JP7530893B2 - 間葉系細胞を含む細胞集団、それを含む医薬組成物、及び、その製造方法 - Google Patents

間葉系細胞を含む細胞集団、それを含む医薬組成物、及び、その製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、医学、生化学等の分野で利用することができる、間葉系細胞を含む細胞集団、該細胞集団を含む医薬組成物、及び、該細胞集団の製造方法に関する。
再生医療は、体外で人工的に培養した幹細胞等を、患者の体内に投与することにより、損傷した臓器や組織を再生し、生体機能を回復させる医療である。近年、間葉系幹細胞や骨格筋芽細胞、上皮細胞などの細胞を患者に投与し、組織や臓器の再生や機能改善を促進する新たな治療法の実用化が急速に進んでいる。例えば、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）や脊髄損傷の患者を対象とした骨髄間葉系幹細胞製剤や、重症心不全の患者を対象とした骨格筋芽細胞シートが、再生医療等製品として国内で販売されている。
再生医療等に用いられる細胞のほとんどは、培養基材に接着する性質を有しており、前記細胞製剤を製造する際は、細胞を培養基材に接着させて増殖培養する工程に加えて、培養基材に接着した細胞を剥離する工程を有する。上述した骨髄間葉系幹細胞も培養基材に接着する性質を有しており、細胞を培養基材に接着させた状態で増殖培養した後、細胞を培養基材から剥離する工程を経て、細胞懸濁液を回収する。前記細胞を培養基材から剥離する方法としては、例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素や化学薬品を用いた化学的手段や、セルスクレーパーのような物理的に細胞を剥離する器具を用いた物理的手段が挙げられる。例えば、特許文献１は、トリプシンを培養基材に添加し、間葉系幹細胞を剥離させる方法を開示している。
また、特許文献２には、温度によって細胞接着性が変化する温度応答性高分子を表面に被覆した培養基材用い、温度変化によって培養基材から細胞を剥離する方法が開示されている。
特許第５３９４９３２号公報 国際公開ＷＯ２００１／０６８７９９
上述したように間葉系幹細胞等の接着性細胞を培養基材から剥離させる方法が各種開発されている。しかしながら、特許文献１の方法は、トリプシンなどの化学物質により培養細胞が損傷を受ける。また、トリプシン処理によって培養細胞を培養基材から剥離すると、剥離された細胞は単細胞化し、細胞シートの形態では剥離できない。
また、特許文献２の方法では、細胞培養の足場となる培養基材として、特定の材料を用いる必要があるため製造コストが上がってしまう。
そこで本発明では、化学的手段や物理的手段、特殊な培養基材を用いることなく、培養基材から自発的に剥離する細胞集団、その製造方法、及び、それを含む医薬組成物を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である間葉系細胞を含む細胞集団は、特殊な手段や器具を必要とせずに自発的に基材から剥離することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成された。
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
（１）間葉系細胞を含む細胞集団であって、
前記細胞集団において、ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である、細胞集団。
（２）前記細胞集団において、ＣＤ３２６陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である、（１）に記載の細胞集団。
（３）前記細胞集団において、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ４５陽性を呈する細胞の比率が１０％以下であり、かつＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、（１）又は（２）に記載の細胞集団。
（４）前記間葉系細胞が、胎児付属物に由来する、（１）～（３）のいずれかに記載の細胞集団。
（５）間葉系細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記間葉系細胞を含む細胞集団の中から、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程を含む、間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法：
（ａ）前記細胞集団においてＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である。
（６）（１）～（４）のいずれかに記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
（７）間葉系細胞の１回の投与量が１０１２個以下となるようにヒトに投与される、（６）に記載の医薬組成物。
（８）前記医薬組成物が注射用製剤である、（６）又は（７）に記載の医薬組成物。
（９）前記医薬組成物が細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、（６）又は（７）に記載の医薬組成物。
（１０）免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、脳腫瘍、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、筋ジストロフィー、慢性膵炎、慢性腎炎、並びに癌から選択される疾患の治療剤である、（６）～（９）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１１）医薬組成物の製造のための、（１）～（４）のいずれかの間葉系細胞を含む細胞集団の使用。
（１２）細胞治療剤の製造のための、（１）～（４）のいずれかの間葉系細胞を含む細胞集団の使用。
（１３）心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制に用いる医薬の製造のための、（１）～（４）のいずれかの間葉系細胞を含む細胞集団の使用。
（１４）疾患の治療のために使用される、（１）～（４）のいずれかの間葉系細胞を含む細胞集団。
（１５）前記疾患が、（１０）に記載の疾患である、（１４）に記載の細胞集団。
（１６）患者又は被験者には投与して、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制のために使用される、（１）～（４）のいずれかの間葉系細胞を含む細胞集団。
（１７）患者又は被験者に、治療有効量の（１）～（４）のいずれかの間葉系細胞を含む細胞集団を投与する工程を含む、患者又は被験者の疾患の治療方法。
（１８）前記疾患が、前記（１０）に記載の疾患であり、前記患者又は被験者が、前記疾患の治療を必要とする患者又は被験者である、（１７）に記載の方法。
（１９）患者がヒトであり、１回の投与量が１０１２個細胞以下である、（１７）又は（１８）に記載の方法。
（２０）前記細胞集団が、細胞塊又はシート状構造を有する、（１７）、（１８）又は（１９）に記載の方法。
（２１）患者又は被験者に、治療有効量の（１）～（４）のいずれかの間葉系細胞を含む細胞集団を投与する工程を含む、患者又は被験者において、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制を行う方法。
（２２）患者がヒトであり、１回の投与量が１０１２個細胞以下である、（２１）に記載の方法。
（２３）前記細胞集団が、細胞塊又はシート状構造を有する、（２１）又は（２２）に記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１９－１１１４７０号の開示内容を包含する。
本発明の一以上の実施形態に係る細胞集団は、化学的手段及び／又は物理的手段を用いなくとも自発的に培養基材から剥離する。
本発明の一以上の実施形態に係る細胞集団の製造方法は、上記の効果を有する細胞集団を効率的に製造することができる。
本発明の一以上の実施形態に係る医薬組成物は免疫関連疾患等の治療に用いることができる。
図１は、評価１での、ドナー＃１から調製した比較例１の５継代目の細胞集団の培養２１日目の細胞形態の観察像（倍率４０倍）である。 図２は、評価２での、ドナー＃１から調製した実施例１の５継代目の細胞集団の培養１０日目の細胞形態の観察像（倍率４０倍）である。部分的な細胞の剥離が観察された。 図３は、評価２での、ドナー＃３から調製した実施例２の２継代目の細胞集団の培養１０日目の細胞形態の観察像（倍率１００倍）である。部分的な細胞の剥離が観察された。 図４は、評価２での、ドナー＃３から調製した実施例２の２継代目の細胞集団の培養１１日目の細胞形態の観察像（倍率４０倍）である。基材から剥離した細胞シートが凝集した塊状構造物（細胞塊）が観察された。
［１］用語の説明
本明細書における「間葉系細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ)」は、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ４５陰性、及び、ＣＤ３２６陰性のうち少なくとも１つを呈する細胞を指し、典型的には、以下ｉ）及びｉｉ）の特徴を満たす細胞を指し、「間葉系間質細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ)」及び「間葉系幹細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ)」も本発明の間葉系細胞に含まれる。
「間葉系細胞」としては、各種組織及び器官から採取することができる体性細胞（組織細胞）のうち、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３２６陰性のうち少なくとも１つを呈する細胞、好ましくは、下記ｉ）及びｉｉ）の特徴を満たす細胞、を使用することができる。前記体性細胞としては、特に限定されないが、例えば、脂肪細胞、脂肪幹細胞、神経細胞、神経幹細胞、心筋細胞、心筋幹細胞、肝細胞、肝幹細胞、上皮細胞、上皮幹細胞、骨格筋細胞、骨格筋幹細胞、造血細胞、造血幹細胞、間葉系細胞、間葉系幹細胞、羊膜由来の間葉系細胞、羊膜由来の間葉系幹細胞、羊膜上皮由来の間葉系細胞、羊膜上皮由来の間葉系幹細胞、羊膜細胞外基質層由来の間葉系細胞、羊膜細胞外基質層由来の間葉系幹細胞、消化管上皮細胞、消化管上皮幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、滑膜幹細胞などが挙げられる。
本明細書における間葉系細胞の典型的な特徴
ｉ）標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。ここでいう標準培地とは、基礎培地（例：αＭＥＭ培地）に血清、血清代替試薬又は増殖因子（例：血清代替試薬であるヒト血小板溶解物）を添加した培地である。
ｉｉ）表面抗原のＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３２６が陰性。
前記「間葉系細胞」は、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３２６陰性のうち少なくとも１つを呈する細胞であればよく、例えばＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５陰性及びＣＤ３２６陰性を呈する細胞であることができ、骨、軟骨、脂肪等への分化能の有無については特に限定されない。本明細書における「間葉系細胞」には、間葉系幹細胞のように、骨、軟骨及び脂肪への分化能を有している細胞も含まれる。また、前記「間葉系細胞」には、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３２６陰性のうち少なくとも１つを呈するものの、骨、軟骨、脂肪への分化能を有していない細胞も含まれる。また、前記「間葉系細胞」には、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３２６陰性のうち少なくとも１つを呈するものの、骨、軟骨、脂肪のうち何れか１つ、又は２つにのみ分化する細胞も含まれる。
本明細書において「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯および羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜および脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜で、内壁は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌する。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は間葉系細胞を含む。
本明細書における「間葉系細胞を含む細胞集団」は、その形態は特に限定されず、例えば、細胞ペレット、細胞凝集塊、細胞シート、細胞浮遊液、細胞懸濁液、これらの凍結物等が挙げられる。
本明細書において、所定の表面抗原についての「陽性を呈する（間葉系）細胞の比率」とは、後記する実施例に記載の通り、対象となる細胞集団において、フローサイトメトリーによって解析した所定の表面抗原について陽性である細胞の比率を示す。本明細書において、所定の表面抗原について陽性を呈する細胞の比率は「陽性率」と記載されることがあり、また、所定の表面抗原について陰性を呈する細胞の比率は「陰性率」と記載されることがある。
本明細書において細胞集団中の所定の細胞の比率は、対象となる細胞集団の全細胞数に対する、前記所定の細胞の細胞数の割合を指す。
本明細書において「間葉系細胞」、「間葉系細胞を含む細胞集団」及び「胎児付属物」は、好ましくはヒトに由来するものである。
［２］間葉系細胞を含む細胞集団
本発明の一以上の実施形態に係る細胞集団は、間葉系細胞を含む細胞集団であって、前記細胞集団において、ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上であることを特徴とする。ＣＤ３２４陽性を呈する細胞は間葉系細胞であってよい。
この特徴を有する間葉系細胞を含む細胞集団を基材上で培養すると、一般的な化学的手段及び／又は物理的手段を用いなくても、間葉系細胞を含む細胞集団は、自発的に基材から剥離する。より好ましい態様においては、前記間葉系細胞を含む細胞集団は、細胞シートの形態として自発的に基材から剥離する。
本明細書における「間葉系細胞を含む細胞集団」とは、少なくとも間葉系細胞を含む細胞集団であれば特に限定されず、他の細胞を含む集団であってもよい。特に限定されないが、前記間葉系細胞を含む細胞集団における間葉系細胞の比率は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、１００％でもよい。
また、前記間葉系細胞を含む細胞集団における他の細胞の比率は、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、１％以下、０％でもよい。なお、前記他の細胞は、間葉系細胞以外であれば特に限定されないが、例えばリンパ球、顆粒球、赤血球などの血球系細胞を挙げることができる。
表面抗原のＣＤ３２４は、分化クラスター３２４を意味し、上皮カドヘリン（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）としても知られているタンパク質である。
表面抗原のＣＤ９０は、分化クラスター９０を意味し、Ｔｈｙ－１としても知られているタンパク質である。
前記細胞集団において、ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率は、より好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上でもよい。
前記細胞集団において、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上でもよく、１００％でもよい。
本発明の一以上の実施形態の細胞集団は、好ましくは、ＣＤ３２６陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である。
ＣＤ３２６は分化クラスター３２６を意味し、ＥｐＣＡＭとしても知られているタンパク質である。
前記細胞集団において、ＣＤ３２６陽性を呈する細胞の比率は、より好ましくは５％以下（陰性率９５％以上）、４％以下（陰性率９６％以上）、３％以下（陰性率９７％以上）、２％以下（陰性率９８％以上）、１％以下（陰性率９９％以上）でもよく、０％（陰性率１００％）でもよい。
本発明の一態様によれば、本発明により提供される間葉系細胞を含む細胞集団は、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上である、ＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、ＣＤ４５陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である、のうち１以上を満足することが好ましく、全てを満足することがより好ましい。更に、本発明の一態様によれば、本発明により提供される間葉系細胞を含む細胞集団は、ＣＤ３４陽性を呈する細胞の比率が１０％以下であることが好ましい。
ＣＤ７３は、分化クラスター７３を意味し、５－Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ、或いはＥｃｔｏ－５’－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅとしても知られているタンパク質である。
ＣＤ１６６は、分化クラスター１６６を意味し、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＡＬＣＡＭ）としても知られているタンパク質である。
ＣＤ１０５は、分化クラスター１０５を意味し、Ｅｎｄｏｇｌｉｎとしても知られているタンパク質である。
ＣＤ４５は、分化クラスター４５を意味し、ＰＴＰＲＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ，Ｃ）、或いはＬＣＡ（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）としても知られているタンパク質である。
ＣＤ３４は、分化クラスター３４を意味し、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ３４としても知られているタンパク質である。
前記細胞集団においてＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上でもよく、１００％でもよい。
前記細胞集団においてＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上でもよい。
前記細胞集団においてＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは７４％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上でもよい。
前記細胞集団においてＣＤ４５陽性を呈する細胞の比率は、より好ましくは５％以下（陰性率９５％以上）、４％以下（陰性率９６％以上）、３％以下（陰性率９７％以上）、２％以下（陰性率９８％以上）、１％以下（陰性率９９％以上）でもよく、０％（陰性率１００％）でもよい。
前記細胞集団においてＣＤ３４陽性を呈する細胞の比率は、より好ましくは５％以下（陰性率９５％以上）、４％以下（陰性率９６％以上）、３％以下（陰性率９７％以上）、２％以下（陰性率９８％以上）、１％以下（陰性率９９％以上）でもよく、０％（陰性率１００％）でもよい。
ここで、ＣＤ３２４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ３２６陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ４５陽性及びＣＤ３４陽性を呈する細胞又は間葉系細胞とは、それぞれ、ＣＤ３２４、ＣＤ９０、ＣＤ３２６、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ１０５、ＣＤ４５及びＣＤ３４の発現が陽性である細胞又は間葉系細胞を意味する。
本発明の一以上の実施態様において指標とする発現マーカー（ＣＤ３２４、ＣＤ９０、ＣＤ３２６、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ１０５、ＣＤ４５又はＣＤ３４）は、当該技術分野において公知の任意の検出方法により検出することができる。発現マーカーを検出する方法としては、例えばフローサイトメトリー又は細胞染色が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞染色において、着色するか若しくは蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。免疫細胞染色において使用される抗体についても特に限定されず、目的のマーカーを検出するのに一般的に知られている抗体を使用できるが、好ましくは後述する実施例で使用した抗体を用いる。例えば、ＣＤ３２４陽性を検出するために使用する抗体は特に限定されず、ＲＥＡ８１１、６７Ａ４、ＳＰＭ３８１のクローンから作製した抗体を用いてＣＤ３２４陽性を検出することができるが、その中でも、本発明の一以上の実施形態においては、ＲＥＡ８１１のクローンから作製した抗体を用いてＣＤ３２４陽性を検出することがより望ましい。なお、発現マーカーと表面抗原は同義であり、両者は置き換えて使うことができる。
本発明の一以上の実施態様の細胞集団は、分化能の有無は特に限定されないが、好ましくは、軟骨組織への分化能を有し、且つ、脂肪組織への分化能が低い又は有さず、好ましくは更に、骨組織への分化能が低い又は有さないものである。
本発明の一以上の実施態様の細胞集団は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。上記の細胞集団は、間葉系細胞及び他の細胞以外に、任意の成分を含んでもよい。かかる成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ＨＥＳ、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
［３］間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法
本発明の一以上の実施形態の、間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法は、間葉系細胞を含む細胞集団を培養する工程と、前記間葉系細胞を含む細胞集団の中から、（ａ）前記細胞集団においてＣＤ３２４が陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、（ｂ）前記細胞集団において、ＣＤ９０が陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である、という特性を有する細胞集団を選別する工程を含む方法である。
本発明の一以上の実施形態に係る間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法によれば、前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する間葉系細胞を含む細胞集団を調製できる。前記特性は、基材から自発的に剥離できる間葉系細胞を含む細胞集団を取得する際の指標として有用である。また、前記特性は、剥離後の間葉系細胞集団を単細胞化された形態ではなく、細胞シートの形態で取得する際の指標としても有用である。
前記細胞集団の製造方法において、間葉系細胞を含む細胞集団を培養する工程と、前記間葉系細胞を含む細胞集団の中から前記特性を有する細胞集団を選別する工程とは、別の工程であってもよいし、一体の工程であってもよい。例えば、後述するように、間葉系細胞を含む細胞集団を、上記（ａ）及び（ｂ）の一方又は両方の特性を満たす細胞集団を選別できる特定の条件下において培養することが、前記二つの工程が一体の工程である例である。
前記細胞集団の製造方法において、前記特性を満たす細胞集団を選別する工程は、前記特性を満たす細胞集団を選別できる工程であれば特に限定されない。そのような工程としては、例えばセルソーターにて（ａ）を満たす細胞集団を選択し、次いで、得られた細胞集団を（ｂ）を満たす細胞集団を選別できる条件下において培養することが挙げられる。また、セルソーターにて（ｂ）を満たす細胞集団を選択し、次いで得られた細胞集団を（ａ）を満たす細胞集団を選別できる条件下において培養してもよい。また、前記特性を満たす細胞集団の他の調製方法としては、細胞集団を、上記（ａ）及び（ｂ）を満たす細胞集団を選別できる特定の条件下において培養することが挙げられる。培養条件や培養方法の詳細については以下で説明する。また、後述の細胞集団の選別方法で記載されたような方法を用いて、前記特性を満たす細胞集団を選別することもできる。
本発明の一以上の実施形態に係る間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法は、好ましくは、羊膜などの胎児付属物を酵素処理することにより、原料となる、間葉系細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程を更に含むものでもよい。
羊膜は、上皮細胞層と細胞外基質層からなり、後者には間葉系細胞が含まれている。上記の細胞集団取得工程は、羊膜を帝王切開により得る工程を更に含む工程でもよい。
胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団は、より好ましくは、胎児付属物から採取した、上皮細胞層と間葉系細胞を含む細胞外基質層とを含む試料を少なくともコラゲナーゼで処理して得た細胞集団である。
胎児付属物から採取した試料（好ましくは上皮細胞層と間葉系細胞を含む細胞外基質層とを含む試料）の酵素処理は、好ましくは、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる間葉系細胞を遊離することができ、かつ上皮細胞層を分解しない酵素（又はその組み合わせ）による処理である。かかる酵素としては、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼを挙げることができる。金属プロテイナーゼとしては、非極性アミノ酸のＮ末端側を切断する金属プロテイナーゼであるサーモリシン及び／又はディスパーゼを挙げることができるが、特に限定されない。
コラゲナーゼの活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、コラゲナーゼの活性濃度は、特に限定されないが、例えば、１０００ＰＵ／ｍｌ以下、９００ＰＵ／ｍｌ以下、８００ＰＵ／ｍｌ以下、７００ＰＵ／ｍｌ以下、６００ＰＵ／ｍｌ以下、５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、ＦＩＴＣ－ｃｏｌｌａｇｅｎ １ｕｇを１分間で分解する酵素量と定義する。
金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１５０ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１９０ＰＵ／ｍｌ以上である。また、金属プロテイナーゼの活性濃度は、好ましくは１０００ＰＵ／ｍｌ以下、より好ましくは９００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは８００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは７００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは６００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは５００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは３００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、金属プロテイナーゼとしてディスパーゼを用いた態様において、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、乳酸カゼインから１分間に１ｕｇのチロシンに相当するアミノ酸を遊離する酵素量と定義される。上記の酵素濃度の範囲において、胎児付属物の上皮細胞層に含まれる上皮細胞の混入を防止しながら、細胞外基質層に含まれる間葉系細胞を効率よく遊離させることができる。コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼの好ましい濃度の組み合わせは、酵素処理後の胎児付属物の顕微鏡観察や、取得した細胞のフローサイトメトリーにより決定することができる。
生細胞を効率的に回収する観点から、コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを組み合わせて胎児付属物を処理することが好ましい。さらに好ましくは、前記組み合わせによって胎児付属物を同時一括に処理する。この場合の金属プロテイナーゼとしては、サーモリシン及び／又はディスパーゼを使用することができるが、これらに限定されない。コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを含有する酵素液を用いて胎児付属物を一回のみ処理することにより、間葉系細胞を簡便に取得することができる。また、同時一括に処理することにより、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクを低減することができる。
胎児付属物の酵素処理は、生理食塩水やハンクス平衡塩溶液等の洗浄液を用いて洗浄した羊膜を酵素液に浸漬し、撹拌手段によって撹拌しながら処理することが好ましい。かかる撹拌手段としては、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる間葉系細胞を効率よく遊離させる観点から、例えば、スターラー又はシェーカーを使用することができるが、これらに限定されない。撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、５ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、２０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、４０ｒｐｍ以上又は５０ｒｐｍ以上である。また、撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、１００ｒｐｍ以下、９０ｒｐｍ以下、８０ｒｐｍ以下、７０ｒｐｍ以下又は６０ｒｐｍ以下である。酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上、６０分以上、７０分以上、８０分以上又は９０分以上である。また、酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下、１１０分以下、１００分以下である。酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、１５℃以上、１６℃以上、１７℃以上、１８℃以上、１９℃以上、２０℃以上、２１℃以上、２２℃以上、２３℃以上、２４℃以上、２５℃以上、２６℃以上、２７℃以上、２８℃以上、２９℃以上、３０℃以上、３１℃以上、３２℃以上、３３℃以上、３４℃以上、３５℃以上又は３６℃以上である。また、酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、４０℃以下、３９℃以下、３８℃以下又は３７℃以下である。
本発明の一以上の実施形態に係る製造方法において、所望により、遊離した間葉系細胞を含む酵素溶液からフィルター、遠心分離や中空糸分離膜、セルソーター等の公知の方法により遊離した間葉系細胞を分離及び／又は回収することができる。好ましくは、フィルターによって遊離した間葉系細胞を含む酵素溶液を濾過する。前記酵素溶液をフィルターによって濾過する態様においては、遊離した細胞のみがフィルターを通過し、分解されなかった上皮細胞層はフィルターを通過できずにフィルター上に残るため、遊離した間葉系細胞を容易に分離及び／又は回収することができるだけでなく、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクも低減することができる。フィルターとしては、特に限定されないが、例えば、メッシュフィルターを挙げることができる。メッシュフィルターのポアサイズ（メッシュの大きさ）は、特に限定されないが、例えば、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、又は９０μｍ以上である。また、メッシュフィルターのポアサイズは、特に限定されないが、例えば、２００μｍ以下、１９０μｍ以下、１８０μｍ以下、１７０μｍ以下、１６０μｍ以下、１５０μｍ以下、１４０μｍ以下、１３０μｍ以下、１２０μｍ以下、１１０μｍ以下、又は１００μｍ以下である。濾過速度に関しては特に限定されないが、メッシュフィルターのポアサイズを上記の範囲とすることにより、間葉系細胞を含む酵素溶液を自然落下により濾過することができ、これにより細胞生存率の低下を防止することができる。
メッシュフィルターの材質としては、ナイロンが好ましく用いられる。研究用として汎用されるＦａｌｃｏｎセルストレーナーなどの４０μｍ、７０μｍ、９５μｍ又は１００μｍのナイロンメッシュフィルターを含有するチューブが利用可能である。また、血液透析などで使用されている医療用メッシュクロス（ナイロン及びポリエステル）が利用できる。さらに、体外循環時に使用される動脈フィルター（ポリエステルメッシュフィルター、ポアサイズ：４０μｍ以上１２０μｍ以下）も利用可能である。他の材質、例えば、ステンレスメッシュフィルター等も用いることが可能である。
間葉系細胞をフィルター通過させる場合、自然落下（自由落下）が好ましい。ポンプ等を用いた吸引など強制的なフィルター通過も可能であるが、細胞に損傷を与えることを避けるため、できるだけ弱い圧力とすることが望ましい。
フィルターを通した間葉系細胞を含む細胞集団は、倍量又はそれ以上の培地又は平衡塩緩衝液で濾液を希釈した後、遠心分離により回収することができる。平衡塩緩衝液としては、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等を用いることができるが、これらに限定されない。
本発明の一以上の実施形態に係る製造方法は、間葉系細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む。
間葉系細胞を含む細胞集団の培養する工程における細胞の播種密度は、特に限定されないが例えば、例えば５００～１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種することができる。前記播種密度の下限としては、例えば５００細胞／ｃｍ２以上、１，０００細胞／ｃｍ２以上、２，０００細胞／ｃｍ２以上、３，０００細胞／ｃｍ２以上、４，０００細胞／ｃｍ２以上、５，０００細胞／ｃｍ２以上が好ましい。また、前記播種密度の上限としては、例えば１０，０００細胞／ｃｍ２以下、９，０００細胞／ｃｍ２以下、８，０００細胞／ｃｍ２以下、７，０００細胞／ｃｍ２以下が好ましい。
なお、上記培養する工程は、継代工程を含んでもよいし、異なる培養条件で複数回培養を繰り返す工程を含んでもよい。
上記の１回の培養の培養期間としては、例えば４～１０日間を挙げることができ、より具体的には、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間を挙げることができる。
上記の培養に用いる培地は、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分（血清、血清代替試薬、増殖因子など）を適宜添加することにより調製することができる。なお、前記基礎培地に増殖因子を添加する態様においては、増殖因子を培地中で安定化させるための試薬（ヘパリンなど）を、増殖因子に加えて、さらに添加することにより調製してもよいし、増殖因子をあらかじめゲルや多糖類などで安定化しておき、その後、安定化した増殖因子を前記基礎培地に対して添加することで調製してもよい。このように、間葉系細胞を含む細胞集団を培養するために、基礎培地に、血清、血清代替試薬又は増殖因子を添加した培地を、標準培地と定義する。
基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２ Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。好ましい基礎培地としてはαＭＥＭ培地が例示できる。
基礎培地に添加し得る他の成分としては例えば、アルブミン、ウシ血清、血清代替試薬又は増殖因子などが挙げられ、血清代替試薬が好ましく、特にヒト血小板溶解物が好ましい。なかでも、血清代替試薬を含み、且つ、アルブミン、ウシ血清及び増殖因子を含まない基礎培地中で培養を行うことが好ましい。ヒト血小板溶解物の培地中の濃度の下限としては例えば、終濃度として１重量％以上、２重量％以上、３重量％以上を挙げることができる。また、ヒト血小板溶解物の培地中の濃度の上限としては例えば、２０重量％以下、１０重量％以下、７重量％以下が好ましい。
また、上記の培養に用いる培地は、一般的に市販されている無血清培地を用いても良い。例えば、ＳＴＫ１やＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社）、ＥＸＰＲＥＰ ＭＳＣ Ｍｅｄｉｕｍ（バイオミメティクスシンパシーズ社）、Ｃｏｒｎｉｎｇ ｓｔｅｍｇｒｏヒト間葉系幹細胞培地（コーニング社）などが挙げられるが、特に限定されない。
間葉系細胞を含む細胞集団の培養は、例えば、以下のような工程にて行うことができる。まず、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。次に、培養容器（例えばプラスチック製培養容器）に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いて培養する。上記のような培養により取得した細胞は、１回培養した細胞である。
上記の１回培養した細胞は、例えば、以下のようにさらに継代し、培養することができる。まず、１回目の培養でコンフルエント率９５％以下となるまで培養した細胞を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて処理した後にトリプシンにて処理して培養容器（例えばプラスチック製培養容器）から剥離させる。本発明の一以上の実施形態で製造する細胞集団は、基材から穏やかな条件で剥離し得る細胞培養物を形成することができる細胞集団であり、トリプシン処理による培養容器からの剥離の際にも容易に剥離することができるため、トリプシン処理による細胞へのダメージを軽減することができる。また、細胞集団が基材上で細胞シートを形成した場合でも、細胞シートを基材から剥離すること、及び、細胞シートを酵素処理により崩壊させて細胞懸濁液を得ることが容易であるため、細胞へのダメージを軽減することができる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。最後に、培養容器（例えばプラスチック製培養容器）に細胞を播種し、３％以上、５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いて培養する。上記のような継代及び培養により取得した細胞は、１回継代した細胞である。同様の継代及び培養を行うことにより、ｎ回継代した細胞を取得することができる（ｎは１以上の整数を示す）。継代培養を行う場合は、細胞をコンフルエント率９５％以下となるまで培養し、上記の手順で細胞を剥離して回収し、次代の培養に用いることができる。継代回数ｎの下限は、細胞を大量に製造する観点から、例えば、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上である。また、継代回数ｎの上限は、細胞の老化を抑える観点から、例えば、５０回以下、４５回以下、４０回以下、３５回以下、３０回以下であることが好ましい。更なる継代培養を行わずに培養細胞を回収する場合は、細胞をコンフルエント率１００％以上まで培養して基材上で細胞シートを形成させ、更に培養を続けて細胞シートを基材から自発的に剥離させることができる。
本発明の一以上の実施形態に係る製造方法は、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程を含んでもよい。
（ａ）ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、
（ｂ）ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である。
前記特性を指標として細胞集団を選別する方法としては、上述したようにセルソーターにて上記（ａ）及び／又は（ｂ）の特性を満たす細胞集団を選別する工程を含み、更に必要に応じて前記工程で選別しない特性を満たす細胞集団を選別できる条件下において培養する工程を含む方法を用いることができる。またセルソーター以外の選別方法として、例えばＦＡＣＳ、磁気ビーズによる分取などの物理的な方法を用いてもよい。
さらに、別の選別工程として、細胞集団を、上記（ａ）及び（ｂ）の特性を満たす細胞集団を選別できる特定の条件下において培養する工程も挙げられる。例えば、上述した細胞集団の培養工程において、適宜好ましい培養条件を組み合わせることでも上記（ａ）及び（ｂ）の特性を満たす細胞集団を得ることが可能である。この場合、上述の細胞集団の培養工程の一部又は全部が、上記（ａ）及び（ｂ）の特性を満たす細胞集団を選別する工程でもある。その一例として、ヒト血小板溶解物などの血清代替試薬を添加した培地中で間葉系細胞を含む細胞集団を培養することが挙げられる。具体的にはヒト血小板溶解物を添加した基礎培地を用いるなどの適切な培養条件によって指標を満たさない細胞を淘汰し、上記指標を満たすように間葉系細胞を含む細胞集団を純化させる化学的な方法、或いはヒト血小板溶解物を添加した基礎培地などの適切な標準培地を選択して培養を行うことにより、上記指標を満たす細胞集団に変化させる方法を挙げることができる。しかしその方法は特に限定されず、培養方法等に応じて適宜選択すればよい。
なお、上記選別の前に、上記特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団を識別する工程を含んでもよい。
上記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別するタイミングは、特に限定されないが、例えば、培養前、培養の途中、培養後、細胞集団の回収前、細胞集団の回収後、細胞の凍結保存ストック作成前、細胞の凍結保存ストックを解凍した後、等を挙げることができる。
上記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する方法について、さらに詳細に説明する。
細胞集団の培養により、上記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する方法としては、例えば、間葉系細胞を含む細胞集団を培養基材に播種し、培養基材上で増殖培養することにより、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞がポジティブセレクションされ、ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上となった細胞集団を剥離・回収する方法が挙げられる。このとき、抗ＣＤ３２４抗体や抗ＣＤ９０抗体によりコーティングした培養基材を用いて培養しても良い。間葉系細胞を含む細胞集団から、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞を培養により選別するタイミングは特に限定されず、任意の継代培養において選別することができるが、初代培養において間葉系細胞を含む細胞集団から、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞を選別することが好ましい。
また、フローサイトメトリーや磁気ビーズを用いた細胞分離法により、間葉系細胞を含む細胞集団から、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞を選別することもできる。
細胞集団の選別は更に、ＣＤ３２６陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である細胞集団を選別することが好ましく、更に、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上である、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上である、ＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、ＣＤ４５陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である、のうち１以上、より好ましくは全て、を満足する細胞集団を選別することが好ましく、更に、ＣＤ３４陽性を呈する細胞の比率が１０％以下であることを満足する細胞集団を選別することが好ましい。選別した細胞集団を、更に上記の方法で培養してもよい。これらの追加の特性を有する細胞集団を選別する工程もまた、細胞集団を培養する工程と一体となった工程であってもよいし、別の工程であってもよい。これらの追加の特性を有する細胞集団を選別する工程は、上記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程と一体となった工程であってもよいし、別の工程であってもよい。
また、本発明の一以上の実施形態に係る製造方法は、前記間葉系細胞を含む細胞集団を凍結保存する工程を含むことができる。前記細胞集団を凍結保存する工程を含む態様においては、前記細胞集団を解凍後、必要に応じて前記細胞集団を分離、回収及び／又は培養してもよい。また、前記細胞集団を解凍後、そのまま使用してもよい。
前記間葉系細胞を含む細胞集団を凍結保存するための手段は、特に限定されないが、例えば、プログラムフリーザー、ディープフリーザー、液体窒素への浸漬などが挙げられる。凍結する際の温度は、好ましくは－３０℃以下、－４０℃以下、－５０℃以下、－６０℃以下、－７０℃以下、－８０℃以下、－９０℃以下、－１００℃以下、－１１０℃以下、－１２０℃以下、－１３０℃以下、－１４０℃以下、－１５０℃以下、－１６０℃以下、－１７０℃以下、－１８０℃以下、－１９０℃以下、又は－１９６℃（液体窒素温度）以下である。凍結する際の好ましい凍結速度は、例えば、－１℃／分、－２℃／分、－３℃／分、－４℃／分、－５℃／分、－６℃／分、－７℃／分、－８℃／分、－９℃／分、－１０℃／分、－１１℃／分、－１２℃／分、－１３℃／分、－１４℃／分又は－１５℃／分である。かかる凍結手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、例えば、－２℃／分以上－１℃／分以下の凍結速度で－５０℃以上－３０℃以下の間の温度（例えば、－４０℃）まで温度を下げ、さらに－１１℃／分以上－９℃／分以下（例えば、－１０℃／分）の凍結速度で－１００℃以上－８０℃以下の温度（例えば、－９０℃）まで温度を下げることができる。
上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の保存容器に入った状態で凍結されてよい。かかる保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
凍結用保存液は、相対的に増殖能が高い間葉系細胞の生存率を高める観点から、０質量％より多い所定濃度のアルブミンを含有することが好ましい。アルブミンの好ましい濃度は、例えば、０．５質量％以上、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上又は８質量％以上である。また、アルブミンの好ましい濃度は、例えば、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、２５質量％以下、２０質量％以下、１５質量％以下、１０質量％以下又は９質量％以下である。アルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、マウスアルブミン、ヒトアルブミン等を挙げることができるが、これに限定されない。
［４］医薬組成物
本発明の一以上の実施形態に係る間葉系細胞を含む細胞集団は、医薬組成物として使用することができる。即ち、本発明の一以上の実施形態によれば、前記細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物が提供される。
本発明の一以上の実施形態の医薬組成物は、細胞治療剤、例えば、難治性疾患治療剤として使用することができる。
本発明の一以上の実施形態の医薬組成物は、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、脳腫瘍、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫（Ａｌｉｂｅｒｔ－Ｂａｚｉｎ症候群）、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、筋ジストロフィー、慢性膵炎、慢性腎炎、並びに癌から選択される疾患の治療剤として使用することができる。本発明の一以上の実施形態の医薬組成物を治療部位に効果が計測できる量投与することで、上記疾患を治療することができる。
本発明の一以上の実施形態によれば、医薬組成物のために使用される、本発明の一以上の実施形態の間葉系細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明の一以上の実施形態によれば、細胞治療剤のために使用される、本発明の一以上の実施形態の間葉系細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明の一以上の実施形態によれば、前記疾患の治療のために使用される、本発明の一以上の実施形態の間葉系細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明の一以上の実施形態によれば、患者又は被験者に投与して、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制のために使用される、本発明の一以上の実施形態の間葉系細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明の一以上の実施形態によれば、患者又は被験者に、本発明の一以上の実施形態の間葉系細胞を含む細胞集団の治療有効量を投与する工程を含む、患者又は被験者に細胞を移植する方法、並びに患者又は被験者の疾患の治療方法が提供される。
本発明の一以上の実施形態によれば、医薬組成物の製造のための、本発明の一以上の実施形態の間葉系細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明の一以上の実施形態によれば、細胞治療剤の製造のための、本発明の一以上の実施形態の間葉系細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明の一以上の実施形態によれば、前記疾患の治療剤の製造のための、本発明の一以上の実施形態の間葉系細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明の一以上の実施形態によれば、患者又は被験者に投与して、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制に必要な治療剤の製造のための、本発明の一以上の実施形態の間葉系細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明の一以上の実施形態の医薬組成物の投与量としては、患者又は被験者に投与した場合に、投与していない患者又は被験者と比較して疾患に対して治療効果を得ることができるような細胞の量である。具体的な投与量は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。投与量は、特に限定されないが、例えば、間葉系細胞の細胞数として、１０４個／ｋｇ体重以上、１０５個／ｋｇ体重以上又は１０６個／ｋｇ体重以上である。また、投与量は、特に限定されないが、例えば、間葉系細胞の細胞数として、１０９個／ｋｇ体重以下、１０９個／ｋｇ体重以下又は１０９個／ｋｇ体重以下である。また、１回の投与量としては、間葉系細胞の細胞数として好ましくは１０１２個以下、より好ましくは１０１１個以下、より好ましくは１０１０個以下である。
本発明の一以上の実施形態の医薬組成物の投与方法は、特に限定されないが、例えば、皮下注射、リンパ節内注射、静脈内注射、腹腔内注射、胸腔内注射又は局所への直接注射、又は局所に直接移植することなどが挙げられる。
本発明の一以上の実施形態の医薬組成物は、他の疾患治療目的に注射用製剤、或いは細胞塊又はシート状構造の移植用製剤、或いは任意のゲルと混合したゲル製剤として用いることも可能である。上述したとおり、本発明の好ましい態様においては、得られる細胞集団は細胞シートの形態で基材から剥離できることから、得られたシート形態の細胞集団をそのまま（あるいは最低限の加工で）シート状の移植用製剤としても利用することができる。すなわち、シート状の間葉系細胞を含む細胞集団も本発明における一態様である。
本発明の一以上の実施形態の医薬組成物が対象とする患者又は被験者とは、典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、フェレット等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類が挙げられる。
本発明の一以上の実施形態の医薬組成物は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。本発明の一以上の実施形態の医薬組成物は、ヒトの治療の際に用いられる任意の成分を含んでもよい。かかる成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ＨＥＳ、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
また、本発明の一以上の実施形態の医薬組成物は、間葉系細胞を含む細胞集団を、製薬上許容し得る媒体として使用される輸液製剤により希釈したものでもよい。本明細書における「輸液製剤（製薬上許容し得る媒体）」としては、ヒトの治療の際に用いられる溶液であれば特に限定されないが、例えば、生理食塩液、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持輸液（３号液）、術後回復液（４号液）等を挙げることができる。
患者又は被験者において間葉系細胞を含む細胞集団を用いて治療することができる疾患等の他の例、前記疾患等の更なる具体例、及び、治療の具体的な手順は、Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，２００９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ８；５４（２４）：２２７７－２２８６、Ｈｏｎｍｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ ２０１１：１３４；１７９０－１８０７、Ｍａｋｈｏｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．２０１３；９５：１８２７－１８３３、特許第５９５０５７７号公報、特表２０１０－５１８０９６号公報、特表２０１２－５０９０８７号公報、特表２０１４－５０１２４９号公報、特開２０１３－２５６５１５号公報、特開２０１４－１８５１７３号公報、特表２０１０－５３５７１５号公報、特開２０１５－０３８０５９号公報、特開２０１５－１１０６５９号公報、特表２００６－５２１１２１号公報、特表２００９－５４２７２７号公報、特開２０１４－２２４１１７号公報、特開２０１５－０６１８６２号公報、特表２００２－５１１０９４号公報、特表２００４－５０７４５４号公報、特表２０１０－５０５７６４号公報、特表２０１１－５１４９０１号公報、特開２０１３－０６４００３号公報、特開２０１５－１３１７９５号公報等に記載された事項を参照することができる。
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜比較例１＞
（工程１－１：羊膜の採取）
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦（ドナー♯１）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
（工程１－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収）
上皮細胞層と間葉系細胞を含む細胞外基質層とを含む羊膜を２４０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼ及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、間葉系細胞を含む細胞懸濁液を回収した。
（工程１－３：間葉系細胞の培養）
上述の「工程１－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団を培養容器のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング社製）に播種した。播種密度は、６，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種した。細胞播種後は、終濃度が１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は０継代目の細胞集団である。その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は１継代目の細胞集団である。その後、細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約１５，０００～１８，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において、前記１継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度にして１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は２継代目の細胞集団である。その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は３継代目の細胞集団である。前記細胞集団について、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において前記３継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は４継代目の細胞集団である。その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は５継代目の細胞集団である。その後、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移して－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
（工程１－４：間葉系細胞の表面抗原解析）
上記の培養方法で培養した５継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ３２４の陽性率、ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ１６６の陽性率、ＣＤ４５の陰性率、ＣＤ３２６の陰性率）を解析した。その結果、ＣＤ３２４の陽性率は７０％未満（具体的には３３％）、ＣＤ１０５の陽性率は７０％以上（具体的には９３％）、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６の陽性率はいずれも９０％以上であった（具体的にはＣＤ７３：９９％、ＣＤ９０：９３％、ＣＤ１６６：９７％）。ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陰性率はいずれも９５％以上であった（具体的にはＣＤ４５：１００％、ＣＤ３２６：１００％）。以上の結果から、上記の培養方法で培養した細胞集団は、間葉系細胞を含む細胞集団であることが分かった。また、比較例１の５継代目の細胞集団は、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上という条件は満たすものの、ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であるという条件は満たさない細胞集団であることが分かった。
なお、本測定では、アイソタイプコントロール用抗体として、ＲＥＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｓ）ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ２９３、型番：１３０－１１３－４３４）を使用し、ＣＤ３２４抗原に対する抗体として、ＣＤ３２４－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ８１１、型番：１３０－１１１－８４０）を、ＣＤ７３抗原に対する抗体として、ＣＤ７３－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ８０４、型番：１３０－１１１－９０９）を、ＣＤ９０抗原に対する抗体として、ＣＤ９０－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ８９７、型番：１３０－１１４－８６１）を、ＣＤ１０５抗原に対する抗体として、ＣＤ１０５－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ７９４、型番：１３０－１１２－１６６）を、ＣＤ１６６抗原に対する抗体として、ＣＤ１６６－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ４４２、型番：１３０－１０６－５７６）を、ＣＤ４５抗原に対する抗体として、ＣＤ４５－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ７４７、型番：１３０－１１０－６３３）を、ＣＤ３２６抗原に対する抗体として、ＣＤ３２６－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ７６４、型番：１３０－１１１－０００）を使用した。表面抗原解析は、メルク社のＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅを用い、測定条件は解析細胞数：３０，０００ｃｅｌｌｓ、流速設定：３５．４μＬ／ｍｉｎとした。また、各抗原に対する陽性細胞の比率（陽性率）は、以下の手順で算出した。
（１）アイソタイプコントロールの測定結果を、縦軸にＳＳＣ、横軸にＦＳＣとしたドットプロットで展開した。
（２）間葉系細胞に該当する細胞集団のゲートを設定し、その細胞集団に対して、縦軸にカウント数、横軸をＡＰＣの傾向強度としたヒストグラムで展開した。
（３）（２）のヒストグラムにおいて、アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が０．５％以下となる全ての領域（ゲート）を選択した。
（４）表面抗原マーカーに対応する抗体で測定した総細胞のうち、（３）で選択したゲート内に含まれる細胞の割合を算出した。
＜実施例１＞
（工程２－１：羊膜の採取）
比較例１と同じドナー（ドナー♯１）から、比較例１と同様の手法にて羊膜を取得した。
（工程２－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収）
比較例１と同じ手法にて間葉系細胞を含む細胞集団を取得した。
（工程２－３：間葉系細胞の培養）
上述の「工程２－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団を培養容器のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング製）に播種した。播種密度は、６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度とした。細胞播種後は、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は０継代目の細胞集団である。その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が５％のｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は１継代目の細胞集団である。その後、細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約１５，０００～１８，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において、前記１継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は２継代目の細胞集団である。次いで、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が５％のｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は３継代目の細胞集団である。その後、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１溶液（登録商標）（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において、前記３継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は４継代目の細胞集団である。次いで、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が５％のｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は５継代目の細胞集団である。前記細胞集団について、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
（工程２－４：間葉系細胞の表面抗原解析）
上記の培養方法で培養した５継代目の間葉系細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ３２４の陽性率、ＭＳＣマーカーと知られているＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ１６６の陽性率、ＣＤ４５の陰性率、ＣＤ３２６の陰性率）を解析した。その結果、ＣＤ３２４、ＣＤ１０５の陽性率は７０％以上（具体的にはＣＤ３２４：９１％、ＣＤ１０５：９５％）、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６の陽性率はいずれも９０％以上であった（具体的にはＣＤ７３：１００％、ＣＤ９０：１００％、ＣＤ１６６：９９％）。ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陰性率はいずれも９５％以上であった（具体的にはＣＤ４５：１００％、ＣＤ３２６：９９％）。以上の結果から、上記の培養方法で培養した細胞は、間葉系細胞を含む細胞集団であることが分かった。また、実施例１に記載の細胞集団は、ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である細胞集団であることが確認された。
なお、本測定の方法、試薬は比較例１と同じである。
＜実施例２＞
以下に示す実施例２では、比較例１、実施例１と比較してドナーや酵素処理条件、培養条件が異なる間葉系細胞集団を取得した。
比較例１、実施例１とは異なる、インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦３名（ドナー＃２～＃４）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。
（工程３－１：羊膜の採取）
比較例１及び実施例１と同様の手法にて羊膜を取得した。
（工程３－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収）
上皮細胞層と間葉系細胞を含む細胞外基質層とを含む羊膜を４８０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼ及び４００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、間葉系細胞を含む細胞懸濁液を回収した。
（工程３－３：間葉系細胞の培養）
上述の「工程３－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団を培養容器のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種した。播種密度は、１，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２とした。細胞播種後は、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培地交換は３～５日に１回の頻度で実施した。培養後、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は０継代目の細胞集団である。その後、細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう生理食塩液を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約１，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度で１継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで５日間接着培養した。その後、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は１継代目の細胞集団である。次いで、細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう生理食塩液を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約１，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度で２継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで５日間接着培養した。その後、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は２継代目の細胞集団である。前記細胞集団について、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう生理食塩液を添加した。これに等量のＣＰ－１溶液（登録商標）（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移して－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
（工程３－４：間葉系細胞の表面抗原解析）
工程３－３に記載の培養方法で培養した２継代目の細胞集団（＃２～＃４）に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ３２４の陽性率、ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ１６６の陽性率、ＣＤ４５の陰性率、ＣＤ３２６の陰性率）を解析した。その結果、ＣＤ３２４、ＣＤ１０５の陽性率は７０％以上（具体的には＃２、♯３、＃４の順にそれぞれ、ＣＤ３２４：９０％、８７％、８７％、ＣＤ１０５：８９％、９１％、７４％）、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１６６の陽性率はいずれも９０％以上であった（具体的には＃２、♯３、＃４の順にそれぞれ、ＣＤ７３：１００％、９９％、１００％、ＣＤ９０：１００％、９９％、１００％、ＣＤ１６６：９９％、９７％、９８％）。ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陰性率はいずれも９５％以上であった（具体的には＃２、♯３、＃４の順にそれぞれ、ＣＤ４５：９９％、１００％、１００％、ＣＤ３２６：９９％、１００％、１００％）。以上の結果から、上記の培養方法で培養した＃２、＃３、＃４の細胞集団は、全てＣＤ３２４陽性を呈する細胞を含む細胞集団であることが分かった。また、実施例２に記載の細胞集団は、ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である細胞集団であることが確認された。なお、本測定の方法、試薬は比較例１と同じである。
＜評価実験：間葉系細胞の培養基材からの剥離能の評価＞
（評価１：比較例１で得られた細胞集団における評価）
比較例１の工程１－３に記載の培養方法で培養した５継代目の細胞集団（♯１）を解凍し、約１０，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度で５継代目の細胞集団を６ウェルプレートに播種し、終濃度が１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にて接着培養を開始した。培地交換は３～５日に１回の頻度で実施した。培養５日目にコンフルエンシーが１００％になったが、剥離処理を行うことなく、培養を継続した。培養４、５、６、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、２１日目の細胞形態を、オリンパス社の位相差顕微鏡を用いて観察した。培養７日目にはオーバーコンフルエントとなり、細胞が隙間なく密着する状態となった。しかしながら、その後は細胞形態に目立った変化はなく、培養を開始してから２１日経過しても、６ウェルプレートから細胞が自発的に剥離することはなかった（図１：培養２１日目の細胞形態）。
（評価２：実施例１及び２で得られた細胞集団における評価）
実施例１の工程２－３に記載の培養方法で培養した５継代目の細胞集団（♯１）及び実施例２の工程３－３に記載の培養方法で培養した２継代目の細胞集団（＃３）を解凍し、約１０，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度で培養容器（６ウェルプレート）に播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにて接着培養を開始した。培地交換は３～５日に１回の頻度で実施した。培養４日目にコンフルエンシーが１００％になったが、剥離処理を行うことなく、培養を継続した。培養４、５、６、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、２１日目の細胞形態を、オリンパス社の位相差顕微鏡を用いて観察した。培養５日目にはオーバーコンフルエントとなり、細胞同士が隙間なく密着、一部では細胞同士は重積する状態となった。培養１０日目には、細胞集団の一部分が、自発的に培養容器から剥離した（図２、図３：培養１０日目に観察された部分的な細胞の剥離）。剥離した細胞集団の一部分はシート状の形態であった。培養１１日目では、細胞集団全体が培養容器から自発的に剥離し、一枚の細胞シートとなった（図４：ドナー＃３から調製した実施例２の２継代目の細胞集団の培養１１日目に観察された、剥離した細胞シートが凝集した塊状構造物）。
以上の結果から、ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である細胞集団は、培養容器から自発的に剥離してくることが明らかとなった。つまり、上記条件を満たす細胞集団は、剥離剤添加などの化学的手段、又はセルスクレーパーを用いて物理的に細胞集団を回収する物理的手段を講じることなく、培養した細胞集団を容易に回収することができる。これにより、本発明の細胞集団は、従来の方法で必要であった剥離工程を必要とせず、細胞へのダメージを軽減又は抑制することが可能となる。
また、ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上という条件を満たす細胞集団は、剥離後の細胞集団を細胞シートの形態で取得することができる。つまり、本発明に記載の方法によれば、上述したような化学的手段または物理的手段を用いることなく、また培養容器に対して特別な処置を施すことなく、細胞シートを作成することが可能である。細胞シートは、作業性の観点から臨床使用に適した製剤形態であり、有用である。
＜医薬組成物の調製＞
上記の実施例２で得られた間葉系細胞集団（♯２～４）の一部を医薬組成物の調製に供する。間葉系細胞２．０×１０８個、６．８ｍＬのＣＰ－１溶液（登録商標）、３．２ｍＬの２５％ヒト血清アルブミン溶液、及び１０ｍＬの生理食塩液を含有する医薬組成物（細胞製剤）を調製する。当該医薬組成物を凍結用バッグに封入し、凍結状態で保存する。なお、使用時に医薬組成物を解凍し、患者に供することができる。
＜表面抗原の陰性率、陽性率のまとめ＞
表１に比較例１、実施例１、及び実施例２における表面抗原解析、継代時の酵素処理時間、及び細胞シート形成能の結果についてまとめる。
Figure 0007530893000001
＜参考例＞
（工程４－１：骨髄由来間葉系幹細胞の培養）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ間葉系幹細胞、Ｌｏｎｚａ社製）を購入し、解凍して６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度でφ１５ｃｍのディッシュに播種し、Ｌｏｎｚａ社製の専用培地でサブコンフルエントになるまで接着培養した。培地交換は３～５日に１回の頻度で実施した。その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて細胞集団を剥離し、細胞濃度が２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう生理食塩液を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
（工程４－２：骨髄由来間葉系幹細胞の表面抗原解析）
工程４－１に記載の培養方法で培養した骨髄由来間葉系幹細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ３２４の陽性率、ＭＳＣマーカーと知られているＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ１６６の陽性率、ＣＤ４５の陰性率、ＣＤ３２６の陰性率）を解析した。その結果、ＣＤ３２４の陽性率は７０％以下（具体的には１％）、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６の陽性率はいずれも９０％以上であった（具体的にはＣＤ７３：９７％、ＣＤ９０：９８％、ＣＤ１０５：９７％、ＣＤ１６６：９５％）。ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陰性率はいずれも９５％以上であった（具体的にはＣＤ４５：１００％、ＣＤ３２６：１００％）。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (12)

  1. 羊膜に由来する、間葉系細胞を含む細胞集団であって、
    前記細胞集団において、ＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上であり、
    終濃度で１重量％～２０重量％のヒト血小板溶解物を含む基礎培地で培養され、前記基礎培地で２回以上継代された、前記細胞集団。
  2. 前記細胞集団において、ＣＤ３２６陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である、請求項１に記載の細胞集団。
  3. 前記細胞集団において、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ４５陽性を呈する細胞の比率が１０％以下であり、かつＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、請求項１又は２に記載の細胞集団。
  4. 羊膜に由来する、間葉系細胞を含む細胞集団を、終濃度で１重量％～２０重量％のヒト血小板溶解物を含む基礎培地で培養し、前記基礎培地で２回以上継代する工程と、
    前記間葉系細胞を含む細胞集団の中から、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程を含む、間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法：
    （ａ）前記細胞集団においてＣＤ３２４陽性を呈する細胞の比率が７０％以上であり、
    （ｂ）前記細胞集団において、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である。
  5. 前記基礎培地が、終濃度で２重量％～１０重量％のヒト血小板溶解物を含む、請求項４に記載の製造方法。
  6. 前記基礎培地が、終濃度で３重量％～７重量％のヒト血小板溶解物を含む、請求項４に記載の製造方法。
  7. 前記基礎培地が、αＭＥＭ培地である、請求項４～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
  9. 間葉系細胞の１回の投与量が１０１２個以下となるようにヒトに投与される、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 前記医薬組成物が注射用製剤である、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
  11. 前記医薬組成物が細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
  12. 免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、脳腫瘍、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、筋ジストロフィー、慢性膵炎、慢性腎炎、並びに癌から選択される疾患の治療剤である、請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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