 의한, 본 방법에 의해 제조된 것과 같은 엑소좀의 로딩 방법이 제공된다. 상기 전기천공은 4D-뉴클레오팩터 LV 대규모 형질감염 시스템 (Lonza)과 같은 관류형 전기천공 시스템으로 수행될 수 있다. 각각의 전기천공 가동은 적어도 2×10¹² 개의 엑소좀을 포함할 수 있다. 상기 엑소좀에는 siRNA와 같은 핵산이 로딩될 수 있다. 상기 버퍼는 환자에게 사용하기 위해 FDA에서 승인된 멸균성이면서 비발열성이기 때문에, 이들을 환자에게 직접 주입할 수 있으므로 환자에게 투여하기 전에 버퍼를 교환하는데 필요한 세척 단계를 두지 않는다. 따라서, 기존의 방법에서와 같이 약 50%의 엑소좀의 손실을 초래할 수 있는 추가의 세척 단계로 인한 엑소좀의 손실이 없다. 상기 버퍼는 전기천공 후에 엑소좀을 온전하게 유지할 수 있다.

추가로, 환자에 있어서 면역 관련 질환 및 암과 같은 질병의 치료를 위한, siRNA가 로딩된 엑소좀과 같은 엑소좀의 사용 방법도 본원에 제공된다.

I. 정의

특정 성분과 관련하여, 본원에 사용된 "본질적으로 없는"이라는 말은, 해당 특정 성분을 의도적으로 조성물에 제제화시키지 않았고/않았거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하고자 본원에 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 초래되는 특정 성분의 총량은 0.05%를 훨씬 밑도는 수준, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 특정 성분의 양을 표준 분석 방법으로 전혀 검출할 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.

본 출원의 명세서에서 사용되는 단수형 명사 ("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수도 있다. 본 출원의 청구항에서 사용되는 단수형 명사 ("a" 또는 "an") 단어는, "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용되는 경우, 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.

청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한, 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서, "또 다른"이라는 말은 두번째 또는 그 이상의 경우를 의미할 수 있다. "약", "실질적으로" 및 "대략"이라는 용어는 일반적으로 명시된 값에 ±5%를 의미한다.

"세포외 소포" 및 "EV"는 세포 유래의 미세소포 및 세포에서 분비된 미세소포로서, 그 종류로는 엑소좀, 엑소좀 유사 소포, (원형질막으로부터 직접적인 소포 출아(budding)로 인하여 발생하는) 엑토좀, 미세입자, 미세소포, 배출형 미세소포 (shedding microvesicle, SMV), 나노입자 및 심지어 (대형) 아폽토시스성 소기포(bleb) 또는 (세포 사멸로 인한) 사체 또는 막입자를 포함한다.

본원에 사용된 "미세소포"및 "MV"라는 용어는 일반적으로 직경이 약 100 nm 내지 약 1,000 nm, 또는 혈장에서 약 100 nm 내지 약 400 nm인 인지질 이중층으로 둘러싸인 더 큰 세포외 막 소포 또는 구조물을 의미한다. 미세소포/MV는 원형질막의 출아 또는 소기포 형성(blebbing)으로 조절된 방출에 의해 형성된다.

세포외 소포의 종류들 중에서, 중요한 성분으로는 "엑소좀" 자체를 들 수 있는데, 이들은 직경이 약 40 내지 120 nm, 예컨대 50 내지 100 nm이고, 막성 소포, 즉 다소포체 (MVB)의 세포외 융합 또는 "세포외유출"로 생성된 세포내이입 기원의 인지질 이중층으로 둘러싸인 소포인 것이 바람직하다. 엑소좀은 포유동물의 임의 적절한 생체 샘플, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 모유, 뇌척수액, 양수, 복수, 골수 및 배양된 포유동물 세포 [예컨대, (야생형 또는 불멸화된) 미성숙 수지상 세포, 유도성 및 비유도성 만능성 줄기 세포, 섬유아세포, 혈소판, 면역 세포, 망상적혈구, 종양 세포, 중간엽 줄기 세포, 위성 세포, 조혈 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 백색 및 베이지색 지방전구세포 등]로부터 분리될 수 있다. 당업자라면 누구나, 배양된 세포 샘플들이 해당 세포에 적합한 (엑소좀이 없는 혈청을 사용하는) 배양 배지 중에 존재하고 있음을 이해할 것이다.

엑소좀은 테트라스패닌, 예컨대 CD9, CD37, CD44, CD53, CD63, CD81, CD82 및 CD151과 같은 표면 마커를 비롯한 다른 소포에 존재하지 않는 특이적 표면 마커; 인테그린, ICAM-1, EpCAM과 같은 표적화 또는 부착 마커, 아넥신, TSG101, ALIX와 같은 막 융합 마커; 및 다른 엑소좀 막관통 단백질, 예컨대 Rab5b, HSP70, LAMP2 (리소좀 관련 막 단백질) 및 LIMP (리소좀 내재성 막 단백질)를 포함한다.

본원에 사용된 "중간엽 줄기 세포" 또는 "MSC"라는 용어는, 자가 재생 능력 및 분화 능력을 가져 특히 결합 조직, 골수의 기질, 지방세포, 진피 및 근육 등을 비롯한 넓은 표현형 다양성을 갖는 후대자손 세포를 생성하는 중배엽 유래의 다능성 체세포 줄기 세포를 지칭한다. MSC는 일반적으로 이들이 마커 CD19, CD45, CD14 및 HLA-DR에 대해 음성이고 마커 CD105, CD106, CD90 및 CD73에 대해 양성인 것을 특징으로 하는 세포 마커 발현 프로파일을 가진다. MSC는 모든 유형의 조직으로부터 분리될 수 있다. 일반적으로, MSC는 골수, 지방 조직, 탯줄 또는 말초 혈액으로부터 분리될 수 있다. 특정 실시양태에서, MSC는 골수 유래의 줄기 세포이다.

엑소좀이 유래하는 MSC는 자가 유래의 동종이계성 또는 이종성일 수 있다. 본원에 사용된 "자가 유래"라는 말은 MSC의 공여체 및 상기 MSC로부터 유래된 엑소좀 (또는 분리된 엑소좀 군)의 수용 대상체가 동일한 대상체임을 의미한다. "동종이계"라는 말은 MSC의 공여체 및 상기 MSC로부터 유래된 엑소좀 (또는 분리된 엑소좀 군)의 수용 대상체가 서로 다른 대상체임을 의미한다. "이종이계"라는 말은 MSC의 공여체 및 상기 MSC로부터 유래된 엑소좀 (또는 분리된 엑소좀 군)의 수용 대상체가 서로 다른 종의 대상체임을 의미한다. 특정 실시양태에서, 엑소좀이 유래하는 MSC는 동종이계성이다.

본원에 사용된 "지방 조직 유래의 줄기 세포" 또는 "ASC"라는 용어는 지방 조직으로부터 유래된 MSC를 가리킨다. ASC는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 "인간 지방 중간엽 줄기 세포 분리 및 증식"이라는 명목 하에 기재된 방법에 의해 지방 조직으로부터 분리될 수 있다. "지방 조직"이란 임의의 지방 조직을 의미한다. 상기 지방 조직은, 예를 들어 피하, 망(omental)/내장, 유선, 생식선, 인접장기 또는 다른 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 지방 조직일 수 있다. 바람직하게는, 상기 지방 조직은 피하 백색 지방 조직이다. 상기 지방 조직은 1차 세포 배양물 또는 불멸화 세포주를 포함할 수 있다. 상기 지방 조직은 지방 조직을 갖는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 지방 조직은 포유동물에서 유래한 것이고, 추가의 실시양태에서 상기 지방 조직은 인간에서 유래한 것이다. 지방 조직을 편리하게 공급받을 수 있는 방법은 지방흡입 수술이다. 그러나, 지방 조직의 공급원 또는 지방 조직의 분리 방법은 본 발명에서 중요하지 않음을 알 수 있을 것이다. 특정 실시양태에서, ASC는 대상체의 지방흡입물로부터 분리된다.

상기 MSC는 임의의 동물, 바람직하게는 비영장류 (예컨대, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 토끼 또는 마우스) 및 영장류 (예컨대, 원숭이 또는 인간)를 포함하는 포유동물로부터 유래할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 MSC는 인간으로부터 유래한다.

"기능적으로 폐쇄된"이라는 용어는 전체 시스템을 기밀하게 밀봉하거나 수집 시스템에 대한 모든 연결부에 멸균성 차단 필터를 제공함으로써 유체의 멸균성이 담보되도록 밀봉된 시스템을 지칭한다.

"생물반응기"라는 용어는 폐쇄된 멸균 시스템 중에서 세포에 영양분을 제공하고 대사물질은 제거할 뿐만 아니라 세포 성장에 도움이 되는 물리화학적 환경을 제공하는 대규모 세포 배양 시스템을 가리킨다. 특정 양태에서, 상기 생물학적 및/또는 생화학적 과정은 모니터링하여 제어된 환경 및 작업 조건, 예를 들어 pH, 온도, 압력, 영양 공급 및 폐기물 제거 하에 이루어진다. 본 발명에 따르면, 본 방법에서 사용하기에 적합한 기본적인 생물반응기의 종류로는 중공사 생물반응기를 포함한다.

"중공사"라는 용어는 생물반응기 내에 포함된 세포에 영양분 (용액)을 전달하고 생물반응기 내에 포함된 세포로부터 폐기물 (용액)을 제거하는데 사용하기 위해 규정된 크기, 형상 및 밀도의 공극을 함유하는 (임의 형상의) 중공 구조물을 포함시키고자 한 것이다. 본 발명의 목적상, 중공사는 재흡수성 또는 비흡수성 재료로 제조될 수 있다. 상기 섬유는 관형 구조물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 "환자"또는 "대상체"라는 용어는 살아있는 포유동물 유기체, 예컨대 인간, 원숭이, 소, 양, 염소, 개, 고양이, 마우스, 토끼, 기니피그 또는 이들의 유전자이식 종들을 가리킨다. 특정 실시양태에서, 상기 환자 또는 대상체는 영장류이다. 인간 환자의 비제한적인 예로는 성인, 청소년, 유아 및 태아를 들 수 있다.

"치료" 또는 "치료하는"이라는 말은 (1) 어떤 질병의 병리적 측면 또는 증상적인 측면을 경험하거나 나타내고 있는 대상체 또는 환자에 있어서 해당 질병을 억제하는 것 (예컨대, 상기 병리적 측면 및/또는 증상적인 측면의 추가의 발생을 중지시키는 것), (2) 어떤 질병의 병리적 측면 또는 증상적인 측면을 경험하거나 나타내고 있는 대상체 또는 환자에 있어서 해당 질병을 완화하는 것 (예컨대, 상기 병리적 측면 및/또는 증상적인 측면을 역전시키는 것), 및/또는 (3) 어떤 질병의 병리적 측면 또는 증상적인 측면을 경험하거나 나타내고 있는 대상체 또는 환자에 있어서 해당 질병을 측정가능한 정도로 감소시키는 것을 포함한다.

명세서 및/또는 청구범위에서 사용된 "효과적인"이라는 용어는 목적하거나, 예상하거나, 또는 의도한 결과를 달성하기에 적합하다는 것을 의미한다. 환자 또는 대상체를 화합물로 치료하는 내용에서 사용되는 "유효량", "치료적 유효량" 또는 "약학적 유효량"이라는 말은, 어떤 질병의 치료 또는 예방을 위해 대상체 또는 환자에게 투여될 때 해당 질병의 치료 또는 예방에 영향을 미치기에 충분한 양인 화합물의 양을 의미한다.

본원에 사용된 "암"이라는 용어는 고형 종양, 전이성 암 또는 비전이성 암을 기술하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 암은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 십이지장, 소장, 대장, 결장, 직장, 항문, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁에서 발생할 수 있다.

세포에 대하여 사용되는 "접촉된" 및 "노출된"이라는 용어들은 치료제가 표적 세포로 전달되거나 표적 세포와 직접적으로 병치되는 과정을 설명하기 위해 본원에 사용된다. 세포를 사멸시키기 위해, 예를 들어, 해당 세포를 사멸시키거나 해당 세포가 분열하는 것을 방지하는데 효과적인 양으로 하나 이상의 제제를 세포에 전달한다.

치료에 대한 환자의 유효 반응 또는 환자의 "반응성"이란 질병 또는 장애에 걸릴 위험이 있거나 해당 질병 또는 장애를 앓고 있는 환자에게 부여되는 임상적 또는 치료적 이점을 가리킨다. 이러한 이점으로는 세포 또는 생체 반응, 완전 반응, 부분 반응, (진행 또는 재발없이) 안정된 질병, 또는 차후 재발하는 반응을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유효 반응이란 암으로 진단받은 환자에서 종양 크기 감소 또는 무진행 생존일 수 있다.

본원에 사용된 "치료제"란 질병 또는 건강과 관련된 질환에 대한 치료적 이점을 얻을 목적으로 대상체에게 투여될 수 있는 임의의 제제를 지칭한다. 예를 들어, 치료제를 포함하는 나노입자는 종양의 크기를 감소시키거나, 종양의 국소 침습을 감소 또는 억제시키거나, 또는 전이의 발생 위험을 감소시킬 목적으로 대상체에게 투여될 수 있다.

본원에 사용된 "진단제"란 대상체에서 질병 또는 건강관 관련된 질환을 진단할 목적으로 대상체에게 투여될 수 있는 임의의 제제를 지칭한다. 진단에는 질병의 존재 여부, 질병의 진행 여부 또는 질병 상태의 임의의 변화를 판단하는 것을 포함될 수 있다.

상기 치료제 또는 진단제는 소분자, 펩타이드, 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 항체 단편, DNA 또는 RNA일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 치료제 또는 진단제는 siRNA이다.

본원에 사용된 "핵산"이란 일반적으로 핵염기를 포함하는 DNA, RNA의 분자 (즉, 가닥) 또는 이의 유도체 또는 유사체를 지칭할 것이다. 핵염기는 예를 들어 DNA (예컨대, 아데닌 "A", 구아닌 "G", 티민 "T" 또는 사이토신 "C") 또는 RNA (예컨대, A, G, 우라실 "U" 또는 C)에서 발견되는 자연적으로 생성되는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함한다. "핵산"이라는 용어는 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"이라는 용어를 각각 핵산"이라는 용어의 아속(subgenus)으로서 포함한다. "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 3개 내지 약 100개의 핵염기 길이를 갖는 분자를 지칭한다. "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 약 100개 초과의 핵염기 길이를 갖는 적어도 하나의 분자를 지칭한다.

이러한 정의들은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 분자에 관한 것이다. 이중 가닥 핵산은 완전히 상보적인 결합에 의해 형성되지만, 일부 실시양태에서는 이중 가닥 핵산은 부분 또는 실질적인 상보적 결합에 의해 형성될 수도 있다. 따라서, 핵산은 일반적으로 한 분자를 포함하는 특정 서열의 하나 이상의 상보적 가닥(들) 또는 "보체(들)"을 포함하는 이중 가닥의 분자를 포함할 수 있다. 본원에서, 단일 가닥 핵산은 접두사 "ss"로 나타내고, 이중 가닥 핵산은 접두사 "ds"로 나타낼 수 있다.

본원에 사용된 "뉴클레오타이드"는 "백본 모이어티"를 추가로 포함하는 뉴클레오사이드를 가리킨다. 백본 모이어티는 일반적으로 뉴클레오타이드를, 뉴클레오타이드를 포함하는 다른 분자 또는 또 다른 뉴클레오타이드에 공유 결합시켜 핵산을 형성한다. 자연적으로 생성되는 뉴클레오타이드에서 "백본 모이어티"는 통상적으로 5탄당에 공유 결합되어 있는 인 모이어티를 포함한다. 백본 모이어티의 부착은 보통 5탄당의 3'- 또는 5'- 위치에서 이루어진다. 그러나, 특히 뉴클레오타이드가 자연 발생 5탄당 또는 인 모이어티의 유도체 또는 유사체를 포함하는 경우, 다른 유형의 부착들도 당업계에 알려져 있다.

핵산은 자연적으로 생성되는 핵산에 존재할 수 있는 핵염기, 핵염기 링커 모이어티 및/또는 백본 모이어티의 유도체 또는 유사체를 포함하거나, 이들로 전부 구성될 수 있다. 본원에 사용된 "유도체"는 화학적으로 개질되거나 변형된 형태의 자연적으로 발생하는 분자를 지칭하는 반면, "모방체"또는 "유사체"라는 용어는 자연적으로 발생하는 분자 또는 모이어티와 구조적으로 유사하거나 유사하지 않을 수 있지만 비슷한 기능을 갖는 분자를 가리킨다. 본원에 사용된 "모이어티"라는 말은 일반적으로 큰 화학 구조 또는 분자 구조 중의 작은 화학 또는 분자 성분을 지칭한다. 핵염기, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체는 당업계에 익히 알려져 있다.

"siRNA" (짧은 간섭 RNA)는 일반적으로 19-28개의 염기쌍 길이의 짧은 이중 가닥 RNA 복합체를 지칭한다. 다시 말해, siRNA는 약 19개 내지 약 28개의 뉴클레오타이드 (즉, 약 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 뉴클레오타이드)를 각각 함유하는 2개의 뉴클레오타이드 가닥을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자이다. 상기 복합체는 흔히 3'-오버행을 포함한다. siRNA는 당업자에게 공지된 기법들을 사용하여 제조될 수 있으며, 광범위하게 다양한 siRNA는 미국 아이오와주 코럴빌 소재의 인터그레이티드 DNA 테크놀로지스 인코포레이티드(Integrated DNA Technologies, Inc.)와 같은 제조업체로부터 구매할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 TNF-α에 대한 2'-O-메틸-변형된 siRNA 듀플렉스는 나노입자에 도입될 수 있는데, 이 경우 안티센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형은 표적외 영향을 없애고, 비특이적 면역 반응을 최소화하며, siRNA 안정성을 향상시킨다.

"마이크로RNA (miRNA)"는 3'-UTR 성분을 통해 단백질 코딩 유전자를 표적화하여 이를 실질적으로 사일런싱할 수 있는 짧은 비암호화 RNA이다. miRNA는 대략 21-22개의 뉴클레오타이드 길이로 더 긴 전구체로부터 발생할 수 있으며, 비단백질 암호화 유전자로부터 전사된다.

"면역 장애", "면역 관련 장애" 또는 "면역 매개성 장애"라는 말은 면역 반응이 질환의 발생 또는 진행에 역할을 하는 장애를 가리킨다. 면역 매개성 장애로는 자가면역성 질환, 동종이식편 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 및 염증성 및 알레르기 질환을 포함한다.

"자가면역성 질환"은 면역계가 정상 숙주의 일부인 항원 (즉, 자기 항원)에 대한 면역 반응 (예를 들어, B 세포 또는 T 세포 반응)을 나타내어 결과적으로 조직에 손상을 입히는 질환을 지칭한다. 자기 항원은 숙주 세포로부터 유래될 수 있거나, 또는 보통 점막 표면에 콜로니를 만드는 미생물 (공생적 유기체로 알려짐)과 같은 공생 유기체로부터 유래할 수도 있다.

본원에 사용된 "전면생장률(confluency)"이라는 용어는 생물반응기의 중공사와 같은 표면을 덮는 세포의 비율을 가리킨다. 상기 전면생장률은 세포가 배양되는 배지 중의 글루코스 및/또는 락토스의 수준에 의해 측정될 수 있다.

II. 엑소좀의 제조

본 발명의 특정 실시양태는 생물반응기, 특히 중공사 생물반응기와 같은 기능적으로 폐쇄된 시스템의 사용을 통한 임상 등급 EV, 특히 엑소좀의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 중요한 점은, 치료제를 로딩하는 후속 과정을 포함하는 엑소좀 제조의 전과정은 무혈청일 수 있다는 것이다.

A. 중간엽 줄기 세포

EV의 제조를 위한 세포는 지방 유래 또는 골수 유래의 MSC와 같은 MSC일 수 있다. 특정 양태에서, 상기 MSC는 자가유래성 또는 동종이계성일 수 있는 인간 MSC이다.

상기 MSC를 생물반응기 중에 약 100-1,000개의 세포/cm², 예컨대 약 150개의 세포/cm², 약 200개의 세포/cm², 약 250개의 세포/cm², 약 300개의 세포/cm², 예컨대 약 350개의 세포/cm², 예컨대 약 400개의 세포/cm², 예컨대 약 450개의 세포/cm², 예컨대 약 500개의 세포/cm², 예컨대 약 550개의 세포/cm², 예컨대 약 600개의 세포/cm², 예컨대 약 650개의 세포/cm², 예컨대 약 700개의 세포/cm², 예컨대 약 750개의 세포/cm², 예컨대 약 800개의 세포/cm², 예컨대 약 850개의 세포/cm², 예컨대 약 900개의 세포/cm², 예컨대 약 950개의 세포/cm² 또는 약 1000개의 세포/cm²의 밀도로 분주할 수 있다. 특히, 상기 세포를 약 400-500개의 세포/cm², 예컨대 약 450개의 세포/cm²의 세포 밀도로 분주할 수 있다.

생물반응기 중에 분주되는 세포의 총수는 약 1.0×10⁶개 내지 약 1.0×10⁸개의 세포, 예컨대 약 1.0×10⁶개 내지 5.0.0×10⁶개, 5.0×10⁶개 내지 1.0×10⁷개, 1.0×10⁷개 내지 5.0×10⁷개, 5.0×10⁷개 내지 1.0×10⁸개의 세포일 수 있다. 특정 양태에서, 생물반응기 중에 분주되는 세포의 총수는 약 1.0×10⁷개 내지 약 3.0×10⁷개, 예컨대 약 2.0×10⁷개의 세포이다.

세포는 대부분 시판중인 임의 적절한 세포 배양 배지에 분주될 수 있다. 대표적인 배지로는 DMEM, RPMI, MEM, 배지 199, HAMS 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 배지는 알파 MEM 배지, 특히 L-글루타민이 보충된 알파 MEM이다. 상기 배지에는 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 또는 B27, 항생제, 비타민 및/또는 소분자 약물 중 하나 이상을 보충할 수 있다. 특히, 상기 배지는 무혈청일 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포는 실온에서 배양될 수 있다. 항온배양기는 가습될 수 있고 약 5%의 CO₂ 및 약 1%의 O₂의 대기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 CO₂ 농도는 약 1-20%, 2-10% 또는 3-5%의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 O₂ 농도는 약 1-20%, 2-10% 또는 3-5%의 범위일 수 있다.

특정 실시양태에서, 세포를 무혈청 배지 중에 분주하여 배양한다. 상기 배지에는 혈소판 용해물, 특히 인간 혈소판 용해물 (PLT)을 보충할 수 있다. 상기 PLT는 약 1-10%, 예컨대 약 1-4%, 2-5%, 3-6%, 4-7%, 5-8% 또는 6-10%, 예컨대 약 4%, 5% 또는 6%, 특히 약 5%의 농도로 배지 중에 존재할 수 있다.

상기 MSC는 분주 후 약 5-10일, 예컨대 약 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일, 특히 약 7, 8 또는 9일간 생물반응기 중에서 초기 배양될 수 있다. 구체적으로, 상기 MSC는 약 75-95%의 전면생장률, 예컨대 약 75-80%, 80-85%, 85-90% 또는 90-95%의 전면생장률, 특히 약 85-95%, 예컨대 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90%의 전면생장률까지 PLT를 사용하여 배지 중에서 초기 배양될 수 있다. 상기 세포가 목적한 전면생장률에 도달하면, 상기 세포들을 PLT가 없는 배지로 전환시킬 수 있다. 상기 세포를 PLT 무함유 배지로 옮기기 전에 PBS와 같은 버퍼로 적어도 1회 세척할 수 있다.

PLT 무함유 배지 중에서의 세포 배양은, PLT 중에 존재할 수 있는 엑소좀에 의한 MSC 유래 엑소좀의 오염 또는 희석을 방지하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, 상기 PLT를 원심분리해서 엑소좀을 제거하여 엑소좀이 없는 PLT를 수득할 수 있다.

상기 세포들을 PLT 무함유 배지 중에서 약 8-100시간, 예컨대 12-72시간, 예컨대 약 12-15, 15-20, 20-25, 25-30, 35-40, 40- 45, 45-50, 50-55, 55-60, 65-70 또는 70-72시간 동안 배양할 수 있다. 특히, 상기 세포를 엑소좀을 수확하기 전 약 24-48시간, 예컨대 약 48시간 동안 PLT 무함유 배지 중에서 배양할 수 있다.

B. 생물반응기

생물반응기는 정치형 생물반응기, 교반 플라스크형 생물반응기, 회전벽 용기형 생물반응기, 중공사 생물반응기 및 직접 관류형 생물반응기를 포함하는 일반 카테고리에 따라 분류될 수 있다. 생물반응기 내에서, 세포들은 자유롭게 존재하건, 고정되어 있거나, 또는 다공성의 3차원 스캐폴드(하이드로겔) 상에 분주되어 있을 수 있다.

중공사 생물반응기는 배양하는 동안 물질 이동을 향상시키는데 사용될 수 있다. 중공사 생물반응기는 10-30 kDa의 통상적인 분자량 차단값(MWCO) 범위와 평행한 어레이로 배열된 작은 반투과성 모세관 막인 중공사를 기반으로 한 3D 세포 배양 시스템이다. 이러한 중공사막은 흔히 다발 형태로 관형 폴리카보네이트 쉘 내에 하우징하여 중공사 생물반응기 카트리지를 만드는 경우가 많다. 주입구 및 배출구 포트도 장착된 카트리지 내에는 두 구획: 중공사 내의 모세관내 (IC) 공간 및 중공사를 둘러싸고 있는 모세관외 (EC) 공간이 존재한다.

따라서, 본 발명에 있어서, 생물반응기는 중공사 생물반응기일 수 있다. 중공사 생물반응기는, 배지를 섬유의 루멘 외부의 공간을 관류시키면서 루멘 내에 세포를 내장시킬 수 있거나, 또는 다르게는, 세포를 루멘 외부의 공간 내에서 증식시키면서 중공사를 통해 기체와 배치를 관류시킬 수도 있다. 본 발명에 적합한 중공사 생물반응기는 당업계에 공지되어 있으며, 카리디안(Caridian) (테루모) BCT 퀀텀(Quantum) 세포 증식 시스템을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 중공사는 생물반응기에서 영양분의 전달과 폐기물의 제거에 적합해야 한다. 상기 중공사는 임의의 형상일 수 있는데, 예를 들어 원형 및 관형일 수 있거나 또는 동심원상 고리의 형태일 수 있다. 상기 중공사는 재흡수성 또는 비재흡수성 막으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 적절한 중공사의 성분들로는 폴리디옥사논, 폴리락티드, 폴리글락틴, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리글리콜산/트리메틸렌 카보네이트, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 셀룰로스 중합체, 셀룰로스 에스테르, 재생 셀룰로오스, 플루로닉, 콜라겐, 엘라스틴 및 이들의 혼합물을 포함한다.

생물반응기는 세포의 분주 전에 프라이밍될 수 있다. 상기 프라이밍은 PBS와 같은 버퍼로 플러슁하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이밍은 생물반응기를 피브로넥틴과 같은 세포외 기질 단백질로 코팅하는 것을 포함할 수도 있다. 이후, 생물반응기는 알파 MEM과 같은 PLT 배지로 세척될 수 있다.

C. 조정된 배지 수집

PLT 무함유 배지 중에서 배양된 세포로부터 조정된 배지는 매 8-100시간마다, 예컨대 매 12-72시간마다, 예컨대 약 12-15, 15-20, 20-25, 25-30, 35-40, 40-45, 45-50, 50-55, 55-60, 65-70 또는 70-72시간마다 수집할 수 있다. 특히, 상기 조정된 배지 분획은 매 약 24-48시간마다 수집할 수 있다.

상기 조정된 배지 분획의 부피는 약 100-500 mL, 예컨대 약 100-150, 150-200, 250-300, 350-400, 400-450 또는 450-500 mL, 특히 약 250 mL를 포함할 수 있다. 상기 분획을 밀봉된 백에 수집하여 엑소좀이 분리될 때까지 약 -70℃ 내지 약 -90℃, 예컨대 약 -80℃에서 저온보존할 수 있다.

특정 양태에서, 상기 조정된 배지는 각 회마다 적어도 4회, 예컨대 4-10회, 특히 5회, 6회, 7회, 8회 또는 9회, 특히 6회 수집한다. 각 분획은, 예를 들어어 4℃에서 밤새, 예컨대 2-6℃에서 약 10-20시간 동안 해동시킬 수 있다.

D. 엑소좀의 분리

이후, 상기 모아진 조정 배지 분획은 특히 4℃에서 엑소좀 분리과정을 거칠 수 있다. 상기 조정된 배지는 약 2℃, 4℃, 6℃, 8℃, 10℃, 12℃, 14℃, 16℃, 18℃, 20℃, 22℃, 24℃ 또는 26℃의 온도에서 원심분리될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 조정된 배지는 약 4℃의 온도에서 원심분리된다. 상기 엑소좀 분리는 당업계에 공지된 엑소좀 분리 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 엑소좀의 분리는 상기 엑소좀 제조에서와 같은 폐쇄된 시스템 중에서도 수행된다. 이러한 작업은 펌프와 밀봉된 배관을 사용하여 달성될 수 있다.

상기 분리는 큰 잔해물을 제거하기 위한 원심분리 단계, 이후 여과 단계 및 하나 이상의 초원심분리 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리 방법은 상기 모아진 모든 배지 분획을 처리하기 위해 다수회, 예컨대 3회로 수행될 수 있다.

원심분리 단계는 약 500-2,000g, 예컨대 약 1,000g로 약 5-25분, 예컨대 약 15분간의 원심분리를 포함할 수 있다. 상기 조정된 배지는 약 1,000g, 2,000g, 4,000g, 6,000g, 8,000g, 10,0000g, 12,000g, 14,000g, 16,000g 또는 18,000g로 원심분리될 수 있다. 상기 원심분리는 10-30분, 12-28분, 14-24분 또는 15-20분과 같은 시간 동안 수행될 수 있다. 당업자라면 누구나, 적절한 시판중인 실험실용 원심분리기, 예컨대 THERMO-SCIENTIFIC™ 또는 COLE-PARMER™를 사용하여 상기 원심분리 단계를 수행한다는 사실을 알 것이다. 특히, 원심분리는 코베(Cobe) 2991 세포처리기 (테루모)와 같은 폐쇄된 시스템 중에서 수행될 수 있다. 저속 원심분리는 살아있는 세포, 죽은 세포 및 큰 세포 잔해물을 제거하기 위해 1회 이상 수행될 수 있다.

여과 단계는, 예컨대 큰 미세소포와 같은 잔해물을 제거하기 위해, 1 마이크론 미만의 필터, 예컨대 0.1-0.3 마이크론 필터, 예컨대 0.2 마이크론 필터를 갖는 여과용 백의 사용을 포함할 수 있다. 그 후, 상청액을 주사기 및 튜브와 직접적으로 연결된 라인을 사용하여 튜브 (예컨대, 폴리카보네이트 튜브)로 옮길 수 있다. 상기 여과는 1회 이상 반복될 수 있다. 상기 여과는 동일한 크기의 필터, 예를 들어 0.2 마이크론 필터를 통해 한번 이상 통과시킴으로써 수행될 수 있다. 다르게는, 2종 이상의 필터를 사용하는 여과를 수행할 수 있는데, 예컨대 40-50 마이크론 필터에 한번 이상 통과, 20-30 마이크론 필터에 한번 이상 통과, 10-20 마이크론 필터에 한번 이상 통과, 0.2-10 마이크론 필터에 한번 이상 통과 등 동일하거나 감소되는 크기의 필터를 사용하여 여과를 수행할 수 있다. 본 단계에서 사용하기에 적합한 필터로는 0.45 및 0.22 마이크론 필터의 사용을 포함한다.

초원심분리는 75,000 내지 150,000g, 예컨대 100,000 내지 170,000g, 예컨대 약 100,000g로 약 2-6시간, 약 1-3시간, 예컨대 약 4시간 또는 5시간 동안 수행할 수 있다. 시판중인 임의의 초원심분리기, 예컨대 THERMO-SCIENTIFIC™ 또는 Beckman™을 사용하여 본 단계를 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 초원심분리는, 이에 제한되지는 않지만, 45 Ti 타입의 로터 [베크만-쿨터(Beckman-Coulter)]와 같은 임의의 폐쇄된 시스템의 원심분리기를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 초원심분리 단계는 향상된 결과를 위해서 임의로, 예컨대 2회 이상 반복될 수 있다. 확립된 기법을 사용하여 엑소좀 함유 펠릿을 상청액으로부터 제거한 후 적절한 생리학적 용액에 재현탁시킨다.

당업자라면 누구나, 임의의 원심분리 또는 초원심분리 단계에서의 엑소좀 펠릿을 적절한 생리학적 용액, 예컨대 멸균 PBS, 멸균 0.9% 식염수 또는 멸균 탄수화물 함유 0.9% 식염수 버퍼를 사용하여 원심분리 단계들 중간에 세척할 수도 있다는 것을 이해할 것이다.

원심분리 후, 용액을 제거하고 엑소좀을 PBS와 같은 적절한 버퍼에 재현탁시킨다. 상기 버퍼의 pH는 샘플에 적당한 임의의 pH일 수 있으나, 통상적인 범위는 6 내지 8이다. 상기 버퍼의 pH는 4 내지 10, 4 내지 6, 4 내지 8, 6 내지 10, 6 내지 8 또는 8 내지 10일 수 있다. 특히, 엑소좀 펠릿은 약 7.4의 생리학적 환경의 pH에서와 같이 임상 등급의 버퍼, 예컨대 PLASMALYTE-A®에 재현탁시킬 수 있다. 버퍼의 부피는 침전 용액 중에 약 0.01 부피 내지 약 0.09 부피, 약 0.02 부피 내지 약 0.08 부피; 약 0.03 부피 내지 약 0.07 부피일 수 있다. 수확된 엑소좀은 전기천공이나 치료에 있어서와 같이 즉시 사용될 수 있거나, 또는 예컨대 차후의 사용을 위해 -20℃로 냉동하여 보관할 수도 있다.

본원에 사용된 분석이란 엑소좀의 직접 또는 간접적인 가시화를 가능케하는 생체내 또는 생체외로 행할 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 예를 들어, 분석은, 이에 제한되지는 않지만, 고체 기질에 결합된 엑소좀의 생체외 현미경 또는 세포분석 검출 및 가시화, 유세포분석, 형광 영상촬영 등을 포함할 수 있다. 예시적 양태에서, 암세포 유래의 엑소좀은 글리피칸 1에 대한 항체를 사용하여 검출한 후, 고체 기질에 결합시켜 현미경 또는 세포분석 검출을 사용하여 가시화한다. 엑소좀은 해당 엑소좀 표면 마커 CD63, CD47, CD9 및 CD81의 발현에 대한 유세포분석 및/또는 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 분석될 수 있다. 추가로, 나노입자 추적 분석 및 microBCA 분석을 사용하여 엑소좀을 정량할 수도 있다.

따라서, MSC를 생물반응기 내에 분주한 후 최종 수집까지의 기간은 약 15-30일, 예컨대 약 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24일, 예컨대 약 19일 또는 20일이 될 수 있다. 조정된 각 배지 분획은 적어도 9×10¹¹ 개의 엑소좀, 예컨대 적어도 1×10¹² 개의 엑소좀, 예컨대 적어도 2×10¹² 개의 엑소좀, 특히 약 3×10¹² 개의 엑소좀을 포함할 수 있다. 본 방법은 총 적어도 10×10¹²개의 엑소좀, 예컨대 적어도 11×10¹²개의 엑소좀, 예컨대 적어도 12×10¹²개의 엑소좀, 예컨대 적어도 13×10¹²개의 엑소좀, 예컨대 적어도 14×10¹²개의 엑소좀, 예컨대 적어도 15×10¹²개의 엑소좀, 예컨대 적어도 16×10¹²개의 엑소좀, 예컨대 적어도 17×10¹²개의 엑소좀, 예컨대 적어도 18×10¹²개의 엑소좀, 예컨대 적어도 19×10¹²개의 엑소좀 또는 예컨대 적어도 20×10¹²개의 엑소좀을 제조할 수 있다.

E. 엑소좀의 로딩

본 방법에 의해 제조된 엑소좀에는 치료제 또는 진단제와 같은 탑재물을 로딩할 수 있다. 본 발명의 엑소좀을 사용하여 전달될 수 있는 탑재물의 예로는, 엑소좀에 자연적으로 존재하지 않는 (외부 공급원으로부터 유래하는) 외인성 물질, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 핵산 분자, 예컨대 DNA (핵 및 미토콘드리아 모두), RNA, 예컨대 mRNA, tRNA, miRNA 및 siRNA, 앱타머 및 기타 핵산 함유 분자, 펩타이드, 단백질, 리보자임, 탄수화물, 중합체, 치료제, 소분자 등을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 분리된 엑소좀은 이차 구조를 갖는 화합물 (예를 들어, miRNA, mRNA, 단백질/펩타이드)뿐만 아니라 큰 화합물, 예를 들어 20개 초과의 염기쌍, 예컨대, 50개 초과의 염기쌍 또는 100개 초과의 염기쌍을 포함하는 핵산 분자, 펩타이드, 단백질 등의 전달에 특히 유용하다.

탑재물은 해당 탑재물을 세포 내로 도입하는 당업계에 확립된 방법들을 사용하여 본 발명의 엑소좀에 도입될 수 있다. 따라서, 탑재물은 예를 들어 약 20-1000 V/cm 범위로 전압을 인가하는 전기천공을 사용하여 엑소좀에 도입될 수 있다. 양이온성 지질 기반의 형질감염 시약을 사용하는 형질감염도 탑재물을 엑소좀에 도입하는데 사용될 수 있다. 적절한 형질감염 시약의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 리포펙타민 (Lipofectamine) MessengerMAX^TM 형질감염 시약, 리포펙타민 RNAiMAX 형질감염 시약, 리포펙타민 3000 형질감염 시약, 또는 리포펙타민 LTX 시약과 PLUS^TM 시약을 포함한다. 탑재물 로딩의 경우, 적절한 양의 형질감염 시약을 사용하지만, 이는 해당 시약, 샘플 및 적재물에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 리포펙타민 MessengerMAX^TM 형질감염 시약을 사용하면, 약 0.15 μL 내지 10 μL 범위의 양으로 사용하여 100 ng 내지 2500 ng의 mRNA 또는 단백질을 엑소좀에 로딩할 수 있다. 다른 방법들, 예를 들어 단백질 도입용 세포 침투성 펩타이드의 사용도 탑재물을 엑소좀 내로 도입하는데 이용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 핵산, 예컨대 siRNA와 같은 탑재물은 PLASMALYTE-A®와 같은 FDA 승인된 버퍼 중에서의 전기천공과 같은 전기천공을 사용하여 엑소좀에 로딩된다. 상기 전기천공은 4D-뉴클레오팩터 LV 대규모 형질감염 시스템 (Lonza)과 같은 관류형 전기천공 시스템으로 수행될 수 있다. 각각의 전기천공 가동은 적어도 2×10¹² 개의 엑소좀을 포함할 수 있다. 상기 버퍼는 환자에게 사용하기 위해 FDA에서 승인된 멸균성이면서 비발열성이기 때문에, 이들을 환자에게 직접 주입할 수 있으므로 환자에게 투여하기 전에 버퍼를 교환하는데 필요한 세척 단계를 두지 않는다. 따라서, 기존의 방법에서와 같이 약 50%의 엑소좀의 손실을 초래할 수 있는 추가의 세척 단계로 인한 엑소좀의 손실이 없다.

특정 실시양태에서, 치료제는 RNA, 예컨대 siRNA, shRNA, 플라스미드, mRNA, miRNA 또는 ncRNA, 특히 siRNA 또는 miRNA 치료제일 수 있다. 상기 miRNA는 miRNA 모방체 또는 miRNA 전구체일 수 있다. 상기 엑소좀에 로딩되는 RNA의 크기는 100개 미만의 뉴클레오타이드 길이, 예컨대 75개 미만의 뉴클레오타이드, 특히 50개 미만의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 예를 들어, RNA는 약 10-100개의 뉴클레오타이드, 예컨대 20-50개의 뉴클레오타이드, 특히 10-20, 15-25, 20-30, 25-35, 30-40 또는 45-50개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다.

RNA는 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. RNA는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은, 예컨대 RNA의 말단(들)에 또는 내부에 (해당 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에) 비-뉴클레오타이드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, RNA 분자는 3'-하이드록실기를 함유한다. 본 발명의 RNA 분자 내의 뉴클레오타이드는 비자연발생적 뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 비롯한 비표준 뉴클레오타이드를 포함할 수도 있다. 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드는 변형된 백본, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 당업계에 공지된 다른 변형된 백본을 함유할 수 있거나, 또는 비천연 뉴클레오사이드간 결합을 함유할 수 있다. siRNA에 대한 추가의 변형 (예컨대, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오타이드, "범용 염기" 뉴클레오타이드, 5-C-메틸 뉴클레오타이드, 하나 이상의 포스포로티오에이트 인터 뉴클레오타이드간 결합 및 역상 데옥시염기 결여성 잔기의 도입)에 대한 내용은 미국 특허 공보 20040019001호 및 미국 특허 6,673,611호 (각 그 전문이 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. 총괄하여, 상술된 이러한 변형된 모든 산 또는 RNA를 변형된 siRNA로 지칭한다.

바람직하게는, RNAi는 단백질의 발현을 적어도 10%, 20%, 30% 또는 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상으로 감소시킬 수 있다.

본원에 기재된 방법 또는 조성물에 사용된 siRNA는 언급한 유전자/단백질에 대한 NCBI 참조 서열에 의해 암호화된 mRNA 서열에 상보적인 부분을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, siRNA는 이중 가닥 부분 (듀플렉스)을 포함한다. 한 실시양태에서, siRNA의 길이는 20-25개의 뉴클레오타이드이다. 한 실시양태에서, siRNA는 19-21개의 코어 RNA 듀플렉스를 포함하는데, 상기 듀플렉스의 한 가닥 또는 양 가닥 중 어느 한 경우에 대해 독립적으로 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드 3' 오버행을 함유한다. 한 실시양태에서, 상기 오버행은 UU이다. siRNA는 5' 인산화되거나 인산화되지 않을 수 있으며, 효능 및/또는 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 향상시키기 위해 당업계에 공지된 임의의 변형법을 사용하여 변형시킬 수 있다. 비제한적인 실시양태에서, siRNA는 하나 이상의 세포 내로 형질감염이 되도록 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, siRNA는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 이중 가닥 RNA를 포함할 수 있으며, 이 경우 RNA의 한 가닥은 유전자의 RNA 전사체의 일부에 80, 85, 90, 95 또는 100% 상보적이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 siRNA의 단일 구성 가닥은 14개 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이이다. 다른 실시양태에서, siRNA의 단일 구성 가닥은 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 뉴클레오타이드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siRNA의 단일 구성 가닥은 21개의 뉴클레오타이드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siRNA의 단일 구성 가닥은 22개의 뉴클레오타이드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siRNA의 단일 구성 가닥은 23개의 뉴클레오타이드 길이이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 siRNA는 28개 내지 56개의 뉴클레오타이드 길이이다.

일반적으로, 표적 유전자는 폴리펩타이드를 암호화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미하거나; 해당 폴리펩타이드의 발현에 중요한 복제, 전사 또는 해독 또는 기타 과정들을 조절하는 폴리뉴클레오타이드 영역을 의미하거나; 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 영역 및 그에 작동가능하게 연결된 발현을 조절하는 영역을 모두 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 표적화 유전자는 염색체(유전체)에 관한 것이거나 염색체외의 것일 수도 있다. 상기 표적화 유전자는 세포에 대하여 내인성이거나, 또는 외래 유전자 (이식유전자)일 수도 있다. 상기 외래 유전자는 숙주 유전체 내로 통합될 수 있거나, 또는 플라스미드 또는 코스미드와 같은 염색체외 유전자 구축물 상에 존재할 수도 있다. 상기 표적화 유전자는 유기체 또는 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물과 같은 병원체로부터 유래될 수도 있다. 표적 유전자는 레트로바이러스 유전자와 같이 인터페론 반응을 유발하지 않는 바이러스 및 프로바이러스성 유전자일 수도 있다. 상기 표적 유전자는 단백질 암호화 유전자 또는 비단백질 암호화 유전자, 예컨대 리보솜 RNA, 스플라이스오솜 RNA, tRNA 등을 암호화하는 유전자일 수 있다.

세포 중에서 발현되는 임의의 유전자를 표적으로 삼을 수 있다. 바람직하게는, 표적 유전자는 연구 대상으로서 질병에 중요하거나 특정 관심 대상인 세포 활동의 진행에 관여되어 있거나 이와 관련된 유전자이다. 따라서, 예로서, 하기 기재한 것들은 표적 유전자 발현을 조절하거나 약화시키기 위해 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 표적 유전자로서 가능한 종류들이다: 발달성 유전자 (예컨대, 부착 분자, 사이클린 키나제 억제제, Wnt 계열 구성원, Pax 계열 구성원, 윙드 헬릭스(Winged helix) 구성원, Hox 계열 구성원, 사이토카인/림포카인 및 이들의 수용체, 증식 또는 분화 인자 및 이들의 수용체, 신경전달물질 및 이들의 수용체), 종양 억제 유전자 (예컨대, APC, CYLD, HIN-1, KRAS2b, p16, p19, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, 유테로글로빈, Skp2, BRCA-1, BRCA-2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MEN1, MEN2, MTS1, NF1, NF2, VHL, WRN, WT1, CFTR, C-CAM, CTS-1, zac1, ras, MMAC1, FCC, MCC, FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta* (BLU), Luca-1 (HYAL1), Luca-2 (HYAL2), 123F2 (RASSF1), 101F6, Gene 21 (NPRL2), 또는 SEM A3 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자), 아폽토시스 유발성 유전자 (예컨대, CD95, 카스파제-3, Bax, Bag-1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PARP, bad, bcl-2, MST1, bbc3, Sax, BIK 및 BID), 사이토카인 (예컨대, GM-CSF, G-CSF, IL-1α , IL-1β , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, TNF-β, PDGF 및 mda7), 종양유전자 (예컨대, ABLI, BLC1, BCL6, CBFA1, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETS1, ETS1, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TCL3 및 YES), 및 효소 (예컨대, ACP 불포화효소 및 수산화효소, ADP-글루코스 파이로포릴라제, ATPase, 알코올 탈수소효소, 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 카탈라제, 셀룰라제, 사이클로옥시게나제, 디카복실라제, 덱스트리나제, 에스테라제, DNA 및 RNA 중합효소, 갈락토시다제, 글루카나제, 글루코스 옥사다제, GTPase, 헬리카제, 헤미셀룰라제, 인테그라제, 인버타제, 아이오머라제, 키나제, 락타제, 리파제, 리폭시게나제, 리소자임, 펙틴에스테라제, 퍼옥시다제, 포스파타제, 포스포리파제, 포스포릴라제, 폴리갈락투로나제, 프로테이나아제 및 펩티다제, 풀라나제, 재조합효소, 역전사효소, 토포아이소머라제, 자일라나제).

당업자라면 누구나 이해할 수 있듯이, 탑재물을 로딩하기 전 또는 후에, 본 발명의 엑소좀은 탑재물의 전달 비히클로서의 유용성을 향상시키기 위하여 표적화 모이어티를 도입함으로써 추가로 변형시킬 수 있다. 이와 관련하여, 엑소좀은 어떤 특정 세포를 조직 유형에 특이적으로 표적화하는 물질이 도입되도록 유전자 조작될 수도 있다. 이러한 표적 특이적 물질, 예컨대 표적 세포 또는 조직 상의 수용체 또는 리간드에 친화도를 갖는 펩타이드는, 예를 들어 당업계에 널리 확립된 방법들을 사용하여 엑소좀막 마커에 융합시킴으로써 해당 엑소좀막 내로 통합될 수 있다.

III. 사용 방법

일부 실시양태에서, 본 발명은 치료제, 예컨대 RNAi를 세포로 전달하기 위해 본원에 제공된 엑소좀을 사용하는 방법을 제공한다. 전달을 위한 엑소좀에 의해 표적화될 수 있는 추가의 면역 세포들로는 수지상 세포, NK 세포 및/또는 B 세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 엑소좀에 의해 전달되는 치료제는 소분자, 펩타이드, 백신 또는 항원일 수 있다. 세포는 생체내 또는 생체외 세포일 수 있다. 한 실시양태에서, RNAi를 포함하는 엑소좀의 유효량을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, RNA를 세포 내에 전달하는 방법이 제공된다. 상기 세포는 T 세포와 같은 면역 세포이거나, 또는 KRAS 양성 암세포와 같은 암세포일 수도 있다.

추가의 실시양태에서, RNA를 캡슐화한 엑소좀의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 유기체의 면역자극 방법이 제공된다. 상기 RNA는 면역 조절성 RNA일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 본 발명의 엑소좀을 투여하는 단계를 포함하는, 질병 또는 장애가 있는 상기 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 질병 또는 장애의 치료하거나, 또는 대상체를 면역자극시키기 위한 본 발명의 엑소좀의 용도가 제공된다.

상기 생체내 세포는 포유동물과 같은 임의의 대상체 중에 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 대상체는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 염소, 양, 영장류 또는 조류 종일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 인간이다. 예를 들어, 상기 인간은 질병에 걸린 대상체일 수 있다. 상기 질병은 대상체를 괴롭히는 임의의 질환, 예컨대 염증성 질환, 과증식성 질환, 감염성 질환 또는 퇴행성 질환일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 암과 같은 과증식성 질환이다. 예를 들어, 상기 암은 유방암, 폐암, 전립선암, 난소암, 뇌암, 간암, 자궁경부암, 결장암, 신장암, 피부암, 두경부암, 뼈암, 식도암, 방광암, 자궁암, 림프암, 위암, 췌장암, 고환암, 장암, 림프종 또는 백혈병일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 암은 난소암이다.

또 다른 실시양태에서, 치료적 유효량의 본 발명의 엑소좀을 면역 매개성 염증성 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체의 면역 매개성 염증성 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

상기 암은, 구체적으로 하기의 조직학적 유형의 암일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 악성 종양; 암종; 미분화 암종; 거대 세포 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평상피 세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 전이 세포 암종; 유두 전이 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암; 간세포 암종; 간세포 암종과 담관암의 병합 암종; 소주 선암종; 선양 낭포 암종; 선종성 용종의 선암종; 선암종, 가족성 대장 용종증; 고형 암종; 악성 카르시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 혐색소성 암종; 호산성(acidophil) 암종; 호산성(oxyphilic) 선암종; 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두 및 여포성 선암종; 비피막형 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 이도 선암종; 점막 표피양 암종; 낭포선암종; 유두 낭포선암종; 장액성 유두 낭포선암종; 점액성 낭포선암종; 점액성 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 도관 암종; 수질 암종; 소엽성 암종; 염증성 암종; 유방의 페제트병; 선포 세포 암종; 선편평상피 암종; 편평상피 화생이 있는 선암종; 악성 흉선종; 악성 난소 간질성 종양; 악성 난포막종; 악성 과립막 세포 종양; 악성 남성모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 라이디히(leydig) 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 곁신경절종; 악성 유방외 곁신경절종; 갈색세포종; 사구혈관육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확산성 흑색종; 거대 색소 모반의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유성 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 간질성 육종; 악성 혼합종; 뮬러리안 혼합종; 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 중간엽세포종; 악성 브렌너 종양; 악성 엽상 종양; 활막 육종; 악성 중피종; 미분화배세포종; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관 주위 세포종; 림프관 육종; 골육종; 방피질성 골육종; 연골육종; 악성 연골 모세포종; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유윙 육종; 악성 치원성 종양; 법랑질모세포성 치아육종; 악성 법랑질모세포종; 법랑질모세포성 섬유육종; 악성 송과체종; 척색종; 악성 신경교종; 뇌실 상의 세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상모세포종; 교모세포종; 성긴돌기 아교세포종(oligodendroglioma); 성긴돌기 아교모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경 외배엽 종양; 소뇌 육종; 신경절 모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립상 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 부육아종(paragranuloma); 소형 림프구성 악성 림프종; 확산성 거대 세포 악성 림프종; 여포성 악성 림프종; 균상식육종; 기타 명시된 비호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기구성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수성 육종; 및 모발 세포 백혈병.

일부 실시양태에서, 치료제가 로딩된 엑소좀의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 질병은 자가면역성 질환과 같은 면역 관련 질환일 수 있다. 자가면역성 질환의 비제한적 예로는 하기를 포함한다: 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역성 애디슨병, 부신의 자가면역성 질환, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 자가면역성 난소염 및 고환염, 자가면역성 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유사천포창, 심근병증, 셀리악 빈발성 피부염(celiac spate-dermatitis), 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군, 반창성 유사천포창, CREST 증후군, 한랭 응집소병, 크론병, 원판상 루푸스, 본태성 혼성 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반증(ITP), IgA 신경병증, 소아성 관절염, 편평 태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼성 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 1형 또는 면역 매개성 진성 당뇨병, 중증 근무력증, 신장 증후군 (예컨대, 미세변화병, 중심성 사구체경화증 또는 막성 신장병증), 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선 증후군, 류머티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담관 간경화증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류머티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 강직 증후군, 전신 홍반성 루프스, 홍반성 루프스, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염 (예컨대, 결절성 다발동맥염, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 또는 헤르페스성 피부염 혈관염), 백반증 및 베게너 육아종증. 따라서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 자가면역성 질환의 일부 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 다발성 경화증, 류머티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 1형 진성 당뇨병, 크론병; 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 사구체신염, 강직성 척추염, 혈관염 또는 건선을 포함한다. 상기 대상체는 천식과 같은 알레르기 질환을 가질 수도 있다.

치료 결과는 예측하여 모니터링할 수 있고/있거나 이러한 치료로부터 혜택을 받는 환자들은 본원에 기술된 방법을 통해 확인 또는 선택될 수 있다.

종양 질환의 치료와 관련하여, 종양 질환의 단계에 따라, 종양 질환의 치료는 종양 조직을 제거하기 위한 수술, 방사선 요법 및 화학요법 중 하나 또는 이들의 조합을 수반한다. 다른 치료 요법들은 항암제, 예컨대 치료 조성물 및 화학요법제의 투여와 조합할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료를 받을 환자는 방사선 요법을 받을 수 있고/있거나 수술을 받을 수도 있다.

질환의 치료를 위해, 치료 조성물의 적절한 용량은, 상기 규정한 바와 같이 치료될 질환의 종류, 해당 질환의 중증도 및 경과, 해당 환자의 임상 병력 및 제제에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 좌우될 것이다. 제제는 한번에 투여되거나, 또는 일련의 치료 과정 동안에 걸쳐서 환자에게 적절하게 투여된다.

치료 및 예방 방법 및 조성물은 목적하는 효과를 달성하기에 효과적인 총량으로 제공될 수 있다. 조직, 종양 또는 세포는 하나 이상의 제제를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)과 접촉되거나, 또는 조직, 종양 및/또는 세포를 2종 이상의 서로 다른 조성물 또는 제형들과 접촉될 수 있다. 또한, 이러한 병용 요법은 화학요법, 방사선 요법, 수술적 치료 또는 면역요법과 함께 사용될 수 있다.

병용 투여는 동일한 제형의 2종 이상의 제제의 동시적 투여, 별도의 제형의 동시적 투여 및 개별적 투여를 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 치료 조성물 및 다른 치료제는 동일한 제형으로 함께 제제화하여 동시에 투여할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 치료 조성물 및 다른 치료제는 동시에 투여될 수 있으며, 이 경우 두 제제는 모두 별도의 제형으로 존재한다. 또 다른 대안으로, 상기 치료제는 다른 치료제를 투여한 직후에 투여하거나, 또는 그 반대로 투여할 수도 있다. 별도의 투여 프로토콜에서, 본 발명의 치료 조성물과 다른 치료제는 몇 분의 간격을 두어, 몇 시간 간격을 두어, 또는 며칠 간격을 두어 투여될 수 있다.

본원에 기재된 엑소좀은 치료, 연구 및 진단 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 아래에 기재한 엑소좀은 세포의 하나 이상의 표현형 형질을 향상시키기 위해 해당 세포 배양물에 첨가할 수 있다. 본 발명의 엑소좀은 세포의 하나 이상의 표현형 형질을 억제하기 위해 상기 세포 배양물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 엑소좀은 세포의 새로운 표현형 형질을 제공하기 위해 상기 세포 배양물에 첨가될 수 있다.

A. 약제학적 조성물

본원에 제시된 특정 방법들은 본 발명의 엑소좀을 포함하는 약제학적 유효량의 조성물의 투여를 수반하는 방법에 관한 것이다.

본원에 사용된 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 보존제 (예컨대, 항균제, 항진균제), 등장성 제제, 흡수지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 착향료, 염료, 이와 유사한 재료 및 이들의 조합을 포함한다 (Remington's, 1990) 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 상용성이 없는 경우를 제외하고는, 상기 치료 또는 약제학적 조성물에서 그의 사용이 고려된다. 본 발명에서 사용되는 조성물은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여될지의 여부, 및 주사 투여 경로를 위해 멸균될 필요가 있는지의 여부에 따라 서로 다른 유형의 담체를 포함할 수 있다.

약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 지금까지 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 상용성이 아닌 경우를 제외하고는, 치료학적 조성물 중에서 그의 사용이 고려된다. 추가의 활성 성분들도 본 조성물에 포함될 수 있으며, 이들에 대해서는 아래에서 보다 상세하게 논의한다. 인간에게 투여하는 경우, 제제는 FDA 생물의약품국 (Office of Biologics) 기준에서 요구하는 무균성, 발열성, 전반적인 안전성 및 순도 기준을 충족하는 것이 바람직하다.

엑소좀을 포함하는 조성물은 원치않는 작은 분자량을 갖는 분자를 제거하기 위해 광범위하게 투석할 수 있고/있거나, 적절한 경우에 보다 손쉽게 원하는 비히클로 제제화하기 위해 동결건조될 수도 있다. 특정 양태에서, (예를 들어, PLASMALYTE-A® 중의) 본 발명의 엑소좀을 포함하는 조성물은 어떠한 처리도 필요하지 않으며 대상체에게 직접 주입될 수도 있다. 이후, 활성 화합물은 일반적으로 비경구 투여와 같은 임의의 공지된 경로에 의해 투여되도록 제형화될 것이다. 투여 방법은하기에 보다 상세하게 논의한다.

본 발명은, 하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 혈관내 주사용 또는 임의의 다른 경로용의 멸균 용액인 조성물을 사용하는 방법을 고려한다. 당업자라면 누구나 주사용 또는 임의의 다른 경로용의 멸균 용액을 제조하는 기법들에 익숙할 것이다. 멸균 주사액은, 필요량의 활성 화합물을 당업계의 숙련자에게 익숙한 다양한 기타 성분들과 함께 적절한 용매 중에 포함시켜 제조할 수도 있다.

조성물의 제형은 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 수용액으로의 비경구 투여의 경우, 상기 용액은 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스를 사용하여 등장성으로 만들어야 한다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명의 내용에 비추어 봤을 때 당업자에게 공지되어 있을 것이다.

정맥내 또는 근육내 주사와 같은 비경구 투여를 위해 제형화된 화합물 이외에, 다른 약제학적으로 허용가능한 제형으로는 이식가능한 약물 전달 장치를 이용하는 투여용 제형 및 임의의 다른 제형도 포함된다. 본 발명에서는 비강 용액 또는 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제를 사용할 수도 있다.

경구 제형은 예를 들어, 의약품 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아린산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 통상적으로 사용되는 부형제들을 포함한다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐제, 서방형 제제 또는 분말의 형태를 취한다. 당업자라면 누구나 경구 제형의 제조를 위해 널리 공지된 기법들에 익숙할 것이다.

특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 적어도 약 0.1 중량%의 활성제를 포함한다. 상기 조성물은, 예를 들어 약 0.01%를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 약제학적 조성물은, 예를 들어 해당 조성물의 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 해당 조성물의 중량의 약 25% 내지 약 60% 및 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위를 포함한다.

상기 조성물은 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 다양한 산화방지제를 포함할 수 있다. 추가로, 이에 제한되는 것은 아니지만, 파라벤 (예컨대, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 항균제 및 항진균제와 같은 보존제에 의해 미생물의 작용을 방지할 수 있다. 상기 조성물은 제조 및 보관 조건 하에 안정할 수 있으며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존될 수 있다. 내독소 오염은 예를 들어, 최소한 단백질 1 mg당 0.5 ng 미만의 안전한 수준으로 유지되어야 할 것이다.

조성물이 액체 형태인 실시양태에서, 담체는 이에 제한되지는 않지만, 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 지질 (예컨대, 트리글리세리드, 식물성유, 리포좀) 및 이들의 조합을 포함하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 대부분의 경우, 등장화제, 예를 들어 당, 염화나트륨 또는 이들의 조합을 포함하는 것이 바람직할 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명에서는 비강 용액 또는 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제를 사용할 수도 있다. 비강 용액은 점적제 또는 스프레이로 비강 통로에 투여되도록 고안된 수용액일 수 있다.

멸균 주사액은, 필요량의 나노입자를, 필요에 따라 상기 열거한 다양한 기타 성분들과 함께 적절한 용매 중에 포함시킨 후, 멸균시켜 제조할 수도 있다.

제제화시, 엑소좀은 제형과 양립가능한 방식으로 그리고 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다.

상기 나노입자는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 엑소좀의 유효량을 포함하는 조성물은 정맥내, 뇌내, 두개내, 척수강내, 흑질내 또는 흑질 영역내, 피부내, 동맥내, 복강내, 병소내, 기관내, 비강내, 국소, 근육내, 복강내, 피하, 경구, 국소, 국부, 흡입 (예컨대, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 표적 세포를 직접적으로 국소 관류욕 수행에 의해, 카테터를 통해, 세척술을 통해, 크림으로, 지질 조성물 (예컨대, 리포좀)로, 또는 다른 방법 또는 당업계의 숙련가에게 공지된 상술한 것들의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다(Remington's, 1990). 특정 실시양태에서, 상기 조성물은 약물 전달 장치를 사용하여 대상체에게 투여된다.

다른 실시양태에서, 엑소좀은 이에 제한되지는 않지만, 경구, 비강내, 장내, 국소, 설하, 동맥내, 골수내, 척수강내, 흡입, 안구내, 경피, 질 또는 직장 경로를 포함하는 경로에 의해 투여되도록 제형화된다. 예를 들어, 국소용 엑소좀 조성물은 적절한 담체를 포함하여 제조될 수 있다. 트리글리세리드 베이스와 같은 적절한 베이스를 사용하여 국소용 크림, 로션 및 연고도 제조할 수 있다. 이러한 크림, 로션 및 연고는 표면 활성제도 함유할 수 있다. 적절한 분사제 보조제를 사용하는 에어로졸 제형도 제조할 수 있다. 조성물의 투여 방식에 관계없이 다른 보조제들도 조성물에 첨가할 수 있는데, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제 및 기타 보존제들을 조성물에 첨가하여 장기간의 보관 기간 동안 미생물의 증식 및/또는 분해를 방지할 수 있다.

나노입자의 약학적 유효량은 의도한 목적, 예를 들어 세포 사멸의 억제를 기초로 하여 결정된다. 치료 및 투여 횟수 모두에 따른 투여량은 치료할 대상체, 대상체의 상태, 목적한 보호 방식 및 투여 경로에 따라 좌우된다. 치료제의 정확한 양 역시 의사의 판단에 좌우되며, 각 개인에 따라 다르다.

예를 들어, 치료제의 용량은 해당 용량당 약 0.0001 밀리그램 내지 약 1.0 밀리그램, 또는 약 0.001 밀리그램 내지 약 0.1 밀리그램, 또는 약 0.1 밀리그램 내지 약 1.0 밀리그램, 또는 심지어 약 10 밀리그램 정도일 수 있다. 다회분 용량으로도 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용량은 적어도 약 0.0001 밀리그램이다. 추가의 실시양태에서, 용량은 적어도 약 0.001 밀리그램이다. 추가의 실시양태에서, 용량은 적어도 약 0.01 밀리그램이다. 추가의 실시양태에서, 용량은 적어도 약 0.1 밀리그램이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 용량은 적어도 1.0 밀리그램일 수 있다. 보다 더 구체적인 실시양태에서, 용량은 적어도 10 밀리그램일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 용량은 적어도 100 밀리그램 또는 그 이상이다.

다른 비제한적인 예로서, 용량은 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중 내지 약 1000 mg/kg/체중 또는 그 이상까지, 그리고 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위도 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치들로부터 유도가능한 범위의 비제한적 예로서, 상술한 수치에 기초하여, 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위를 투여할 수 있다.

상기 용량은 당업계의 숙련자들에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수 있다. 따라서, 본원에 제시된 방법들의 일부 실시양태에서, 단일 용량이 고려된다. 다른 실시양태에서, 2회분 이상의 용량이 고려된다. 1회분 이상의 용량이 대상체에게 투여되는 경우, 용량들 간의 시간 간격은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 임의의 시간 간격일 수 있다. 예를 들어, 용량들 간의 시간 간격은 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 24시간, 약 1일 내지 약 2일, 약 1주 내지 약 2주 또는 그 이상, 또는 상기 언급한 임의의 범위 내에서 도출될 수 있는 임의의 시간 간격일 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 방법은 환자에게 약제학적 조성물을 연속적으로 공급할 수 있다. 이러한 연속적 공급은 카테터 삽입 후, 치료제의 연속적 투여에 의해 달성될 수 있다. 상기 투여는 수술 중 또는 수술 후일 수 있다.

B. 병용 요법

본 발명의 특정 실시양태는 질환의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 2차적 형태의 요법의 실시 또는 적용도 제시한다. 예를 들어, 상기 질환은 암과 같은 과증식성 질환일 수 있다.

상기 2차적 형태의 요법은 암의 치료 또는 예방에 적용될 수 있는 하나 이상의 2차적 약리학적 제제의 투여일 수 있다.

상기 2차적 요법이 약리학적 제제인 경우, 상기 제제는 나노입자의 투여 전, 나노입자의 투여와 동시에 또는 나노입자의 투여 후에 투여될 수 있다.

엑소좀의 투여와 상기 2차 요법 간의 간격은 당업자에 의해 결정된 임의의 간격일 수 있다. 예를 들어, 상기 간격은 몇분에서 몇주일 수도 있다. 제제가 별도로 투여되는 실시양태에서, 투여자라면 누구나 일반적으로 각 전달 시간 사이에 긴 시간이 경과되지 않도록 하여, 각 치료제가 대상체에게 유리한 병용 효과를 계속해서 충분히 발휘할 수 있도록 할 것이다. 예를 들어, 치료제들 간의 간격은 서로 약 12시간 내지 약 24시간일 수 있으며, 보다 바람직하게는 서로 약 6시간 내지 약 12시간 이내일 수 있다. 그러나, 어떤 상황에서는, 각 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일)의 경과와 같이 치료 기간이 연장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2차 치료제의 투여 시기는 나노입자에 대한 대상체의 반응에 기초하여 결정한다.

다양한 조합들을 사용할 수 있다. 아래 예의 경우, 엑소좀 조성물은 "A"이고, 항암 요법은 "B"이다.

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

환자에 대한 본 발명의 임의의 화합물 또는 요법의 투여 또는 실시는, 제제들의 독성이 존재하는 경우라면 그의 독성을 고려하여, 상기 화합물의 투여에 대한 일반적인 프로토콜을 따르게 될 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서는 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계를 둔다. 치료 주기는 반복될 수 있는 것으로 예상한다. 또한, 수술적 개입 뿐만 아니라 다양한 표준 요법들도 기술한 요법과 함께 적용할 수 있다.

특정 양태에서, 표준 요법으로는 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 수술적 치료 또는 유전자 요법을 포함할 것이며, 상기 표준 요법은 본원에 기술된 바와 같이 유전자 발현 요법 억제제, 항암 요법, 또는 유전자 발현 요법 억제제와 항암 요법 모두를 병용하여 사용할 수 있다.

1. 화학요법

본 실시양태에 따르면, 다양한 화학요법제들을 사용할 수 있다. "화학요법"이라는 용어는 암을 치료하기 위해 약물을 사용하는 것을 가리킨다. "화학요법제"는 암 치료시 투여되는 화합물 또는 조성물을 의미하는 것으로 사용된다. 이러한 제제 또는 약물은 세포 내에서의 이들의 활동 방식, 예를 들어 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지의 여부 및 어느 단계에서 영향을 미치는지에 따라 분류된다. 다르게는, 제제는 DNA를 직접 가교결합하거나, DNA에 삽입되거나, 또는 핵산 합성에 영향을 주어 염색체 및 유사분열 변이를 유도하는 그의 능력을 기반으로 특성화시킬 수 있다.

화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아미드, 트리에틸렌티오포스포아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로나파진, 클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 에네딘 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마lI 및 칼리케아미신 오메가II); 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라, 네오카지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질인 에네딘 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라나이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로나놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK다당류 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 착물, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 엑셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예를 들어, CPT-11); 토포아이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 겜시타비엔, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라아제 억제제, 트랜스백금, 및 전술한 것들 중 임의의 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.

2. 방사선요법

DNA 손상을 유발하는 것으로 광범위하게 사용되는 다른 요인으로는 일반적으로 γ-선, X-선 및/또는 종양 세포에 대한 방사성 동위원소의 유도형 전달로서 공지된 것들을 포함한다. 마이크로파, 양성자 빔 조사 (미국 특허 5,760,395호 및 4,870,287호) 및 자외선 조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 요인들도 고려된다. 이러한 인자들은 모두 DNA, DNA 전구체, DNA 복제 및 수선, 염색체 조립 및 유지에 광범위하게 손상을 미칠 확률이 높다. X-선의 조사량 범위는, 장기간 (3주 내지 4주) 동안에는 하루 조사량으로 50 내지 200 ?盧?겐에서부터 단회 조사량으로 2000 내지 6000 렌트겐까지의 범위이다. 방사성 동위원소의 조사 범위는 광범위하게 다를 수 있어서, 해당 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도와 종류, 및 신생물 세포의 흡수율에 좌우된다.

3. 면역요법

당업자라면 누구나 추가의 면역요법을 본 실시양태의 방법들과 조합하거나 그와 함께 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 암치료와 관련하여, 면역요법은 암세포를 표적으로 삼아 파괴하는 면역 효과기 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙 (RITUXAN®)이 이러한 예이다. 면역 효과기는, 예를 들어, 종양 세포의 표면상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 요법의 효과기로서 기능을 할 수 있거나, 또는 세포 사멸에 실질적으로 영향을 미치는 다른 세포들을 동원할 수도 있다. 또한, 항체는 약물 또는 독소 (화학요법, 방사성 핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합되어 표적화제로 기능할 수도 있다. 다르게는, 효과기는 종양 세포 표적과 직간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수도 있다. 다양한 효과기 세포로는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.

항체-약물 접합체 (ADC)는 세포 사멸 약물과 공유 결합된 단일클론성 항체 (MAb)를 포함한다. 이러한 접근법은 MAb의 항원 표적에 대한 높은 특이성과 매우 강력한 세포독성 약물을 조합하여, 항원의 수준이 집적화된 종양 세포에 탑재물(약물)을 전달하는 "무장된" MAb를 제조한다. 약물의 표적화 전달은 정상 조직에 그의 노출을 최소화함으로써, 독성을 감소시켜 치료 지수의 개선을 도모한다. 2011년에 ADCETRIS® (브렌툭시맙 베도틴) 및 2013년에 KADCYLA® (트라스투주맙 엠탄신 또는 T-DM1)의 2종의 ADC 약물에 대한 FDA 승인으로 인해 이러한 접근법의 유효성이 검증되었다. 현재 30종 이상의 ADC 약물 후보 물질들이 암치료를 위한 다양한 단계의 임상에서 시험되고 있다. 항체 유전자 조작 및 링커 탑재물 최적화가 점차 더 발달하게 됨에 따라, 새로운 ADC의 발견과 개발은 이러한 접근법 및 표적화 MAb의 제조에 적절한 새로운 표적의 확인과 유효성 검증에 점점 더 의존하게 되었다. ADC 표적에 대한 두 가지 기준은 종양 세포에서의 상향 조절된/높은 수준의 발현 및 강력한 내재화이다.

면역요법의 한 양태에서, 종양 세포는 표적화가 용이한, 즉 대다수의 다른 세포 상에는 존재하지 않는 일부 마커를 보유할 수 있다. 다수의 종양 마커들이 존재하며, 이들 중 임의의 마커가 본 실시양태와 관련한 표적화에 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커로는 CD20, 암배아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적인 양태는 항암 효과와 면역 자극 효과를 조합시키는 것이다. 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, γ-IFN, 케모카인, 예컨대 MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예컨대 FLT3 리간드를 포함하는, 면역 자극 분자들도 존재한다.

현재 조사 중이거나 사용 중인 면역요법제의 예로는 면역 보조제, 예컨대 마이코박테리움 보비스, 플라스모디움 팔시파룸, 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물; 사이토카인 요법제, 예컨대 인터페론 α, β 및 γ, IL-1, GM-CSF 및 TNF; 유전자 요법제, 예컨대, TNF, IL-1, IL-2 및 p53; 및 단일클론성 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-갱글리오사이드 GM2 및 항-p185을 들 수 있다. 하나 이상의 항암 요법들을 본원에 기재된 항체 요법과 함께 사용할 수 있을 것으로 생각된다.

일부 실시양태에서, 면역요법은 면역 체크포인트 억제제일 수 있다. 면역 체크포인트는 신호 (예컨대, 보조 자극 분자)를 증폭시키거나, 신호를 거절하는 면역계 내에 존재하는 분자이다. 면역 체크포인트 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제성 체크포인트 분자들로는 아데노신 A2A 수용체 (A2AR), B7-H3 (CD276으로도 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠기 (BTLA), 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4 (CTLA-4, CD152로도 공지됨), 인돌레아민 2,3-디옥시게나아제 (IDO), 살해 세포 면역글로불린 (KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG3), 프로그래밍된 사멸 1 (PD-1), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3) 및 T 세포 활성화에 대한 V-도메인 Ig 억제자 (VISTA)를 포함한다. 특히, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적으로 한다.

상기 면역 체크포인트 억제제는 리간드 또는 수용체의 재조합 형태의 소분자와 같은 약물일 수 있거나, 특히 항체, 예컨대 인간 항체이다 (예를 들어, 국제 특허 공보 WO2015016718호; 본 명세서에 참조로 포함됨). 면역 체크포인트 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제들이 사용될 수 있으며, 특히 키메라 형태, 인간화 형태, 인간 형태의 항체들이 사용될 수 있다. 당업자가 주지하는 바와 같이, 본 발명에 언급된 특정 항체에 대해서 대안적인 명칭 및/또는 그와 균등한 명칭들이 사용될 수도 있다. 이러한 대안적인 명칭 및/또는 그와 균등한 명칭들은 본 발명의 내용에서 서로 혼용가능하다. 예를 들어, 람브롤리주맙은 대안적인 명칭 및/또는 그와 균등한 명칭인 MK-3475와 펨브롤리주맙으로도 알려져 있다.

일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 리간드 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 실시양태에서, PDL1 결합 길항제는 PD-1의 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 실시양태에서, PDL2 결합 길항제는 PDL2의 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역접합소, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드일 수 있다. 대표적인 항체들은 미국 특허 8,735,553호, 8,354,509호 및 8,008,449호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제공되는 방법에 사용하기 위한 다른 PD-1 축 길항제들은, 예컨대 미국 특허 출원 20140294898호, 2014022021호 및 20110008369호에 기술된 바와 같이 당업계에 공지되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 본 명세서에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체 (예를 들어, 인간 항체, 인간화 형태의 항체 또는 키메라 형태의 항체)이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 CT-011로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 면역접합소 [예를 들어, 불변 영역 (예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역접합소]이다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 및 OPDIVO^®로도 알려진 니볼루맙은 WO2006/121168호에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA^® 및 SCH-900475로도 알려진 펨브롤리주맙은 WO2009/114335호에 기재된 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로도 알려진 CT-011은 WO2009/101611호에 기재된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로도 알려진 AMP-224는 WO2010/027827호 및 WO2011/066342호에 기재된 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다.

본원에 제공된 방법에서 표적으로 삼을 수 있는 또 다른 면역 체크포인트는 CD152로도 알려진 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4 (CTLA-4)이다. 인간 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 수탁번호 L15006으로 등록되어 있다. CTLA-4는 T 세포의 표면에 존재하며, 항원 제시 세포의 표면 상의 CD80 또는 CD86과 결합하는 경우, "오프 (off)" 스위치로 작용한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면 상에 발현되어 T 세포에 억제 신호를 전송하는 면역글로불린 상과 계열의 일원이다. CTLA4는 T 세포 보조 자극 단백질인 CD28과 유사하며, 양 분자 모두 각각 항원 제시 세포 상의 B7-1 및 B7-2로도 불리는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA4는 T 세포에 억제 신호를 전송하는 한편, CD28은 자극 신호를 전송한다. 세포내 CTLA4는 조절 T 세포에서도 발견되며, 이들의 기능에 중요할 수 있다. T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자의 억제 수용체인 CTLA-4의 발현을 증가시킨다.

일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체 (예를 들어, 인간 항체, 인간 형태의 항체 또는 키메라 형태의 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역접합소, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드이다.

본 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-CTLA-4 항체 (또는 그로부터 유래한 VH 및/또는 VL 도메인)는 당업계에 익히 공지되어 있는 방법들을 사용하여 제조할 수 있다. 다르게는, 당업계에 알려져 있는 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, US 8,119,129호, WO 01/14424호, WO 98/42752호; WO 00/37504호 (CP675,206, 트레멜리무맙; 이전에는 티실리무맙으로 공지됨), 미국 특허 6,207,156호에 개시된 항-CTLA-4 항체가 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 전술한 공보들의 각 교시내용은 본원에 참조로 포함된다. CTLA-4와 결합하는 것으로 당업계에 알려져 있는 항체들 중 임의의 항체와 경쟁하는 항체들도 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 형태의 CTLA-4 항체가 국제 특허 출원 WO2001014424호, WO2000037504호 및 미국 특허 8,017,114호에 기재되어 있으며; 상기 문헌들은 모두 본 명세서에 참조로 포함된다.

항-CTLA-4 항체의 예로는 이필리무맙 (10D1, MDX-010, MDX-101 및 Yervoy®로도 알려짐) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체를 들 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 상기 언급한 항체와 동일한 CTLA-4 상의 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/경쟁하거나, 상기에서 언급한 항체와 동일한 CTLA-4 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 90%의 가변 영역 아미노산 서열 동일성 (예를 들어, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95% 또는 99%의 가변 영역 동일성)을 가진다.

CTLA-4를 조절하기 위한 다른 분자들로는, 모두 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 US5844905호, US5885796호 및 국제 특허 출원 WO1995001994호 및 WO1998042752호에 기재된 것과 같은 CTLA-4 리간드 및 수용체와, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 US8329867호에 기재된 것과 같은 면역접합소를 포함한다.

4. 수술

암에 걸린 사람의 약 60%가 예방, 진단 또는 병기결정, 치료 및 완화 수술을 포함하는, 일정 유형의 수술을 받게 될 것이다. 치료 수술은 암 조직의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거, 절개 및/또는 파괴하는 절제술을 포함하며, 본 실시양태의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역 요법 및/또는 대체 요법과 같은 다른 요법들과 함께 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 가리킨다. 종양 절제술 이외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 저온수술, 전기수술 및 현미경 제어 수술 [모즈 수술 (Mohs' surgery)]을 포함한다.

암 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절개시, 체내에 공동이 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접 주사, 또는 추가의 항암 요법을 사용한 해당 영역에 대한 국소 적용에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다 또는 1, 2, 3, 4 및 5주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복할 수 있다. 이러한 치료 역시 다양한 투여량으로 이루어질 수 있다.

5. 기타 제제

기타 다른 제제들을 본 실시양태들의 특정 양태들과 조합해 사용하여 해당 치료의 치료 효능을 개선시키는 것도 고려할 수 있다. 따라서, 추가의 실시예들도 고려될 수 있다. 이러한 추가의 제제들은 세포 표면 수용체 및 GAP 접합부의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포 증식 억제제 및 분화제, 세포 부착 억제제, 아폽토시스 유도제에 대한 과증식성 세포의 감응성을 증가시키는 제제, 또는 기타 생물학적 제제를 포함한다. GAP 접합부 수의 증가에 의한 세포간 신호전달의 증가는 인접한 과증식성 세포군에 대한 항-과증식성 효과를 증대시킬 것이다. 다른 실시양태에서, 세포 증식 억제 또는 분화제는 치료의 항-과증식성 효능을 개선시키기 위해, 본 실시양태의 특정 양태들과 조합하여 사용될 수 있다. 세포 부착 억제제는 본 실시양태의 효능을 개선시킬 수 있을 것으로 생각된다. 세포 부착 억제제의 예로는 국소 부착 키나제 (FAK) 억제제 및 로바스타틴을 들 수 있다. 추가로, 항체 c225와 같이 치료 효능을 개선시키기 위해, 아폽토시스에 대한 과증식성 세포의 감응성을 증가시키는 다른 제제들을 본 실시양태의 특정 양태들과 조합하여 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

IV. 키트

실시양태의 다양한 측면에서, 치료제 및/또는 다른 치료제 및 전달제를 함유하는 키트가 고려된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 실시양태들은 실시양태의 엑소좀 조성물을 제조 및/또는 투여하기 위한 키트를 고려한다. 상기 키트는 본 발명의 실시양태의 임의의 약제학적 조성물을 함유하는 하나 이상의 밀봉된 바이알을 포함할 수 있다. 상기 키트는 예를 들어, 엑소좀 뿐만 아니라, 실시양태의 성분들을 제조, 제제화 및/또는 투여하거나, 또는 본 발명의 방법의 하나 이상의 단계를 수행하기 위한 시약들을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 적절한 용기도 포함할 수 있는데, 이 용기는 상기 키트의 부품들, 예컨대 에펜도르프 튜브, 분석 플레이트, 주사기, 병 또는 튜브와 반응하지 않는 용기이다. 상기 용기는 플라스틱 또는 유리와 같은 멸균가능한 재료로 제조될 수 있다.

상기 키트는 본원에 제시된 방법들의 절차적 단계들을 개략적으로 설명하는 지침서를 추가로 포함할 수 있는데, 이것은 본원에 기술된 것과 실질적으로 동일한 절차를 따를 것이거나 당업자에게 공지되어 있다. 상기 지침서의 정보는, 컴퓨터를 사용하여 실행하는 경우 약학적 유효량의 치료제를 전달하는 실제 또는 가상 절차를 표시하여 보여주는 기계 판독가능 지침을 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체 내에 존재할 수 있다.

V. 실시예

하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 실시양태를 설명한다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 실시양태에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.

실시예 1 - 엑소좀의 제조 및 특성 분석

MSC로부터 다량의 엑소좀을 제조하기 위해, 골수 유래 MSC의 생물반응기 배양물을 250 mL의 조정된 배지 수집군을 수확할 수 있도록 개질하였다. 테루모의 퀀텀 세포 증식 시스템은 GMP에 적절한 세포 생산을 위해 설계된 자동화 중공사 세포 배양 플랫폼이다.

MSC는 대략 2.0×10⁷개의 MSC로서 약 450개의 세포/cm²의 밀도로 생물반응기에 분주하였다. MSC 증식 및 부착을 위해 L-글루타민 + 인간 혈소판 용해물 (PLT)이 보충된 알파 MEM 배지를 사용하여 상기 세포를 5%의 산소 중에서 8일간 배양하였다.

다른 발명자들에 의해 아직 보고된 바 없는 본 발명의 전략에서의 독특한 단계는, 생물반응기에서 최적의 MSC 전면생장률을 위해 초기에 혈소판 용해물을 사용하는 단계 이후, 다음 단계로서 생물반응기의 MSC가 85% 이상의 전면생장률에 도달하게 되면 상기 증식 배지를 무혈청의 조정된 배지로 교환하는 단계를 수반한다는 것이다. 상기 단계로 인해 혈소판 용해물에서 다량으로 발견되는 엑소좀이 최종 생성물을 오염시키는 것을 피할 수 있는데, 이러한 단계가 없었다면 MSC 유래의 엑소좀을 희석시켜야 했을 것이다. 상기 조정된 배지를 생물반응기에 48시간 동안 방치한 후, EV 정제를 위해 이를 수집하였다 (도 1). 상기 생물반응기는 12일 동안 EV를 지속적으로 생산하였는데, 이는 6개의 수집군 (매 48시간마다 1개의 수집군)을 포함하였다 (도 2).

이러한 접근 방법을 사용하여 약 6억개의 MSC로부터 EV를 순차적으로 수집하여 해당 시스템을 최적화하였다. 21일 후, 매 48시간마다 수집하여 -80℃로 보관한 조정된 배지 분획들을 해동하여 모은 후, 기능적으로 폐쇄된 시스템 중에서 여과하였다 (도 3).

임상 세포 요법 절차에 요구되는 GMP 기준 요건과 일관되게, 본 공정을 위한 백 배관의 열 밀봉 후 여과에서 펌프 (Baxter)를 사용하였다. XE-90 초원심분리기 (베크만 쿨터)를 사용하여 4℃에서 4시간 동안 100,000g로 초원심분리하여 상기 조정된 배지로부터 엑소좀으로서 EV를 분리하였다. 상기 Baxter 펌프와 열 밀봉 배관을 사용하여 최고 품질의 임상 제품을 위해 기능적으로 폐쇄된 방식으로 초원심분리기로부터 엑소좀을 제거하였다.

여과 및 초원심분리에 의해 엑소좀을 풍부하게 하여 엑소좀 수가 수확물당 9000억 내지 4500억개 범위였다. 생성된 엑소좀의 총수는 생물반응기 1회 가동당 9.8 내지 15.1조 범위이다. 6회의 생물반응기 가동의 모든 수확물의 엑소좀의 최빈값 크기는 약 170 nm에서 특징적인 피크를 나타내었다. 엑소좀 단백질 함량의 측정치는 Nanosight 분석으로 측정한 엑소좀 세수와 비슷하였다. 특히, 조정된 배지의 대사물 수확량은 일정하게 유지되었는데, 이는 MSC가 생존하고 있다는 사실을 뒷받침하는 것이다.

정제된 엑소좀은 해당 엑소좀 표면 마커 CD63, CD47, CD9 및 CD81의 발현에 대한 유세포분석; 및 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 확인될 수 있다 (도 4). 추가로, 나노입자 추적 분석 및 microBCA 분석을 사용하여 엑소좀을 정량할 수도 있다 (도 5). 하나의 생물반응기에서의 가동 수율은 최소 10×10¹²개의 엑소좀이었는데, 이는 100 T-225 플라스크에서의 대략적인 엑소좀 수율과 동일한 것이다. 따라서, 본 방법은 엑소좀의 효율적인 임상 등급 생산을 가능하게 한다.

실시예 2 - 엑소좀의 전기천공

4D 뉴클레오팩터 시스템을 LV 유닛으로 조정하여, 실시예 1에서 유도된 엑소좀과 같은 2.5×10¹⁰ 내지 2.5×10¹²개 범위의 다량의 엑소좀에 대한 효율적인 폐쇄형 규모 가변성의 시험관내 형질감염이 가능하도록 하였다. 상기 4D 뉴클레오팩터 장치에는 3개의 뉴클레오팩터 용액인 SE, SF 및 SG가 포함되어 있으며, 이들 각각은 MSC 유래 엑소좀 및 특정 siRNA를 사용하여 16가지의 서로 다른 뉴클레오팩터 프로그램들과 함께 시험되었다. 상기 siRNA를 MSC 유래의 엑소좀으로 효율적으로 도입하는 각 조건의 효율성은, siRNA를 운반하는 MSC-엑소좀에 의해 유도된 수용 대상체 세포의 아폽토시스 분석에 의해 평가하였다 (도 7).

예전에는, 제조한 전기천공 버퍼 (연구 버퍼, 'RB')를 사용하여 siRNA를 엑소좀에 도입하였는데, 이러한 방식은 상기 버퍼를 인체에 사용하도록 승인되지 않았기 때문에 세포 또는 마우스를 처리하기 전에 엑소좀의 세척 단계가 필요하였다. 상기 세척 단계는 엑소좀의 손실을 가져오게 되는데, 이러한 손실은 siRNA의 엑소좀으로의 성공적인 전기천공을 가능하게 하고 세포 또는 마우스로 직접 투여될 수 있는 희석제의 사용에 의해 경감시킬 수 있다. 환자에게 MSC 및 다수의 기타 세포 생성물을 주입하는데 사용되는, FDA 승인된 인체용 희석제인 임상 버퍼 (PLASMALYTE-A®, 'CB')를 전기천공에 대하여 시험하였다. MSC 유래 엑소좀을 전기천공한 후, 전자 현미경 분석을 통해 당초 제조했던 연구 버퍼 (RB) 또는 PLASMALYTE-A® (도 8b)를 사용하여 온전한 엑소좀의 존재를 확인하였다.

실시예 3 - 엑소좀 제조에 있어서 조건의 최적화

MSC 배양물로부터 엑소좀을 생성하기 위한 최적의 시간을 결정하기 위해, 조정된 배지의 수집을 서로 다른 시간대로 수행하였다 (도 5d). Nanosight에서 얻은 데이터 (즉, 입자수)를 유세포분석에서 얻은 데이터 (즉, 엑소좀 마커의 비율)와 조합하였다. 그 결과, MSC의 입자수는 24시간째에 최고 수준에 도달하여 48시간까지 유지되는 것으로 나타났다. 그 시간 후 입자수는 크게 감소하였다. 데이터 흐름은 엑소좀 마커의 비율이 24시간째의 비율에 비해 48시간째에 풍부해졌음을 나타내고 있다 (도 5e). 24시간째와 48시간째의 입자수의 차이가 크지 않았기 때문에, 48시간째의 시점을 수집 시점으로 선택하였다.

다음으로, 배양물 중에서 MSC로부터 엑소좀을 제조하기 위한 이상적인 조건을 결정하기 위해, PLT를 함유하는 배지를 사용 및 미사용하여 24시간의 배양 후 조정된 배지로부터 MSC 유래의 엑소좀을 분리하였다. 그 결과, PLT를 함유하는 배지로부터 분리된 입자들의 수가 무혈청 배지를 사용한 경우에서보다 더 많았던 것으로 나타났다 (도 6a). 그러나, 엑소좀 마커의 유세포분석에서는 엑소좀의 비율이 낮은 것으로 나타났는데, 이는 아마도 PLT 중의 단백질 및 지질의 수가 많았기 때문일 것이다 (도 6b).

따라서, 소량의 핵산 서열 또는 단백질을 엑소좀 내로 전기천공하는 과정을 인체에 직접적으로 주입할 수 있는 멸균 용액 (즉, PLASMALYTE-A®) (도 8a)을 사용해 최적화하여, 상기 조작과정, 재료의 손실 및 치료 비용을 감소시켰다 (도 9). 5가지의 서로 다른 연구 버퍼들을 시험하여 PLASMALYTE-A®가 최적의 전기천공 결과를 나타내었음을 입증하였다 (도 8a). 또한, 본 전략에 의해 제조된 MSC 유래 엑소좀의 여러 개의 조직들을 표적으로 하는 능력도 생체 내에서 입증하였다 (도 10).

따라서, 본 연구는 수용 대상체 세포에서 표적 RNA의 시험관내 발현을 사일런싱시킬 수 있는 KRAS siRNA를 운반하는 MSC-엑소좀의 효율적인 대량 제조를 입증한 것이다 (도 8c). 상기 접근법은 기존의 방법들에 비해 1 초과의 로그로 다수의 EV를 생성한다. 추가로, 본 방법은 세척 또는 다른 조작이 없이도 상기 조작된 엑소좀의 직접 주입도 가능케 한다.

실시예 4 - 재료와 방법

세포: MD 앤더슨 암센터(MD Anderson Cancer Center)의 세포 요법 연구소(Cell Therapy Laboratory)에서 입수한 골수 유래의 MSC 계대배양물 3을 1% L-글루타민, 5% 인간 혈소판 용해물 및 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 알파 MEM (완전 배지) 중에서 배양하였다. 3개의 각 공여체들의 MSC를 평가한 후, 높은 엑소좀 생산 수율에 기초하여 1개의 공여체를 선택하였다. 시험관내 형질감염을 위해, 6-웰 플레이트의 웰당 250,000개의 Panc-1 세포를 밤새 분주하였다. 엑소좀 처리 전에, 단층을 1 ㎖의 PBS로 2회 세척한 후, 각 분석에서 설명된 바와 같이 지정된 시점에 1 ㎖의 무혈청 배지 (1% 페니실린-스트렙토 마이신이 보충된 RPMI) 중에서 엑소좀으로 처리하였다.

상기 임상 버퍼 (PLASMALYTE-A®, pH 7.4 또는 'CB')는 0.09 M의 염화나트륨, 0.23 M의 글루콘산나트륨, 0.27 M의 아세트산나트륨 삼수화물, 5 mM의 염화칼륨 및 3 mM의 염화마그네슘으로 이루어져 있다. 상기 버퍼에는 항균제가 함유되어 있지 않다. 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다.

임상 등급의 엑소좀은 MD 앤더슨 암 센터의 세포 요법 연구소의 GMP 시설에서 배양시킨 MSC로부터 엄격한 과정으로 제조되었다. 상기 퀀텀 생물반응기 배양 시스템 (테루모 BCT)을 1 L의 1XPBS로 프라이밍 (자동화 공정)한 후, 250 ㎖의 1XPBS에 24시간 동안 희석시킨 5 mg의 인간 피브로넥틴 [독일 소재의 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences) 제조]을 사용하여 코팅하였다. 그 후, 상기 생물반응기를 1% L-글루타민, 5% 인간 혈소판 용해물 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 알파 MEM (완전 배지) 중의 500 ㎖의 배양물로 세척하고, 25 ㎖의 완전 배지 중에서 희석된 20×10⁶개의 MSC (계대배양물 3)를 로딩한 후, 완전 배지를 사용하여 9일간 증식시켰다. 신선한 완전 배지를 세포에 계속하여 첨가하고, 매일 글루코스 및 락테이트 측정치에 의해 정한 대로 주입 속도를 조정하였다. 9일 후, 세포들이 (글루코스 및 락토스 측정치로 확인하여) 대략 80% 전면생장률에 도달했을 때, 상기 세포들을 2 L의 1XPBS로 세척하여 상기 완전 배지를 PLT 무함유 배지 (1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 알파 MEM)로 교체하였다. 이후, 생물반응기 조정된 배지 (250 ㎖)를 매 48시간마다 밀봉된 백 (폐쇄된 시스템) 중에서 수집하여 총 6개의 수집군(수확물)을 수집하였다. 상기 12일 동안, 상기 배양물은 매일 측정한 일정한 글루코스 수준에 기반하여 확장시키지 않았다. 따라서, 12일 동안 매 48시간마다 계속해서 엑소좀을 수확하였다. 추가의 처리를 위해 수확물들을 -80℃로 보관하였다. 각 수확물을 멸균성 (혐기성 및 호기성 박테리아에 대해 음성으로 확인됨), 내독소 (< 1EU/㎖) 및 마이코플라스마 (PCR, 음성)에 대하여 시험하였다. 이어서, 상기 수집군들을 4℃에서 밤새 해동시키고, 모아서 코베 2991 세포처리기 (테루모 BCT)를 사용하여 폐쇄된 시스템 중에서 1,000g로 15분간 원심분리하였다. 원심분리 (4℃에서 15분간 1,000g)에 의해 큰 세포 잔해물을 제거한 후, 상기 조정된 배지를 0.2 ㎛ 필터의 여과용 백 (테루모 BCT)을 사용하여 폐쇄된 시스템 중에서 여과하였다. 그 후, 600 ㎖의 상청액을 주사기 및 폴리카보네이트 튜브 (베크만-쿨터)와 직접 연결된 라인을 사용하여 반폐쇄형 시스템 중에서 6개의 투명한 폴리카보네이트 튜브들 (각 튜브는 100 ㎖ 용량임)로 옮기고, 밀봉하여 45 Ti 타입의 로터 (베크만-쿨터) 중에서 100,000 g로 3시간 동안 원심분리하였다. 상기 과정을 3회 반복하여 모든 수집군들을 회전시켰다 (총 1500 ㎖). 이후, 상기 상청액을 펌프에 연결된 16G 주사기 (BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 14-826-18B)를 사용하여 흡인하였다. 상기 엑소좀 펠릿을 18G 주사기 (BD, 카탈로그 번호 408360)를 사용하여 (튜브 당) 4 ㎖의 임상 버퍼 중에 수동으로 재현탁시킨 후, 멸균 유리 용기 [APP 파마(APP Pharma) 제조, 용량 30 ㎖)로 옮겼다. 모든 원심분리가 완료될 때까지 이를 72시간 까지 4℃로 유지시켰다. 모든 원심분리가 완료되었을 때, 재현탁시킨 엑소좀의 모아진 최종 부피는 72 ㎖였다. 모아진 MSC 엑소좀을 NanoSight^TM (0.5 ㎖), 유세포분석 (1 ㎖)에 의해 분석하고, 내독소 (모은 샘플 0.5 ㎖ 사용) 및 멸균성 (상술한 바와 같이 모은 샘플 1 ㎖ 사용)에 대하여 시험하였다. 상기 엑소좀 (69 ㎖의 최종 부피)을 마지막으로 각각 (2 ㎖)로 함유하는 저온유리 바이알에 분취한 후, -80℃로 보관하였다. 향후 임상 제품의 제조를 위해, 상기 엑소좀은 대규모 전기천공을 위해 직접 가공처리된 후(자세한 내용은 아래 참조), 분취되어 -80℃로 보관될 것이다.

NTA를 사용한 입자 크기 및 농도 분포의 측정: 분리된 엑소좀 현탁액을 NanoSight™ LM 10 장비 [나노사이트 리미티드(NanoSight Ltd) 제조]를 사용하여 분석하였다. 분석 설정은 최적화하여 샘플들 간에 일정하게 유지하였고, 각 비디오를 분석하여 각 입자 크기에 대한 평균치, 최빈치, 중간치 및 추정 농도를 제공하였다.

microBCA 분석에 의한 엑소좀의 정량: CB 중에 재현탁시킨 MSC 엑소좀을 1XPBS로 세척한 후, SW 41 Ti 타입의 로터 (베크만 쿨터) 중에서 100,000g로 3시간 동안 초원심분리하였다. 상기 세척된 MSC 엑소좀을 NanoSight^TM로 재차 측정한 후, 제조업체의 설명서에 따라 microBCA 단백질 분석 시약 키트 (써모 사이언티픽)를 사용하여 총 단백질 함량을 분석하였다.

엑소좀의 전기천공: 총 0.5×10¹²개의 MSC 유래 엑소좀 및 0.5 mg의 siRNA 공급원 2 (Avecia)를 20 ㎖의 임상 버퍼 중에서 혼합하였다. 폐쇄된 시스템 중에서 4D 뉴클레오펙터 LV 유닛 (Lonza)을 사용하여 상기 엑소좀들을 전기천공시켰다. LV Nucleocuvette™ 카트리지는 최대 20 ㎖까지 전기천공이 가능한 새로운 큐벳 시스템이다. 상기 카트리지는 2개의 저장소 백 (주입 및 배출), 및 상기 카트리지를 시간당 1 ㎖로 채우는 연동 펌프에 연결되어 있다. 상기 배출 백은 전체 절차를 진행하는 동안 얼음 상에서 유지하며, 절차를 완료하는데는 약 10분이 걸린다. 전기천공 후, 상기 엑소좀들을 (상술한 바와 같이) NanoSight^TM에 의해 분석하고, 내독소 및 멸균성에 대해 시험한 후, 저온바이알에 분취하여 -80℃로 보관하였다. 이어서, 상기 엑소좀들을 얼음에서 해동시키고, 차후 시험관내 및 생체내 실험에 사용하였다. 시험관내 실험을 위해, 상기 엑소좀들을 아래 설명된 다운스트림 적용을 위해 희석시켰다. 생체내 실험을 위해, 109개의 전기천공된 엑소좀들을 100 ㎕의 연구 버퍼 또는 임상 버퍼 중에 희석시켰다.

전자 현미경: 최적 농도로 고정시킨 시험편들을 300 메쉬의 탄소/포름바(formvar)로 코팅된 그리드 상에 놓고 최소 1분간 상기 포름바에 흡수시켰다. 그리드를 PBS로 헹군 후, 0.1M 인산염 버퍼 중의 2.5% 글루타르알데히드에 15분간 두었다. 상기 그리드 PBS 및 증류수에서 세정하여 건조시킨 후, 대조를 위해 우라닐 아세테이트를 사용하여 염색하였다. 상기 샘플들을 Tecnai Bio Twin 투과 전자 현미경 (미국 오리건주 힐스버러 소재의 FEI)으로 관찰하고, 영상을 AMT CCD 카메라 [미국 매사추세츠주 댄버스 소재의 어드밴스드 마이크로스코피 테크닉스(Advanced Microscopy Techniques)로 촬영하였다.

엑소좀의 유세포 분석: MSC 유래의 엑소좀을 상술한 바와 같이 분리한 후, 200㎕의 PBS에 재현탁시켰다. 알데히드/설페이트 비드 (10 ㎕, 라이프 테크놀로지스)를 상기 용액에 첨가하고, 비드와 엑소좀 혼합물을 벤치탑 회전기를 사용하여 실온에서 15분간 혼합되도록 하였다. 그 후, PBS (600 ㎕)를 상기 용액에 첨가한 후, 4℃에서 밤새 혼합을 지속하였다. 1M의 글리신 (400 ㎕)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 혼합을 지속하였다. 다음으로, 상기 혼합물을 1분간 8,000g로 회전량을 감소시켰다. 이후, 상기 침전물을 PBS 중 100 μL의 10% BSA에 재현탁시킨 후, 실온에서 45분간 혼합하였다. 상기 혼합물을 8,000 g로 1분간 회전량을 감소시킨 후, 상청액을 흡인시켰다. 그 후, 엑소좀들이 부착된 비드들 (펠릿)을 PBS 중 20㎕의 2% BSA에 재현탁시킨 후, CD47, CD63, CD81, CD9, CD29, CD90 또는 동형의 대조군에 대하여 면역표지화하였다. 비드에 결합된 엑소좀들을 1 ㎕의 항-CD47 항체 (e바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 14-0479) 또는 1 ㎕의 항-CD63 (BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 556019) 또는 1 ㎕의 항-CD81 항체 (BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 555675), 또는 1 ㎕의 항-CD9 항체 (시그마, 카탈로그 번호 SAB4700092), 또는 1 ㎕의 항-CD29 항체 (바이오레전드, 카탈로그 번호 303001), 또는 1 ㎕의 항-CD90 항체 a (바이오레전드, 카탈로그 번호 328101), 또는 κ 동형 대조군 항체인 1 ㎕의 마우스 IgG1 (BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 555746)과 함께 20 ㎕의 부피로 항온배양한 후, 실온에서 30분간 혼합하였다. 이어서, 상기 혼합물을 8,000g로 1분간 원심분리하여 상청액을 흡인한 후, 펠릿을 PBS 중 2% BSA 20 ㎕에 재현탁시켰다. 그 후, 1 ㎕의 2차 항체 (인비트로겐, 카탈로그 번호 A21202)를 상기 샘플 및 동형 대조군에 첨가하였다. 다음으로, 모든 샘플들을 실온에서 1시간 동안 혼합하였다. 이후, 상기 샘플들을 8,000g로 1분간 원심분리하여 상청액을 흡인한 후, 펠릿을 PBS 중 2% BSA 200 ㎕에 재현탁시켰다. 비드에 결합된 엑소좀들을 PBS 중 2% BSA로 3회 세척하였다. LSR Fortessa X-20 세포 분석기를 사용하여 엑소좀 마커 (CD9, CD63 및 CD81, CD47) 및 중간엽 마커 (CD29 및 CD90)의 발현을 분석하였다. FlowJoR 소프트웨어 [트리스타 인코포레이티드(TreeStar Inc.) 제조]를 사용하여 데이터를 분석하였다. 상기 유세포분석 데이터는 각 실험의 동형 대조군과 샘플을 모두 함께 수집하였다. 상기 유세포분석 실험은 동일한 엑소좀 제제를 사용하여 2회 독립적으로 반복하였다.

* * *

본원에 개시되어 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 미루어 보면 과도한 실험없이 준비하여 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 바람직한 실시양태의 측면에서 기재하였으나, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 방법 및 이러한 방법의 단계 또는 상기 단계들의 순서에 다양한 변화들을 적용할 수 있음은 당업계의 통상의 기술자들에게는 자명한 사항일 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련이 있는 특정 제제들은, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있는 것이라면 본원에 기술된 제제들을 대신할 수 있음은 자명한 사항일 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.

참고문헌

하기의 참고문헌들은, 본 명세서에 기재된 예시적인 절차 또는 기타 세부적인 내용을 제공하는 하는 범위 내에서, 본원에 참고로 인용된다.

Claims (77)

1. 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 엑소좀을 제조하는 방법으로서,
   (a) 기능적으로 폐쇄된 생물반응기 중의 상기 MSC를 인간 혈소판 용해물 (PLT)을 포함하는 배지에서 75 내지 95%의 전면생장률(confluency)까지 배양하는 단계;
   (b) 본질적으로 PLT가 없는 배지 중에서 상기 세포를 추가로 배양하는 단계;
   (c) 상기 생물반응기로부터 조정된 배지(conditioned media) 분획을 수집하는 단계; 및
   (d) 상기 조정된 배지 분획으로부터 엑소좀을 분리하는 단계
   를 포함하는 것인, 방법.
2. 제1항에 있어서, 각각의 조정된 배지 분획을 수집한 후 -80℃로 보관하는 것인, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 조정된 배지 분획을 단계 (d) 전에 해동하여 모아두는 것인, 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 MSC가 골수 유래의 MSC로서 추가로 정의되는 것인, 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 MSC가 지방 유래의 MSC로서 추가로 정의되는 것인, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 전에 생물반응기에 적어도 1×10⁷ 개의 MSC를 분주하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 MSC를 약 400-500개의 세포/cm²의 밀도로 분주하는 것인, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐쇄된 생물반응기가 중공사 생물반응기인 것인, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 중공사 생물반응기가 테루모(Terumo) 세포 증식 시스템인 것인, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PLT가 단계 (a)의 배지 중에 5%의 농도로 존재하는 것인, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 새로운 배지를 생물반응기의 MSC에 연속적으로 첨가하는 것인, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 5%의 산소에서 배양하는 것인, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 배양이 5-10일간 수행되는 것인, 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 단계 (a)의 배양이 8일간 수행되는 것인, 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 MSC가 80-90%의 전면생장률까지 배양되는 것인, 방법.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC가 85-90%의 전면생장률까지 배양되는 것인, 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 배양이 24-72시간 동안 수행되는 것인, 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 단계 (b)의 배양이 48시간 동안 수행되는 것인, 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 배지가 PLT를 함유하지 않는 것인, 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC를 단계 (a)와 (b) 사이에 세척하는 것인, 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC를 무혈청의 합성(defined) 배지에서 배양하는 것인, 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)-(d)를 무혈청 조건 하에 수행하는 것인, 방법.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조정된 배지 분획을 밀봉한 백(bag)에 수집하는 것인, 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조정된 배지 분획을 매 24-72시간마다 수집하는 것인, 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 조정된 배지 분획을 매 40-50시간마다 수집하는 것인, 방법.
26. 제24항에 있어서, 상기 조정된 배지 분획을 매 48시간마다 수집하는 것인, 방법.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조정된 배지 분획의 부피가 각각 200-300 mL인 것인, 방법.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조정된 배지 분획을 매 10-14일마다 수집하는 것인, 방법.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조정된 배지 분획을 매 12일마다 수집하는 것인, 방법.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 5개의 조정된 배지 분획을 수집하는 것인, 방법.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)-(d)를 3주 미만으로 수행하는 것인, 방법.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 조정된 배지 분획이 9×10¹¹ 내지 50×10¹¹ 개의 엑소좀을 포함하는 것인, 방법.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 10×10¹² 개의 엑소좀이 단계 (c)에서 분리되는 것인, 방법.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 15×10¹² 개의 엑소좀이 단계 (c)에서 분리되는 것인, 방법.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 분리가 모아둔 분획들을 여과 및 초원심분리하여 엑소좀 함유 펠릿을 수득하고, 상기 엑소좀 함유 펠릿을 버퍼 중에 재현탁시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
36. 제35항에 있어서, 분리가, 펌프 및 열 밀봉 배관을 사용하여 기능적으로 폐쇄된 방식으로 수행되는 것인, 방법.
37. 제35항에 있어서, 여과가, 모아둔 분획들을 0.2 ㎛ 필터를 통해 통과시키는 것으로 추가로 정의되는 것인, 방법.
38. 제35항에 있어서, 분리가, 큰 세포 잔해물을 제거하기 위해 여과 전 원심분리 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 분리를 4℃에서 수행하는 것인, 방법.
40. 제35항에 있어서, 상기 버퍼가 0.09 M의 염화나트륨, 0.23 M의 글루콘산나트륨, 0.27 M의 아세트산나트륨 삼수화물, 5 mM의 염화칼륨 및 3 mM의 염화마그네슘을 포함하는 것인, 방법.
41. 제35항 또는 제40항에 있어서, 상기 버퍼의 pH가 7.4인 것인, 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 버퍼가 PLASMALYTE-A®인 것인, 방법.
43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀에 치료제를 로딩하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 치료제가 하나 이상의 사이토카인, 화학요법제, 핵산, 소분자 또는 단백질을 포함하는 것인, 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 핵산이 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 것인, 방법.
46. 제45항에 있어서, 상기 RNA가 siRNA, miRNA 또는 shRNA인 것인, 방법.
47. 제45항에 있어서, 상기 RNA가 siRNA인 것인, 방법.
48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩이 엑소좀을 전기천공하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
49. 제48항에 있어서, 전기천공을 PLASMALYTE-A® 중에서 수행하는 것인, 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 방법이 단계 (d)와 전기천공 단계 사이에 엑소좀 세척 단계 또는 버퍼 교환 단계를 포함하지 않는 것인, 방법.
51. 제50항에 있어서, 단계 (d)에서의 엑소좀의 개수에서 로딩된 엑소좀의 개수까지 20% 이상 감소하지 않는 것인, 방법.
52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물.
53. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 엑소좀의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 것인, 방법.
55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 전기천공된 엑소좀을 대상체에 직접 주입하는 것인, 방법.
56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 항암 요법을 실시하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
57. 제56항에 있어서, 상기 적어도 제2 항암 요법이 화학요법, 방사선요법, 유전자 요법, 수술, 호르몬 요법, 항혈관형성 요법 또는 면역요법을 포함하는 것인, 방법.
58. 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 RNA가 로딩된 엑소좀의 유효량을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포에 RNA를 전달하는 방법.
59. 제58항에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인 것인, 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 세포가 암세포 또는 T 세포인 것인, 방법.
61. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 엑소좀의 유효량을 질병 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법.
62. 제61항에 있어서, 상기 엑소좀에 siRNA 또는 miRNA를 로딩하는 것인, 방법.
63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 질병 또는 장애가 암, 염증성 질환 또는 면역 관련 장애인 것인, 방법.
64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 폐암인 것인, 방법.
65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀에 KRAS siRNA를 로딩하는 것인, 방법.
66. 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 것인, 방법.
67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀을 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 내시경, 경피, 피하, 국지 또는 직접 주사에 의해 투여하는 것인, 방법.
68. 제67항에 있어서, 상기 엑소좀을 정맥내 투여하는 것인, 방법.
69. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
70. 제69항에 있어서, 상기 적어도 제2 치료제가 항암제인 것인, 방법.
71. 제70항에 있어서, 상기 항암제가 화학요법제, 방사선요법제, 유전자 요법제, 수술, 호르몬 요법제, 항혈관형성 요법제 또는 면역요법제인 것인, 방법.
72. 제1항에 따라 제조된 MSC 유래의 엑소좀의 치료적 유효량을 면역 매개성 염증성 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체의 면역 매개성 염증성 질환을 치료하는 방법.
73. 제72항에 있어서, 상기 면역 매개성 염증성 질환이 류머티스 관절염 (RA), 염증성 장질환 (IBD) 및 크론병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 MSC가 동종이계성인 것인, 방법.
75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀을 전신 또는 국소적으로 투여하는 것인, 방법.
76. 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀을 직장, 비강, 협측, 질, 피하, 피부내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척수강내, 병변내 또는 두개내 경로를 통해, 또는 이식된 저장소를 통해서 투여하는 것인, 방법.
77. 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀을 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 투여하는 것인, 방법.

Images