JP6243738B2 - 羊膜間葉系幹細胞の調製方法および単離された羊膜間葉系幹細胞集団 - Google Patents

Description

本発明は、哺乳動物の羊膜由来の間葉系細胞から、間葉系幹細胞集団を調製する方法および単離された羊膜間葉系幹細胞集団に関するものである。

再生医療の分野においては、幹細胞に関する研究が進められている。特に、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、すべての細胞系譜に分化することができる能力（分化万能性）を有するため、非常に有用である。しかしながら、ヒトＥＳ細胞を作成するには、ヒト初期胚を破壊する工程が必須となるため、倫理的な面で問題があった。また、ＥＳ細胞は、臓器移植と同様に、ドナーの確保、他家移植による免疫拒絶反応といった様々な問題があり、臨床へ応用する際の障壁となっていた。

近年、ＥＳ細胞に近い細胞として、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が樹立され、注目を集めている。ｉＰＳ細胞は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２の４種の遺伝子を体細胞に導入することにより、ＥＳ細胞と類似の分化万能性を持たせた細胞である。ｉＰＳ細胞は、採取に差し支えない組織由来の体細胞から樹立できるため、ＥＳ細胞の抱える倫理的問題を回避でき、また、患者自身の分化した体細胞を利用することで免疫拒絶を防ぐことができることから、臨床への応用が期待されている。しかし、ｉＰＳ細胞は、その作製にがん原遺伝子であるｃ−Ｍｙｃを使用しており、また、レトロウイルスを用いて染色体内のランダムな位置に遺伝子を導入することから、細胞ががん化し、腫瘍を形成しやすいという問題があり、臨床応用のためには、さらなる研究が必要とされている。

これらの問題を解決するために、最近、羊膜が注目されている。羊膜は、外胚葉由来の上皮細胞と中胚葉由来の間葉系細胞から構成される胚体外組織であり、多能性幹細胞としての特性を有する細胞群を含有することが確認されている。羊膜は、出産後の排泄物として廃棄されるものであるので、生体材料として使用する上での倫理的問題が少ない。また、羊膜は、免疫学的にも特殊な性質を有しており、免疫原性が低いため、他家移植による免疫拒絶反応も比較的穏やかであることが期待されている。

これまでに本発明者らは、ヒト羊膜上皮由来幹細胞が肝細胞やインスリン産生細胞へと分化する可能性や、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞が軟骨細胞や心筋細胞へ分化する可能性を報告している（特許文献１）。

したがって、羊膜由来間葉系幹細胞を効率よく簡便に単離・調製することが望まれている。しかし、羊膜由来間葉系細胞の細胞集団から、選択的に間葉系幹細胞を得ることは困難であった。

一方、フローサイトメトリーにより細胞にレーザー光を照射し、その照射光の前方散乱光および側方散乱光を測定し、その測定値に基づいて神経幹細胞を分離・分取する方法が知られている（特許文献２）。

しかしながら、羊膜由来間葉系幹細胞の場合には、従来一般的に行われている培養方法や、フローサイトメトリーによる通常のソーティングゲートの組み合わせでは、羊膜由来間葉系細胞の細胞集団から、高い分化能と増殖能を兼ね備えた間葉系幹細胞を選択的に取得することは困難であった。

特許文献１ 特開２００３−２３１６３９号公報
特許文献２ 特開２００３−３０４８６７号公報

本発明は、哺乳動物の羊膜由来の間葉系細胞から、効率よく簡便に、長期間にわたり継代培養可能な増殖能と高い分化能を兼ね備えた間葉系幹細胞集団を調製する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、採取した羊膜間葉系細胞から、長期間にわたり継代培養可能な増殖能と高い分化能を有する羊膜由来間葉系幹細胞集団を容易に得ることができる方法を見出すに至った。

すなわち、第一発明は、（Ａ）哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取するステップと、（Ｂ）前記間葉系細胞の細胞集団について、（ｂ１）フローサイトメーターを用いて前方散乱光および側方散乱光を検出し、二次元分布図を作成し、（ｂ２）前記二次元分布図上に、四角形の３分割ゲートを設定することにより選択された細胞を分取するステップと、（Ｃ）前記分取された細胞を継代培養するステップとを含む、羊膜間葉系幹細胞集団を調製する方法を提供するものである。

前記ステップ（Ｂ）における（ｂ１）において、前記二次元分布図に示された細胞は、間葉系細胞の細胞集団全体の８５〜９５％であることが望ましい。

前記ステップ（Ｂ）における（ｂ２）において、前記四角形の３分割ゲートは、前方散乱光の強度に基づいて３分割したものであることが望ましい。

前記四角形の３分割ゲートは、（ｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前方散乱光の検出限界を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の５〜１５％が含まれるように上辺を設定した第１のゲートと、（ｉｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前記第１のゲートの上辺を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の３５〜４５％が含まれるように上辺を設定した第２のゲートと、（ｉｉｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前記第２のゲートの上辺を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の３５％以上が含まれるように上辺を設定した第３のゲートとからなることが望ましい。

前記ステップ（Ｃ）における継代培養は、（ｃ１）前記分取された細胞を４００〜３５００／ｃｍ^２の細胞濃度において播種し、２〜３日間初期培養するステップと、（ｃ２）前記初期培養の１／５００以上１／１０未満の細胞濃度において播種し、１週間に２回の培地交換を行う継代培養を３〜４回繰り返すステップと、（ｃ３）前記継代培養において紡錘状の形態を有する細胞のコロニーが形成されたとき、細胞がコンフルエントになるまで同一の培養皿で培養を維持するステップとを含むことが望ましい。

前記ステップ（ｃ２）における細胞濃度は、前記初期培養の１／２００以上１／５０未満であることが望ましい。

また、第二発明は、（Ｄ）哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取するステップと、（Ｅ）前記採取された細胞集団を４００〜３５０００／ｃｍ^２の細胞濃度において播種し、２〜３日間初期培養するステップと、（Ｆ）前記初期培養の１／５０００以上１／１０未満の細胞濃度において播種し、１週間に２回の培地交換を行う継代培養を３〜４回繰り返すステップと、（Ｇ）前記継代培養において紡錘状の形態を有する細胞のコロニーが形成されたとき、細胞がコンフルエントになるまで同一の培養皿で培養を維持するステップを含む、羊膜間葉系幹細胞集団を調製する方法を提供するものである。

前記ステップ（Ｆ）における細胞濃度は、前記初期培養の１／２０００以上１／５０未満であることが望ましい。

さらに、本発明は、上記第一発明の方法および／または第二発明の方法により調製された、哺乳動物の羊膜間葉系幹細胞集団を提供する。

前記哺乳動物は、ヒトであることが望ましい。

前記羊膜間葉系幹細胞集団は、紡錘状の形態を有する細胞を含み、かつ、５０回以上の細胞分裂（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ）が可能であることが望ましい。

前記羊膜間葉系幹細胞集団は、軟骨、骨、心筋、神経、肝臓、膵臓などへの高い分化能を有する。

本発明に係る羊膜間葉系幹細胞集団の調製方法は、高い分化能と増殖能を有する羊膜間葉系幹細胞集団を、哺乳動物の羊膜由来間葉系細胞から効率よく簡便に調製することを可能とする。また、本発明に係る方法により調製された羊膜間葉系幹細胞集団を用いることにより、倫理的問題が少なく、かつ、他家移植による免疫拒絶反応が少ない安全な再生医療が可能となる。さらに本発明の羊膜間葉系幹細胞集団は、肝硬変時に起こる肝小葉の線維化を軽減する効果も有する。

フローサイトメーターによって細胞を分取する為の二次元分布図（スキャッタグラム）およびゲートを示す図である。 スキャッタグラムおよびゲートの模式図である。 第２の発明に係る培養方法の模式図である。 羊膜間葉系細胞集団の顕微鏡像および増殖曲線。（ａ）は、単離直後の羊膜間葉系細胞集団（ｆｒｅｓｈ ＨＡＭ：ｆＨＡＭ）の顕微鏡像を示す。（ｂ）は、通常の培養条件により継代培養された羊膜間葉系細胞集団の顕微鏡像を示す。（ｃ）は、低濃度条件により継代培養された羊膜間葉系細胞集団（ＨＡＭα）の顕微鏡像を示す。（ｄ）は、ＨＡＭαの典型的な増殖曲線であり、縦軸が細胞分裂回数、横軸が培養日数を示す。 フローサイトメーターにより分取された細胞から作成された羊膜間葉系幹細胞（ｓｏｒｔｅｄ ＨＡＭα：ｓＨＡＭα）の顕微鏡像。（ａ）および（ｂ）は、ゲートＳから採取され、継代培養された羊膜間葉系幹細胞（ｓＨＡＭα−Ｓ）の顕微鏡像を示す。（ｃ）は、通常の培養条件により継代培養された羊膜間葉系細胞集団の顕微鏡像を示す。 ＨＡＭαにおける幹細胞マーカーの発現を、免疫細胞化学染色により示した図である。 ＨＡＭαにおける、軟骨で発現される遺伝子と細胞外マトリックス遺伝子の発現パターンを示す図である。 ＨＡＭαにおける、骨で発現される遺伝子と細胞外マトリックス遺伝子の発現パターンを示す図である。 ＨＡＭα、および、フローサイトメーターによりゲートＳ、Ｍ、Ｌから採取され、継代培養された羊膜間葉系幹細胞（それぞれ、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−Ｍ、ｓＨＡＭα−Ｌ）における、幹細胞転写因子（山中４因子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ、ｃ−Ｍｙｃ）および神経幹細胞マーカー（Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓａｓｈｉ）の発現を、免疫細胞化学染色により示した図である。 ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−Ｍ、およびｓＨＡＭα−Ｌにおける、幹細胞マーカー（ＣＤ４４、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ?１?６０）および間葉系細胞マーカー（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）の発現を、免疫細胞化学染色により示した図である。 ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−Ｌにおける、心筋組織に特異的な転写因子（ＧＡＴＡ４）の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法により示した図である。 ｓＨＡＭα−Ｓにおける心筋組織マーカーの発現を、免疫細胞化学染色により示した図である。 肝硬変の線維化に対するＨＡＭαの効果を示す図である。 肝細胞特異的マーカー遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法により示した図である。 肝細胞への分化誘導後の細胞について、肝細胞特異的マーカーの発現を免疫細胞化学染色により示した図である。

第一発明は、（Ａ）哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取するステップと、（Ｂ）前記間葉系細胞の細胞集団について、（ｂ１）フローサイトメーターを用いて前方散乱光および側方散乱光を検出し、二次元分布図を作成し、（ｂ２）前記二次元分布図上に、四角形の３分割ゲートを設定することにより選択された細胞を分取するステップと、（Ｃ）前記分取された細胞を継代培養するステップとを含む、羊膜間葉系幹細胞集団を調製する方法である。

「羊膜」とは、哺乳動物の発生過程において形成される、胎子と羊水を包む膜である。哺乳動物には、ヒトをはじめとする霊長類の他、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどが含まれる。本発明で使用される羊膜は、好ましくはヒトの羊膜である。

羊膜は、通常の外科的手法により得ることができる。または、分娩後に廃棄される胎盤から得ることも可能である。ヒト羊膜は、例えばインフォームドコンセントを得た妊婦から、帝王切開により採取することができる。

第一発明の方法では、ステップ（Ａ）として、哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取する。羊膜は、上皮細胞と間葉系細胞とから構成されており、羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取するには、羊膜から上皮細胞を取り除き、分離操作を行えばよい。間葉系細胞の細胞集団の採取は、例えば特開２００３−２３１６３９号公報に記載される方法に準じて行うことができる。

「細胞集団」とは、当該技術分野において通常理解される意味であり、複数の細胞の集まりのことである。採取された羊膜間葉系細胞の細胞集団には、種々の増殖能、寿命、性質を有する細胞が混在している。そのため、一般的な培養条件において間葉系細胞の細胞集団について維持培養を行った場合には、間葉系細胞の細胞集団に含まれる細胞のうち、培養開始初期に接着し、増殖を開始する上皮様の細胞が培養面の大半を占拠してしまうことにより、それよりも遅れて増殖を開始する羊膜間葉系幹細胞は、増殖できずに駆逐されてしまい、単離することができない。

そこで、第一発明の方法では、採取された羊膜間葉系細胞の細胞集団から羊膜間葉系幹細胞集団を調製するために、ステップ（Ｂ）として、前記間葉系細胞の細胞集団を、（ｂ１）フローサイトメーターを用いて前方散乱光および側方散乱光を検出し、二次元分布図を作成し、（ｂ２）前記二次元分布図上に、四角形の３分割ゲートを設定することにより、細胞集団を分取する。このステップにより、分化能および増殖能の異なる細胞集団を分離し、羊膜間葉系幹細胞集団を採取することが可能となる。

「羊膜間葉系幹細胞集団」とは、羊膜間葉系幹細胞以外の細胞が実質的に分離除去された細胞集団を意味し、細胞集団のうち少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上が羊膜間葉系幹細胞である細胞集団を意味する。

第一発明において使用するフローサイトメーターは、特に限定されず、例えばＦＡＣＳ−Ａｒｉａ（日本ＢＤ社）、ＭｏＦｌｏ−ＸＤＰ（ベックマン・コールター社）、ＥＰＩＣＳ−Ａｌｔｒａ（ベックマン・コールター社）などを用いることができる。

第一発明の方法では、フローサイトメーターを用いて前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）を検出することにより、二次元分布図（スキャッタグラム）を作成する。前方散乱光は、レーザー光の軸に対して前方向の小さい角度で散乱する光であり、細胞の大きさに関連して強度が変化する。すなわち、細胞のサイズが大きいほど前方散乱光の強度の値は大きくなる。一方、側方散乱光は、レーザー光の軸に対して約９０度で散乱する光であり、核や顆粒などの細胞の内部構造に応じて強度が変化する。すなわち、細胞の内部密度が高いほど側方散乱光の強度の値は大きくなる。

検出された前方散乱光および側方散乱光に基づいて作成されたスキャッタグラムの模式図を図２に示す。細胞集団は、スキャッタグラムにおいて、楕円で示す領域に分布して表示される。この楕円領域内に、間葉系細胞の細胞集団全体の８５〜９５％が表示されることが好ましい。また、楕円領域は、右斜め方向に展開することが好ましい。

第一発明の方法では、上記二次元分布図（スキャッタグラム）上に、四角形の３分割ゲートを設定する。このとき、四角形の３分割ゲートは、（ｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前方散乱光の検出限界を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の５〜１５％が含まれるように上辺を設定した第１のゲート（ゲートＳ）、（ｉｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前記第１のゲートの上辺を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の３５〜４５％が含まれるように上辺を設定した第２のゲート（ゲートＭ）、（ｉｉｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前記第２のゲートの上辺を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の３５％以上が含まれるように上辺を設定した第３のゲート（ゲートＬ）とすることができる。特に好ましくは、上記四角形の３分割ゲートは、（ｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前方散乱光の検出限界を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の１０％が含まれるように上辺を設定した第１のゲート（ゲートＳ）、（ｉｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前記第１のゲートの上辺を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の４０％が含まれるように上辺を設定した第２のゲート（ゲートＭ）、（ｉｉｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前記第２のゲートの上辺を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の４０％以上が含まれるように上辺を設定した第３のゲート（ゲートＬ）とすることができる。このようにゲートを３分割することにより、羊膜間葉系幹細胞を多く含む細胞集団と、それ以外の細胞集団とを分離することが可能となる。羊膜間葉系幹細胞を多く含む細胞集団は、特に、第１のゲート（ゲートＳ）から高効率で得ることができる。

第一発明の方法では、次に、ステップ（Ｃ）として、上記ゲートごとに分取された細胞について、継代培養を行う。ステップ（Ｃ）の継代培養は、通常の培養条件により行うことができるが、好ましくは、（ｃ１）前記分取された細胞を４００〜３５００／ｃｍ^２の細胞濃度において播種し、２〜３日間初期培養するステップを行った後、（ｃ２）前記初期培養の１／５００以上１／１０未満、特に好ましくは１／２００以上１／５０未満の細胞濃度において播種し、１週間に２回の培地交換を行う継代培養を３〜４回繰り返し、（ｃ３）前記継代培養において紡錘状の形態を有する細胞のコロニーが形成されたとき、細胞がコンフルエントになるまで同一の培養皿で培養を維持することができる。ここで、（ｃ２）の細胞濃度が初期培養の１／５００未満であると、細胞増殖不良の原因となる。また、（ｃ２）の細胞濃度が初期培養の１／１０以上であると、羊膜由来間葉系幹細胞以外の細胞が優位に増殖してしまい、羊膜由来間葉系幹細胞を得ることができない。その他の具体的な条件（培地、温度、二酸化炭素濃度など）は、特に限定されるものではなく、適宜設定することが可能である。

また、ステップ（Ｃ）の継代培養は、成長因子 (例えばｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ)などのサイトカインを培地に添加することにより、さらに効率よく羊膜由来間葉系幹細胞を得ることができる。

第二発明は、（Ｄ）哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取するステップと、（Ｅ）前記採取された細胞集団を４００〜３５０００ｃｍ^２の細胞濃度において播種し、２〜３日間初期培養するステップと、（Ｆ）前記初期培養の１／５０００以上１／１０未満、特に好ましくは１／２０００以上１／５０未満の細胞濃度において播種し、１週間に２回の培地交換を行う継代培養を３〜４回繰り返すステップと、（Ｇ）前記継代培養において紡錘状の形態を有する細胞のコロニーが形成されたとき、細胞がコンフルエントになるまで同一の培養皿で培養を維持するステップとを含む、羊膜間葉系幹細胞を調製する方法である。すなわち、第二発明の方法では、第一発明のステップ（Ａ）と同様の手順であるステップ（Ｄ）により哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取した後、フローサイトメーターを用いた細胞集団の分離を行うことなく、第一発明のステップ（ｃ１）〜（ｃ３）と同様の手順であるステップ（Ｅ）〜（Ｇ）の培養を行うことにより、羊膜間葉系幹細胞集団を調製する。第二発明の培養方法の模式図を図３に示す。

本発明は、上記第一発明の方法および／または第二発明の方法により調製された羊膜間葉系幹細胞集団を提供する。本発明に係る羊膜間葉系幹細胞集団は、羊膜間葉系幹細胞以外の細胞が実質的に分離除去された細胞集団であり、細胞集団のうち少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上が羊膜間葉系幹細胞である細胞集団である。また、本発明に係る羊膜間葉系幹細胞集団は、好ましくはヒト羊膜間葉系幹細胞集団である。

上記第一発明の方法および／または第二発明の方法により調製された羊膜間葉系幹細胞集団は、紡錘状の形態を有する細胞を含み、かつ、高い増殖能を有し、好ましくは５０回以上の細胞分裂（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ）が可能である。

上記第一発明の方法および／または第二発明の方法により調製された羊膜間葉系幹細胞集団は、軟骨、骨、心筋、神経、肝臓、膵臓などへの高い分化能を有し、好ましくは軟骨、骨、心筋、肝臓への分化能を有する。また、肝硬変時に起こる肝小葉の線維化を軽減する効果を有する。

第二発明の方法により調製された羊膜間葉系幹細胞集団は、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１１９およびＦＥＲＭ Ｐ−２２１２５として、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託されている。

以下に製造例、試験例及び実施例を挙げ、本発明について更に説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

＜羊膜間葉系細胞の細胞集団の調製＞
インフォームドコンセントを得たヒト妊婦を帝王切開し、ヒト羊膜を入手した。得られた羊膜から血液などを除去した後、直ちに０．０３％ヒアルロニダーゼと０．０２５％デオキシリボヌクレアーゼＩが入ったリン酸塩緩衝液に浸し、手術用ハサミにより断片化した。その後、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ／ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）溶液中、３７℃で３０分間インキュベートすることにより羊膜組織断片を消化し、消化溶液をガーゼで濾過する操作を６〜８回繰り返した。この工程により、羊膜組織断片からヒト羊膜上皮細胞（Ｈｕｍａｎ ａｍｎｉｏｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ：ＨＡＥＣ）が除去される。

ＨＡＥＣが取り除かれ、ガーゼに残った羊膜組織断片を、０．０７５％コラゲナーゼ−０．００７５％ＤＮアーゼＩ／ＤＭＥＭ溶液中、３７℃で１５分間インキュベートすることにより消化した。得られた消化溶液をガーゼで濾過し、ヒト羊膜間葉系細胞（Ｈｕｍａｎ ａｍｎｉｏｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ：ＨＡＭＣ）を含む細胞集団を採取した。

得られたＨＡＭＣは、１．５〜２×１０^６／１０ｃｍディッシュとなるように、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）−ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ社製、Ｄ５６７１）にて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で５〜６日培養した。

＜フローサイトメーターによる細胞の分取＞
培養された細胞を、０．１％ｔｒｙｐｓｉｎ−０．００８％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液によりディッシュから剥離回収し、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭにより２回洗浄した。得られた細胞は、１×１０^７／ｍｌの濃度になるように、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭにより希釈された。

得られた細胞溶液をフローサイトメーターに供し、二次元分布図（スキャッタグラム）を取得した。図１に示すように、細胞集団全体の９０％の細胞がスキャッタグラム上で検出され、かつ、楕円形状の細胞集団がスキャッタグラム上において中心よりやや左に位置するように、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）の感度を設定した。ＦＳおよびＳＳの感度は、光電子倍増管(Ｐｈｏｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒｔｕｂｅ，ＰＭＴ)の電圧と増幅率を調節することにより調整した。

次いで、スキャッタグラムに対し、以下の３分割ゲートを設定した。
（１）ゲートＳ：側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前方散乱光の検出限界を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の１０％が含まれるように上辺を設定。
（２）ゲートＭ：側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、ゲートＳの上辺を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の４０％が含まれるように上辺を設定。
（３）ゲートＬ：側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、ゲートＭの上辺を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の４０％以上が含まれるように上辺を設定。

各ゲートから分取された細胞集団は、２５８０／ｃｍ^２濃度により初期培養された。（この培養を継代数（Ｐ）＝１とし、それぞれ、ｓｏｒｔｅｄ ＨＡＭα−Ｓ（ｓＨＡＭα−Ｓ）、ｓｏｒｔｅｄ ＨＡＭα−Ｍ（ｓＨＡＭα−Ｍ）、ｓｏｒｔｅｄ ＨＡＭα−Ｌ（ｓＨＡＭα−Ｌ）とした。

＜羊膜間葉系幹細胞の調製＞
ｓＨＡＭα−Ｓでは、Ｐ＝１の初期培養の時点で、周囲の細胞と異なるコロニーが観察された（図５ａおよび５ｂ）。通常の培養条件で培養を行った場合に観察される上皮様細胞（図５ｃ）とは異なり、紡錘状の細胞（図５ａ）や、培養神経細胞様の細胞（図５ｂ：細胞−細胞間に大きな空間が存在し、細胞同士がネットワークを構築する）が、コロニーを形成した。

また、別の培養条件として、上記「羊膜間葉系細胞の細胞集団の調製」で得られたＨＡＭ細胞を含む細胞集団を、フローサイトメーターに供することなく、低濃度条件下に継代培養を実施した。低濃度条件下による継代培養は、５１７／ｃｍ^２の濃度で細胞を播種し、一週間維持した後、新たなディッシュに再播種することにより行った。培地は、週に２回交換した。この継代培養を３〜４回繰り返した場合にも、ゲートＳから分取された細胞集団の継代培養で観察されたものと同様のコロニー形成が確認された。

上記コロニーが観察された培養を、細胞がコンフルエントになるまで継続し、ヒト羊膜間葉系幹細胞集団（以下、ＨＡＭαと称する）を得た。このＨＡＭαについて継代培養を継続した結果を図４に示す。ＨＡＭαは、紡錘状の形態を有し（図４ａ〜ｃ）、５０回以上の細胞分裂が可能であった（図４ｄ）。

＜羊膜間葉系幹細胞の性質についての検討＞
ＨＡＭαが羊膜間葉系幹細胞の性質を有するかどうかを確認するために、種々の幹細胞マーカーに対する抗体を用いて免疫細胞化学的解析を行った。一次抗体には、抗Ｏｃｔ３／４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＯｃｔＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ｃ−Ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗Ｓｏｘ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社製）、抗Ｎａｎｏｇ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＫＬＦ４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＣＤ４４（Ａｂｃａｍ社製）、抗ＳＳＥＡ−３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗ＳＳＥＡ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗ＴＲＡ−１−６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗ＴＲＡ−１−８１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使用した。一次抗体反応は、４℃にて一晩行った。二次抗体反応は、ビオチン標識二次抗体（ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて、室温にて３０分行った。その後、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を室温にて３０分反応させて染色を行った。また、核染色は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所製）により行った。染色した標本は、蛍光顕微鏡により観察した。

結果を図６に示す。ＨＡＭαは、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４などの多能性幹細胞マーカーを強く発現していることが明らかになった。

また、ＨＡＭαについてＦＡＣＳ解析を行った結果では、間葉系幹細胞マーカー（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４４）の発現が確認された。一方で、血液幹細胞マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ）の発現は認められなかった。この結果から、ＨＡＭαは間葉系の幹細胞集団であることが示された。

＜羊膜間葉系幹細胞の分化能の検討＞
ＨＡＭαの分化能について検討を行った。まず、ＨＡＭαの軟骨分化能について検討を行った。２×１０^５個のＨＡＭα細胞を１５ｍｌ遠沈管に回収し、１５０ｇで５分間遠心分離することにより、ＨＡＭαのペレットを得た。得られたＨＡＭαのペレットを、以下の４種類の培地を用いて２８日間培養した。（１）ヒト間葉系幹細胞軟骨細胞分化培地キット（ｈＭＳＣ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ、Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ社製）の基本培地、（２）基本培地に１０ｎｇ／ｍｌのｒＴＧＦ−β３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加したもの、（３）基本培地に１０ｎｇ／ｍｌのｒＴＧＦ−β３および５００ｎｇ／ｍｌのｒＢＭＰ−２（Ａｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ社製）を添加したもの、（４）基本培地に５００ｎｇ／ｍｌのｒＢＭＰ−２を添加したもの。

培養後の細胞を回収して得られたペレットについて、ＲＴ−ＰＣＲ法により、軟骨細胞マーカー遺伝子の発現解析を行った。ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。

結果を図７に示す。分化したＨＡＭαは、軟骨細胞マーカーであるＳＯＸ９、アグリカン、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１を発現していた。この結果から、ＨＡＭαは軟骨への分化能を有していることが明らかになった。

続いて、ＨＡＭαの骨分化能について検討を行った。骨分化誘導は、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭの基本培地に、１０ｍＭのβ-グリセロリン酸二ナトリウム、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、１００ｎＭのデキサメタゾンを添加した分化培地中で培養することにより行った。独立したＨＡＭα細胞集団（ＨＡＭα１〜３）を上記分化培地中で３週間培養した後、培養物からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、骨形成マーカー遺伝子の発現解析を行った。

結果を図８に示す。分化誘導を行ったＨＡＭαは、骨形成マーカーであるオステオカルシンを発現していた（図８、レーンＩ）。この結果から、ＨＡＭαは骨への分化能を有していることが明らかになった。

＜羊膜間葉系幹細胞の性質についての検討・２＞
ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−ＭおよびｓＨＡＭα−Ｌについて、幹細胞マーカーに対する抗体を用いて免疫細胞化学的解析を行った。一次抗体には、抗Ｏｃｔ３／４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ｃ−Ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗Ｓｏｘ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社製）、抗Ｎａｎｏｇ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＫＬＦ４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ｎｅｓｔｉｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ｍｕｓａｓｈｉ（Ａｂｃａｍ社製）、抗ＣＤ４４（Ａｂｃａｍ社製）、抗ＳＳＥＡ−１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗ＳＳＥＡ−３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗ＳＳＥＡ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗ＴＲＡ−１−６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗ＴＲＡ−１−８１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（ダコ・ジャパン社製）を使用した。一次抗体反応は、４℃にて一晩行った。二次抗体反応は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４またはＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８標識二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、室温にて１時間行った。核染色は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所製）あるいはＤａｐｉ（Ｆｌｕｏｍｏｕｎｔ−Ｇ：ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃ社製）により行った。染色した標本は、蛍光顕微鏡により観察した。

結果を図９および図１０に示す。ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−ＭおよびｓＨＡＭα−Ｌのすべてについて、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２およびＫＬＦ４（山中４因子）の顕著な発現が認められた（図９Ａ〜Ｄ）。また、ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−ＭおよびｓＨＡＭα−Ｌのすべてについて、間葉系細胞マーカーであるＶｉｍｅｎｔｉｎの強い発現が認められた（図１０Ｆ）。これらの結果から、ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−ＭおよびｓＨＡＭα−Ｌは、いずれも間葉系幹細胞の集団であることが示された。特に、ｓＨＡＭα−Ｓは、Ｍα−ＭおよびｓＨＡＭα−Ｌに比較して、山中４因子の発現が顕著であり、このことから、ｓＨＡＭα−Ｓが、幹細胞としての強い特性を有することが示された。また、ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−ＭおよびｓＨＡＭα−Ｌのすべてについて、神経幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎおよびＭｕｓａｓｈｉの発現が認められた（図９Ｅ、Ｆ）。

＜羊膜間葉系幹細胞の分化能の検討・２＞
ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−ＳおよびｓＨＡＭα−Ｌについて、心筋分化能の検討を行った。ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−ＳおよびｓＨＡＭα−Ｌを、１×１０^４個／ｃｍ^２の密度になるように１００ｍｍディッシュに播種し、心筋分化培地（２０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに１０μＭの５−アザシチジンを添加したもの）中において２４時間培養した。その後、培地を２０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに交換し、１週間に２回新しい２０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに培地交換することにより、４週間培養した。

（ＲＮＡ抽出）
培養後、１００ｍｍディッシュをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、ＲＮＡ抽出用試薬（ＩＳＯＧＥＮ、和光純薬株式会社）１ｍＬを加え、細胞溶解液を回収した。回収した細胞溶解液に０．２ｍＬのクロロホルムを加えて混合した後、５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した。回収した上清に、２−プロパノールを加えて混合した後、５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、得られた沈殿物を７０％エタノールによりリンスし、５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、得られた沈殿物に滅菌水（ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー）を加え、溶解した。

（ＲＴ−ＰＣＲ）
ｃＤＮＡ合成には、ＴＯＹＯＢＯ ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅキット（東洋紡株式会社）を使用し、以下の反応条件により行った。
（１）各ＲＮＡ １μｇを５分間、６５℃で処理し変性させた。
（２）緩衝液、プライマーミックス、エンザイムミックスを規定量添加した。
（３）１５分間、３７℃処理し逆転写させた。
（４）５分間、９５℃処理し逆転写酵素を失活させ、反応を終了させた。
続いて、ＰＣＲ反応には、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ ＣＯＲＥキット（株式会社キアゲン）使用し、以下の反応条件により行った。
（１）各ｃＤＮＡ １μｇ、各５００ｎＭプライマー、緩衝液、ｄＮＴＰを規定量混合させた。
（２）９５℃で１分間処理。
（３）９５℃で１分間、６０℃（または５５℃）で１分間、７２℃で１分間の処理を４０サイクル。
（４）７２℃で７分間処理。

得られたＰＣＲ産物は、２％アガロース／ＴＡＥゲルに供され、電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドで１５分間染色し、ルミノ・イメージアナライザー（ＬＡＳ３０００：ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）により解析した。

結果を図１１に示す。ｓＨＡＭα−Ｓのみが、分化誘導前から心筋特異的転写因子であるＧＡＴＡ４を発現しており、分化誘導によりその発現量が増加した。それ以外の細胞集団については、分化誘導の前後を通じてＧＡＴＡ４の発現は見られなかった。

（免疫細胞化学染色）
ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−ＭおよびｓＨＡＭα−Ｌの心筋組織への分化度を検討するために、心筋組織マーカーであるミオシン軽鎖に対する抗体（抗Ｍｌｃ２、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）、および心筋ミオシン重鎖に対する抗体（抗ｃａｒｄｉａｃ ＭＨＣ、Ａｂｃａｍ社製）を用いて免疫細胞化学的解析を行った。

結果を図１２に示す。ｓＨＡＭα−Ｓにおけるミオシン軽鎖の発現が確認された。この結果から、ｓＨＡＭα-Ｓは他の分画に比べ、心筋への分化能が高いことが示された。

＜ＨＡＭαの肝硬変に対する効果＞
肝硬変モデルマウスにＨＡＭαを投与した場合の、肝硬変における線維化に対する効果について検討した。
（１）肝硬変モデルマウスの作成
６〜８週齢のＩＣＲマウスに、四塩化炭素／オリーブオイル溶液（オリーブオイル：四塩化炭素＝４：１）を腹腔内に４週間投与し、肝硬変モデルを作成した。
（２）ＨＡＭαの投与
肝硬変モデルマウス一匹あたり１０^６個のＨＡＭαを、脾臓あるいは静脈内に投与した。投与から２週間後、肝臓を摘出し、組織学的検討を行った。
（３）組織標本の作成
摘出した肝臓は、４％パラホルムアルデヒド溶液にて固定後、常法により脱水し、パラフィン包埋を行った。パラフィン包埋された肝臓は、ミクロトームによる薄切の後、脱パラフィンされた。脱パラフィン後のサンプルをシリウスレッドにより染色した。
（４）画像解析
染色後の標本について、一枚の標本から無作為に５視野を抽出し、ＩｍａｇｅＪによる画像解析を実施し、その結果について統計処理を行った。

結果を図１３に示す。ＨＡＭα投与群の肝臓では、非投与群の肝臓と比較して、線維化領域の有意な減少が見られた。この結果から、ＨＡＭαは肝硬変による線維化を減少させる効果があることが示された。

＜羊膜間葉系幹細胞の分化能の検討・２＞
ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−ＭおよびｓＨＡＭα−Ｌについて、肝分化能の検討を行った。ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−ＭおよびｓＨＡＭα−Ｌを、３×１０^４個／ｃｍ^２の密度になるように、コラーゲンでコートされた１００ｍｍディッシュに播種した。分化培地には、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに２０ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、１０ｎｇ／ｍＬの繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、１０ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、１００ｎＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）、１０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのヘパリンを添加したものを用い、３日ごとに培地を交換して、１０日間培養した。

（ＲＴ−ＰＣＲ）
上記の方法に準じて、培養後の細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。結果を図１４に示す。肝細胞への分化誘導前のｓＨＡＭα−ＳおよびｓＨＡＭα−Ｌにはアルブミンの発現が見られないが、チトクローム４５０に対するｍＲＮＡはすべての群で発現が認められた。この結果から、ＨＡＭαは肝細胞への分化能が高い間葉系細胞集団であることが示された。

（免疫細胞化学染色）
ＨＡＭα、ｓＨＡＭα−Ｓ、ｓＨＡＭα−ＭおよびｓＨＡＭα−Ｌの肝細胞への分化度を検討するために、免疫細胞化学的解析を行った。一次抗体には、肝細胞マーカーに対する以下の抗体：抗アルブミン抗体（Ａｂｃａｍ社製）、抗Ａｌｐｈａ−１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ抗体（Ｄａｋｏ社製）、抗ヒトサイトケラチン１８（ＣＫ１８）抗体（ダコ・ジャパン社製）、未分化細胞マーカーに対する抗体（抗サイトケラチン５（ＣＫ５）ポリクローナル抗体、Ｃｏｎｖａｎｃｅ社製）、および、間葉系細胞マーカーに対する抗体（抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ダコ・ジャパン社製）を使用した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４またはＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８標識二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。核染色は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所製）あるいはＤａｐｉ（Ｆｌｕｏｍｏｕｎｔ−Ｇ：ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃ社製）により行った。染色した標本は、蛍光顕微鏡により観察した。

結果を図１５に示す。上記のＲＴ−ＰＣＲ解析ではｓＨＡＭα−Ｌにはアルブミンの発現が見られなかったが、免疫細胞化学染色解析では強いアルブミンの発現が確認された。また、ｓＨＡＭα−Ｌには、他の肝細胞マーカーであるＣＫ１８の発現も認められた。一方、ｓＨＡＭα−Ｓには、いずれの肝細胞マーカーについてもわずかな発現しか見られなかった。このことから、ｓＨＡＭα−Ｌが特に強い肝分化能を有する細胞集団であることが示された。

実施例の結果より、本発明の方法は、長期間にわたり継代培養することができ、かつ、軟骨、骨、心筋および肝細胞への高い分化能を有する羊膜由来間葉系幹細胞を調製できるものであることが示された。また、本発明方法より調製した羊膜由来間葉系肝細胞には肝硬変で生じる肝臓の線維化を軽減する効果があることが明らかである。本発明は、再生医療分野などにおいて利用される羊膜由来間葉系幹細胞の効率的な調製に極めて有用な手段を提供するものである。

Claims (9)

1. （Ａ）哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取するステップと、
   （Ｂ）前記間葉系細胞の細胞集団について、
   （ｂ１）フローサイトメーターを用いて前方散乱光および側方散乱光を検出し、前記間葉系細胞の細胞集団全体の８５〜９５％が示されるように二次元分布図を作成し、
   （ｂ２）前記二次元分布図上に、前方散乱光の強度に基づいて、四角形の３分割ゲートを設定する
   ことにより選択された細胞を分取するステップと、ここで、前記四角形の３分割ゲートは、
   （ｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前方散乱光の検出限界を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の１０％が含まれるように上辺を設定した第１のゲートと、
   （ｉｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前記第１のゲートの上辺を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の４０％が含まれるように上辺を設定した第２のゲートと、
   （ｉｉｉ）側方散乱光の検出上限を右辺、側方散乱光の検出限界を左辺とし、前記第２のゲートの上辺を底辺として、前記二次元分布図に示された細胞集団の４０％以上が含まれるように上辺を設定した第３のゲートと
   からなり、
   （Ｃ）前記分取された細胞を２５８０／ｃｍ ^２ の細胞濃度において播種し、２〜３日間初期培養した後、継代培養するステップと
   を含む、羊膜間葉系幹細胞集団を調製する方法。
2. 前記ステップ（Ｃ）における継代培養は、
   （ｃ２）前記初期培養の１／５００以上１／１０未満の細胞濃度において播種し、１週間に２回の培地交換を行う継代培養を３〜４回繰り返すステップと、
   （ｃ３）前記継代培養において紡錘状の形態を有する細胞のコロニーが形成されたとき、細胞がコンフルエントになるまで同一の培養皿で培養を維持するステップと
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ステップ（ｃ２）における細胞濃度は、前記初期培養の１／２００以上１／５０未満である請求項２に記載の方法。
4. 肝細胞、神経細胞、軟骨または骨への分化能を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により調製された、哺乳動物の羊膜間葉系幹細胞集団。
5. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法において、（ｉ）の第１のゲートから分取された、哺乳動物の羊膜間葉系幹細胞集団。
6. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法において、（ｉｉ）の第２のゲートから分取された、哺乳動物の羊膜間葉系幹細胞集団。
7. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法において、（ｉｉｉ）の第３のゲートから分取された、哺乳動物の羊膜間葉系幹細胞集団。
8. 前記哺乳動物は、ヒトである請求項４〜７のいずれか１項に記載の羊膜間葉系幹細胞集団。
9. 紡錘状の形態を有する細胞を含み、かつ、５０回以上の細胞分裂（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ）が可能である請求項４〜８のいずれか１項に記載の羊膜間葉系幹細胞集団。

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