CN111979189A - 一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，1)清理，2)处理，3)培养，4)接种传代，本发明采用的组织块分离法获得的羊膜间充质干细胞方法简单，成本低，细胞活性好，纯度高，最终收获细胞浓度高，培养时间短，培养第4～5天即可看到细胞从组织块爬出，整个干细胞分离制备培养工艺能够快速、高效从羊膜组织获取高纯度的间充质干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞分离培养技术领域，尤其涉及一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，是动物有机体和各种组织器官的起源细胞。新近的研究表明，众多成体组织中(如骨髓、肌肉、胃肠道、皮肤、视网膜、外周及中枢神经系统等)均存在间充质干细胞。MSCs它来源广泛、易体外分离扩增，具有向三种胚层细胞分化的多向分化潜能；具有低免疫原性、不能刺激产生同种异体免疫反应、不被细胞毒性T细胞和NK细胞杀伤，“归巢”修复作用，肿瘤趋向性以及免疫调节作用。
胎盘组织中MSCs主要分布在羊膜和绒毛膜等来源于胎儿的组织中，羊膜是胎膜最内层的一层薄膜，位于胎盘的婴儿面，由立方形或是圆柱形上皮样细胞组成其基底层，其中分布间质细胞，故羊膜干细胞主要由羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞组成。羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞相似，具有很强的可塑性和多向分化潜能，在不同的诱导培养条件下可以向三个胚层分化。羊膜间充质干细胞具有低免疫原性和免疫抑制作用，并能分泌多种细胞因子对损伤细胞进行修复，故羊膜间充质细胞是目前干细胞治疗、组织修复和再生医学的理想细胞。对羊膜间充质干细胞分离培养方法的探索及对其细胞生物学特性研究具有重要意义，可为将来的细胞移植应用奠定基础。目前分离羊膜间充质干细胞通常也采用两种方法，组织块直接贴壁法与酶消化。
酶消化分离的经济成本高，消化时间长，一般需要4～6个小时，最长的有消化16小时，组织块大小同时也会影响细胞的消化效果，如消化不充分，无法得到足够数量的细胞，而消化时间过长，其消化酶对细胞的损伤太大，细胞会大量死亡。组织块培养法原代培养方案操作简便易行，在缩短操作时间、降低成本、细胞得率高等方面具有明显优势。
发明内容
本发明的提供一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法。
本发明采用的技术方案是：
一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，包括下列步骤：
1)清理
胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用清洗液冲洗胎盘表面，清洗去除残留的血液与其他杂物；
2)处理
将清洗后的胎盘组织，以脐带根部为交叉中心剪十字切口，轻轻剥离羊膜层，将脐带和羊膜分离后，钝性分离羊膜和绒毛膜；将剥离的羊膜置于含双抗的磷酸盐缓冲液中反复冲洗去除血块；此操作方法较简单，节约时间；
3)培养
将整块羊膜平铺于平皿内，待水分慢慢挥发，用无菌组织剪将绒毛膜组织剪碎成大小1～3cm3，将所述组织块平铺于细胞培养皿中，静止20～30分钟后，加入含有10～20％胎牛血清的培养液中进行培养；
4)接种传代
所述羊膜组织原代分离培养间充质干细胞生长达到80～90％融合后，即可传代扩增培养，获得羊膜间充质干细胞，用0.25％胰酶/EDTA消化细胞，按5000～7000个/cm3接种，接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述间充质干细胞可以扩增至20代次以上；消化时间短，消化过程对细胞的损伤小，接种密度可以很好的控制细胞的生长周期，按此种消化，接种密度传代羊膜间充质干细胞可以扩增20代次以上。
作为优选的技术方案，所述步骤1)中的冲洗采用包含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲液和生理盐水。
作为优选的技术方案，所述步骤2)中的磷酸盐缓冲液采用包含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲液。
作为优选的技术方案，步骤3)中所述10～20％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-MEM基础培养液与胎牛血清，对干细胞的分离、增殖更有利，同时在长期扩增培养过程能更好的维持干细胞干性及生物学功能。
作为优选的技术方案，所述步骤3)中细胞培养皿中细胞培养3天后更换一次10～20％胎牛血清的培养液，之后每间隔2～3天更换10～20％胎牛血清的培养液，贴壁4～5天后即可见羊膜间充质干细胞从所述组织块中爬出，7～10天后羊膜间充质干细胞可以达到80～90％融合。
作为优选的技术方案，所述步骤3)中的含有10～20％胎牛血清的培养液用量为20～50ml/皿。
作为对上述技术方案的改进，还包括将步骤4)中获得的间充质干细胞进行质量评估，所述质量评估包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、分化功能、细菌检测、支原体检测、安全性评估。
采用所述方法建立的羊膜间充质干细胞生产规范、质量控制体系及评估体系，可以快速简便的获得临床研究与应用的间充质干细胞。
由于采用了上述技术方案，一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，1)处理，胎儿分娩后，用生理盐水冲洗胎盘组织，将清洗后的胎盘组织，以脐带根部为交叉中心剪十字切口，轻轻剥离羊膜层，将羊膜与绒毛层钝性分离；2)清洗，将剥离的羊膜置于含双抗的缓冲液中反复冲洗3次；3)培养，将整块羊膜平铺于平皿内，待水分慢慢挥发，用无菌组织剪将绒毛膜组织剪碎成大小1～3cm3，将所述组织块平铺于细胞培养皿中，静止20～30分钟后，加入含有10～20％胎牛血清的培养液中进行培养；4)接种传代，所述羊膜组织原代分离培养间充质干细胞生长达到80～90％融合后，即可传代扩增培养，获得羊膜间充质干细胞，用0.25％胰酶/EDTA消化细胞，按5000～7000个/cm3接种，接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述间充质干细胞可以扩增至20代次以上，本发明采用的组织块分离法获得的羊膜间充质干细胞方法简单，成本低，细胞活性好，纯度高，最终收获细胞浓度高，获得的间充质干细胞方法简单，培养时间缩短，培养第4～5天即可看到细胞从组织块爬出，最终收获细胞浓度高，整个干细胞分离制备培养工艺能够快速、高效从羊膜组织获取高纯度的间充质干细胞，细胞质量完全符合国家颁布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》，为临床应用提供保障；本发明从获取胎盘组织，清洗并轻轻剥离羊膜层、钝性分离羊膜和绒毛膜，控制组织块大小为1cm3，采用细胞培养皿进行平铺，水分挥发完全后再补液，对原代细胞的获得率得到明显的提高。
附图说明
图1为实施例3的剥离的羊膜；
图2组织剪碎并铺平的羊膜组织块
图3为实施例3的脐带间充质干细胞从组织块中爬出图；
图4为实施例3的脐带间充质干细胞流式检测图；
图5为实施例4的脐带间充质干细胞进行多向分化潜能鉴定图；
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了一种羊膜充质干细胞分离培养扩增方法以解决上述背景技术中的问题。
一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，包括下列步骤：
1)清理
胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用清洗液冲洗胎盘表面，清洗去除残留的血液与其他杂物；
2)处理
将清洗后的胎盘组织，以脐带根部为交叉中心剪十字切口，轻轻剥离羊膜层，将脐带和羊膜分离后，钝性分离羊膜和绒毛膜；将剥离的羊膜置于含双抗的磷酸盐缓冲液中反复冲洗去除血块；此操作方法较简单，节约时间；
3)培养
将整块羊膜平铺于平皿内，待水分慢慢挥发，用无菌组织剪将绒毛膜组织剪碎成大小1～3cm3，将所述组织块平铺于细胞培养皿中，静止20～30分钟后，加入含有10～20％胎牛血清的培养液中进行培养；
4)接种传代
所述羊膜组织原代分离培养间充质干细胞生长达到80～90％融合后，即可传代扩增培养，获得羊膜间充质干细胞，用0.25％胰酶/EDTA消化细胞，按5000～7000个/cm3接种，接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述间充质干细胞可以扩增至20代次以上；消化时间短，消化过程对细胞的损伤小，接种密度可以很好的控制细胞的生长周期，按此种消化，接种密度传代羊膜间充质干细胞可以扩增20代次以上。
所述步骤1)中的冲洗采用包含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲液和生理盐水。
所述步骤2)中的磷酸盐缓冲液采用包含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲液。
步骤3)中所述10～20％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-MEM基础培养液与胎牛血清，对干细胞的分离、增殖更有利，同时在长期扩增培养过程能更好的维持干细胞干性及生物学功能。
所述步骤3)中细胞培养皿中细胞培养3天后更换一次10～20％胎牛血清的培养液，之后每间隔2～3天更换10～20％胎牛血清的培养液，贴壁4～5天后即可见羊膜间充质干细胞从所述组织块中爬出，7～10天后羊膜间充质干细胞可以达到80～90％融合。
所述步骤3)中的含有10～20％胎牛血清的培养液用量为20～50ml/皿。
还包括将步骤4)中获得的间充质干细胞进行质量评估，所述质量评估包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、分化功能、细菌检测、支原体检测、安全性评估。
采用所述方法建立的羊膜间充质干细胞生产规范、质量控制体系及评估体系，可以快速简便的获得临床研究与应用的间充质干细胞。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：
1)清理，胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用清洗液冲洗胎盘表面，清洗去除残留的血液与其他杂物；
2)处理，将清洗后的胎盘组织，以脐带根部为交叉中心剪十字切口，轻轻剥离羊膜层，将脐带和羊膜分离后，钝性分离羊膜。将剥离的羊膜置于含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲液中反复冲洗去除血块，无菌组织剪将羊膜组织剪碎成大小2cm3。羊膜为一薄层膜样组织块，此操作方法较简单，节约时间；
3)培养，将所述羊膜组织块平铺于细胞培养皿中，待水分挥发后加入含有10％胎牛血清的培养液中进行培养；此操作的特点是组织块小，组织贴壁牢固，有利于间充质干细胞从组织块中爬出，能大量获得原代细胞；
4)接种传代，所述羊膜组织块原代分离间充质干细胞生长达到80％融合后，即可传代扩增培养，获得羊膜间充质干细胞，用0.25％胰酶/EDTA消化细胞，按5000个/cm3接种，所述羊膜间充质干细胞接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述羊膜间充质干细胞可以扩增至20代次以上。消化时间短，消化过程对细胞的损伤小，接种密度可以很好的控制细胞的生长周期，按此种消化，接种密度传代绒毛膜间充质干细胞可以扩增20代次以上。
所述步骤1)中清洗液含青霉素、链霉素的磷酸盐缓冲液。
步骤3)中所述10％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-MEM基础培养液与胎牛血清，对干细胞的分离、增殖更有利，同时在长期扩增培养过程能更好的维持干细胞干性及生物学功能。
还包括将步骤4)中获得的间充质干细胞进行质量评估，所述质量评估包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、分化功能、细菌检测、支原体检测、安全性评估。
所述步骤3)中细胞培养皿中细胞培养3天换一次10％胎牛血清的培养液，之后每间隔2～3天更换10％胎牛血清的培养液，贴壁4～5天后即可见羊膜间充质干细胞从所述组织块中爬出，7～10天后羊膜间充质干细胞可以达到80～90％融合。
实施例2：
一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，包括下列步骤：
1)清理，胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用清洗液冲洗胎盘表面，清洗去除残留的血液与其他杂物；
2)处理，将清洗后的胎盘组织，以脐带根部为交叉中心剪十字切口，轻轻剥离羊膜层，将脐带和羊膜分离后，钝性分离羊膜和绒毛膜。将剥离的羊膜置于含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲液中反复冲洗去除血块，无菌组织剪将绒毛膜组织剪碎成大小3cm3。羊膜为一薄层膜样组织块，此操作方法较简单，节约时间；
3)培养，将所述羊膜组织块平铺于细胞培养皿中，将水分挥发后加入含有20％胎牛血清的培养液中进行培养；此操作的特点是组织块小，组织贴壁牢固，有利于间充质干细胞从组织块中爬出，能大量获得原代细胞；
4)接种传代，所接种传代，所述羊膜组织块原代分离间充质干细胞生长达到90％融合后，即可传代扩增培养，获得羊膜间充质干细胞，用0.25％胰酶/EDTA消化细胞，按3000～5000个/cm3接种，所述羊膜间充质干细胞接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述羊膜间充质干细胞可以扩增至20代次以上。消化时间短，消化过程对细胞的损伤小，接种密度可以很好的控制细胞的生长周期，按此种消化，接种密度传代羊膜间充质干细胞可以扩增20代次以上。
步骤3)中所述20％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-MEM基础培养液与胎牛血清，对干细胞的分离、增殖更有利，同时在长期扩增培养过程能更好的维持干细胞干性及生物学功能。
还包括将步骤4)中获得的间充质干细胞进行质量评估，所述质量评估包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、分化功能、细菌检测、支原体检测、安全性评估。
所述步骤3)中细胞培养皿中细胞培养3天换一次20％胎牛血清的培养液，之后每间隔2～3天更换20％胎牛血清的培养液，贴壁4～5天后即可见羊膜间充质干细胞从所述组织块中爬出，7～10天后羊膜间充质干细胞可以达到90％融合。
所述步骤3)中加入50ml/皿的含有20％胎牛血清的培养液。
实施例3：
经过传染病等筛查，签署知情同意书和捐赠协议后的产妇，分娩后无菌收集胎盘组织，无菌条件下，先用含青霉素、链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗表面，清洗去除血管残留的血液和其他杂质。
以脐带根部为交叉中心剪十字切口，轻轻剥离羊膜层，将脐带和羊膜分离后，小心分离羊膜。将剥离的羊膜置于含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的PBS液中反复冲洗去除血块(见图1)，无菌组织剪将羊膜组织剪碎成1cm3大小的组织块(见图2)。
将组织平铺于细胞培养皿中，待水分挥发后加入含15％胎牛血清的完全培养液。
细胞培养3天换液，每间隔2-3天换液，贴壁4-5天后即可见细胞从组织块中爬出，7-10天后羊膜间充质干细胞可以达到85％融合；
用0.25％胰酶/EDTA消化细胞，按3000-5000个/cm3接种，细胞接种后4-5天可以达到95％融合传代。
所述述15％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-MEM基础培养液与胎牛血清。
将实施例3得到的羊膜简充质干细胞进行间充质干细胞干性维持，表面标记物流式分析三种培养液培养后的干细胞表面抗原，结果显示，获得的MSCs均质性好。均表达CD73、CD105、CD90；不表达CD45,CD34,CD11b,CD19 and HLA-DR。结果为羊膜间充质干细胞P10代流式检测CD73、CD90、CD105表达阳性，Negative--CD45,CD34,CD11b,CD19 and HLA-DR表达阴性，见图4。
实施例4：
将实施例3羊膜间充质干细胞进行多向分化潜能鉴定，其中图5A为成骨分化对照，图5B为成骨分化后茜素红染色；图5C为成脂分化对照，图5D为成脂分化后油红“O”染色；图5E为成软骨分化对照，图5F为成软骨分化后阿辛利蓝染色。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。
Claims (8)
1.一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)清理
胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用清洗液冲洗胎盘表面，清洗去除残留的血液与其他杂物；
2)处理
将清洗后的胎盘组织，以脐带根部为交叉中心剪十字切口，轻轻剥离羊膜层，将脐带和羊膜分离后，钝性分离羊膜和绒毛膜；将剥离的羊膜置于含双抗的磷酸盐缓冲液中反复冲洗去除血块；
3)培养
将整块羊膜平铺于平皿内，待水分慢慢挥发，用无菌组织剪将绒毛膜组织剪碎成大小1～3cm3，将所述组织块平铺于细胞培养皿中，静止20～30分钟后，加入含有10～20％胎牛血清的培养液中进行培养；
4)接种传代
所述羊膜组织原代分离培养间充质干细胞生长达到80～90％融合后，即可传代扩增培养，获得羊膜间充质干细胞，用0.25％胰酶/EDTA消化细胞，按5000～7000个/cm3接种，接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述间充质干细胞可以扩增至20代次以上。
2.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：所述步骤1)中的清洗液采用包含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲液和生理盐水。
3.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：所述步骤2)中的磷酸盐缓冲液采用包含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：步骤3)中所述10～20％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-MEM基础培养液与胎牛血清。
5.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：所述步骤3)中细胞培养皿中细胞培养3天后更换一次10～20％胎牛血清的培养液，之后每间隔2～3天更换10～20％胎牛血清的培养液，贴壁4～5天后即可见羊膜间充质干细胞从所述组织块中爬出，7～10天后羊膜间充质干细胞可以达到80～90％融合。
6.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：所述步骤3)中的含有10～20％胎牛血清的培养液用量为20～50ml/皿。
7.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：还包括将步骤4)中获得的间充质干细胞进行质量评估，所述质量评估包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、分化功能、细菌检测、支原体检测、安全性评估。
8.如权利要求1至7任意一项所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法其特征在于：采用所述方法建立的羊膜间充质干细胞生产规范、质量控制体系及评估体系，可以快速简便的获得临床研究与应用的间充质干细胞。
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