WO2022203022A1 - 羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法 - Google Patents

羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法 Download PDF

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WO2022203022A1
WO2022203022A1 PCT/JP2022/014149 JP2022014149W WO2022203022A1 WO 2022203022 A1 WO2022203022 A1 WO 2022203022A1 JP 2022014149 W JP2022014149 W JP 2022014149W WO 2022203022 A1 WO2022203022 A1 WO 2022203022A1
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amniotic membrane
cell population
derived
passage
cell
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PCT/JP2022/014149
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千穂 小林
伸彦 佐藤
梨緒 政安
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株式会社カネカ
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    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
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    • C12N2506/025—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells from extra-embryonic cells, e.g. trophoblast, placenta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells are somatic stem cells that have been reported to exist in bone marrow, adipose tissue, dental pulp, etc. Recently, it has been revealed that they also exist in fetal appendages such as the placenta, umbilical cord, and egg membrane. It's becoming Mesenchymal stem cells not only have the ability to differentiate into bone, cartilage, fat, etc., but also have immunosuppressive ability, and are being clinically applied to acute graft-versus-host disease (GVHD), Crohn's disease, and the like. I'm in.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • the amniotic membrane which is a type of fetal appendage, is a tissue that contains a large amount of mesenchymal stem cells, so it is attracting attention as a promising cell source for mesenchymal stem cells.
  • fetal appendages, including the amniotic membrane contain abundant epithelial cells in addition to mesenchymal stem cells, so it is necessary to separate epithelial cells from mesenchymal stem cells in order to obtain highly pure mesenchymal stem cells. .
  • contamination by epithelial cells has been prevented to some extent by physically peeling off unnecessary tissue fragments adhering to the amniotic membrane (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 to 3).
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a cell population, including efficiently separating a cell population containing highly purified mesenchymal stem cells from amniotic membrane.
  • the present invention provides a method for producing a cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells, comprising: (1) store the amniotic membrane in a medium for 4 hours or longer at -1°C or higher and 10°C or lower;
  • the present invention relates to a method for producing a cell population containing mesenchymal stem cells, comprising (2) then enzymatically treating the amniotic membrane (3) culturing a cell fraction containing mesenchymal stem cells after the enzymatic treatment.
  • a method for producing a cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells comprising: (1) a step of storing the amniotic membrane in a medium for 4 hours or longer at -1°C or higher and 25°C or lower; A method for producing a cell population containing mesenchymal stem cells, comprising the steps of (2) then enzymatically treating the amniotic membrane, and (3) culturing a cell fraction containing mesenchymal stem cells after the enzymatic treatment.
  • [3] The method for producing a cell population containing mesenchymal stem cells according to [1] or [2], wherein the medium is an aqueous solution, gel or sol.
  • [4] The method for producing a cell population containing mesenchymal stem cells according to any one of [1] to [3], wherein the enzyme is at least one selected from the group consisting of trypsin, collagenase and dispase.
  • [5] The method for producing a cell population containing mesenchymal stem cells according to any one of [1] to [4], wherein in step (1), the minced amniotic membrane is stored in a medium.
  • [6] The method for producing a cell population containing mesenchymal stem cells according to any one of [1] to [5], wherein in step (1), the amniotic membrane is stored at -1°C or higher and 10°C or lower.
  • the present invention it is possible to efficiently separate a highly pure cell population containing mesenchymal stem cells from the amniotic membrane, thereby enabling the production of cell preparations (pharmaceutical compositions) at low cost.
  • FIG. 1 is a microscope observation image of a cell population at passage 0 derived from donor A of Comparative Example 1.
  • FIG. FIG. 2 is a diagram showing the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 in the 0-passage cell population derived from donor A of Comparative Example 1.
  • FIG. Microscopic observation image of cell population at passage 0 derived from donor A in Example 1 (left: cell population obtained from amniotic membrane preserved for 120 hours in process 1, right: obtained from amniotic membrane preserved for 216 hours in process 1 cell population).
  • FIG. 2 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 after storage for 120 hours or 216 hours in the cell population at passage 0 derived from donor A of Example 1.
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 after storage for 120 hours or 216 hours in the cell population at passage 0 derived from donor A of Example 2; 3 is a microscopy image of a cell population at passage 0 derived from donor B of Example 3.
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 in the cell population at passage 0 derived from donor B of Example 3.
  • FIG. 4 is a microscopy image of a cell population at passage 0 derived from donor A of Example 4.
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 in the cell population at passage 0 derived from donor A in Example 4.
  • FIG. 10 is a microscopy image of a cell population at passage 0 derived from donor C of Example 5.
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 in the 0-passage cell population derived from donor C of Example 5.
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 after storage for 48 hours or 144 hours in the 0-passage cell population derived from donor B of Example 6.
  • FIG. 10 Microscopic observation image of cell population at passage 0 derived from donor B in Example 7 (left: cell population obtained from amniotic membrane preserved for 48 hours in process 1, right: obtained from amniotic membrane preserved for 144 hours in process 1 cell population).
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 after storage for 48 hours or 144 hours in the 0-passage cell population derived from donor B of Example 6.
  • FIG. Microscopic observation image of cell population at passage 0 derived from donor B in Example 7 (left: cell population obtained from amniotic membrane preserved for 48 hours in process 1, right: obtained from amniotic membrane preserved for 144 hours in process 1 cell population).
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 after storage for 48 hours or 144 hours in the cell population at passage 0 derived from donor B of Example 7; Microscopic observation image of cell population at passage 0 derived from donor B in Example 8 (left: cell population obtained from amniotic membrane preserved for 48 hours in process 1, right: obtained from amniotic membrane preserved for 144 hours in process 1 cell population).
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 after storage for 48 hours or 144 hours in the cell population at passage 0 derived from donor B of Example 7; Microscopic observation image of cell population at passage 0 derived from donor B in Example 8 (left: cell population obtained from amniotic membrane preserved for 48 hours in process 1, right: obtained from amniotic membrane preserved for 144 hours in process 1 cell population).
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 after storage for 48 hours or 144 hours in a cell population at passage 0 derived from donor B of Example 8; Microscopic observation image of cell population at passage 0 derived from donor C in Example 9 (left: cell population obtained from amniotic membrane preserved for 4 hours in process 1, right: obtained from amniotic membrane preserved for 94 hours in process 1 cell population).
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 after storage for 4 hours or 94 hours in the cell population at passage 0 derived from donor C of Example 9.
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 after storage for 4 hours or 94 hours in the cell population at passage 0 derived from donor C of Example 9.
  • FIG. 10 shows the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 after storage for 4 hours or 94 hours in the cell population at passage 0 derived from donor C of Example 10.
  • FIG. 4 is a microscope observation image of a cell population at passage 0 derived from donor C of Comparative Example 2.
  • FIG. 10 is a diagram showing the positive rate of surface antigens CD73, CD90, and CD326 after storage for 4 hours in a cell population at passage 0 derived from donor C of Comparative Example 2;
  • Fig. 10 is a microscopic observation image of a cell population at passage 0 derived from donor C of Comparative Example 3 (left: cell population 3 days after seeding in process 4; right: cell population 7 days after seeding in process 4).
  • amnion and chorion originate from the fetus.
  • Amniotic membrane refers to the innermost layer of the egg membrane, the thin, transparent thin film lacking blood vessels.
  • the inner layer of the amniotic membrane also called the epithelial cell layer
  • epithelial cell layer is covered with a single layer of epithelial cells that have a secretory function and secretes amniotic fluid, while the outer layer of the amniotic membrane (also called the extracellular matrix layer, which corresponds to the stroma) stores mesenchymal stem cells.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • a standard medium is a medium obtained by adding serum, a serum-replacement reagent, or a growth factor (eg, human platelet lysate, which is a serum-replacement reagent) to a basal medium (eg, ⁇ MEM medium).
  • a basal medium eg, ⁇ MEM medium.
  • the "cell population containing mesenchymal stem cells” as used herein is not particularly limited in its form, and includes, for example, cell pellets, cell aggregates, cell suspensions, and cell suspensions.
  • Amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells refers to mesenchymal stem cells derived from amnion, and is sometimes described as “amniotic membrane-derived MSCs”.
  • the “medium” in the present invention is not particularly limited, and may be in any state, property, or structure. For example, it may be in any state such as solid, liquid, or gas, and it may be in a mixed state. Specific examples include gels, sols, and aqueous solutions.
  • Gel refers to a substance in which colloidal particles are dispersed in a liquid or gas and have lost fluidity.
  • a sol refers to a substance in which colloidal particles are dispersed in a liquid or gas without losing fluidity, and examples thereof include milk, yogurt, and oil.
  • the sol/gel is preferably a colloid using water as a dispersion medium, and more preferably a so-called hydrogel.
  • Aqueous solutions refer to buffers, isotonic solutions, hypotonic solutions, hypertonic solutions, and the like. From the viewpoint of reducing damage to tissues, buffers and isotonic solutions are more preferable.
  • buffers such as phosphate buffered saline (PBS), Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) and Earle's Balanced Salt Solution (EBSS).
  • balanced salt solutions such as Ringer's solution, lactated Ringer's solution, infusions such as physiological saline, culture solutions, albumin solutions, aqueous solutions containing blood-derived components, or mixtures thereof.
  • an antibiotic may be added to the medium.
  • the medium according to the present invention may contain at least one selected from the group consisting of proteins, peptides, polysaccharides and synthetic polymers.
  • proteins proteins, peptides, polysaccharides and synthetic polymers.
  • polysaccharides or substances containing polysaccharides include agarose, pectin, carrageenan, curdlan, chitin, chitosan, alginic acids, soybean polysaccharides, celluloses such as carboxymethyl cellulose, mannans, gum arabic, gellan gum, guar gum, xanthan gum, starch, and agar. , fucoidan, etc. can be used.
  • Synthetic polymers that can be used include synthetic peptides (self-assembling peptides such as Panacea gel and PuraMatrix), polyvinyl alcohol, propylene glycol, silicon, and polyacrylamide. Moreover, even if it uses these individually, you may use it in combination of 2 or more.
  • the "medium” in the present invention preferably does not contain components that affect amniotic tissue, such as enzymes such as trypsin, collagenase, and dispase.
  • culture medium as used herein is not particularly limited, and any liquid medium for cell culture may be used as a basal medium, and other components (albumin, blood-derived components, growth factors, etc.) may be appropriately added as necessary. can be prepared by
  • BME medium BME medium, BGJb medium, CMRL1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium
  • IMDM medium Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • Medium 199 medium Eagle MEM medium, ⁇ MEM (Alphabic Modification of Minimum Essential Medium Eagle) medium, MEM- ⁇ (Minimum Essential Medium ⁇ ) medium
  • DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • Ham's F10 medium Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium
  • a medium such as a mixed medium (for example, DMEM/F12 medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham))
  • DMEM/F12 medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham
  • serum-free media can also be used.
  • albumin other components added to the basal medium include, for example, albumin, blood-derived components, growth factors and the like.
  • concentration of albumin is preferably 0.05% by mass or more and 5% by mass or less.
  • various serums animal-derived serum such as fetal bovine serum (FBS and FCS), human serum, platelet-rich plasma and platelet lysate derived from various animals and/or human blood are prepared as raw materials. serum, etc.), platelet lysates derived from various animal and/or human blood, plasma, and the like.
  • the human serum may be serum derived from the same individual from which the tissue containing adherent cells was obtained, or from a different individual.
  • the concentration of the blood-derived component is preferably 2% by volume or more and 40% by volume or less. More preferably, it is 3% by volume or more and 30% by volume or less.
  • a reagent for stabilizing the growth factor in the medium antioxidant such as heparin, gel, polysaccharide, etc.
  • Pre-stabilized growth factors may be added to the basal medium.
  • Growth factors include, for example, fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor (TGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), platelet-derived growth factor (PDGF), and their Family can be used, but is not particularly limited.
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • TGF transforming growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • the collected amniotic membrane is preserved by immersing it in the "medium” described in [1] Explanation of terms.
  • the amniotic membrane to be stored in the medium it is preferable to use finely chopped amniotic membrane because the efficiency of subsequent enzymatic treatment can be improved, but the collected amniotic membrane may be immersed as it is and then finely chopped.
  • the amniotic membrane must be stored for "4 hours or more". For example, 4 hours or more, or 5 hours or more. It is preferably 6 hours or longer, 8 hours or longer, or 10 hours or longer, and more preferably 12 hours or longer, 24 hours or longer, or 48 hours or longer.
  • the upper limit of the storage period of the amniotic membrane is not particularly limited, but may be, for example, 30 days or less, 25 days or less, 20 days or less, 15 days or less, or 10 days or less. Preferably, within 9 days, within 7 days, within 5 days, or within 3 days. Examples of the storage period include 4 hours to 30 days, 5 hours to 20 days, 6 hours to 10 days, 12 hours to 9 days, or 24 hours to 7 days.
  • the amniotic membrane must be stored at a temperature of "-1°C or higher and 25°C or lower".
  • the upper limit of the storage temperature is not particularly limited as long as it is 25°C or lower, but for example, 20°C or lower, 19°C or lower, 18°C or lower, 17°C or lower, 16°C or lower, 15°C or lower, 14°C or lower, 13°C or lower. , 12° C. or less, 11° C. or less, 10° C. or less, 9° C. or less, or 8° C. or less.
  • the lower limit of the storage temperature is not particularly limited as long as the water in the medium does not freeze. °C or higher, 6 °C or higher, or 7 °C or higher. Examples of temperature ranges include -1°C to 20°C, -1°C to 15°C, or -1°C to 10°C.
  • the process of separating a cell fraction containing mesenchymal stem cells from the preserved tissue can be performed, for example, by the following procedure.
  • the tissue after the storage may be treated with the enzyme as it is, it is preferably treated with the enzyme after being removed from the medium, then the adherent cells are separated by centrifugation, and the tissue is washed with a washing solution and centrifuged several times.
  • a cell fraction containing mesenchymal stem cells is obtained repeatedly.
  • the amniotic membrane may be finely cut with scissors before the enzymatic treatment in order to increase the efficiency of digestion by the enzyme, and the amniotic membrane may be washed as necessary.
  • the enzyme is not limited as long as it can at least partially digest the amniotic tissue and separate at least a portion of the adhesive cells contained in the amniotic tissue.
  • Digestive enzymes may be, for example, proteolytic enzymes (proteases).
  • proteolytic enzymes proteolytic enzymes
  • an enzyme solution containing one or more selected from trypsin, collagenase, dispase, etc. can be used, but the present invention is not limited thereto.
  • the enzymatic treatment solution can contain components such as magnesium salts and calcium salts necessary for the enzymatic treatment.
  • a step of producing a cell population containing mesenchymal cells from a cell fraction containing mesenchymal stem cells separated from a tissue containing adherent cells can be performed, for example, by the following procedure. First, the cell suspension, which is the cell fraction containing the mesenchymal stem cells, is centrifuged, the supernatant is removed, and the obtained cell pellet is suspended in a medium. Next, the cells are seeded in a culture vessel and cultured in a 37° C. environment with a CO 2 concentration of 3% or more and 5% or less using a medium so that the confluency rate is 95% or less.
  • the "culture solution” described in [1] Explanation of terms can be used, but the present invention is not limited thereto.
  • the cells obtained by culturing as described above are cells that have been cultured once.
  • the culture period for the above single culture is, for example, 2 to 21 days, more preferably 3 to 19 days, and still more preferably 4 to 17 days.
  • the cells that have been cultured once can be further subcultured and cultured as follows. First, cells that have been cultured once are treated with a cell detachment means to be described later and detached from the culture vessel. Next, the resulting cell suspension is centrifuged, the supernatant is removed, and the resulting cell pellet is suspended in medium. Finally, the cells are seeded in a culture vessel and cultured in a 37° C. environment with a CO 2 concentration of 3% or more and 5% or less using a medium so that the confluency rate is 95% or less. As the medium, the "culture solution" described in [1] Explanation of terms can be used, but the present invention is not limited to this.
  • Cells obtained by culturing can be subcultured n times by repeating passage and culture (n is an integer of 1 or more).
  • n is an integer of 1 or more.
  • the lower limit of the number of passages n is, for example, 1 or more, preferably 2 or more, more preferably 3 or more, and even more preferably 4 or more.
  • the upper limit of the passage number n is preferably, for example, 25 times or less, 20 times or less, 15 times or less, or 10 times or less from the viewpoint of suppressing cell aging.
  • a cell detachment agent may be used as the cell detachment means.
  • trypsin As the cell detachment agent, trypsin, collagenase, dispase, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and the like can be used, but are not particularly limited.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • a commercially available cell detachment agent may be used as the cell detachment agent. Examples include trypsin-EDTA solution (manufactured by Thermo Fisher Scientific), TrypLE Select (manufactured by Thermo Fisher Scientific), Accutase (manufactured by Stemcell Technologies), Accumax (manufactured by Stemcell Technologies) and the like, but are not limited to these.
  • a physical cell detachment means may be used, for example, a cell scraper (manufactured by Corning Inc.) can be used, but it is not limited to this.
  • the cell detachment means may be used singly or in combination.
  • the cell population containing mesenchymal stem cells obtained as described above can also be cryopreserved.
  • Means for cryopreserving a cell population containing mesenchymal stem cells are not particularly limited, but examples thereof include storage in a program freezer, deep freezer, and liquid nitrogen.
  • the freezing temperature is preferably ⁇ 30° C. or less, ⁇ 40° C. or less, ⁇ 50° C. or less, ⁇ 80° C. or less, ⁇ 90° C. or less, ⁇ 100° C. or less, or ⁇ 150° C. or less. , ⁇ 180° C. or less, or ⁇ 196° C. (liquid nitrogen temperature) or less.
  • the preferred freezing rate is, for example, 15° C./min or less, 11° C./min or less, 10° C./min or less, 9° C./min or less, 5° C./min or less, 2° C. /min or less, or 1°C/min or less.
  • a program freezer is used as the above freezing means, for example, at least between room temperature and -10 ° C.
  • the freezing rate is set to 1 ° C./min or more and 2 ° C./min or less, and other than that, it is cooled appropriately. It is preferable to change the speed to finally reach the target freezing temperature (eg -80°C to -150°C).
  • the temperature can be rapidly lowered to ⁇ 196° C. to freeze, and then cryopreserved in liquid nitrogen (gas phase). It can also be stored in liquid nitrogen (liquid phase).
  • the above cell population may be frozen in any storage container.
  • the storage container include, but are not limited to, cryotubes, cryovials, freezing bags, transfusion bags, and the like.
  • cryopreservation solution When freezing by the above freezing means, the above cell population may be frozen in any cryopreservation solution.
  • a commercially available cryopreservation solution may be used as the cryopreservation solution.
  • CP-1 registered trademark
  • BAMBANKER manufactured by Lymphotech
  • STEM-CELLBANKER manufactured by Nihon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
  • ReproCryo RM manufactured by Reprocell
  • CryoNovo Akron Biotechnology
  • MSC Freezing Solution Manufactured by Biological Industries
  • CryoStor manufactured by HemaCare
  • Cryopreservation solutions may be used singly or in combination.
  • the above cryopreservation solution can contain polysaccharides at a predetermined concentration.
  • Preferred concentrations of polysaccharides are, for example, 1% or more, 2% or more, 4% or more, or 6% or more by weight.
  • the preferable concentration of the polysaccharide is, for example, 20% by mass or less, 18% by mass or less, 16% by mass or less, 14% by mass or less, or 13% by mass or less.
  • Examples of polysaccharides include, but are not limited to, hydroxylethyl starch (HES) and dextran (Dextran 40, etc.). Polysaccharides may be used singly or in combination.
  • the above cryopreservation solution can contain a predetermined concentration of dimethylsulfoxide (DMSO).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • concentrations of DMSO are, for example, 1% or more, 2% or more, 3% or more, 4% or more, or 5% or more by weight.
  • the preferable concentration of DMSO is, for example, 20% by mass or less, 18% by mass or less, 16% by mass or less, 14% by mass or less, 12% by mass or less, or 10% by mass or less.
  • the above cryopreservation solution may contain albumin at a predetermined concentration higher than 0% by mass.
  • a preferred concentration of albumin is, for example, 1% by mass or more, 2% by mass or more, 3% by mass or more, or 4% by mass or more.
  • the preferable albumin concentration is, for example, 30% by mass or less, 20% by mass or less, 10% by mass or less, or 9% by mass or less.
  • albumin include, but are not limited to, bovine serum albumin (BSA), mouse albumin, human albumin, and the like.
  • the cell population containing mesenchymal stem cells obtained by the production method of the present invention has a ratio of CD73, CD90, and CD105-positive mesenchymal stem cells of 80% or more. may be satisfied.
  • CD73 means differentiation cluster 73, and is a protein also known as 5-Nucleotidase or Ecto-5'-nucleotidase.
  • CD90 is a protein that stands for Cluster of Differentiation 90 and is also known as Thy-1.
  • CD105 stands for Cluster of Differentiation 105 and is a protein also known as Endoglin.
  • the ratio of CD73-positive mesenchymal stem cells in the cell population obtained by the production method of the present invention is 80% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 100%.
  • the ratio of CD90-positive mesenchymal stem cells in the cell population obtained by the production method of the present invention is 80% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 100%.
  • the ratio of CD105-positive mesenchymal stem cells in the cell population obtained by the production method of the present invention is 80% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 100%.
  • the cell population containing mesenchymal stem cells obtained by the production method of the present invention satisfies that the ratio of mesenchymal stem cells that are negative for CD45 and CD31 is 80% or more, respectively. may be
  • CD45 means differentiation cluster 45, and is a protein also known as PTPRC (Protein Tyrosine Phosphatase, Receptor Type, C) or LCA (Leukocyte Common Antigen).
  • PTPRC Protein Tyrosine Phosphatase, Receptor Type, C
  • LCA Leukocyte Common Antigen
  • CD31 means differentiation cluster 31 and is a protein also known as hematopoietic progenitor cell antigen CD31.
  • the ratio of CD45-negative mesenchymal stem cells in the cell population obtained by the production method of the present invention is 80% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90%. 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 100%.
  • the ratio of CD31-negative mesenchymal stem cells in the cell population obtained by the production method of the present invention is 80% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90%. 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 100%.
  • the cell population obtained by the production method of the present invention is characterized by a low positive rate for the epithelial cell marker CD326.
  • the ratio of CD326-positive cells in the cell population obtained by the production method of the present invention is more preferably 10% or less (negative rate of 90% or more), 5% or less (negative rate of 95% or more). , 4% or less (negative rate of 96% or more), 2% or less (negative rate of 98% or more), 1% or less (negative rate of 99% or more), or 0% (negative rate of 100%).
  • ⁇ Comparative Example 1 Examination of preservation of amniotic membrane> (Process 1: Collection of amniotic membrane) Fetal appendages, the egg membrane and placenta, were aseptically harvested from a pregnant woman (donor A) who had an elective caesarean section with informed consent. The obtained egg membrane and placenta were placed in a container containing physiological saline, and the amniotic membrane was separated from the egg membrane stump. The amniotic membrane was washed with Hank's balanced salt solution (containing no Ca and Mg), the weight of the collected amniotic membrane was measured, and about 1 g of the amniotic membrane was used to quickly carry out process 2.
  • Hank's balanced salt solution containing no Ca and Mg
  • the surface antigen analysis was performed using Merck's Guava easyCyte Single with the number of analyzed cells: 10,000 cells and the flow rate setting: Medium.
  • APC REA control (manufactured by Miltenyi Biotec / model number: 130-113-434) was used as an isotype control antibody
  • APC Mouse Anti-Human CD73 (manufactured by Miltenyi Biotec / Model number: 130-112-061)
  • APC Mouse Anti-Human CD90 manufactured by Miltenyi Biotec / model number: 130-114-903
  • APC Mouse Anti-Human CD326 (Miltenyi Biotec/model number: 130-111-117) was used.
  • FIGS. 1-2 The results of surface antigen analysis are shown in Figure 1-2.
  • the cell population at passage 0 derived from donor A of Comparative Example 1 had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 98.5% and 83.6%, respectively, and epithelial cell markers.
  • the positive rate of CD326 was 74.6%.
  • the width of the histogram showing CD90 expression was widened, indicating that the degree of CD90 expression was heterogeneous.
  • Process 2 enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs
  • a cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs was obtained from the preserved amniotic membrane in the same manner as in Process 2 of Comparative Example 1.
  • Process 3 Culture of amnion-derived MSCs
  • a cell population at passage 0 was obtained and collected from the cell fraction containing amnion-derived MSCs in process 2 in the same manner as in process 3 of comparative example 1.
  • the results of surface antigen analysis are shown in Figure 2-2.
  • the 0 passage cell population obtained from the amniotic membrane derived from donor A in Example 1 and stored for 120 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 99.7% and 99.7%, respectively. 9%, and the epithelial cell marker CD326 positive rate was 1.2% (negative rate was 98.8%).
  • the 0 passage cell population obtained from the amniotic membrane derived from donor A in Example 1 and stored for 216 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 98.8% and 99.6%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 0.3% (negative rate was 99.7%).
  • Example 2 Examination of preservation of amniotic membrane> (Process 1: Collection and preservation of amniotic membrane) The amniotic membrane was collected in the same manner as in Process 1 of Comparative Example 1, and about 1 g of each of the chopped amniotic membranes was added to 4 mL of Hank's balanced salt solution (Ca/Mg-free) containing 5% (w/v) gelatin. containing) was embedded in a 15 mL centrifuge tube.
  • Ca/Mg-free Hank's balanced salt solution
  • the amniotic membrane is embedded by liquefying the prepared 5% (w/v) gelatin-containing Hank's balanced salt solution at 37°C, placing the amniotic membrane in the solution, and then quickly cooling it to 4°C to gel it. board. After that, it was stored under refrigeration (4 ° C.) for 120 hours (5 days) or 216 hours (9 days), respectively, and then heated to 37 ° C. to liquefy the 5% (w / v) gelatin-containing Hank's balanced salt solution. The amniotic membrane was removed using a pedestal, and process 2 was performed.
  • Process 2 enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs
  • a cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs was obtained from the preserved amniotic membrane in the same manner as in Process 2 of Comparative Example 1.
  • Process 3 Culture of amnion-derived MSCs
  • a cell population at passage 0 was obtained and collected from the cell fraction containing amnion-derived MSCs in process 2 in the same manner as in process 3 of comparative example 1.
  • the results of surface antigen analysis are shown in Figure 3-2.
  • the 0 passage cell population obtained from the amniotic membrane that was derived from donor A in Example 2 and stored for 120 hours had a positive rate of MSC markers CD73 and CD90 of 99.8%, respectively. 99.8%, and the epithelial cell marker CD326 positive rate was 2.8% (negative rate was 97.2%).
  • the 0 passage cell population obtained from the amniotic membrane derived from donor A in Example 2 and stored for 216 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 99.5% and 99.9%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 0.8% (negative rate was 99.2%).
  • Example 1 passage 0 cell populations obtained from amniotic membranes derived from donor A in Example 2 and stored for 120 hours or 216 hours, respectively, were compared with passage 0 cells derived from the same donor A in Comparative Example 1. It was found that the CD326 positive rate was remarkably low and the CD90 expression was uniform (sharp histogram) compared to the cell population of .
  • Example 3 Examination of preservation of amniotic membrane> (Process 1: Collection of amniotic membrane) Fetal appendages, the egg membrane and placenta, were aseptically harvested from a pregnant woman (donor B) who had an elective caesarean section with informed consent.
  • the obtained egg membrane and placenta were placed in a container containing physiological saline, and the amniotic membrane was separated from the egg membrane stump.
  • the amniotic membrane was washed with Hank's balanced salt solution (Ca-Mg free) and minced.
  • Approximately 13 g of shredded amniotic membrane was placed in a square medium bottle containing 150 mL of Hank's balanced salt solution (Ca-Mg free). After it was stored under refrigeration (4° C.) for 72 hours (3 days), process 2 was carried out.
  • the results of surface antigen analysis are shown in Figure 4-2.
  • the cell population at passage 0 derived from donor B in Example 3 had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 99.9% and 99.9%, respectively.
  • the positive rate of CD326 was 4.3%.
  • the 0-passage cell population obtained from the amniotic membrane derived from donor B in Example 3 and stored for 72 hours is the 0-passage cell population derived from donor A in Examples 1 and 2 and stored for 120 hours or more. It was found that the positive rate of CD326 was remarkably low and the expression of CD90 was uniform (sharp histogram) as in the cell population of the second generation.
  • Example 4 Examination of preservation of amniotic membrane> (Process 1: Collection of amniotic membrane) About 1 g of minced amniotic membrane treated in the same manner as in Comparative Example 1 and Examples 1 and 2 was placed in a 15 mL centrifuge tube containing 4 mL of MEM- ⁇ containing 5% by mass of hPL. After that, it was stored under refrigeration (4° C.) for 216 hours (9 days), and then Process 2 was carried out.
  • Process 2 enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs
  • a cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs was obtained from the preserved amniotic membrane in the same manner as in Process 2 of Comparative Example 1.
  • Process 3 Culture of amnion-derived MSCs
  • a cell population at passage 0 was obtained and collected from the cell fraction containing amnion-derived MSCs in process 2 in the same manner as in process 3 of comparative example 1.
  • the results of surface antigen analysis are shown in Figure 5-2.
  • the cell population at passage 0 derived from donor A in Example 4 had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 99.6% and 99.5%, respectively.
  • the CD326 positive rate was 0.4% (negative rate 99.6%).
  • the cell population at passage 0 obtained from the amniotic membrane derived from donor A in Example 4 and stored for 216 hours has a significantly positive rate of CD326 compared to the cell population at passage 0 derived from donor A in Comparative Example 1. It was found that the expression of CD90 was extremely low and the expression of CD90 was uniform (sharp histogram).
  • Example 5 Examination of preservation of amniotic membrane> (Process 1: Collection of amniotic membrane) Fetal appendages, the egg membrane and placenta, were aseptically harvested from a pregnant woman (donor C) who underwent elective caesarean section with informed consent. The obtained egg membrane and placenta were placed in a container containing physiological saline, and the amniotic membrane was separated from the egg membrane stump.
  • the amniotic membrane was washed with Hank's balanced salt solution (not containing Ca/Mg), and one piece of washed amniotic membrane (approximately 40 g) was placed in a rectangular shape containing 500 mL of Hank's balanced salt solution (not containing Ca/Mg). Housed in a medium bottle. After that, it was stored under refrigeration (4° C.) for 5 hours, and then process 2 was carried out.
  • Process 2 enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs
  • Process 2 of Comparative Example 1 After the preserved amniotic membrane was removed from the medium, it was subjected to enzyme treatment and filtration in the same manner as in Process 2 of Comparative Example 1 to obtain a cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs.
  • Process 3 Culture of amnion-derived MSCs
  • the cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs obtained in the above "Process 2: Enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs” was placed in a 10-stage cell stack (manufactured by Corning) in a culture vessel at 1,000 cells/cm 2 .
  • MEM- ⁇ Minimum Essential Medium ⁇
  • human platelet lysate a final concentration of 5% by volume.
  • MEM- ⁇ Minimum Essential Medium ⁇
  • This adherent cultured cell is called a 0 passage cell population.
  • the recovered cell population was suspended in a cryopreservation solution containing CP-1 (registered trademark) (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.): 25% by mass human serum albumin: physiological saline at a ratio of 2:1:3, and stored at -80. It was slowly frozen to °C and then stored frozen at -80°C.
  • CP-1 registered trademark
  • the results of surface antigen analysis are shown in Figure 6-2.
  • the cell population at passage 0 derived from donor C in Example 5 had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 99.9% and 100.0%, respectively, and epithelial cell markers.
  • the positive rate of CD326 was 3.8%.
  • the 0 passage cell population obtained from the amniotic membrane derived from donor C in Example 5 and stored for 5 hours has a significantly positive rate of CD326 compared to the 0 passage cell population derived from donor A in Comparative Example 1. It was found that the expression of CD90 was extremely low and the expression of CD90 was uniform (sharp histogram).
  • amniotic membrane-derived MSCs can be produced by the method of the example that satisfies the following conditions (1), (2), and (3).
  • (1) store the amniotic membrane in a medium for 4 hours or longer at -1°C or higher and 10°C or lower; (2) Then, the amniotic membrane is treated with an enzyme.
  • ⁇ Example 6 Examination of preservation of amniotic membrane> (Process 1: Collection and preservation of amniotic membrane)
  • a donor amniotic membrane (donor B) different from Comparative Example 1 and Examples 1 to 5 was collected, and about 1 g of each shredded amniotic membrane was added to 4 mL of Hank's balanced salt. It was housed in a 15 mL centrifuge tube containing the solution (not containing Ca/Mg). After that, they were stored under refrigeration (10° C.) for 48 hours (2 days) or 144 hours (6 days), respectively, and then Process 2 was carried out.
  • Process 2 enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs
  • a cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs was obtained from the preserved amniotic membrane in the same manner as in Process 2 of Comparative Example 1.
  • Process 3 Culture of amnion-derived MSCs
  • a cell population at passage 0 was obtained and collected from the cell fraction containing amnion-derived MSCs in process 2 in the same manner as in process 3 of comparative example 1.
  • the results of surface antigen analysis are shown in Figure 7-2.
  • the 0 passage cell population obtained from the amnion derived from donor B in Example 6 and stored for 48 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 99.2% and 99.9%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 4.4% (negative rate was 95.6%).
  • the 0 passage cell population obtained from the amniotic membrane derived from donor B in Example 6 and stored for 144 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 90.9% and 90.4%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 6.8% (negative rate was 93.2%).
  • Passage 0 cell populations obtained from amniotic membranes derived from donor B of Example 6 and stored for 48 hours or 144 hours, respectively, showed a CD326 , and the CD90 expression was uniform (sharp histogram).
  • Example 7 Examination of preservation of amniotic membrane> (Process 1: Collection and preservation of amniotic membrane)
  • a donor amniotic membrane (donor B) different from Comparative Example 1 and Examples 1 to 5 was collected, and about 1 g of each of the chopped amniotic membranes was added to 5% (w / 4 mL of Hank's balanced salt solution (Ca/Mg-free) containing gelatin in v) was placed in a 15 mL centrifuge tube.
  • Process 2 was carried out.
  • Process 2 enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs
  • a cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs was obtained from the preserved amniotic membrane in the same manner as in Process 2 of Comparative Example 1.
  • Process 3 Culture of amnion-derived MSCs
  • a cell population at passage 0 was obtained and collected from the cell fraction containing amnion-derived MSCs in process 2 in the same manner as in process 3 of comparative example 1.
  • the results of surface antigen analysis are shown in Figure 8-2.
  • the 0 passage cell population obtained from the amniotic membrane derived from donor B in Example 7 and stored for 48 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 98.6% and 99.6%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 6.2% (negative rate was 93.8%).
  • the cell population at passage 0 obtained from the amniotic membrane derived from donor B in Example 7 and stored for 144 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 97.8% and 99.9%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 2.2% (negative rate was 97.8%).
  • Passage 0 cell populations obtained from amniotic membranes derived from donor B of Example 7 and stored for 48 hours or 144 hours, respectively, showed a CD326 , and the CD90 expression was uniform (sharp histogram).
  • Example 8 Examination of preservation of amniotic membrane> (Process 1: Collection and preservation of amniotic membrane) In the same manner as in Process 1 of Comparative Example 1, a donor amniotic membrane (donor B) different from Comparative Example 1 and Examples 1 to 5 was collected, and about 1 g each of the shredded amniotic membrane was added to 5% by mass of hPL.
  • Process 2 was carried out.
  • Process 2 enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs
  • a cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs was obtained from the preserved amniotic membrane in the same manner as in Process 2 of Comparative Example 1.
  • Process 3 Culture of amnion-derived MSCs
  • a cell population at passage 0 was obtained and collected from the cell fraction containing amnion-derived MSCs in process 2 in the same manner as in process 3 of comparative example 1.
  • the results of surface antigen analysis are shown in Figure 9-2.
  • the cell population at passage 0 obtained from the amniotic membrane derived from donor B in Example 8 and stored for 48 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 98.9% and 99.2%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 8.4% (negative rate was 91.6%).
  • the 0 passage cell population obtained from the amnion derived from donor B in Example 8 and stored for 144 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 90.9% and 99.9%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 4.2% (negative rate was 95.8%).
  • Passage 0 cell populations obtained from amniotic membranes derived from Donor B of Example 8 and stored for 48 hours or 144 hours, respectively, showed a CD326 , and the CD90 expression was uniform (sharp histogram).
  • Example 9 Examination of preservation of amniotic membrane> (Process 1: Collection and preservation of amniotic membrane) In the same manner as Process 1 of Comparative Example 1, a donor amniotic membrane (donor C) different from Comparative Example 1 and Examples 1 to 8 was collected, and about 10 g of the cut amniotic membrane was added to 150 mL of Hank's balanced salt solution ( It was housed in a 250 mL square bottle containing Ca/Mg-free).
  • Process 2 was carried out.
  • Process 2 enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs
  • a cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs was obtained from the preserved amniotic membrane in the same manner as in Process 2 of Comparative Example 1.
  • Process 3 Culture of amnion-derived MSCs
  • a cell population at passage 0 was obtained and collected from the cell fraction containing amnion-derived MSCs in process 2 in the same manner as in process 3 of comparative example 1.
  • the results of surface antigen analysis are shown in Figure 10-2.
  • the 0 passage cell population obtained from the amniotic membrane derived from donor C in Example 9 and stored for 4 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 97.9% and 99.6%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 0.6% (negative rate was 99.4%).
  • the 0 passage cell population obtained from the amniotic membrane derived from donor C in Example 9 and stored for 94 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 97.0% and 99.3%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 1.3% (negative rate was 98.7%).
  • Passage 0 cell populations obtained from amniotic membranes derived from donor C of Example 9 and stored for 4 hours or 94 hours, respectively, showed a CD326 , and the CD90 expression was uniform (sharp histogram).
  • Example 10 Examination of preservation of amniotic membrane> (Process 1: Collection and preservation of amniotic membrane) In the same manner as Process 1 of Comparative Example 1, a donor amniotic membrane (donor C) different from Comparative Example 1 and Examples 1 to 8 was collected, and about 9 g of the cut amniotic membrane was added to 150 mL of Hank's balanced salt solution ( It was housed in a 250 mL square bottle containing Ca/Mg-free).
  • Process 2 was implemented after preserve
  • Process 2 enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs
  • a cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs was obtained from the preserved amniotic membrane in the same manner as in Process 2 of Comparative Example 1.
  • Process 3 Culture of amnion-derived MSCs
  • a cell population at passage 0 was obtained and collected from the cell fraction containing amnion-derived MSCs in process 2 in the same manner as in process 3 of comparative example 1.
  • the results of surface antigen analysis are shown in Figure 11-2.
  • the cell population at passage 0 obtained from the amniotic membrane derived from donor C in Example 10 and stored for 4 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 98.0% and 99.2%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 0.5% (negative rate was 99.5%).
  • the 0 passage cell population obtained from the amniotic membrane derived from donor C in Example 9 and stored for 94 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 97.9% and 98.8%, respectively.
  • the positive rate of epithelial cell marker CD326 was 9.3% (negative rate was 90.7%).
  • Passage 0 cell populations obtained from amniotic membranes derived from donor C of Example 10 and stored for 4 hours or 94 hours, respectively, showed a CD326 , and the CD90 expression was uniform (sharp histogram).
  • process 2 was carried out.
  • Process 2 enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs
  • a cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs was obtained from the preserved amniotic membrane in the same manner as in Process 2 of Comparative Example 1.
  • Process 3 Culture of amnion-derived MSCs
  • a cell population at passage 0 was obtained and collected from the cell fraction containing amnion-derived MSCs in process 2 in the same manner as in process 3 of comparative example 1.
  • the results of surface antigen analysis are shown in Figure 12-2.
  • the 0 passage cell population obtained from the amniotic membrane derived from donor C in Comparative Example 2 and stored for 4 hours had positive rates of MSC markers CD73 and CD90 of 98.8% and 99.2%, respectively.
  • the epithelial cell marker CD326 positive rate was 13.6%.
  • the width of the histogram showing CD90 expression was widened, indicating that the degree of CD90 expression was heterogeneous.
  • process 2 was carried out.
  • Process 2 enzymatic treatment of amniotic membrane and acquisition of amniotic membrane-derived MSCs
  • a cell fraction containing amniotic membrane-derived MSCs was obtained from the preserved amniotic membrane in the same manner as in Process 2 of Comparative Example 1.
  • Process 3 Culture of amnion-derived MSCs
  • the amnion-derived MSC-containing cell fraction of Process 2 was cultured in the same manner as in Process 3 of Comparative Example 1.
  • epithelial cells died selectively in cell populations obtained from amniotic membranes stored at 4°C or 20°C. Therefore, by preserving the amniotic membrane under low-temperature conditions of about 25°C or less, it is possible to selectively reduce the proportion of epithelial cells, and the resulting cell population contains a high proportion of mesenchymal stem cells. , has been shown to have beneficial effects.

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Abstract

本発明は、羊膜から高純度の間葉系幹細胞を含む細胞集団を効率的に分離することを含む、前記細胞集団の製造方法を提供することを課題とする。　羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、（１）羊膜を媒体中に４時間以上、－１℃以上２５℃以下で保存し、（２）その後、媒体から羊膜を取り出し、酵素処理し（３）酵素処理後、間葉系幹細胞を含む細胞画分を培養することを含む、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法を提供する。

Description

羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法
　本発明は、羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。
　間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、歯髄などに存在することが報告されている体性幹細胞であり、最近では、胎盤、臍帯、卵膜などの胎児付属物にも存在することが明らかになっている。間葉系幹細胞は、骨、軟骨、及び脂肪などに分化する能力を有するだけでなく、免疫抑制能も有しており、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及びクローン病などに対する臨床応用が進んでいる。
　胎児付属物の一種である羊膜は、間葉系幹細胞を多く含む組織であるため、間葉系幹細胞の有望な細胞ソースとして注目されている。しかしながら、羊膜を含む胎児付属物には間葉系幹細胞以外に上皮細胞も豊富に含むため、純度の高い間葉系幹細胞を取得するには、上皮細胞と間葉系幹細胞を分離する必要がある。従来の方法では、羊膜に付着している不要な組織片を物理的に剥離することなどで、上皮細胞の混入をある程度防いできたが（特許文献１、非特許文献１～３）、羊膜内部に存在する上皮細胞についてはこのような方法では除去が難しく、上皮細胞が一旦培養工程へ持ち込まれた場合は、両者とも接着性細胞であるためにその後の工程で分離・選別することが非常に難しい。そのような状況から、上皮細胞の混入を出来るだけ低減する方法が望まれている。
ＷＯ２０１５／０２５８１０号公報
Am J Obstet Gynecol. 2004;190(1):87-92. Am J Obstet Gynecol. 2006;194(3):664-73. Current Protocols in Stem Cell Biology 1E.5
　本発明は、羊膜から高純度の間葉系幹細胞を含む細胞集団を効率的に分離することを含む、前記細胞集団の製造方法を提供することを課題とする。
　上記課題の下で検討を進める中で、羊膜から間葉系幹細胞を含む細胞集団を分離する際の酵素処理効率を上げるため、羊膜を細切した後に酵素処理を行ったところ、目的とする間葉系幹細胞を含む細胞集団中の上皮細胞の混入率が著しく上昇する現象を認めた。本発明者らは、更に鋭意検討を進めた結果、驚くべきことに、羊膜を媒体に浸漬させ、一定期間保存した後に酵素処理することで、混入する上皮細胞の割合を減らすことができ、羊膜から間葉系幹細胞を含む細胞集団を高純度で効率的に分離できることを見出した。
　以上の成果に基づき、以下の本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、
（１）羊膜を媒体中に４時間以上、－１℃以上１０℃以下で保存する、
（２）その後、羊膜を酵素処理する
（３）酵素処理後、間葉系幹細胞を含む細胞画分を培養する
ことを含む、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。
　本発明はまた、以下を提供する。
［１］羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
（１）羊膜を媒体中に４時間以上、－１℃以上２５℃以下で保存する工程、
（２）その後、羊膜を酵素処理する工程、及び
（３）酵素処理後、間葉系幹細胞を含む細胞画分を培養する工程
を含む、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
［２］酵素処理の前に媒体から羊膜を取り出すことをさらに含む、［１］に記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
［３］媒体が、水溶液、ゲルまたはゾルである、［１］または［２］に記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
［４］酵素がトリプシン、コラゲナーゼ及びディスパーゼからなる群より選択される少なくとも１つである［１］～［３］のいずれかに記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
［５］工程（１）において、細切した羊膜を媒体に保存する、［１］～［４］のいずれかに記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
［６］工程（１）において、羊膜を－１℃以上１０℃以下で保存する、［１］～［５］のいずれかに記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-052792号の開示内容を包含する。なお、本明細書における図１－１及び図１－２は、日本国特許出願番号2021-052792号における図１及び表１に対応する。本明細書における図２－１及び図２－２は、日本国特許出願番号2021-052792号における図２及び表２に対応する。本明細書における図３－１及び図３－２は、日本国特許出願番号2021-052792号における図３及び表３に対応する。本明細書における図４－１及び図４－２は、日本国特許出願番号2021-052792号における図４及び表４に対応する。本明細書における図５－１及び図５－２は、日本国特許出願番号2021-052792号における図５及び表５に対応する。本明細書における図６－１及び図６－２は、日本国特許出願番号2021-052792号における図６及び表６に対応する。
　本発明によれば、羊膜から高純度で間葉系幹細胞を含む細胞集団を効率的に分離することができ、これにより、細胞製剤（医薬組成物）を低コストで製造することができる。
比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像である。 比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団における表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 実施例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像（左：プロセス１で１２０時間保存した羊膜から取得された細胞集団、右：プロセス１で２１６時間保存した羊膜から取得された細胞集団）である。 実施例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団の、１２０時間又は２１６時間保存後の表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 実施例２のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像（左：プロセス１で１２０時間保存した羊膜から取得された細胞集団、右：プロセス１で２１６時間保存した羊膜から取得された細胞集団）である。 実施例２のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団の、１２０時間又は２１６時間保存後の表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 実施例３のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像である。 実施例３のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団における表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 実施例４のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像である。 実施例４のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団における表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 実施例５のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像である。 実施例５のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団における表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 実施例６のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像（左：プロセス１で４８時間保存した羊膜から取得された細胞集団、右：プロセス１で１４４時間保存した羊膜から取得された細胞集団）である。 実施例６のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団の、４８時間又は１４４時間保存後の表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 実施例７のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像（左：プロセス１で４８時間保存した羊膜から取得された細胞集団、右：プロセス１で１４４時間保存した羊膜から取得された細胞集団）である。 実施例７のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団の、４８時間又は１４４時間保存後の表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 実施例８のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像（左：プロセス１で４８時間保存した羊膜から取得された細胞集団、右：プロセス１で１４４時間保存した羊膜から取得された細胞集団）である。 実施例８のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団の、４８時間又は１４４時間保存後の表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 実施例９のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像（左：プロセス１で４時間保存した羊膜から取得された細胞集団、右：プロセス１で９４時間保存した羊膜から取得された細胞集団）である。 実施例９のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団の、４時間又は９４時間保存後の表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 実施例１０のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像（左：プロセス１で４時間保存した羊膜から取得された細胞集団、右：プロセス１で９４時間保存した羊膜から取得された細胞集団）である。 実施例１０のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団の、４時間又は９４時間保存後の表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 比較例２のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像である。図中、白丸の内部の領域は上皮細胞を示す。 比較例２のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団の、４時間保存後の表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ３２６の陽性率を示す図である。 比較例３のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団の顕微鏡観察画像（左：プロセス４で播種３日後の細胞集団、右：プロセス４で播種７日後の細胞集団）である。
　以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。
［１］用語の説明
　本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯、及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜、及び脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は間葉系幹細胞を含む。
　本明細書における「間葉系幹細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ)」は、下記の定義を満たす幹細胞を指し、「間葉系間質細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ)」と区別なく用いられる。本明細書において、「間葉系幹細胞」は「ＭＳＣ」と記載されることがある。
　間葉系幹細胞の定義
i)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。標準培地は、基礎培地（例：αＭＥＭ培地）に血清、血清代替試薬又は増殖因子（例：血清代替試薬であるヒト血小板溶解物）を添加した培地である。
ii)表面抗原ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５が陰性。
　本明細書における「間葉系幹細胞を含む細胞集団」は、その形態は特に限定されず、例えば、細胞ペレット、細胞凝集塊、細胞浮遊液又は細胞懸濁液などが挙げられる。
　本明細書における「羊膜由来間葉系幹細胞」は、羊膜に由来する間葉系幹細胞を指し、「羊膜由来ＭＳＣ」と記載されることがある。
　本発明における「媒体」とは特に限定されず、どのような状態・性状・構造であっても構わない。例えば、固体、液体、気体などどのような性状であってもよく、その混合状態でも構わない。具体的な例としては、ゲルやゾル、水溶液などが挙げられる。ゲルとは、コロイド粒子が液体中や気体に分散し、流動性を失ったものを指し、例えば、こんにゃく、羊羹、寒天、プリンなどが挙げられる。ゾルとは、コロイド粒子が液体中や気体に分散し、流動性が失われていないものを指し、例えば、牛乳、ヨーグルト、油などが挙げられる。ゾル／ゲルとしては、水を分散媒とするコロイドが好ましく、いわゆるハイドロゲルがより好ましい。水溶液とは、緩衝液、等張液、低張液、高張液などを指す。組織へのダメージ低減の観点で、緩衝液や等張液がより好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）やアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）などの平衡塩類溶液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、生理食塩液などの輸液、培養液、アルブミン溶液、血液由来成分を含む水溶液、またはそれらの混合物などが挙げられる。また、菌の増殖抑制の観点で、抗生物質を上記媒体に添加しても良い。
　本発明に記載の媒体は、生体適合性の観点から、タンパク質、ペプチド、多糖及び合成高分子からなる群より選択される少なくとも１つを含んでいても良い。―上記タンパク質として、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、大豆タンパク質などが使用できる。多糖あるいは多糖を含む物質として、アガロース、ペクチン、カラギナン、カードラン、キチン、キトサン、アルギン酸類、大豆多糖類、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース類、マンナン類、アラビアガム、ジェランガム、グアーガム、キサンタンガム、澱粉、寒天、フコイダンなどが使用できる。合成高分子として、合成ペプチド（パナセアゲルやＰｕｒａＭａｔｒｉｘなどの自己組織化ペプチド）、ポリビニルアルコール、プロピレングリコール、シリコン、ポリアクリルアミドなどが使用できる。また、これらを単独で用いても、２個以上組み合わせて使用しても構わない。なお、本発明における「媒体」としては、羊膜の組織に影響を与えるような成分、例えばトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等の酵素を含まないのが好ましい。
　本明細書における「培養液」とは特に限定されず、任意の細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分（アルブミン、血液由来成分、増殖因子など）を適宜添加することにより調製することができる。
　上記基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ（Ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ）培地、ＭＥＭ－α（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　α）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ－１２　Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。また、市販の各種の無血清培地も使用できる。
　前記基礎培地に対して添加する他の成分としては、例えば、アルブミン、血液由来成分、増殖因子などが挙げられる。前記基礎培地にアルブミンを添加する態様においては、アルブミンの濃度は０．０５質量％以上、５質量％以下が好ましい。また、血液由来成分としては、各種の血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳやＦＣＳ）などの動物由来血清、ヒト血清、各種動物および／またはヒト血液由来の多血小板血漿や血小板溶解物を原料として調製される血清など）、各種動物および／またはヒト血液由来の血小板溶解物、血漿、などが挙げられる。ヒト血清は、接着性細胞を含む組織を取得した個体と同一個体由来の血清であっても、異なる個体由来であっても、どちらでも構わない。前記基礎培地に血液由来成分を添加する態様においては、血液由来成分の濃度は２体積％以上４０％体積以下が好ましい。より好ましくは３体積％以上３０％体積以下である。増殖因子を添加する態様においては、増殖因子を培地中で安定化させるための試薬（ヘパリンなどの抗凝固剤、ゲル、多糖類など）を、増殖因子に加えてさらに添加してもよいし、あらかじめ安定化させた増殖因子を前記基礎培地に対して添加してもよい。増殖因子は例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、及びそれらのファミリーを使用することができるが、特に限定されない。
［２］羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法
　間葉系幹細胞を含む胎児付属物を採取する工程は、例えば羊膜組織の場合、以下のような手順で行うことができる。出産時に胎児付属物（胎盤、卵膜など）を採取し、卵膜の断端から羊膜を剥離する。
　その後、採取した羊膜を［１］用語の説明で記載した「媒体」に浸漬することにより保存する。媒体に保存する羊膜は、細切した羊膜を用いることが、その後の酵素処理の効率を上げることができる点で好ましいが、採取した羊膜をそのまま浸漬後細切しても良い。
　羊膜の保存の期間は「４時間以上」を満たす必要がある。例えば、４時間以上、又は５時間以上である。好ましくは６時間以上、８時間以上、又は１０時間以上であり、より好ましくは１２時間以上、２４時間以上、又は４８時間以上である。また、羊膜の保存の期間の上限は特に限定されないが、例えば、３０日以内、２５日以内、２０日以内、１５日以内、１０日以内であってもよい。好ましくは、９日以内、７日以内、５日以内、又は３日以内である。保存期間の例としては、４時間以上３０日以内、５時間以上２０日以内、６時間以上１０日以内、１２時間以上９日以内、又は２４時間以上７日以内が挙げられる。
　本発明において、羊膜の保存の温度は「－１℃以上２５℃以下」を満たす必要がある。保存の温度の上限は２５℃以下であれば特に限定されないが、例えば、２０℃以下、１９℃以下、１８℃以下、１７℃以下、１６℃以下、１５℃以下、１４℃以下、１３℃以下、１２℃以下、１１℃以下、１０℃以下、９℃以下、又は８℃以下であってもよい。保存の温度の下限は媒体中の水が凍らない温度であれば特に限定されないが、例えば、－１℃以上、０℃以上、１℃以上、２℃以上、３℃以上、４℃以上、５℃以上、６℃以上、又は７℃以上である。温度範囲の例としては、－１℃以上２０℃以下、－１℃以上１５℃以下、又は－１℃以上１０℃以下が挙げられる。
　保存後の組織から、間葉系幹細胞を含む細胞画分を分離する工程は、例えば、以下のような手順で行うことができる。上記保存後の組織をそのまま酵素処理しても良いが、好ましくは媒体から取り出した後に酵素処理し、次に、遠心分離により接着性細胞を分離し、洗浄液を用いて洗浄と遠心分離を複数回繰り返して間葉系幹細胞を含む細胞画分を得る。その際、酵素による消化効率を上げるため、酵素処理前に羊膜をハサミで細かく切ってもよいし、必要に応じて羊膜を洗浄しても良い。酵素は、羊膜組織を少なくとも部分的に消化し、羊膜組織に含まれる接着性細胞の少なくとも一部を分離し得る消化酵素であれば限定しない。消化酵素は、例えばタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）であってもよい。酵素処理の溶液の例として、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼなどから選択される１種以上を含有する酵素液が使用できるが、本発明はこれらに限定されない。また、酵素処理の溶液は、酵素処理に必要なマグネシウム塩やカルシウム塩等の成分を含むことができる。
　接着性細胞を含む組織から分離した間葉系幹細胞を含む細胞画分から間葉系細胞を含む細胞集団を製造する工程は、例えば、以下のような手順にて行うことができる。まず、上記間葉系幹細胞を含む細胞画分である細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。次に、培養容器に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、［１］用語の説明で記載した「培養液」が使用できるが、本発明はこれに限定されない。上記のような培養により取得した細胞は、１回培養した細胞である。
上記の１回培養の培養期間としては、例えば２～２１日を挙げることができ、より好ましくは３～１９日、更に好ましくは４～１７日である。
　上記の１回培養した細胞は、例えば、以下のようにさらに継代し、培養することができる。まず、１回培養した細胞を、後述する細胞剥離手段にて処理して培養容器から剥離させる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。最後に、培養容器に細胞を播種し、３％以上、５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、［１］用語の説明で記載した「培養液」が使用できるが、本発明はこれに限定されない。
　培養によって取得した細胞は、継代及び培養を繰り返すことにより、ｎ回継代した細胞を取得することができる（ｎは１以上の整数を示す）。継代回数ｎの下限は、細胞を大量に製造する観点から、例えば、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上である。また、継代回数ｎの上限は、細胞の老化を抑える観点から、例えば、２５回以下、２０回以下、１５回以下、１０回以下であることが好ましい。
　上記の細胞剥離手段として、例えば、細胞剥離剤を使用してもよい。細胞剥離剤としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等を使用することができるが、特に限定されない。細胞剥離剤として、市販の細胞剥離剤を用いてもよい。例えば、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、細胞剥離手段として、物理的な細胞剥離手段を使用してもよく、例えば、セルスクレーパー（コーニング社製）を使用することができるが、これに限定されない。細胞剥離手段は、単独で使用してもよく、複数を組み合わせて使用してもよい。
　本発明においては、上記のようにして得られた間葉系幹細胞を含む細胞集団を凍結保存することも出来る。間葉系幹細胞を含む細胞集団を凍結保存するための手段は、特に限定されないが、例えば、プログラムフリーザー、ディープフリーザー、液体窒素での保存などが挙げられる。プログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の温度は、好ましくは－３０℃以下、－４０℃以下、－５０℃以下、－８０℃以下、－９０℃以下、－１００℃以下、－１５０℃以下、－１８０℃以下、又は－１９６℃（液体窒素温度）以下である。プログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の好ましい凍結速度は、例えば、１５℃／分以下、１１℃／分以下、１０℃／分以下、９℃／分以下、５℃／分以下、２℃／分以下、又は１℃／分以下である。上記の凍結手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、例えば、少なくとも室温から－１０℃の間は１℃／分以上２℃／分以下の凍結速度となるように設定した上で、それ以外は適宜冷却速度を変更し最終的には目的とする凍結温度（例えば－８０℃から－１５０℃）に到達させるのが好ましい。また、上記の凍結手段として液体窒素への浸漬を用いた場合、例えば、－１９６℃まで急速に温度を下げて凍結させた後、液体窒素（気相）中で凍結保存することができる。また液体窒素（液相）中で保存することもできる。
　上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の保存容器に入った状態で凍結されてよい。上記の保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の凍結保存液中で凍結されてもよい。上記の凍結保存液としては、市販の凍結保存液を用いてもよい。例えば、ＣＰ－１（登録商標）（極東製薬工業社製）、ＢＡＭＢＡＮＫＥＲ（リンフォテック社製）、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業社製）、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏ　ＲＭ（リプロセル社製）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（Ａｋｒｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＭＳＣ　Ｆｒｅｅｚｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（ＨｅｍａＣａｒｅ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。凍結保存液は、単独で使用してもよく、複数を組み合わせて使用してもよい。
　上記の凍結保存液は、所定濃度の多糖類を含有することができる。多糖類の好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、４質量％以上、又は６質量％以上である。また、多糖類の好ましい濃度は、例えば、２０質量％以下、１８質量％以下、１６質量％以下、１４質量％以下、又は１３質量％以下である。多糖類としては、例えば、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）やデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ４０など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。多糖類は、単独で使用してもよく、複数を組み合わせて使用してもよい。
　上記の凍結保存液は、所定濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有することができる。ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、又は５質量％以上である。また、ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、２０質量％以下、１８質量％以下、１６質量％以下、１４質量％以下、１２質量％以下、又は１０質量％以下である。
　上記の凍結保存液は、０質量％より多い所定濃度のアルブミンを含有するものでもよい。アルブミンの好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、又は４質量％以上である。また、アルブミンの好ましい濃度は、例えば、３０質量％以下、２０質量％以下、１０質量％以下、又は９質量％以下である。アルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マウスアルブミン、ヒトアルブミン等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本発明の一態様によれば、本発明の製造方法により得られる間葉系幹細胞を含む細胞集団は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率がそれぞれ８０％以上であることを満たしていてもよい。
　ＣＤ７３は、分化クラスター７３を意味し、５－Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ、或いはＥｃｔｏ－５’－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅとしても知られているタンパク質である。
　ＣＤ９０は、分化クラスター９０を意味し、Ｔｈｙ－１としても知られているタンパク質である。
　ＣＤ１０５は、分化クラスター１０５を意味し、Ｅｎｄｏｇｌｉｎとしても知られているタンパク質である。
　本発明の製造方法により得られる細胞集団においてＣＤ７３が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率は、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
　本発明の製造方法により得られる細胞集団においてＣＤ９０が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率は、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
　本発明の製造方法により得られる細胞集団においてＣＤ１０５が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率は、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
本発明の一態様によれば、本発明の製造方法により得られる間葉系幹細胞を含む細胞集団は、ＣＤ４５、ＣＤ３１が陰性を呈する間葉系幹細胞の比率がそれぞれ８０％以上であることを満たしていてもよい。
　ＣＤ４５は、分化クラスター４５を意味し、ＰＴＰＲＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ，Ｃ）、或いはＬＣＡ（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｃｏｍｍｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ）としても知られているタンパク質である。
　ＣＤ３１は、分化クラスター３１を意味し、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　ＣＤ３１としても知られているタンパク質である。
　本発明の製造方法により得られる細胞集団においてＣＤ４５が陰性を呈する間葉系幹細胞の比率は、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
　本発明の製造方法により得られる細胞集団においてＣＤ３１が陰性を呈する間葉系幹細胞の比率は、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
　また、本発明の製造方法では上皮細胞の混入を低減することが出来るため、本発明の製造方法で得られる細胞集団においては、上皮細胞マーカーであるＣＤ３２６の陽性率は低いという特徴がある。具体的には、本発明の製造方法により得られる細胞集団においてＣＤ３２６が陽性を呈する細胞の比率は、より好ましくは１０％以下（陰性率９０％以上）、５％以下（陰性率９５％以上）、４％以下（陰性率９６％以上）、２％以下（陰性率９８％以上）、１％以下（陰性率９９％以上）でもよく、０％（陰性率１００％）でもよい。
　以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜比較例１:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取）
　インフォームドコンセントを得た選択的帝王切開症例の妊婦（ドナーＡ）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った容器に収容し、卵膜の断端から羊膜を剥離した。その羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、採取した羊膜の重量を測定し、うち約１ｇの羊膜を用いて速やかにプロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記約１ｇの羊膜を、２４０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼと２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩとを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）中で、３７℃にて９０分間、振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を、ストレイナーでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　上述の「プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得」で得られた羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を、培養容器のＴ－２５フラスコ（コーニング社製）に１／５量播種し、終濃度にして５体積％のヒト血液由来のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むＭＥＭ－α（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　α）にて接着培養した。この接着培養した細胞を、０継代目の細胞集団と呼ぶ。サブコンフルエントに達した時点でＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを用いて剥離し、２体積％ｈＰＬ含有生理食塩液を用いて希釈し、遠心分離により回収した。回収した細胞集団はＣＰ－１（登録商標）（極東製薬工業社製）：２５質量％ヒト血清アルブミン：生理食塩液＝２：１：３の比で混合した凍結保存溶液に懸濁し、－８０℃まで緩慢凍結し、その後も－８０℃で凍結保存した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
　上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。結果を図１－１に示す。
　その結果、比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団には羊膜由来ＭＳＣだけでなく、上皮細胞（図１－１の〇）が多く混入していることがわかった。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析は、メルク（ＭＥＲＣＫ）社のＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ Ｓｉｎｇｌｅを用い、解析細胞数：１０，０００ｃｅｌｌｓ、流速設定：Ｍｅｄｉｕｍにて実施した。本測定では、アイソタイプコントロール用抗体としてＡＰＣ ＲＥＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｓ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製／型番：１３０－１１３－４３４）を使用し、ＣＤ７３抗原に対する抗体としてＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ７３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製／型番：１３０－１１２－０６１）を、ＣＤ９０抗原に対する抗体としてＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ９０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製／型番：１３０－１１４－９０３）を、ＣＤ３２６抗原に対する抗体としてＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３２６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製／型番：１３０－１１１－１１７）を使用した。
　表面抗原解析の結果を図１－２に示す。表面抗原解析の結果、比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９８．５％、８３．６％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は７４．６％であった。さらに、図１－２に示すように、ＣＤ９０の発現を示すヒストグラムの幅が広くなっており、ＣＤ９０発現の程度が不均一であることもわかった。
　以上の結果から、比較例１の０継代目の細胞集団には、上皮細胞が多く混入しており、純度の低い間葉系幹細胞を含む細胞集団であることが確認された。
＜実施例１:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取および保存）
　比較例１のプロセス１と同様の手法にて、羊膜を採取し、細切した羊膜各約１ｇを、４ｍＬのハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）が入った１５ｍＬ遠沈管に収容した。その後、冷蔵（４℃）下で１２０時間（５日間）または２１６時間（９日間）それぞれ保存した後、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜から、比較例１のプロセス２と同様の手法にて、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　比較例１のプロセス３と同様の手法にて、プロセス２の羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分から０継代目の細胞集団を取得、回収した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。結果を図２－１に示す。
　その結果、実施例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に上皮細胞の混入は確認されず、羊膜由来ＭＳＣが培養面全体に増殖していることがわかった。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のプロセス５と同様の手法にて、実施例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析の結果を図２－２に示す。表面抗原解析の結果、実施例１のドナーＡに由来し１２０時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９９．７％、９９．９％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は１．２％（陰性率は９８．８％）であった。実施例１のドナーＡに由来し２１６時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９８．８％、９９．６％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は０．３％（陰性率は９９．７％）であった。実施例１のドナーＡに由来し、それぞれ１２０時間または２１６時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、比較例１の同じドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に比べてＣＤ３２６の陽性率が顕著に低く、ＣＤ９０の発現も均一（ヒストグラムがシャープ）であることがわかった。
　以上の結果から、実施例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団には、上皮細胞が確認されず、純度の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造できていることが確認された。
＜実施例２:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取および保存）
　比較例１のプロセス１と同様の手法にて、羊膜を採取し、細切した羊膜各約１ｇを、５％（ｗ／ｖ）のゼラチンを含有する４ｍＬのハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）が入った１５ｍＬ遠沈管中に包埋した。羊膜の包埋は、調製した５％（ｗ／ｖ）ゼラチン含有ハンクス平衡塩溶液を３７℃で液化させ、羊膜を当該溶液に入れた後に速やかに４℃まで冷却してゲル化させる方法を用いた。その後、冷蔵（４℃）下で１２０時間（５日間）または２１６時間（９日間）それぞれ保存した後、３７℃に加温して５％（ｗ／ｖ）ゼラチン含有ハンクス平衡塩溶液を液化させて羊膜を取り出し、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜から、比較例１のプロセス２と同様の手法にて、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　比較例１のプロセス３と同様の手法にて、プロセス２の羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分から０継代目の細胞集団を取得、回収した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。結果を図３－１に示す。
　その結果、実施例２のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に上皮細胞の混入は確認されず、羊膜由来ＭＳＣが培養面全体に増殖していることがわかった。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のプロセス５と同様の手法にて、実施例２のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析の結果を図３－２に示す。表面抗原解析の結果、実施例２のドナーＡに由来し、１２０時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９９．８％、９９．８％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は２．８％（陰性率は９７．２％）であった。実施例２のドナーＡに由来し、２１６時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９９．５％、９９．９％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は０．８％（陰性率は９９．２％）であった。実施例１と同様に、実施例２のドナーＡに由来しそれぞれ１２０時間または２１６時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、比較例１の同じドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に比べてＣＤ３２６の陽性率が顕著に低く、ＣＤ９０の発現も均一（ヒストグラムがシャープ）であることがわかった。
　以上の結果から、実施例２の０継代目の細胞集団には、上皮細胞が確認されず、純度の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造できていることが確認された。
また、実施例１および実施例２の０継代目の細胞集団の表面抗原解析から、羊膜を媒体で保存する期間が長くなるにつれて上皮細胞マーカーの陽性率が低くなる傾向が明らかになり、より純度が高くなることもわかった。
＜実施例３:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取）
　インフォームドコンセントを得た選択的帝王切開症例の妊婦（ドナーＢ）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った容器に収容し、卵膜の断端から羊膜を剥離した。その羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、細切した。細切りした羊膜約１３ｇを１５０ｍＬのハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）が入った角型培地瓶に収容した。それを、冷蔵（４℃）下で７２時間（３日間）保存した後、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜１３ｇを、２４０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼと２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩとを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）中で、３７℃にて９０分間、振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を、ストレイナーでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　上述の「プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得」で得られた羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を、培養容器のＴ－７５フラスコ（コーニング社製）に１，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、終濃度にして５体積％のｈＰＬを含むＭＥＭ－α（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　α）にて接着培養した。この接着培養した細胞を、０継代目の細胞集団と呼ぶ。サブコンフルエントに達した時点でＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを用いて剥離し、８体積％ｈＰＬ含有生理食塩液を用いて希釈し、遠心分離により回収した。回収した細胞集団はＣＰ－１（登録商標）（極東製薬工業社製）：２５質量％ヒト血清アルブミン：生理食塩液＝２：１：３の比で混合した凍結保存溶液に懸濁し、－８０℃まで緩慢凍結し、その後も－８０℃で凍結保存した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
　上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。結果を図４－１に示す。
　その結果、実施例３のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団に上皮細胞の混入は確認されず、羊膜由来ＭＳＣが増殖していることがわかった。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のプロセス５と同様の手法にて、実施例３のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析の結果を図４－２に示す。表面抗原解析の結果、実施例３のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９９．９％、９９．９％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は４．３％であった。実施例３のドナーＢに由来し７２時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、実施例１や２のドナーＡに由来し、１２０時間以上保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団と同様ＣＤ３２６の陽性率が顕著に低く、ＣＤ９０の発現も均一（ヒストグラムがシャープ）であることがわかった。
　以上の結果から、実施例３の０継代目の細胞集団には、上皮細胞が確認されず、純度の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造できていることが確認された。
＜実施例４:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取）
　比較例１，実施例１，２と同様の処理を行い細切した羊膜約１ｇを、５質量％のｈＰＬを含有する４ｍＬのＭＥＭ－αが入った１５ｍＬ遠沈管中に収容した。その後、冷蔵（４℃）下で２１６時間（９日間）保存した後、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜から、比較例１のプロセス２と同様の手法にて、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　比較例１のプロセス３と同様の手法にて、プロセス２の羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分から０継代目の細胞集団を取得、回収した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
　上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。結果を図５－１に示す。
　その結果、実施例４のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に上皮細胞の混入は確認されず、羊膜由来ＭＳＣが培養面全体に増殖していることがわかった。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のプロセス５と同様の手法にて、実施例４のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析の結果を図５－２に示す。表面抗原解析の結果、実施例４のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９９．６％、９９．５％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は０．４％（陰性率９９．６％）であった。実施例４のドナーＡに由来し２１６時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に比べてＣＤ３２６の陽性率が顕著に低く、ＣＤ９０の発現も均一（ヒストグラムがシャープ）であることがわかった。
　以上の結果から、実施例４の０継代目の細胞集団には、上皮細胞が確認されず、純度の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造できていることが確認された。
＜実施例５:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取）
　インフォームドコンセントを得た選択的帝王切開症例の妊婦（ドナーＣ）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った容器に収容し、卵膜の断端から羊膜を剥離した。その羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、洗浄後の１枚の羊膜（約４０ｇ）をそのまま５００ｍＬのハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）が入った角型培地瓶に収容した。その後、冷蔵（４℃）下で５時間保存した後、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜を媒体から取り出した後、比較例１のプロセス２と同様の手法にて酵素処理とろ過を行い、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　上述の「プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得」で得られた羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を、培養容器の１０段セルスタック（コーニング社製）に１，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、終濃度にして５体積％のヒト血小板溶解物を含むＭＥＭ－α（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　α）にて接着培養した。この接着培養した細胞を、０継代目の細胞集団と呼ぶ。サブコンフルエントに達した時点でＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを用いて剥離し、培地を用いて希釈し、遠心分離により回収した。回収した細胞集団はＣＰ－１（登録商標）（極東製薬工業社製）：２５質量％ヒト血清アルブミン：生理食塩液＝２：１：３の比で混合した凍結保存溶液に懸濁し、－８０℃まで緩慢凍結し、その後も－８０℃で凍結保存した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
　上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。結果を図６－１に示す。
　その結果、実施例５のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団に上皮細胞の混入は確認されず、羊膜由来ＭＳＣが培養面全体に増殖していることがわかった。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のプロセス５と同様の手法にて、実施例５のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析の結果を図６－２に示す。表面抗原解析の結果、実施例５のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９９．９％、１００．０％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は３．８％であった。実施例５のドナーＣに由来し５時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に比べてＣＤ３２６の陽性率が顕著に低く、ＣＤ９０の発現も均一（ヒストグラムがシャープ）であることがわかった。
　以上の結果から、実施例５の０継代目の細胞集団には、上皮細胞が確認されず、純度の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造できていることが確認された。
　以上より、下記（１）（２）（３）の条件を満たした実施例の方法では、純度の高い羊膜由来ＭＳＣを製造できることが分かった。
（１）羊膜を媒体中に４時間以上、－１℃以上１０℃以下で保存する、
（２）その後、羊膜を酵素処理する
（３）酵素処理後、間葉系幹細胞を含む細胞画分を培養する
　つまり、本発明によれば、純度の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を羊膜から効率的に分離することが可能となる。これにより、患者への治療提供機会の拡大、細胞培養者の負担軽減、製造費や医療コストの削減が期待できる。
＜実施例６:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取および保存）
　比較例１のプロセス１と同様の手法にて、比較例１および実施例１～５とは異なるドナーの羊膜（ドナーＢ）を採取し、細切した羊膜各約１ｇを、４ｍＬのハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）が入った１５ｍＬ遠沈管に収容した。その後、冷蔵（１０℃）下で４８時間（２日間）または１４４時間（６日間）それぞれ保存した後、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜から、比較例１のプロセス２と同様の手法にて、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　比較例１のプロセス３と同様の手法にて、プロセス２の羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分から０継代目の細胞集団を取得、回収した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
　上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。
　結果を図７－１に示す。実施例６のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団に上皮細胞の混入は確認されず、羊膜由来ＭＳＣが培養面全体に増殖していることがわかった（図７－１）。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のプロセス５と同様の手法にて、実施例６のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析の結果を図７－２に示す。実施例６のドナーＢに由来し４８時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９９．２％、９９．９％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は４．４％（陰性率は９５．６％）であった。実施例６のドナーＢに由来し１４４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９０．９％、９０．４％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は６．８％（陰性率は９３．２％）であった。実施例６のドナーＢに由来し、それぞれ４８時間または１４４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に比べてＣＤ３２６の陽性率が顕著に低く、ＣＤ９０の発現も均一（ヒストグラムがシャープ）であることがわかった。
　以上の結果から、実施例６のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団には、上皮細胞が確認されず、純度の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造できていることが確認された。
＜実施例７:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取および保存）
　比較例１のプロセス１と同様の手法にて、比較例１および実施例１～５とは異なるドナーの羊膜（ドナーＢ）を採取し、細切した羊膜各約１ｇを、５％（ｗ／ｖ）のゼラチンを含有する４ｍＬのハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）が入った１５ｍＬ遠沈管に収容した。その後、冷蔵（１０℃）下で４８時間（２日間）または１４４時間（６日間）それぞれ保存した後、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜から、比較例１のプロセス２と同様の手法にて、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　比較例１のプロセス３と同様の手法にて、プロセス２の羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分から０継代目の細胞集団を取得、回収した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。
　結果を図８－１に示す。実施例７のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団に上皮細胞の混入は確認されず、羊膜由来ＭＳＣが培養面全体に増殖していることがわかった（図８－１）。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のプロセス５と同様の手法にて、実施例７のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析の結果を図８－２に示す。実施例７のドナーＢに由来し４８時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９８．６％、９９．６％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は６．２％（陰性率は９３．８％）であった。実施例７のドナーＢに由来し１４４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９７．８％、９９．９％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は２．２％（陰性率は９７．８％）であった。実施例７のドナーＢに由来し、それぞれ４８時間または１４４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に比べてＣＤ３２６の陽性率が顕著に低く、ＣＤ９０の発現も均一（ヒストグラムがシャープ）であることがわかった。
　以上の結果から、実施例７のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団には、上皮細胞が確認されず、純度の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造できていることが確認された。
＜実施例８:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取および保存）
　比較例１のプロセス１と同様の手法にて、比較例１および実施例１～５とは異なるドナーの羊膜（ドナーＢ）を採取し、細切した羊膜各約１ｇを、５質量％のｈＰＬを含有する４ｍＬのＭＥＭ－αが入った１５ｍＬ遠沈管に収容した。その後、冷蔵（１０℃）下で４８時間（２日間）または１４４時間（６日間）それぞれ保存した後、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜から、比較例１のプロセス２と同様の手法にて、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　比較例１のプロセス３と同様の手法にて、プロセス２の羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分から０継代目の細胞集団を取得、回収した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。
　結果を図９－１に示す。実施例８のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団に上皮細胞の混入は確認されず、羊膜由来ＭＳＣが培養面全体に増殖していることがわかった（図９－１）。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のプロセス５と同様の手法にて、実施例８のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析の結果を図９－２に示す。実施例８のドナーＢに由来し４８時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９８．９％、９９．２％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は８．４％（陰性率は９１．６％）であった。実施例８のドナーＢに由来し１４４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９０．９％、９９．９％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は４．２％（陰性率は９５．８％）であった。実施例８のドナーＢに由来し、それぞれ４８時間または１４４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に比べてＣＤ３２６の陽性率が顕著に低く、ＣＤ９０の発現も均一（ヒストグラムがシャープ）であることがわかった。
　以上の結果から、実施例８のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団には、上皮細胞が確認されず、純度の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造できていることが確認された。
＜実施例９:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取および保存）
　比較例１のプロセス１と同様の手法にて、比較例１および実施例１～８とは異なるドナーの羊膜（ドナーＣ）を採取し、切断した羊膜約１０ｇを、１５０ｍＬのハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）が入った２５０ｍＬ角型ボトルに収容した。その後、冷蔵（４℃）下で４時間または９４時間（４日間）それぞれ保存した後、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜から、比較例１のプロセス２と同様の手法にて、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　比較例１のプロセス３と同様の手法にて、プロセス２の羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分から０継代目の細胞集団を取得、回収した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。
　結果を図１０－１に示す。実施例９のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団に上皮細胞の混入は確認されず、羊膜由来ＭＳＣが培養面全体に増殖していることがわかった（図１０－１）。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のプロセス５と同様の手法にて、実施例９のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析の結果を図１０－２に示す。実施例９のドナーＣに由来し４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９７．９％、９９．６％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は０．６％（陰性率は９９．４％）であった。実施例９のドナーＣに由来し９４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９７．０％、９９．３％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は１．３％（陰性率は９８．７％）であった。実施例９のドナーＣに由来し、それぞれ４時間または９４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に比べてＣＤ３２６の陽性率が顕著に低く、ＣＤ９０の発現も均一（ヒストグラムがシャープ）であることがわかった。
　以上の結果から、実施例９のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団には、上皮細胞が確認されず、純度の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造できていることが確認された。
＜実施例１０:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取および保存）
　比較例１のプロセス１と同様の手法にて、比較例１および実施例１～８とは異なるドナーの羊膜（ドナーＣ）を採取し、切断した羊膜約９ｇを、１５０ｍＬのハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）が入った２５０ｍＬ角型ボトルに収容した。その後、室温（２０℃）下で４時間または９４時間（４日間）それぞれ保存した後、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜から、比較例１のプロセス２と同様の手法にて、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　比較例１のプロセス３と同様の手法にて、プロセス２の羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分から０継代目の細胞集団を取得、回収した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。
　結果を図１１－１に示す。実施例１０のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団に上皮細胞の混入は確認されず、羊膜由来ＭＳＣが培養面全体に増殖していることがわかった（図１１－１）。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のプロセス５と同様の手法にて、実施例１０のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析の結果を図１１－２に示す。実施例１０のドナーＣに由来し４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９８．０％、９９．２％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は０．５％（陰性率は９９．５％）であった。実施例９のドナーＣに由来し９４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９７．９％、９８．８％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は９．３％（陰性率は９０．７％）であった。実施例１０のドナーＣに由来し、それぞれ４時間または９４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団に比べてＣＤ３２６の陽性率が顕著に低く、ＣＤ９０の発現も均一（ヒストグラムがシャープ）であることがわかった。
　以上の結果から、実施例９のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団には、上皮細胞が確認されず、純度の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造できていることが確認された。
＜比較例２:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取および保存）
　比較例１のプロセス１と同様の手法にて、比較例１および実施例１～８とは異なるドナーの羊膜（ドナーＣ）を採取し、切断した羊膜約５ｇを、１５０ｍＬのハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）が入った２５０ｍＬ角型ボトルに収容した。その後、３７℃で４時間保存した後、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜から、比較例１のプロセス２と同様の手法にて、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　比較例１のプロセス３と同様の手法にて、プロセス２の羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分から０継代目の細胞集団を取得、回収した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。
　結果を図１２－１に示す。比較例２のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団に羊膜由来ＭＳＣだけでなく、上皮細胞（図１２－１の〇）が多く混入していることがわかった（図１２－１）。
（プロセス５：表面抗原解析）
　比較例１のプロセス５と同様の手法にて、比較例２のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ３２６の陽性率）を測定した。
　表面抗原解析の結果を図１２－２に示す。比較例２のドナーＣに由来し４時間保存した羊膜から得られた０継代目の細胞集団は、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性率がそれぞれ９８．８％、９９．２％であり、上皮細胞マーカーのＣＤ３２６の陽性率は１３．６％であった。さらに、表１２に示すように、ＣＤ９０の発現を示すヒストグラムの幅が広くなっており、ＣＤ９０発現の程度が不均一であることもわかった。
　以上の結果から、比較例２のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団には、上皮細胞が多く混入しており、純度の低い間葉系幹細胞を含む細胞集団であることが確認された。
＜比較例３:羊膜保存の検討＞
（プロセス１：羊膜の採取および保存）
　比較例１のプロセス１と同様の手法にて、比較例１および実施例１～８とは異なるドナーの羊膜（ドナーＣ）を採取し、切断した羊膜約５ｇを、１５０ｍＬのハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）が入った２５０ｍＬ角型ボトルに収容した。その後、３７℃で９４時間保存した後、プロセス２を実施した。
（プロセス２：羊膜の酵素処理及び羊膜由来ＭＳＣの取得）
　上記保存後の羊膜から、比較例１のプロセス２と同様の手法にて、羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を取得した。
（プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養）
　比較例１のプロセス３と同様の手法にて、プロセス２の羊膜由来ＭＳＣを含む細胞画分を培養した。
（プロセス４：培養した羊膜由来ＭＳＣを含む０継代目の細胞集団の顕微鏡観察）
上述の「プロセス３：羊膜由来ＭＳＣの培養」で培養した０継代目の細胞集団に関して、培養倒立顕微鏡を用いて、任意のタイミングで細胞形態の観察を行った。
　結果を図１３に示す。比較例３のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団は培養容器に接着せず、増殖しなかった（図１３）。
　以上の結果から、比較例３のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団は接着・増殖しないことが確認された。
＜羊膜保存温度の間葉系幹細胞と上皮細胞に対する効果＞
　以上の実施例及び比較例において細胞回収量を測定した結果を以下の表１及び表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１及び表２に示す結果から、間葉系幹細胞と上皮細胞の両方を含む細胞全体の生存率や羊膜１ｇ当たりの細胞数については、異なる保存温度の間で有意な差は検出されなかった。
　以上の結果から、３７℃で保存した羊膜から取得した細胞集団では、間葉系幹細胞を含む細胞全体の生存率や細胞数が低下しているということはなく、上皮細胞が選択的に死滅せずに残存していることによって間葉系幹細胞の細胞全体に対する割合が低下していることが明らかとなった。よって、羊膜の保存を３７℃で実施する場合には間葉系幹細胞を高い割合で含む細胞集団が得られないことが判明した。
　逆に、４℃又は２０℃で保存した羊膜から取得した細胞集団では、上皮細胞が選択的に死滅することが判明した。したがって、羊膜の保存を約２５℃以下の低温条件下で実施することによって、上皮細胞の割合を選択的に低減することが可能となり、得られる細胞集団において間葉系幹細胞が高い割合で含まれる、有利な効果が得られることが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (6)

  1. 　羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
    （１）羊膜を媒体中に４時間以上、－１℃以上２５℃以下で保存する工程、
    （２）その後、羊膜を酵素処理する工程、及び
    （３）酵素処理後、間葉系幹細胞を含む細胞画分を培養する工程
    を含む、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
  2. 　酵素処理の前に媒体から羊膜を取り出すことをさらに含む、請求項１記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
  3. 　媒体が、水溶液、ゲルまたはゾルである、請求項１または２記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
  4. 　酵素がトリプシン、コラゲナーゼ及びディスパーゼからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１～３のいずれか１項記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
  5. 　工程（１）において、細切した羊膜を媒体に保存する、請求項１～４のいずれか１項記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
  6. 　工程（１）において、羊膜を－１℃以上１０℃以下で保存する、請求項１～５のいずれか１項記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
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