CN113430163A - 一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及制备方法，包括：对组织块进行平皿贴壁培养，所得间充质干细胞制备成间充质干细胞悬液；将间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中进行中空纤维培养，收集中空纤维培养装置外空间培养上清液；对培养上清液进行离心、过滤，提取外泌体。将提取的外泌体与氯化钠、普鲁兰、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、白蛋白、丝蛋白和华通氏胶，制成外泌体冻干剂。本发明的中空纤维培养法培养细胞模拟细胞体内生长环境，实现了细胞与细胞之间相互作用，互相刺激，所得外泌体的种类更多、浓度更高、外泌体提取量更大、操作更方便，满足表皮细胞所需的营养物质。

Description

一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及 制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及制备方法，具体涉及一种基于中空纤维培养法培养间充质干细胞提取外泌体的方法，以及基于外泌体所制备的外泌体冻干剂，以及该外泌体冻干剂的制备方法。

背景技术

目前细胞培养方法主要以平面培养为主，传统的细胞平面培养法培养细胞，细胞的生长方式与机体内的立体环境差别很大，导致细胞形态、分化、细胞与基质间的相互作用以及细胞间的相互作用与体内生理条件下细胞的行为存在显著差异，细胞平面培养法培养细胞诸多生理指标显著不同。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及制备方法。

本发明第一目的提供一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法，包括：

对组织块进行平皿贴壁培养，所得间充质干细胞制备成间充质干细胞悬液；

将所述间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中进行中空纤维培养，收集所述中空纤维培养装置外空间培养上清液；

对所述培养上清液进行离心、过滤，提取外泌体。

作为本发明的进一步改进，所述组织块的来源为脐带。

作为本发明的进一步改进，所述对组织块进行平皿贴壁培养，所得间充质干细胞制备成间充质干细胞悬液；包括：

组织块用0.125％-0.25％胰酶消化8min-15min，离心300g-450g、5min-10min，离心完毕后去掉上清液，留下组织；

将组织分成1mm-5mm大小的组织块进行平皿贴壁，将平皿倒置搁放37℃、CO₂培养箱20min-30min，每皿加入3ml-5ml DMEM培养基培养；

连续培养每隔1天半量换液，收集培养液，待细胞贴壁，去除组织块，收集培养液；

每皿待贴壁细胞生长至融合度80％以上，收集培养液，用PBS缓冲液清洗，0.125％-0.25％胰酶消化，去除胰酶，将细胞传至培养瓶中继续传代培养，细胞传代扩增至2代之后，收集培养液，用PBS清洗，0.125％-0.25％胰酶消化，去除胰酶，制备成含DMEM培养基的间充质干细胞悬液。

作为本发明的进一步改进，所述中空纤维培养的方法为：

将所述间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中培养，每2-5天收集培养上清液，并更换新鲜的培养基；

培养至28-35天后终止培养，连续培养过程中收集中空纤维培养装置外空间培养上清液。

作为本发明的进一步改进，所述中空纤维培养的具体方法为：

中空纤维培养装置由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵组成，各部分有硅胶管连接，形成一个回路的封闭生物安全系统符合cGMP标准适用于细胞培养；当蠕动泵工作时，培养基在回路中循环起来，细胞接种于纤维的外空间(即中空纤维外表面与生物反应器内表面之间的空间里)；培养基流过中空纤维时，迫使培养基一部分直接通过中空纤维内腔，另一部分穿过中空纤维的壁进入纤维外空间，然后又流回中空纤维内腔；这样使附着在中空纤维上的细胞处于流动着的培养基中，培养基有效地向细胞提供营养物质、氧气等，同时不断将代谢废物带走，避免其堆积起来对细胞造成不良的影响，从而为培养的细胞提供一个近似生理条件的微环境以及一个三维的支持基质。细胞在这样的条件下生长、分裂，形成类似组织的多层细胞当蠕动泵停止时，通过打开外空间连接硅胶管将高浓度细胞外泌体取出，然后封闭空间继续工作。

作为本发明的进一步改进，所述对所述培养上清液进行离心、过滤，提取外泌体；包括：

将所述培养上清液在300g～400g离心10min～20min，收集上清液，弃沉淀；

收集的上清液在2000g-3000g离心40min～60min，继续收集上清液，弃沉淀；

收集的上清液用0.22μm孔径过滤器进行过滤，收集过滤液；

在超滤装置上超滤上清液，滤膜的孔径为30-60nm；

超滤完毕后，加入PBS缓冲液并再次超滤，重复3-5次；用PBS缓冲液洗涤滤膜上的外泌体，制得外泌体浓缩液，并进行冷藏保存。

本发明第二目的提供一种外泌体冻干剂，包括：

外泌体、氯化钠、普鲁兰、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、白蛋白、丝蛋白和华通氏胶。

作为本发明的进一步改进，按外泌体的重量百分比计，各成分的加入量包括：

0.9％氯化钠、1％-5％普鲁兰、1％-5％海藻糖、1％-5％甘露醇、5％-10％右旋糖酐、0.5％-1％葡萄糖、0.5％-1％乳酸钠、氯化钾、5％-10％白蛋白、1％-5％丝蛋白和2％-5％华通氏胶。

本发明第三目的提供一种外泌体冻干剂的制备方法，包括：

在外泌体中加入普鲁兰、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、白蛋白、丝蛋白和华通氏胶；

用0.22μm滤膜过滤，分装后，三秒内瞬间液氮冻干休眠；

用超真空冷冻干燥箱，将活性物在真空环境下干燥6小时，将冻干获得的试剂中所含的冰结晶升华排出，最终得到疏松多孔，遇水即崩解冻干产品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的中空纤维培养法培养细胞模拟细胞体内生长环境，实现了细胞与细胞之间相互作用，互相刺激，所得外泌体的种类更多、浓度更高、外泌体提取量更大、操作更方便，满足表皮细胞所需的营养物质；

本发明的中空纤维培养法下培养环境更近似与体内的立体环境，细胞吸附、伸展和生长，细胞形态和极性，基因与蛋白的表达，存活、增值、运动、细胞代谢等功能更接近体内的立体环境，细胞分泌的外泌体的种类也更接近与人体所需；

本冻干剂通过添加华通氏胶作为冻干保护剂，添加的华通氏胶可以将附着在丝蛋白表面的细胞外泌体的活性物进行较好的包裹，使得细胞外泌体能够较好的保存，使得在整个冻干过程中提高细胞外泌体的活性率。

本冻干剂通过添加丝蛋白作为活性物保护剂，丝蛋白其分子量较大，有良好的成膜性能，使外泌体能够较好的附着在丝蛋白表面，使得外泌体活性物的活性得以较好，较长时间的保持。同时由于丝蛋白属于营养活性物，有利于维持皮肤表面细胞的正常功能、获得良好的保湿、吸湿性能，使皮肤细胞更高效的吸收外泌体。

附图说明

图1为本发明一种实施例公开的培养间充质干细胞提取外泌体的方法的流程图；

图2为本发明一种实施例公开的中空纤维培养的原理图；

图3为本发明一种实施例公开的所提取的外泌体纯化后以NTA分析的浓度-蛋白大小示意图；

图4为本发明一种实施例公开的外泌体的透射电镜图；

图5为本发明一种实施例公开的细胞平面培养与中空纤维培养外泌体浓度对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：

如图1所示，本发明提供一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法，包括：

S1、对组织块进行平皿贴壁培养，得到间充质干细胞制备成间充质干细胞悬液；

具体的实现方法为：

取来源为脐带的组织块，组织块用0.125％-0.25％胰酶消化8min-15min，离心300g-450g、5min-10min，离心完毕后去掉上清液，留下组织；将组织分成1mm-5mm大小的组织块进行平皿贴壁，将平皿倒置搁放37℃、CO₂培养箱20min-30min，每皿加入3ml-5ml DMEM培养基培养；连续培养每隔1天半量换液，收集培养液，待细胞贴壁，去除组织块，收集培养液；待贴壁细胞生长至融合度80％以上，收集培养液，用PBS缓冲液清洗，0.125％-0.25％胰酶消化，去除胰酶，将细胞传至培养瓶中继续传代培养，细胞传代扩增至2代之后，收集培养液，用PBS清洗，0.125％-0.25％胰酶消化,去除胰酶，制备含DMEM培养基的间充质干细胞悬液。

S2、将间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中进行中空纤维培养，收集中空纤维培养装置外空间培养上清液；

中空纤维培养的方法为：

将间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中培养，每2-5天收集培养上清液，并更换新鲜的培养基；培养至28-35天后终止培养，连续培养过程中收集中空纤维培养装置外空间培养上清液。

具体方法为：

如图2所示，中空纤维培养装置由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵组成，各部分有硅胶管连接，形成一个回路的封闭生物安全系统符合cGMP标准适用于细胞培养；当蠕动泵工作时，培养基在回路中循环起来，细胞接种于纤维的外空间(即中空纤维外表面与生物反应器内表面之间的空间里)；培养基流过中空纤维时，迫使培养基一部分直接通过中空纤维内腔，另一部分穿过中空纤维的壁进入纤维外空间，然后又流回中空纤维内腔；这样使附着在中空纤维上的细胞处于流动着的培养基中，培养基有效地向细胞提供营养物质、氧气等，同时不断将代谢废物带走，避免其堆积起来对细胞造成不良的影响，从而为培养的细胞提供一个近视生理条件的微环境以及一个三维的支持基质。细胞在这样的条件下生长、分裂，形成类似组织的多层细胞当蠕动泵停止时，通过打开外空间连接硅胶管将高浓度细胞外泌体取出，然后封闭空间继续工作。

S3、对培养上清液进行离心、过滤，提取外泌体；

具体为：

将培养上清液在300g～400g离心10min～20min，收集上清液，弃沉淀；收集的上清液在2000g-3000g离心40min～60min，继续收集上清液，弃沉淀；收集的上清液用0.22μm孔径过滤器进行过滤，收集过滤液；在超滤装置上超滤上清液，滤膜的孔径为30-60nm；超滤完毕后，加入PBS缓冲液并再次超滤，重复3-5次；用PBS缓冲液洗涤滤膜上的外泌体，制得外泌体浓缩液，并进行冷藏保存。

本发明还提供一种外泌体冻干剂，包括：

外泌体、氯化钠、普鲁兰、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、白蛋白、丝蛋白和华通氏胶。

按外泌体的重量百分比计，各成分的加入量包括：

0.9％氯化钠、1％-5％普鲁兰、1％-5％海藻糖、1％-5％甘露醇、5％-10％右旋糖酐、0.5％-1％葡萄糖、0.5％-1％乳酸钠、氯化钾、5％-10％白蛋白、1％-5％丝蛋白和2％-5％华通氏胶。

本发明还提供一种外泌体冻干剂的制备方法，包括：

在外泌体中加入普鲁兰、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、白蛋白、丝蛋白和华通氏胶；

用0.22μm滤膜过滤，分装后，三秒内瞬间液氮冻干休眠；

用超真空冷冻干燥箱，将活性物在真空环境下干燥6小时，将冻干获得的试剂中所含的冰结晶升华排出，最终得到疏松多孔，遇水即崩解冻干产品。

试验：

如图3-5及表1，将本发明的培养方法与平面培养方法进行试验对比：

表1

本发明提供的培养方法提取外泌体较平面培养提取外泌体所需要的培养基更少、所提取的外泌体浓度更高、种类更多。

如图3所示，平面培养间充质干细胞外泌体提取纯化后以NTA分析(黑线)与中空纤维培养间充质干细胞外泌体提取纯化后以NTA分析对(红线)比结果

如图5所示，在部分蛋白表达中平面培养的间充质干细胞分泌的外泌体更少甚至没有，而中空纤维培养的间充质干细胞所分泌的外泌体浓度更高、种类更多。

本发明的优点为：

本发明的中空纤维培养法培养细胞模拟细胞体内生长环境，实现了细胞与细胞之间相互作用，互相刺激，所得外泌体的种类更多、浓度更高、外泌体提取量更大、操作更方便，满足表皮细胞所需的营养物质；

本发明的中空纤维培养法下培养环境更近似与体内的立体环境，细胞吸附、伸展和生长，细胞形态和极性，基因与蛋白的表达，存活、增值、运动、细胞代谢等功能更接近体内的立体环境，细胞分泌的外泌体的种类也更接近与人体所需；

本冻干剂通过添加华通氏胶作为冻干保护剂，添加的华通氏胶可以将附着在丝蛋白表面的细胞外泌体的活性物进行较好的包裹，使得细胞外泌体能够较好的保存，使得在整个冻干过程中提高细胞外泌体的活性率。

本冻干剂通过添加丝蛋白作为活性物保护剂，丝蛋白其分子量较大，有良好的成膜性能，使外泌体能够较好的附着在丝蛋白表面，使得外泌体活性物的活性得以较好，较长时间的保持。同时由于丝蛋白属于营养活性物，有利于维持皮肤表面细胞的正常功能、获得良好的保湿、吸湿性能，使皮肤细胞更高效的吸收外泌体。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法，其特征在于，包括：

对组织块进行平皿贴壁培养，所得间充质干细胞制备成间充质干细胞悬液；

将所述间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中进行中空纤维培养，收集所述中空纤维培养装置外空间培养上清液；

对所述培养上清液进行离心、过滤，提取外泌体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织块的来源为脐带。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述对组织块进行平皿贴壁培养，所得间充质干细胞制备成间充质干细胞悬液；包括：

组织块用0.125％-0.25％胰酶消化8min-15min，离心300g-450g、5min-10min，离心完毕后去掉上清液，留下组织；

将组织分成1mm-5mm大小的组织块进行平皿贴壁，将平皿倒置搁放37℃、CO₂培养箱20min-30min，每皿加入3ml-5ml DMEM培养基培养；

连续培养每隔1天半量换液，收集培养液，待细胞贴壁，去除组织块，收集培养液；

每皿待贴壁细胞生长至融合度80％以上，收集培养液，用PBS缓冲液清洗，0.125％-0.25％胰酶消化，去除胰酶，将细胞传至培养瓶中继续传代培养，细胞传代扩增至2代之后，收集培养液，用PBS清洗，0.125％-0.25％胰酶消化，去除胰酶制备含DMEM培养基的间充质干细胞悬液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纤维培养的方法为：

将所述间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中培养，每2-5天收集培养上清液，并更换新鲜的培养基；

培养至28-35天后终止培养，连续培养过程中收集中空纤维培养装置外空间培养上清液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述培养上清液进行离心、过滤，提取外泌体；包括：

将所述培养上清液在300g～400g离心10min～20min，收集上清液，弃沉淀；

收集的上清液在2000g-3000g离心40min～60min，继续收集上清液，弃沉淀；

收集的上清液用0.22μm孔径过滤器进行过滤，收集过滤液；

在超滤装置上超滤上清液，滤膜的孔径为30-60nm；

超滤完毕后，加入PBS缓冲液并再次超滤，重复3-5次；用PBS缓冲液洗涤滤膜上的外泌体，制得外泌体浓缩液，并进行冷藏保存。

6.一种外泌体冻干剂，其特征在于，包括：

外泌体、氯化钠、普鲁兰、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、白蛋白、丝蛋白和华通氏胶。

7.如权利要求6所述的外泌体冻干剂，其特征在于，按外泌体的重量百分比计，各成分的加入量包括：

0.9％氯化钠、1％-5％普鲁兰、1％-5％海藻糖、1％-5％甘露醇、5％-10％右旋糖酐、0.5％-1％葡萄糖、0.5％-1％乳酸钠、氯化钾、5％-10％白蛋白、1％-5％丝蛋白和2％-5％华通氏胶。

8.一种如权利要求6或7所述的外泌体冻干剂的制备方法，其特征在于，包括：

在外泌体中加入普鲁兰、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、白蛋白、丝蛋白和华通氏胶；

用0.22μm滤膜过滤，分装后，三秒内瞬间液氮冻干休眠；

用超真空冷冻干燥箱，将活性物在真空环境下干燥6小时，将冻干获得的试剂中所含的冰结晶升华排出，最终得到疏松多孔，遇水即崩解冻干产品。

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