CN105765060B - 羊膜间充质系细胞组合物的制造方法和冷冻保存方法、以及治疗剂 - Google Patents

羊膜间充质系细胞组合物的制造方法和冷冻保存方法、以及治疗剂 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供间充质系细胞组合物的制造方法，该方法仅通过一次酶处理，就能简便且无菌地分离高纯度的羊膜来源的MSC。本发明能够提供包括将羊膜用胶原蛋白酶与嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶进行酶处理的工序、以及将酶处理后的羊膜进行过筛的工序的间充质系细胞组合物的制造方法；经过冷冻保存的间充质系细胞组合物的制造方法；以及以上述间充质系细胞组合物为有效成分的移植物抗宿主病·炎性肠病·系统性红斑狼疮·肝硬化·放射性小肠炎治疗剂。

Description

羊膜间充质系细胞组合物的制造方法和冷冻保存方法、以及 治疗剂
技术领域
本发明涉及高纯度且简便地从羊膜分离适于细胞治疗应用的间充质系细胞(Mesenchymal stromal cell：MSC)，从而制造间充质系细胞组合物的方法。本发明还涉及经过冷冻保存的间充质系细胞组合物的制造方法、以及包含间充质系细胞组合物的治疗剂。
背景技术
间充质系干细胞被认为是存在于骨髓的成体干细胞，作为干细胞，具有分化成骨、软骨以及脂肪的能力。间充质系干细胞由于有望成为细胞治疗的细胞源而备受瞩目，最近，得知其还存在于胎盘、脐带、胎膜等胎儿附属物。
现在，间充质干系细胞因除了分化能力以外还具有免疫抑制能力而备受瞩目，用骨髓来源的间充质系干细胞治疗造血干细胞移植时的移植物抗宿主反应(GVHD)、以及作为炎性肠病的Crohn病的疗效有所进展。本发明人等针对胎儿附属物来源的间充质系干细胞对免疫相关疾病的临床应用进行了研究。目前为止，本发明人等公开了下述内容：胎儿附属物来源的间充质系干细胞具有与骨髓来源的间充质系干细胞同样的分化能力(非专利文献6)、胎膜来源的间充质系干细胞改善了大鼠自身免疫性心肌炎模型的病情(非专利文献7)、以及脐带来源的间充质系干细胞改善了小鼠移植物抗宿主反应(GVHD)模型的救活率(非专利文献8)。胎儿附属物来源的间充质系干细胞较骨髓来源的间充质系干细胞能够得到更多的间充质系细胞，能够短时间、低成本地大量培养，能够非侵入地进行采集，免疫抑制效果也高(非专利文献7)。由此可见，包括胎儿附属物来源的间充质系干细胞在内的MSC由于其明显的免疫抑制效果，能够用于以各种免疫相关疾病为对象的细胞治疗。
目前为止，公开了从作为胎儿附属物的胎膜、胎盘以及羊水获得人胎儿来源的多能干细胞的方法(专利文献1)。在专利文献1中，记载了将这些干细胞视为c-kit(CD117)阳性用流式细胞仪进行分离的方法。另外，还公开了从胎盘以及脐带获得能够分化为成人或小儿的各种细胞的干细胞·祖细胞的方法(专利文献2)。在专利文献2中，记载了对包含于胎盘以及脐带中的具有分化成构成各种脏器、组织的细胞的能力(＝具有间充质系细胞以上的分化能力)的干细胞·祖细胞进行分离的方法。
分离这些包含胎儿附属物来源的干细胞以及祖细胞的细胞时，通常使用胰蛋白酶、胶原蛋白酶或中性蛋白酶等分解酶(专利文献1以及2、非专利文献1～4)。在胎儿附属物中，胎膜分为与羊水接触且位于最接近胎儿侧的羊膜和位于其外侧的绒毛膜，胎膜(羊膜以及绒毛膜)来源的MSC通常也用分解酶进行分离(非专利文献1以及4)。
作为胎儿附属物的胎膜的一部分的羊膜分为与羊水接触的上皮细胞层、和位于其下且包含MSC的细胞外基质层(图1)。因此，将羊膜整体用胰蛋白酶进行处理时，不仅细胞外基质层，支持上皮细胞层的基底膜也被消化，结果，存在成为上皮细胞和MSC的混合物的问题。作为解决该问题的方法，有非专利文献1～3所示的方法：为了从羊膜高纯度地分离MSC，预先用分解酶或手工除去上皮细胞，再将剩余的细胞外基质层用分离酶进行处理，回收MSC的方法。但这些方法存在无法完全去除上皮细胞、或MSC的回收量降低等问题。
另外，将胎膜MSC根据需要用于细胞治疗用途时，必须进行冷冻保存。就目前的研究水平而言，市售有以二甲基亚砜(DMSO)为基本组成的各种细胞冷冻保存液，骨髓MSC的临床试验也使用含有10％的DMSO的冷冻保存液，但存在解冻后细胞的存活率下降的问题。
现有技术文献
[专利文献]
[专利文献1]专利第4330995号
[专利文献2]专利第3934539号
[专利文献3]日本特表第2010-518096号
[非专利文献]
[非专利文献1]Am J Obstet Gynecol.2004；190(1)：87-92.
[非专利文献2]Am J Obstet Gynecol.2006；194(3)：664-73.
[非专利文献3]Current Protocols in Stem Cell Biology 1E.5
[非专利文献4]J Tissue Eng Regen Med.2007；1(4)：296-305.
[非专利文献5]Cytotherapy.2006；8(4)：315-7.
[非专利文献6]Stem Cells.2008；26(10)：2625-33.
[非专利文献7]J Mol Cell Cardiol.2012；53(3)：420-8.
[非专利文献8]Cytotherapy.2012；14(4)：441-50.
[非专利文献9]BMC Biotechnology 2012；12：49.
发明内容
本发明要解决的技术问题
考虑到人羊膜来源的MSC的细胞制剂化，为了避免细菌·病毒等的污染，优选制造工序尽量简便。多次酶处理中途需要通过洗涤·离心操作等进行酶除去，结果会使MSC回收效率降低。另外，现有方法并不能通过利用分解酶的工序完全除去上皮细胞(非专利文献3以及实施例3)，处于依然有大量上皮细胞附着于羊膜上的状态。
另外，关于细胞保存液，由于DMSO具有细胞毒性，希望尽量降低其浓度。还公开了使用大鼠骨髓来源的MSC且降低了DMSO含量的冷冻保存液(非专利文献9)。
鉴于上述问题，本发明的课题为：提供一种仅通过一次酶处理就能简便且无菌地分离高纯度的羊膜来源的MSC，从而制造间充质系细胞组合物的方法。本发明的另一课题为：提供一种细胞凝集得到抑制且特别适于MSC移植的经过冷冻保存的间充质系细胞的制造方法。本发明的另一课题为：提供一种包含根据上述方法制造的羊膜来源的MSC的细胞治疗剂。
解决技术问题的手段
为了解决上述问题，本发明人等进行了深入研究，结果发现：利用胶原蛋白酶与嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶对羊膜进行酶处理，并将酶处理后的羊膜过筛，由此能够高纯度地分离间充质系细胞。本发明人等还发现：通过将包含间充质系细胞的混合物在含有二甲基亚砜5～10质量％、且含有羟乙基淀粉5～10质量％或葡聚糖1～5质量％的溶液中进行冷冻保存，能够制造特别适于MSC移植的经过冷冻保存的间充质系细胞。本发明人等还证实了利用上述方法得到的间充质系细胞组合物作为细胞治疗剂是有用的。基于这些发现，完成了本发明。
也就是说，本说明书提供以下发明。
(1)间充质系细胞组合物的制造方法，该方法包括：
将羊膜用胶原蛋白酶、以及嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶进行酶处理的工序；以及
将酶处理后的羊膜过筛的工序。
(2)(1)所记载的间充质系细胞组合物的制造方法，其还包括：
回收过筛后的细胞的工序；以及
将回收的细胞进行培养的工序。
(3)(2)所记载的间充质系细胞组合物的制造方法，上述回收过筛后的细胞的工序为下述工序：用2倍或2倍以上量的培养基或平衡盐溶液将滤液进行稀释以后，通过离心分离来回收间充质系细胞。
(4)(1)～(3)中任一项记载的间充质系细胞组合物的制造方法，其中，胶原蛋白酶的浓度为50CDU/ml～1000CDU/ml、嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶的浓度为100PU/ml～800PU/ml。
(5)(1)～(4)中任一项记载的间充质系细胞组合物的制造方法，其中，酶处理的工序为在30～40℃进行30分钟以上处理的工序。
(6)(1)～(5)中任一项记载的间充质系细胞组合物的制造方法，其中，酶处理的工序为用搅拌器或振荡器以10rpm/分钟～100rpm/分钟搅拌30分钟以上的工序。
(7)(1)～(6)中任一项记载的间充质系细胞组合物的制造方法，其中，羊膜是通过剖腹产而得到的。
(8)(1)～(7)中任一项记载的间充质系细胞组合物的制造方法，其中，筛的孔径为40～200μm。
(9)(1)～(8)中任一项记载的间充质系细胞组合物的制造方法，将羊膜过筛的工序为自然落下。
(10)间充质系细胞组合物，其中，CD324以及CD326阳性上皮细胞的含有率为20％以下、CD90阳性细胞的含有率为75％以上、且活细胞率为80％以上。
(11)(10)所记载的间充质系细胞组合物，其是通过(1)～(9)中任一项记载的间充质系细胞组合物的制造方法而得到的。
(12)间充质系细胞培养组合物，其是将(10)或(11)所记载的间充质系细胞组合物用含有高于0.05质量％且为5质量％以下的白蛋白的培养基进行培养而得到的。
(13)经过冷冻保存的间充质系细胞的制造方法，该方法包括：将包含间充质系细胞的混合物在含有二甲基亚砜5～10质量％、含有羟乙基淀粉5～10质量％或葡聚糖1～5质量％的溶液中进行冷冻保存的工序。
(14)(13)所记载的经过冷冻保存的间充质系细胞的制造方法，其中，上述溶液为还含有高于0质量％且5质量％以下的人白蛋白的溶液。
(15)(13)或(14)所记载的经过冷冻保存的间充质系细胞的制造方法，其中，上述间充质系细胞是：根据(1)～(9)中任一项记载的方法制造的间充质系细胞组合物中所包含的间充质系细胞、(10)或(11)所记载的间充质系细胞组合物中所包含的间充质系细胞、或(12)所记载的间充质系细胞培养组合物中所包含的间充质系细胞。
(16)制造间充质系细胞给药用组合物的方法，该方法包括：将根据(13)～(15)中任一项记载的方法而得到的经过冷冻保存的间充质系细胞解冻后，用输液制剂稀释2倍以上的工序。
(17)细胞治疗剂，其含有(10)或(11)所记载的间充质系细胞组合物、和/或(12)所记载的间充质系细胞培养组合物、和/或根据(16)所记载的方法而制造的间充质系细胞给药用组合物作为有效成分。
(18)(17)所记载的细胞治疗剂，其为注射用制剂。
(19)(17)所记载的细胞治疗剂，其为细胞团块或片状结构的移植用制剂。
(20)(17)～(19)中任一项记载的治疗剂，其为选自下述疾病的治疗剂：移植物抗宿主病、炎性肠病、系统性红斑狼疮、肝硬化、或放射性小肠炎。
(21)疾病的治疗方法，该方法包括：对需要进行细胞治疗的患者给药(10)或(11)所记载的间充质系细胞组合物、和/或(12)所记载的间充质系细胞培养组合物、和/或(16)所记载的方法而制造的间充质系细胞给药用组合物。
(22)(21)所记载的治疗方法，其中，组合物为注射用制剂。
(23)(21)所记载的治疗方法，其中，组合物为细胞团块或片状结构的移植用制剂。
(24)(21)～(23)中任一项记载的治疗方法，其中，疾病为选自移植物抗宿主病、炎性肠病、系统性红斑狼疮、肝硬化、或放射性小肠炎的疾病。
发明的效果
本发明能够简易且高精度地分离人羊膜来源的MSC。因此，本发明有望促进在再生医疗领域展现出有效性的MSC的产业利用。
附图说明
[图1]人羊膜的组织图。
[图2]为说明本实施方式的羊膜来源MSC的分离法的概况的图。
[图3]为在使胶原蛋白酶的浓度恒定而改变嗜热菌蛋白酶的浓度的情况下，由人羊膜的酶处理而得到的细胞的表面抗原标记物表达解析结果。
[图4]为在使胶原蛋白酶的浓度恒定而改变嗜热菌蛋白酶的浓度的情况下，人羊膜的酶处理后滤器上残留的组织的HE染色图像。
[图5]为在完全不含胶原蛋白酶而改变嗜热菌蛋白酶的浓度的情况下，由人羊膜的酶处理得到的细胞的表面抗原标记物表达解析结果。
[图6]为在完全不含胶原蛋白酶而改变嗜热菌蛋白酶的浓度的情况下，人羊膜的酶处理后滤器上残留的组织的HE染色图像。
[图7]为在使用了胰蛋白酶的情况下，由人羊膜的酶处理得到的细胞的表面抗原标记物表达解析结果。
[图8]为在使用了胰蛋白酶的情况下，人羊膜的酶处理后滤器上残留的组织的HE染色图像。
[图9]为在将嗜热菌蛋白酶浓度固定为250PU/ml而改变胶原蛋白酶浓度时，人羊膜的酶处理后滤器上残留的组织的HE染色图像。
[图10]为在将嗜热菌蛋白酶浓度固定为500PU/ml而改变胶原蛋白酶浓度时，人羊膜的酶处理后滤器上残留的组织的HE染色图像。
[图11]为在使胶原蛋白酶的浓度恒定而改变中性蛋白酶的浓度时，由人羊膜的酶处理得到的细胞的表面抗原标记物表达解析结果。
[图12]为在使胶原蛋白酶的浓度恒定而改变中性蛋白酶的浓度时，人羊膜的酶处理后滤器上残留的组织的HE染色图像。
[图13]为在完全不含胶原蛋白酶而改变中性蛋白酶的浓度的情况下，由人羊膜的酶处理得到的细胞的表面抗原标记物表达解析结果。
[图14]为在完全不含胶原蛋白酶而改变中性蛋白酶的浓度的情况下，人羊膜的酶处理后滤器上残留的组织的HE染色图像。
[图15]为在将中性蛋白酶浓度固定为250PU/ml而改变胶原蛋白酶浓度时，人羊膜的酶处理后滤器上残留的组织的HE染色图像。
[图16]为将由各种冷冻保存液急速解冻后的羊膜来源的MSC接种于塑料多孔板后经过24小时的照片。
[图17]为将由各种冷冻保存液急速解冻后的羊膜来源的MSC接种于塑料多孔板后经过48小时的照片。
[图18]羊膜来源的MSC移植对小鼠急性GVHD模型的治疗效果在小鼠体重经时变化率方面的体现。
[图19]羊膜来源的MSC移植对大鼠炎性肠病模型的治疗效果在疾病经时活性的变化、以及治疗第5日大肠长度方面的体现。
[图20]羊膜来源的MSC移植对小鼠系统性红斑狼疮模型的治疗效果在尿蛋白的经时变化方面的体现。
[图21]羊膜来源的MSC移植对大鼠肝硬化模型的治疗效果在肝脏的纤维化面积率方面的体现。
[图22]羊膜来源的MSC移植对大鼠放射性小肠炎模型的治疗效果在通过直肠PAS染色的PAS阳性杯状细胞数方面的体现。
符号说明
1 间充质系细胞
2 上皮细胞层
3 细胞外基质层
具体实施方式
以下，参照附图对本发明的实施方式进行具体地说明，但当该实施方式只是为了使本发明的原理易于理解，本发明的范围并不受下述实施方式的限制，本领域技术人员适当替换以下实施方式的构成而得到的实施方式也在本发明的范围内。
[1]用语说明
在本说明书中，“胎儿附属物”是指胎膜、胎盘、脐带以及羊水。而“胎膜”是指容纳胎儿的羊水的胎囊，其自内侧起由羊膜、绒毛膜以及蜕膜构成。其中，羊膜和绒毛膜是因胎儿产生的。“羊膜”是位于胎膜最内层的血管很少透明薄膜，内壁被具有分泌功能的一层上皮细胞覆盖，分泌羊水。
本说明书中的“间充质系细胞(Mesenchymal stromal cell：MSC)”包括间充质系干细胞以及祖细胞(是指具有能够分化成构成一个或多个各种脏器或组织的细胞的能力的细胞)，是指满足细胞疗法国际学会(The International Society for CellularTherapy)所提倡的多能性间充质系细胞(Mesenchymal stromal cell：MSC)定义的细胞(非专利文献5、下述参照)。
多能性间充质系细胞的定义
i)在标准培养基的培养条件下，展现出对塑料的附着性。
ii)表面抗原CD105、CD73、CD90为阳性，CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79alpha、CD19、HLA-DR为阴性。
iii)在培养条件下能够分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。
本说明书中的“间充质系细胞组合物”是指包含间充质系细胞的任意组合物，没有特别限制，例如，包含将羊膜用分解酶进行处理后的间充质系细胞的细胞悬浮液等。
本说明书中的“间充质系细胞培养组合物”是指对上述间充质系细胞组合物进行培养而得到的细胞悬浮液等。
本说明书中的“间充质系细胞给药用组合物”是指用上述间充质系细胞组合物制备成的适于给药形式的任意组合物，没有特别限制，例如，向包含二甲基亚砜5～10质量％、含有羟乙基淀粉5～10质量％或葡聚糖1～5质量％的溶液中的含有间充质系细胞的混合物中添加2倍量以上的输液制剂而得到的细胞悬浮液等。
[2]间充质系细胞组合物的制造方法
本发明的间充质系细胞组合物的制造方法包括：将羊膜用胶原蛋白酶、以及嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶进行酶处理的工序；以及将酶处理后的羊膜过筛的工序。
在本发明的间充质系细胞组合物的制造方法的一例中，可以将人羊膜用调整成适宜浓度的包含胶原蛋白酶与嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶的酶液仅进行一次处理，并将酶处理后的羊膜消化液过筛。包含基底膜的上皮细胞层无法被调整成适宜浓度的胶原蛋白酶与嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶消化而残留在筛网上，而能够被调整成适宜浓度的胶原蛋白酶与嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶消化的细胞外基质层中所含的MSC能够通过筛网，因此通过回收过筛后的细胞，即可回收MSC。另外，通过培养回收的细胞也可制造间充质系细胞组合物。
图1为人羊膜的组织图。如图1所示，羊膜由表层的上皮细胞层和位于其下的细胞外基质层构成，后者中含有MSC。羊膜上皮细胞与其它上皮细胞同样，具有能够表达上皮钙粘蛋白(E-cadherin：CD324)以及上皮细胞粘附因子(EpCAM：CD326)的特征，而MSC不能表达这些上皮特异性表面抗原标记物，因此能够用FACS容易地区分(图3)。
图2是说明本实施方式的羊膜来源的MSC分离法的概要的图。由人胎儿附属物物理采集羊膜(A)。将羊膜用生理盐水等等张液洗涤(B)，并将羊膜浸渍在包含适宜浓度的胶原蛋白酶与嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶的含酶溶液中，在适宜温度下进行振荡搅拌(C)。在仅以细胞外基质为目标的酶处理中，上皮细胞层保持层结构而并未被分离成单个细胞，因此，将得到的羊膜消化液过筛时(D)，上皮细胞层残留在筛网上，细胞外基质层中所含的MSC通过筛网，能够被回收。E为离心管、F为培养皿、G为培养细胞的照片。
将本发明的实施方式以下述一例的形式进行详细说明。
1.在手术室由择期剖腹产患者无菌摘取人胎儿附属物。
2.由胎儿附属物无菌且手动地剥离羊膜。
3.将羊膜移至灭菌容器(一次性杯)，用生理盐水等等张液洗涤数次，去除附着的血液等。
4.用手术刀/剪等将羊膜粗略地进行剪切(该步骤也可省略)。另外，也可将羊膜于培养基中在2～8℃保存24～48小时后使用。
5.将羊膜浸在含有调整成适宜浓度的胶原蛋白酶、以及嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶的溶液中，用恒温振荡器在37℃以60rpm振荡搅拌90分钟。
6.其结果，仍存留有一层上皮细胞层，而细胞外基质层中所含的MSC悬浮于酶含有溶液中。
7.将Falcon细胞筛网(100μm筛孔)置于灭菌管(Falcon50ml管)中，通过自由落下对羊膜消化后的细胞含有液进行过滤，由此上皮细胞层残留在筛网上，而仅MSC通过筛网。
8.将过筛后的MSC含有溶液用Hank’s平衡盐缓冲液稀释后，以400×g、5分钟的离心操作将间充质系细胞制粒。
9.用添加了10％FBS的αMEM进行稀释，接种于塑料瓶，进行培养。
本发明能够防止像以往那样因多次进行酶处理且每次处理反复进行离心分离、洗涤而导致的回收率降低、微生物等的污染，另外，能够在短时间内容易地制备大量均匀的MSC而无需Ficoll密度梯度离心等纯化操作。
用于本发明的羊膜来源的MSC的分离的酶组合包括：仅消化胶原的胶原蛋白酶、能够切断非极性氨基酸N末端侧的金属蛋白酶即嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶。
在本发明中，使用胶原蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶的组合，也可以使用能够使MSC游离而不分解上皮细胞层的酶(或其组合)。胶原蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶的优选浓度组合可通过酶处理后的显微镜观察、FACS来决定。优选为上皮细胞层不解而能够使细胞外基质层中所含的MSC游离的浓度条件。
胶原蛋白酶的浓度优选为50CDU/ml～1000CDU/ml、嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶的浓度优选为100PU/ml～800PU/ml。
单独用胶原蛋白酶300CDU/ml处理时，活细胞计数为0.29×106个，添加嗜热菌蛋白酶后，活细胞计数浓度依赖性地增加，嗜热菌蛋白酶为400PU/ml时，活细胞计数为1.99×106个，增加达约7倍，活细胞率为91.7％(实施例1、表1)。
同样地，向胶原蛋白酶300CDU/ml中添加中性蛋白酶后，活细胞计数浓度依赖性地增加，中性蛋白酶为200PU/ml时，活细胞计数增加至3.02×106个，活细胞率为83.7％(实施例6、表8)。因此，通过将胶原蛋白酶与嗜热菌蛋白酶或中性蛋白酶混合同时进行酶处理，能够得到更多的活细胞。
胶原蛋白酶300CDU/ml的情况下，最适嗜热菌蛋白酶浓度为400PU/ml。该情况下，CD90阳性MSC含有率为83.3％、CD324阳性上皮细胞为12.8％(实施例1、表2)。另外，向胶原蛋白酶300CDU/ml中添加的最适中性蛋白酶浓度为200PU/ml，该情况下，CD90阳性MSC含有率为83.3％、CD324阳性上皮细胞为12.8％(实施例6、表9)。
以高于400PU/ml的浓度单独添加嗜热菌蛋白酶以及中性蛋白酶时，观察到上皮细胞破裂的现象(实施例2、图6、实施例7、图14)。
胶原蛋白酶300CDU/ml、嗜热菌蛋白酶250PU/ml的情况下，CD90阳性MSC的含有率为93.3％、CD90阳性MSC的细胞数为1.43×106个(实施例4、表6)。另外，胶原蛋白酶300CDU/ml、中性蛋白酶250PU/ml的情况下，CD90阳性MSC的含有率为91.5％、CD90阳性MSC的细胞数为1.49×106个(实施例8、表11)。
酶处理优选将用生理盐水等洗涤后的羊膜浸渍在酶液中，用搅拌器或振荡器边搅拌边进行处理，但只要高效且能够使MSC游离，也可以采用其它搅拌装置。由此，细胞外基质层中所含的MSC游离。酶处理优选用搅拌器或振荡器以10rpm/分钟～100rpm/分钟搅拌30分钟以上来进行。需要说明的是，酶处理时间的上限没有特别限制，一般进行6小时以内、优选3小时以内、例如90分以内。另外，酶处理温度只要能实现本发明的目的即可，没有特别限制，优选为30～40℃、更优选为30～37℃。
此时，重要的是以上皮细胞层不分解的浓度组合。这是因为，如果混入上皮细胞，则MSC的含有率相对地下降。
将含有游离的MSC的酶溶液过筛而进行过滤，由此仅游离的细胞通过筛网，而未分解的上皮细胞层无法通过筛网而以筛状残留，从而能够容易地回收游离的MSC。此时，筛的孔径(大小)只要不背离本发明的目的，就没有特别限制，优选40～200μm、更优选40～150μm、进一步优选70～150μm、特别优选100～150μm。通过使筛的孔径(大小)在上述范围内，无需施加压力，利用自然落下的落下能够防止细胞存活率降低。
作为筛的材质，优选使用尼龙筛。可以使用作为研究用途广泛使用的Falcon细胞筛网等含有40μm、70μm、100μm的尼龙筛的管。另外，可以使用血液透析等所使用的医疗用网布(尼龙以及聚酯)。另外，也可使用体外循环时使用的动脉滤器(聚酯筛、40μm～120μm)。也可使用其它材质，例如，不锈钢筛(金属网)等。
使MSC通过筛时，优选自然落下(自由落下)。也可采用利用泵等进行抽吸等的强制过筛，为了避免损伤细胞，希望采用尽量小的压力。
通过筛的MSC，可用2倍或2倍以上量的培养基或平衡盐缓冲液将滤液稀释后，通过离心分离进行回收。回收的细胞可根据需要通过培养使其增殖，由此可制作间充质系细胞培养组合物。培养基为含有高于0.05％且为5％以下的白蛋白的αMEM·M199或者以其为基础的培养基，DMEM·F12·RPMI1640或者以其为基础的培养基的增殖性低。培养优选用含有10％以上的牛·人血清的αMEM培养基、塑料盘/瓶在5％CO2、37℃环境下进行。作为平衡盐缓冲液，可以使用杜氏膦酸盐缓冲液(DPBS)、厄尔平衡盐缓冲液(EBSS)、汉克平衡盐缓冲液(HBSS)、磷酸缓冲液(PBS)等缓冲液。
上述本发明的方法可以制造CD324以及CD326阳性上皮细胞的含有率为20％以下、CD90阳性细胞的含有率为75％以上、且活细胞率为80％以上的间充质系细胞组合物，上述间充质系细胞组合物也在本发明的范围内。
[3]经过冷冻保存的间充质系细胞的制造方法
本发明的经过冷冻保存的间充质系细胞的制造方法包括下述工序：将包含间充质系细胞的混合物在含有二甲基亚砜(DMSO)5～10质量％、含有羟乙基淀粉5～10质量％或葡聚糖1～5质量％的溶液中进行冷冻保存的工序。
本发明人等经过深入研究，结果发现：解冻后的MSC存活率减少是由于高浓度DMSO引起的细胞毒性而导致的(实施例)。从抑制细胞死亡的观点来看，作为细胞移植用人MSC的冷冻保存液，优选减少冷冻保存液中DMSO含量。采用本发明的方法的MSC的冷冻保存液减少了DMSO含量，代之以添加羟乙基淀粉(HES)或葡聚糖(Dextran40等)。冷冻保存液还可含有高于0质量％且5质量％以下的人白蛋白。作为冷冻保存液的一例，可以使用组成为5质量％DMSO、6质量％HES、4质量％人白蛋白的冷冻保存液。
经过冷冻保存的间充质系细胞可通过下述方法制造：使用上述冷冻保存液，用程序冷冻，例如，以-1～-2℃/分钟的冷冻速度降温至-30℃～-50℃之间的温度(例如，-40℃)，再以-10℃/分钟的冷冻速度降温至-80℃～-100℃之间的温度(例如，-90℃)。
上述方法得到的经过冷冻保存的间充质系细胞在解冻后用输液制剂稀释2倍以上，由此能够制造间充质系细胞给药用组合物。
[4]细胞治疗剂
上述制备的MSC(也包含增殖的MSC)可作为难治性疾病的治疗剂使用。
也就是说，本发明能够提供含有上述间充质系细胞组合物和/或间充质系细胞培养组合物和/或间充质系细胞给药用组合物作为有效成分的细胞治疗剂。本发明还能提供用于细胞移植治疗的上述间充质系细胞组合物和/或间充质系细胞培养组合物和/或间充质系细胞给药用组合物。本发明还能提供对受试者进行细胞移植的方法、以及受试者的疾病治疗方法，其包括对受试者给药治疗有效量的上述间充质系细胞组合物和/或间充质系细胞培养组合物和/或间充质系细胞给药用组合物的工序。
本发明的细胞治疗剂、间充质系细胞组合物和/或间充质系细胞培养组合物和/或间充质系细胞给药用组合物适用于移植物抗宿主病(GVHD、实施例10)、包括克罗恩病(实施例11)和溃疡性大炎性肠病在内的炎性肠病、包括系统性红斑狼疮(实施例12)在内的胶原性疾病(结缔组织疾病)、肝硬化(实施例13)、放射性小肠炎(实施例14)、特应性皮炎等。通过在治疗部位给药有效量(效果可测定)的本发明的制造法制造的MSC，能够抑制炎症。
需要说明的是，为了保持冷冻保存后的MSC细胞存活率，急速解冻后，用生理盐水等输液制剂稀释后，应尽早使用。这是因为冷冻保存液中所含的DMSO具有细胞毒性。用上述输液制剂稀释后的间充质系细胞给药组合物可对移植物抗宿主病、包括克罗恩病在内的炎症性炎性肠病、包括系统性红斑狼疮在内的胶原性疾病、肝硬化、放射性小肠炎、特应性皮炎等的患者静脉给药，进行治疗。
作为本说明书中的“输液制剂”，只要是人的治疗时使用的溶液即可，没有特别限制，可以列举例如，生理盐水、5％葡萄糖溶液、林格溶液、乳酸林格溶液、醋酸林格溶液、1号液、2号液、3号液、4号液等。
本发明的细胞治疗剂的给药方法没有特别限制，可以列举例如，皮下注射、淋巴结内注射、静脉内注射、腹腔内注射、胸腔内注射或局部直接注射、或局部直接移植等，但并不限于此。
本发明的细胞治疗剂与骨髓MSC制剂同样，也可用于其它疾病治疗目地注射用制剂、或者细胞团块或片状结构的移植用制剂。
作为本发明的细胞治疗剂的给药量，为对受试者给药时较未给药的受试者对疾病有治疗效果的细胞量。具体的给药量可根据给药方式、给药方法、使用目的以及受试者的年龄、体重以及症状等适宜决定，作为一例，以间充质系细胞数计，优选人(例如成人)每次给药105～109个细胞/kg体重、更优选105～108个细胞/kg体重。
[实施例]
通过以下实施例对本发明进行具体地说明，但本发明并不受实施例的限定。
(实施例1)
从获得知情同意的择期剖腹产病例的孕妇来源的人胎儿附属物手工分离羊膜。用汉克平衡盐缓冲液(不含有Ca·Mg)洗涤2次后，将得到的羊膜中的1g置于容器中，添加含有纯化胶原蛋白酶(CLSPA，Worthington社，规格>500CDU/mg)300CDU/ml(＝<600μg/ml)以及嗜热菌蛋白酶(和光纯药、规格>7000PU/mg)0～400PU/ml(＝<60μg/ml)(No.1：0PU/ml、No.2：100PU/ml、No.3：200PU/ml、No.4：400PU/ml4种)的汉克平衡盐缓冲液(含有Ca·Mg)5ml，在37℃以60rpm用振荡器振荡搅拌90分钟。向得到的混合物中添加2倍量的添加有10％牛胎儿血清(FBS)的αMEM(Alpha Modification of Minimum Essential Medium Eagle)后，用尼龙网滤器(孔径：100μm)进行了过滤。将残留于滤器的组织用苏木素-伊红(HE)染色，进行了评价。滤液以400x g进行5分钟离心操作，去除上清后，用添加有10％FBS的αMEM使细胞再悬浮，锥虫蓝染色后测定了细胞数。得到的细胞用间充质系标记物抗CD90-FITC抗体以及上皮系标记物抗CD324-APC抗体(BD Bioscience社)于4℃进行15分钟染色后，添加用于除去死细胞的7-AAD色素，用流式细胞仪
(FACSCanto：BD社)进行了表面抗原标记物解析。结果如表1、表2，图3以及图4所示。
CDU(＝collagen digestion unit)：以胶原为基质，在37℃、pH7.5，5小时生成相当于1μmol亮氨酸的氨基酸以及肽的酶量。
PU(＝protease unit)：以乳酸酪蛋白为基质，在35℃、pH7.2，1分钟生成相当于1μg酪氨酸的氨基酸以及肽的酶量。
[表1]
Figure BDA0000926545290000141
如表1所示，仅用胶原蛋白酶(No.1)得到的锥虫蓝染色阴性的活细胞计数为0.29×106个，而加入嗜热菌蛋白酶后，活细胞计数增加，嗜热菌蛋白酶为400PU/ml(No.4)时，活细胞计数为1.99×106个，增加达约7倍。而锥虫蓝阳性的死细胞数无明显变化，任一样品均得到80％以上的活细胞率。
如图3所示，根据由流式细胞仪得到的结果，在仅用胶原蛋白酶(No.1)的试样中，目标CD90阳性MSC仅为34.6％，不要的CD324阳性上皮细胞为8.6％，其它被认为是红细胞的细胞为56.8％。与表1同样地，通过添加嗜热菌蛋白酶，CD90阳性MSC的比例增加，嗜热菌蛋白酶为400PU/ml(No.4)时，CD90阳性MSC为83.3％、CD324阳性上皮细胞为12.8％、其它为3.9％。
[表2]
Figure BDA0000926545290000151
如表2所示，由各试样得到的MSC数在仅用胶原蛋白酶(No.1)的情况下为0.1×106个，而在添加嗜热菌蛋白酶后，MSC增加，嗜热菌蛋白酶为400PU/ml(No.4)时，MSC数为1.66×106个，得到了No.1的约16倍的MSC。
如图4所示，将酶处理后的滤器上残留的组织通过HE染色进行研究时，仅用胶原蛋白酶(No.1)的情况下，保持细胞外基质层的结构，消化不充分。通过添加嗜热菌蛋白酶，确认细胞外基质层被消化，嗜热菌蛋白酶为400PU/ml(No.4)时，细胞外基质层完全被消化。
根据该实施例1的结果，单独使用胶原蛋白酶时，无法消化羊膜，通过与胶原蛋白酶一起加入嗜热菌蛋白酶，羊膜被浓度依赖性地消化，加入400PU/ml的嗜热菌蛋白酶时，含有MSC的细胞外基质层完全被消化。
(实施例2)
在上述实施例1的基础上，利用同样的方法，不用胶原蛋白酶而仅用嗜热菌蛋白酶进行了研究。
结果如表3，图5以及图6所示。
[表3]
Figure BDA0000926545290000161
如表3所示，仅用嗜热菌蛋白酶消化而得到的每1g人羊膜的细胞数随嗜热菌蛋白酶的浓度依赖性地增加。
但如图5所示，就仅用嗜热菌蛋白酶的酶处理液中含有的细胞而言，根据流式细胞仪测定的结果，无论浓度如何，所得细胞均基本为100％CD324阳性上皮细胞，无法得到目标CD90阳性MSC。
如图6所示，对酶处理后的滤器上残留的组织通过HE染色进行研究时，包含MSC的细胞外基质层未被完全消化，另外，上皮细胞层的破裂根据嗜热菌蛋白酶的浓度依赖性地存在。
根据该实施例2的结果，仅用嗜热菌蛋白酶时，完全无法得到目标MSC，在嗜热菌蛋白酶的浓度为800PU/ml以上的情况下，观察到上皮细胞层的破裂。
(实施例3)
另外，与作为现有方法的利用胰蛋白酶的方法进行了比较研究(非专利文献3)。将人羊膜1g置于容器中，用No.41)0.05％胰蛋白酶(含有0.53mM的EDTA)5ml在37℃以60rpm振荡搅拌(通过振荡器)90分钟，用No.42)0.05％胰蛋白酶(含有0.53mM EDTA、Invitrogen社)5ml在37℃以60rpm振荡搅拌(通过振荡器)90分钟后，用尼龙网滤器(孔径：100μm)进行过滤，将残存的组织再次用含有纯化胶原蛋白酶(300CDU/ml)的汉克平衡盐缓冲液(含有Ca·Mg)在37℃以60rpm振荡搅拌(通过振荡器)90分钟，用含有No.43)纯化胶原蛋白酶(300CDU/ml)+嗜热菌蛋白酶(250PU/ml)的汉克平衡盐缓冲液(含有Ca·Mg)5ml在37℃振荡搅拌(通过振荡器)90分钟。以下，与实施例1同样。结果如表4、表5、图7以及图8所示。
如表4所示，在胰蛋白酶处理的基础上，将残留的羊膜再次用胶原蛋白酶处理，经过这些处理的试样(No.42)能够得到最多的细胞。
但如图7所示，就各酶处理液中含有的细胞而言，根据流式细胞仪的测定结果，仅用胰蛋白酶(No.41)的情况下，目标CD90阳性MSC为0.6％，完全无法得到，用胰蛋白酶处理后再用胶原蛋白酶处理的2阶段处理(No.42)的情况下，目标CD90阳性细胞为32.6％，虽能得到，但也含有不要的CD324阳性上皮细胞65.6％，用胶原蛋白酶+嗜热菌蛋白酶的一次处理(No.43)的情况下，CD90阳性MSC为90.3％、CD324阳性上皮细胞为8.0％。
[表4]
Figure BDA0000926545290000171
如图8所示，对酶处理后的滤器上残留的组织通过HE染色进行研究时，仅用胰蛋白酶处理(No.41)的情况下，不仅上皮细胞层的基底膜破裂，而且，上皮细胞为球状且分散，而在保持了细胞外基质层结构的胰蛋白酶处理后，通过用胶原蛋白酶处理(No.42)，羊膜完全被消化，通过胶原蛋白酶+嗜热菌蛋白酶一步处理(No.43)，尽管细胞外基质层完全被消化，但上皮细胞层其结构包含基底膜，被保持了下来。
[表5]
Figure BDA0000926545290000172
如表5所示，关于由各试样得到的MSC，在仅用胰蛋白酶(No.51)时，基本未得到MSC，在用胰蛋白酶后进行胶原蛋白酶处理(No.52)的情况下，得到的MSC为5.39×106个，非常多，用胶原蛋白酶+嗜热菌蛋白酶进行一步处理(No.53)时，得到3.25×106个。而关于不要的CD324阳性上皮细胞，仅用胰蛋白酶(No.51)时，得到2.25×106个上皮细胞，用胰蛋白酶+胶原蛋白酶一步处理(No.52)时，为13.07×106个，得到需要的MSC以上的细胞数，用胶原蛋白酶+嗜热菌蛋白酶一步处理(No.53)时，为0.29×106个，细胞数少于MSC。
由此可知，在现有的胰蛋白酶处理后用胶原蛋白酶进行处理的方法的优点在于能得到多的细胞数，缺点在于混入的上皮细胞多，要得到高纯度的MSC，需要通过比重离心等方法对细胞进行筛选的操作，且工序除了胰蛋白酶处理外还需要胶原蛋白酶处理，分为2阶段，操作繁琐。关于后者的缺点，其原因是胰蛋白酶会因Ca的作用失活，而胶原蛋白酶需要Ca，因此无法同时处理。
(实施例4)
在上述实施例1～3的基础上，将嗜热菌蛋白酶浓度固定为250PU/ml的情况下，对羊膜间充质系细胞分离所需的最低胶原蛋白酶浓度进行了研究。结果如表6以及图9所示。
[表6]
Figure BDA0000926545290000181
如表6所示，用胶原蛋白酶300CDU/ml(No.63)得到的锥虫蓝染色阴性的活细胞计数为1.53×106个，而在胶原蛋白酶浓度为其1/4的75CDU/ml(No.61)的情况下，活细胞计数减少至1.16×106个。锥虫蓝阳性的死细胞数无明显变化，任意试样均得到80％以上的活细胞率。另外，根据流式细胞仪测定的结果，任意试样的CD90阳性间充质系细胞均为90％以上。
如图9所示，对酶处理后的滤器上残留的组织通过HE染色进行研究时，胶原蛋白酶浓度为300以及150CDU/ml(No.63以及62)时，仅观察到上皮细胞层，而胶原蛋白酶浓度为75CDU/ml(No.61)的情况下，还观察到极少一部分细胞外基质层，消化不充分。
根据该实施例4的结果，将嗜热菌蛋白酶浓度固定为250PU/ml的情况下，要使细胞外基质层充分地被消化，胶原蛋白酶浓度优选至少为75CDU/ml以上、更优选为150CDU/ml以上。
(实施例5)
再将嗜热菌蛋白酶浓度固定为实施例3的2倍即500PU/ml的情况下，对羊膜间充质系细胞分离所需的最低胶原蛋白酶浓度进行了研究。结果如表7以及图10所示。
[表7]
Figure BDA0000926545290000191
如表7所示，用胶原蛋白酶150CDU/ml(No.73)得到的锥虫蓝染色阴性的活细胞计数为2.05×106个，而在胶原蛋白酶浓度为其1/4的37.5CDU/ml(No.71)的情况下，活细胞计数减少至0.82×106个。锥虫蓝阳性的死细胞数无明显变化，任意试样均能得到80％以上的活细胞率。另外，根据流式细胞仪的测定结果，任意试样的CD90阳性间充质系细胞均为90％以上。
如图10所示，对酶处理后的滤器上残留的组织通过HE染色进行研究时，胶原蛋白酶浓度为150以及75CDU/ml(No.73以及72)时，仅观察到上皮细胞层，而胶原蛋白酶浓度为37.5CDU/ml(No.71)的情况下，观察到很多细胞外基质层，消化不充分。
根据该实施例5的结果，将嗜热菌蛋白酶浓度固定为500PU/ml的情况下，要充分地消化细胞外基质层，胶原蛋白酶浓度优选至少为37.5CDU/ml以上、更优选为75CDU/ml以上。
(实施例6)
关于上述实施例1，代替嗜热菌蛋白酶，用同样能够切断非极性氨基酸N末端侧的金属蛋白酶即中性蛋白酶，并添加胶原蛋白酶进行了研究。
从获得知情同意的孕妇来源的人胎儿附属物手工分离羊膜。用汉克平衡盐缓冲液(不含有Ca·Mg)洗涤2次后，将得到的羊膜中的1g置于容器中，添加含有胶原蛋白酶(Brightase-C，Nippi社，规格>20万CDU/管形瓶)300CDU/ml以及中性蛋白酶I(和光纯药、规格10000～13000PU/管形瓶)0～400PU/ml(No.1：0PU/ml、No.2：100PU/ml、No.3：200PU/ml、No.4：400PU/ml4种)的汉克平衡盐缓冲液(含有Ca·Mg)5ml，在37℃以60rpm用振荡器振荡搅拌90分钟。向得到的混合物中添加2倍量的添加有10％牛胎儿血清(FBS)的αMEM(AlphaModification of Minimum Essential MediumEagle)后，用尼龙网滤器(孔径：100μm)进行了过滤。将残留于滤器的组织用苏木素-伊红(HE)染色，进行了评价。滤液以400x g进行了5分钟离心操作，去除上清后，用添加有10％FBS的αMEM将细胞再悬浮，通过锥虫蓝染色后测定了细胞数。得到的细胞用间充质系标记物抗CD90-FITC抗体以及上皮系标记物抗CD324-APC抗体(BD Bioscience社)在4℃进行15分钟染色后，添加7-AAD色素，用于除去死细胞，用流式细胞仪(FACSCanto：BD社)进行了表面抗原标记物解析。结果如表8、表9、图11以及图12所示。
[表8]
Figure BDA0000926545290000201
如表8所示，仅用胶原蛋白酶(No.81)得到的锥虫蓝染色阴性的活细胞计数为0.42×106个，而通过加入中性蛋白酶，活细胞计数增加，中性蛋白酶为200PU/ml(No.83)时，活细胞计数为3.02×106个，增加达约7倍。而锥虫蓝阳性的死细胞数无明显变化，加入了中性蛋白酶的任意试样均能得到80％以上的活细胞率。
如图11所示，根据流式细胞仪的测定结果，无论是仅用胶原蛋白酶(No.81)，还是添加了中性蛋白酶(No.82-84)，目标CD90阳性MSC均为90％以上，不要的CD324阳性上皮细胞均为10％以下。仅用胶原蛋白酶(No.81)的结果虽然不同于实施例1(图3)中仅用胶原蛋白酶(No.1)的结果，认为这是由于使用的胶原蛋白酶的制造商不同而引起的。
[表9]
Figure BDA0000926545290000211
如表9所示，关于各试样得到的MSC数，仅用胶原蛋白酶(No.81)时，为0.39×106个，而添加了中性蛋白酶而得到的MSC增加，中性蛋白酶为200PU/ml(No.83)时，MSC数为2.86×106个，能够得到No.81的约7倍的MSC。
如图12所示，对酶处理后的滤器上残留的组织通过HE染色进行研究时，仅用胶原蛋白酶(No.81)时，细胞外基质层的结构被保留，消化不充分。通过添加中性蛋白酶，确认细胞外基质层被消化，中性蛋白酶为200PU/ml(No.83)、400PU/ml(No.84)时，均完全被消化。
根据该实施例6的结果，单独使用胶原蛋白酶时，羊膜消化不充分，而通过将胶原蛋白酶与中性蛋白酶组合，羊膜浓度依赖性地被消化，使用2000P U/ml以上的中性蛋白酶时，含有MSC的细胞外基质层完全被消化。
(实施例7)
基于上述实施例6，利用同样的方法，对不用胶原蛋白酶而仅用中性蛋白酶的情况进行了研究。
结果如表10，图13以及图14所示。
[表10]
Figure BDA0000926545290000212
如表10所示，仅用中性蛋白酶消化而得到的1g人羊膜对应的细胞数随嗜热菌蛋白酶浓度依赖性地增加。
但如图13所示，就仅用中性蛋白酶的酶处理液中含有的细胞而言，根据流式细胞仪的测定结果，无论浓度如何，目标CD90阳性MSC数％均非常少。
如图14所示，对酶处理后的滤器上残留的组织通过HE染色进行研究时，含有MSC的细胞外基质层未被完全消化，另外，上皮细胞层的破裂随中性蛋白酶的浓度依赖性地存在。
根据该实施例7的结果，仅用中性蛋白酶时，完全无法得到目标MSC，中性蛋白酶的浓度为800PU/ml以上的情况下，观察到上皮细胞层的破裂。
(实施例8)
基于上述实施例6～7，将中性蛋白酶浓度固定为250PU/ml的情况下，对羊膜间充质系细胞分离所需的最低胶原蛋白酶浓度进行了研究。结果如表11以及图15所示。
[表11]
Figure BDA0000926545290000221
如表11所示，胶原蛋白酶为300CDU/ml(No.113)时得到的锥虫蓝染色阴性的活细胞计数为1.57×106个，而在胶原蛋白酶浓度为其1/4的75CDU/ml(No.113)的情况下，活细胞计数减少至1.34×106个。锥虫蓝阳性的死细胞数无明显变化，任意试样均能达到80％以上的活细胞率。另外，根据流式细胞仪的测定结果，任意试样的CD90阳性间充质系细胞均为90％以上。
如图15所示，对酶处理后的滤器上残留的组织通过HE染色进行研究时，胶原蛋白酶浓度为300CDU/ml(No.113)时，仅观察到上皮细胞层，而胶原蛋白酶浓度为75以及150CDU/ml(No.111以及112)的情况下，观察到细胞外基质层，消化不充分。
根据该实施例8的结果，将中性蛋白酶浓度固定为250PU/ml的情况下，要使细胞外基质层充分地被消化，胶原蛋白酶浓度有必要至少为75CDU/ml以上、更优选为150CDU/ml以上、进一步优选为300CDU/ml以上。
(实施例9)
将实施例1所得到的细胞用添加有10％FBS的αMEM培养液进行稀释后，接种于塑料盘上，对羊膜来源的MSC进行贴壁培养(adhesion culture)。通过胰蛋白酶处理将细胞剥离后，用添加有10％FBS的αMEM培养液进行胰蛋白酶中和，离心后除去上清，将得到的细胞团用RPMI1640进行再悬浮，制成羊膜来源的MSC悬浮液。将得到的悬浮液制成冷冻保存液，使其最终组成如表12所示。
[表12]
HES(％) DMSO(％) 人白蛋白(％) 葡聚糖40(％)
I DMSO+HES+Alb 6 5 4 0
II DMSO+HES 6 5 0 0
III 仅DMSO 0 11 0 0
IV DMSO+Alb 0 11 4 0
V ①∶④＝1∶2 4 7 4 0
VI ①∶④＝2:1 2 9 4 0
VII DMSO+葡聚糖40 0 11 0 2
DMSO：Simga-Aldrich社制、型号D2650
HES：Nipro社制、型号HES40
人白蛋白(Alb)：Benesis社制、献血白蛋白25％静脉注射液12.5g/50ml
葡聚糖40：大塚制药工场社制、低分子葡聚糖糖注射液
生理盐水：大塚制药工场社制：上述稀释调整用液。
将冷冻保存液调整成含有羊膜来源的MSC量为106细胞/ml，各取1ml至低温保存管(cryotube)中，通过程序冷冻以-1～-2℃/分钟的冷冻速度降温至-40℃，再以-10℃/分钟的速度降温至-90℃，保存于-150℃的超低温冰箱。第二天，将低温保存管浸于37℃恒温槽中，进行急速融解。表13示出了急速解冻后的细胞的锥虫蓝阴性活细胞比例。
[表13]
活细胞比例(％)
I OMSO+HES+AIb 93.2
II DMSO+HES 84.4
III 仅DMSO 55.1
IV DMSO+Alb 72.7
V 1∶4＝1∶2 83.6
VI 1∶4＝2∶1 94.5
VII DMSO+葡聚糖40 82.6
根据该结果，发现III的仅加入了DMSO的活细胞少，通过添加HES、葡聚糖、白蛋白，活细胞比例增加。
另外，将解冻的细胞悬浮液100μL接种于24孔板的4孔，添加3ml添加有10％FBS的αMEM培养液，24小时后以及48小时后拍摄照片，然后测定了单位视野的细胞数的平均值。结果如表14、图16以及图17所示。
[表14]
Figure BDA0000926545290000241
与表13的结果同样，III的仅加入了DMSO、或者IV的DMSO+Alb，细胞增殖慢，而通过添加HES、葡聚糖，促进了细胞增殖。尤其是在DMSO浓度减少了的I、II、IV中，确认到明显的细胞增殖。
(实施例10)
对小鼠进行同种异体骨髓移植以及脾细胞移植，使其产生移植物抗宿主反应(GVHD)，研究了人羊膜来源的MSC移植的治疗效果。对7-8周龄的雌性B6C3F1小鼠照射15Gy的X射线后，经静脉移植同种异体的BDF1小鼠来源的骨髓细胞1.0×107细胞以及脾细胞3×107细胞。在骨髓细胞移植第14日、第17日、第21日、第15日经静脉移植按照与实施例1同样的方法(在胶原蛋白酶300CDU/ml+嗜热菌蛋白酶250PU/ml的条件下)得到的人羊膜来源的MSC(1×105细胞)，观察体重的经时变化。图18示出了自骨髓细胞移植日起的体重变化率。
根据该结果，伴随移植物抗宿主反应(GVHD)的体重增加延迟通过人羊膜来源的MSC移植得到改善。
(实施例11)
对大鼠口服给药葡聚糖硫酸(DSS)，使其产生炎性肠病，研究了人羊膜来源的MSC移植的治疗效果。对8周龄的雄性SD大鼠通过自由饮水开始给药8％DSS。开始DSS给药的第二天，经静脉移植按照与实施例1同样的方法(在胶原蛋白酶300CDU/ml+嗜热菌蛋白酶250PU/ml的条件下)得到的人羊膜来源的MSC(1×106细胞)，总计给药DSS5天。
图19示出了疾病活性(Disease activity index(DAI)：观察并测定体重的减少、粪便的干稀、直肠出血，并对其评分)以及相对的体重变化。根据该结果，炎性肠病病情通过人羊膜来源的MSC移植而得到改善。
需要说明的是，DAI的评分根据下述文献的方法进行。Cooper，H.S.；Murthy，S.N.；Shah，R.S.；Sedergran，D.J.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodiumexperimental murine colitis.Lab.Invest.69：238-249；1993。
(实施例12)
对小鼠给药姥鲛烷(Pristane；2,6,10,14-四甲基十五烷)，使其产生系统性红斑狼疮，研究了人羊膜来源的MSC移植的治疗效果。对13周龄雄性BALB/c小鼠腹腔内给药姥鲛烷500μl。同时，尾静脉给药根据与实施例1同样的方法(在胶原蛋白酶300CDU/ml+嗜热菌蛋白酶250PU/ml的条件下)得到的人羊膜来源的MSC(1×105细胞/10g)，以后隔周给药同数量的人羊膜来源的MSC。20周后进行了生物化学评价。
图20示出了尿蛋白的经时变化。根据该结果，伴随系统性红斑狼疮的蛋白尿通过人羊膜来源的MSC移植而得到改善。
(实施例13)
对大鼠反复给药四氯化碳(CCl4)，使其产生肝硬化，研究了人羊膜来源的MSC移植的治疗效果。对6周龄的雄性SD大鼠以每周2次的频率开始腹腔内给药2ml/kg的CCl4。自CCl4给药开始第3周，经静脉移植根据与实施例1同样的方法(胶原蛋白酶300CDU/ml+嗜热菌蛋白酶250PU/ml的条件下)得到的人羊膜来源的MSC(1×106细胞)，共计给药CCl47周，进行了肝脏的组织学评价。
图21示出了根据肝脏的Masson三色染色结果而得到的纤维化面积率(胶原纤维阳性比例)。根据该结果，伴随肝硬化的肝纤维化通过人羊膜来源的MSC移植得到改善。
(实施例14)
对大鼠的直肠进行放射线照射，使其产生放射性小肠炎，研究了人羊膜来源的MSC的治疗效果。对8周龄的雄性SD大鼠以5Gy/日的放射线连续照射腹部5天。在最终照射日，经静脉移植根据与实施例1同样的方法(胶原蛋白酶300CDU/ml+嗜热菌蛋白酶250PU/ml的条件下)得到的人羊膜来源的MSC(1×106细胞)，在其3日后对直肠进行了组织学评价。
图22示出了根据直肠PAS染色结果得到的PAS阳性杯状细胞数(/HPF：单位高倍视野)的变化。根据该结果，伴随放射性小肠炎的杯状细胞减少通过人羊膜来源的MSC移植得到改善。

Claims (11)

1.间充质系细胞的制造方法，该方法包括：
将在包含二甲基亚砜5～10质量％、且含有羟乙基淀粉5～10质量％以及高于0质量％且为5质量％以下的人白蛋白的溶液中含有间充质系细胞的混合物进行冷冻保存，接着将经冷冻保存的上述混合物解冻后进行培养的工序，
该间充质系细胞为间充质系细胞组合物中含有的间充质系细胞，所述间充质系细胞组合物包含20％以下的CD324阳性和CD326阳性上皮细胞、以及75％以上的CD90阳性细胞。
2.根据权利要求1所记载的制造方法，其中，所述间充质系细胞组合物是通过将羊膜用胶原蛋白酶与嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶进行酶处理而得到的。
3.根据权利要求2所记载的制造方法，其中，胶原蛋白酶的浓度为50CDU/ml～1000CDU/ml、嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶的浓度为100PU/ml～800PU/ml。
4.根据权利要求2所记载的制造方法，其中，在所述酶处理之前，将羊膜用胰蛋白酶进行处理。
5.根据权利要求1记载的制造方法，其中，在制备所述混合物之前，还包括将所述间充质系细胞在间充质系细胞培养组合物中进行培养的步骤。
6.根据权利要求5所记载的制造方法，其中，将所述间充质系细胞培养组合物中的所述间充质系细胞在含有高于0.05质量％且为5质量％以下的白蛋白的培养基中进行培养。
7.间充质系细胞给药用组合物的制造方法，该方法包括下述工序：将根据权利要求1记载的方法而得到的间充质系细胞用输液制剂稀释2倍以上。
8.根据权利要求1所记载的方法而得到的间充质系细胞、和/或根据权利要求7所记载的方法而得到的间充质系细胞给药用组合物在制造细胞治疗剂中的用途。
9.根据权利要求8所记载的用途，其中，所述细胞治疗剂为注射用制剂。
10.根据权利要求8所记载的用途，其中，所述细胞治疗剂为细胞团块或片状结构的移植用制剂。
11.根据权利要求8记载的用途，其中，所述细胞治疗剂为选自下述疾病的治疗剂：移植物抗宿主病、炎性肠病、系统性红斑狼疮、肝硬化、或放射性小肠炎。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3296392A4 (en) * 2015-05-14 2018-11-21 Advanced Cell Technology and Engineering Ltd. Method for producing frozen mesenchymal cells and method for producing implantable therapeutic member
JPWO2017073656A1 (ja) * 2015-10-27 2018-08-16 国立研究開発法人国立循環器病研究センター 間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法、間葉系幹細胞、細胞集団、並びに医薬組成物
CN108934158B (zh) * 2016-02-01 2022-11-15 Gc细胞治疗 细胞冻存用培养基组合物及其应用
JP7006943B2 (ja) * 2016-11-04 2022-01-24 国立大学法人 東京大学 間葉系細胞及び間葉系幹細胞の凍結保存用溶液、凍結物、及び凍結保存方法
JP7105195B2 (ja) 2016-11-15 2022-07-22 株式会社カネカ 胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物
JP7140752B2 (ja) * 2017-04-03 2022-09-21 株式会社カネカ 胎児付属物由来接着細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物
WO2018186420A1 (ja) * 2017-04-03 2018-10-11 株式会社カネカ 間葉系幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、間葉系幹細胞及び医薬組成物
EP3608400A4 (en) * 2017-04-03 2021-01-06 Kaneka Corporation CELL POPULATION WITH MESENCHYMAL STEM CELLS, METHOD OF MANUFACTURING THEREFORE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION
CN106967675A (zh) * 2017-05-31 2017-07-21 东莞市保莱生物科技有限公司 一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法
WO2019059279A1 (ja) * 2017-09-20 2019-03-28 株式会社カネカ 細胞懸濁液を調製するためのデバイス、システム及び方法
US20200360444A1 (en) * 2017-12-28 2020-11-19 Kaneka Corporation Cell population including adhesive stem cells, production method therefor and pharmaceutical composition
EP3750987A4 (en) * 2017-12-28 2021-11-10 Kaneka Corporation CELL POPULATION INCLUDING ADHESIVE STEM CELLS, ITS PRODUCTION PROCESS, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION
CN108904533A (zh) * 2018-07-04 2018-11-30 卡替（上海）生物技术股份有限公司 牙髓间充质干细胞在制备肝硬化治疗药物中的用途
EP3936607A4 (en) 2019-03-08 2023-01-04 Kaneka Corporation MASS CULTURE OF PLURIPOTENTS STEM CELLS
WO2020251020A1 (ja) * 2019-06-14 2020-12-17 株式会社カネカ 間葉系細胞を含む細胞集団、それを含む医薬組成物、及び、その製造方法
US20230338428A1 (en) * 2020-09-08 2023-10-26 Amit Patel Allogenic umbilical cord stem cells for treating severe respiratory conditions
WO2022203022A1 (ja) * 2021-03-26 2022-09-29 株式会社カネカ 羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法
CN113456891B (zh) * 2021-06-16 2022-05-17 成都微沃科技有限公司 一种从细胞层中提取细胞外基质层的方法
CN114097768A (zh) * 2021-11-24 2022-03-01 李敬 一种骨髓干细胞用保护液及其制备方法和应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002529071A (ja) * 1998-11-09 2002-09-10 コンソルツィオ・ペール・ラ・ジェスティオーネ・デル・チェントロ・ディ・ビオテクノロジー・アヴァンツァテ 軟骨細胞様細胞のための無血清培地
JP2000201672A (ja) * 1999-01-11 2000-07-25 Asahi Medical Co Ltd 有核細胞の凍結保存用組成物
EP1442115B9 (en) 2001-11-15 2009-12-16 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
JP3934539B2 (ja) 2001-12-12 2007-06-20 独立行政法人科学技術振興機構 胎盤等由来の成体又は生後組織の前駆細胞
US7176022B2 (en) 2002-12-20 2007-02-13 Cell Genesys, Inc. Directly injectable formulations which provide enhanced cryoprotection of cell products
US20080044848A1 (en) 2006-06-09 2008-02-21 Heidaran Mohammad A Placental niche and use thereof to culture stem cells
EP2630959A1 (en) 2007-02-12 2013-08-28 Anthrogenesis Corporation Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
AR065584A1 (es) 2007-03-01 2009-06-17 Cryo Cell Internat Inc Obtencion aislamiento y crioconservacion de celulas endometriales / menstruales
EP2014767A1 (en) 2007-06-15 2009-01-14 Centro di Ricerca E. Menni T cell immunomodulation by placenta cell preparations
TW200936148A (en) 2007-10-31 2009-09-01 Cryo Cell Int Methods for co-culturing cord blood derived cells with menstrual stem cells
KR20210010648A (ko) * 2008-08-20 2021-01-27 안트로제네시스 코포레이션 개선된 세포 조성물 및 그의 제조 방법
EP2367932B1 (en) 2008-11-19 2019-06-12 Celularity, Inc. Amnion derived adherent cells
JPWO2011021618A1 (ja) * 2009-08-19 2013-01-24 タカラバイオ株式会社 細胞の保存方法
EP2536825B1 (en) 2010-02-18 2024-03-27 Osiris Therapeutics, Inc. Immunocompatible amniotic membrane products
TW201311259A (zh) * 2011-07-15 2013-03-16 Anthrogenesis Corp 利用羊膜衍生附著性細胞治療輻射傷害

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Publication number Publication date
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US10441611B2 (en) 2019-10-15
US20190343892A1 (en) 2019-11-14
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JP2015061520A (ja) 2015-04-02
US20160228474A1 (en) 2016-08-11

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C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Osaka Japan

Applicant after: National Cerebral and Cardiovascular Center

Applicant after: Public welfare corporates, Kobe medical industry city promotion organization

Applicant after: Hyogo College of Medicine

Applicant after: National University Corporation Hokkaido University

Applicant after: Kaneka Corporation

Address before: Osaka Japan

Applicant before: National Cerebral and Cardiovascular Center

Applicant before: FOUNDATION FOR BIOMEDICAL RESEARCH AND INNOVATION

Applicant before: Hyogo College of Medicine

Applicant before: National University Corporation Hokkaido University

Applicant before: Kaneka Corporation

GR01 Patent grant
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