JP6306708B2 - 細胞分散装置およびそれを用いた自動継代培養システム - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養を自動で行う装置に関し、特に継代培養作業を自動で行うことができる装置に関する。

従来、接着依存性細胞の培養をシャーレやフラスコなどの細胞接着された容器内で行う場合、ほとんどの操作が手作業により行われてきた。細胞培養操作は煩雑であり時間がかかるため、多大な人的コストを必要とする。また、培地交換や継代培養操作を行うタイミングなど作業者の経験により行われているため、細胞に与えるダメージの度合いが異なることによる生存率の差異が生じ、作業者による継代培養操作後の細胞の状態に差が生じやすい。そこで、細胞培養を低コストで安定して実施できるよう、細胞培養操作を自動化するための装置が研究開発されている。

例えば、特許文献１には、培養した細胞の回収を自動化し、効率的な継代培養を可能とする細胞培養装置が提案されている。また、特許文献２には、細胞を培養する複数の培養皿と、細胞液を所定の培養皿に選択的に移送させる制御手段とを備えた細胞培養装置を用いて、培養作業におけるコンタミネーションのリスクを低減させることが提案されている。

特開２００８−０７９５５４号公報 特開２００７−１８５１６５号公報

継代培養では、拡大培養した細胞を回収し、適切な細胞数濃度になるよう希釈して再播種する操作が必要となる。ところが、拡大培養装置から回収した細胞懸濁液は、細胞が集塊を形成しており十分に分散できていない場合が多い。そのような状態で再播種を行うと継代培養において十分な増殖率を得ることができない。増殖率を上げるためには、集塊をほぐして細胞がバラバラに分散した状態とする必要がある。細胞集塊を分散させる方法としては、トリプシンなどの酵素を使う方法、あるいはピペッティングなどの機械的に分散させる方法などがあるが、いずれの方法も過度に行うと細胞にダメージを与えてしまい、継代培養時の生存率が低下させる等の問題がある。従って、特に継代培養を自動で行う細胞培養装置においては、細胞にダメージを与えずに、継代培養において十分な増殖率が得られるよう細胞集塊を分散させる手段の提供が望まれている。

本発明は、細胞の分散の程度を確認しながら適切な強度で細胞集塊に剪断力を与えて細胞を分散させることができる装置を提供する。本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）細胞懸濁液に含まれる細胞集塊を分散させる細胞懸濁液処理装置であって、
細胞懸濁液を取り込む入口と、処理済みの細胞懸濁液を排出する出口と、入口と出口の間に設けられ細胞懸濁液を保持可能な流路とを有し、
流路には、内部の細胞懸濁液を流動させるための送液ポンプ、細胞懸濁液中の細胞の分散度を測定する細胞分散度測定器、および内部を流動する細胞懸濁液に剪断力を与える狭窄部が設けられており、
細胞分散度測定器により得たデータに基づいて少なくとも送液ポンプを制御する制御部を有し、
制御部は、細胞分散度測定器により得たデータに基づいて細胞が所定の分散度に達したか否かを判断し、所定の分散度に達していない場合、細胞懸濁液が前記狭窄部を通過するよう送液ポンプを駆動する、前記細胞懸濁液処理装置。
（２）狭窄部が、弾性素材からなる流路を圧迫して流路の狭窄度を任意に設定する流路潰し機構により設けられたものであり、制御部は細胞分散度測定器により得たデータに基づいて流路潰し機構を制御する、（１）に記載の細胞懸濁液処理装置。
（３）流路に、少なくとも２つ以上の流路が並列に設けられ、かつ切替え弁によりその一部の流路を選択して細胞懸濁液を通せるように構成された並列流路部を有し、狭窄部が並列流路部に含まれる少なくとも１つの流路に設けられている、（１）に記載の細胞懸濁液処理装置。
（４）並列流路部に含まれる流路の２つ以上に狭窄部が設けられており、各狭窄部の断面積が異なる、（３）に記載の細胞懸濁液処理装置。

（５）制御部が切替え弁を制御可能であり、制御部は細胞分散度測定器により得たデータに基づいて並列流路部の任意の流路を選択するよう切替え弁を制御する、（３）または（４）に記載の細胞懸濁液処理装置。
（６）細胞分散度測定器は、細胞懸濁液に照射した光の散乱光または透過光の強度を測定し、光強度値として細胞分散度に関するデータを採取し、制御部は光強度値の経時変化に基づいて細胞集塊の分散の程度を判断する、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞懸濁液処理装置。
（７）拡大培養用の第一の細胞培養装置、細胞懸濁液に含まれる細胞集塊を分散させる細胞懸濁液処理装置、および継代培養用の第二の細胞培養装置を含む自動継代培養システムであって、
細胞懸濁液処理装置は、第一の細胞培養装置から排出された細胞懸濁液を取り込む入口と、処理済みの細胞懸濁液を排出する出口と、入口と出口の間に設けられ細胞懸濁液を保持可能な流路とを有し、
流路には、内部の細胞懸濁液を流動させるための送液ポンプ、細胞懸濁液中の細胞の分散度を測定する細胞分散度測定器、および内部を流動する細胞懸濁液に剪断力を与える狭窄部が設けられており、
細胞分散度測定器により得たデータに基づいて少なくとも送液ポンプを制御する制御部を有し、
制御部は、細胞分散度測定器により得たデータに基づいて細胞が所定の分散度に達したか否かを判断し、所定の分散度に達していない場合、細胞懸濁液が前記狭窄部を通過するよう送液ポンプを駆動する、前記自動継代培養システム。

また、本発明はさらに以下の発明も包含する。
（１）細胞を高濃度で含有する細胞懸濁液を取り込む入口と、細胞を入口の濃度よりも低い所望の濃度で含有する細胞懸濁液を排出する出口とを備え、
入口と出口の間に細胞懸濁液を保持可能な流路を有し、
流路には、内部の細胞懸濁液を流動させるための送液ポンプ、細胞懸濁液の単位量あたりの細胞数濃度に関するデータを採取する細胞数計測器、および流路に提供して細胞懸濁液を希釈する希釈液を保持する希釈液容器が備えられており、
細胞数計測器により得たデータに基づいて少なくとも送液ポンプを制御する制御部をさらに備え、
制御部は、細胞数計測器により得たデータに基づいて細胞数濃度を所望の濃度とするのに必要な希釈液の量を判断し、必要量の希釈液を流路に取り込みかつ細胞懸濁液と希釈液を混合するよう送液ポンプを駆動することを特徴とする、細胞数調整装置。
（２）入口と出口の間に設けられた流路の少なくとも一部が循環流路を形成しており、循環流路には送液ポンプと細胞数計測器とが設けられており、制御部は細胞数計測器から得たデータの変動が予め定めた値の範囲内となるまで送液ポンプを駆動して循環流路を繰り返し流動させることにより細胞懸濁液と希釈液を混合する、（１）に記載の細胞数調整装置。
（３）循環流路にバッファタンクをさらに有する、（２）に記載の細胞数調整装置。
（４）制御部が、送液ポンプを順方向と逆方向の交互に駆動することにより細胞懸濁液と希釈液を混合する、（１）に記載の細胞数調整装置。
（５）細胞数計測器は、細胞懸濁液に照射した光の散乱光または透過光の強度を測定し、光強度値として細胞数濃度に関するデータを採取し、制御部はそのデータを予め求めた細胞数濃度と光強度値の関係に照らして細胞数濃度を算出する、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞数調整装置。

（６）細胞数計測器による細胞数濃度に関するデータの採取を、細胞懸濁液を流動させた状態で断続的または連続的に行う、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞数調整装置。
（７）制御部が、入口からの細胞懸濁液の取り込みを制御する弁と、希釈液の流路への取り込みを制御する弁を制御可能であり、制御部は細胞懸濁液と希釈液の取り込みを交互に繰り返し行うよう、送液ポンプと前記２種の弁とを制御する、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞数調整装置。
（８）拡大培養用の第一の細胞培養装置、細胞数調整装置、および継代培養用の第二の細胞培養装置を含む自動継代培養システムであって、
第一の細胞培養装置は高濃度の細胞懸濁液を排出し、細胞数調整装置は高濃度の細胞懸濁液を所望の細胞数濃度を有する均一の細胞懸濁液へと希釈し、第二の細胞培養装置は希釈された細胞懸濁液を播種して継代培養を行い、
前記細胞数調整装置は、
高濃度の細胞懸濁液を取り込む入口と、細胞を入口の濃度よりも低い所望の濃度で含有する細胞懸濁液を排出する出口とを備え、
入口と出口の間に細胞懸濁液を保持可能な流路を有し、
流路には、細胞懸濁液の単位量あたりの細胞数濃度に関するデータを採取する細胞数計測器、および流路に提供して細胞懸濁液を希釈する希釈液を保持する希釈液容器が備えられており、
細胞数計測器により得たデータに基づいて流路内部の細胞懸濁液の流動を制御する制御部をさらに備え、
制御部は、細胞数計測器により得たデータに基づいて細胞数濃度を所望の濃度とするのに必要な希釈液の量を判断し、必要量の希釈液を流路に取り込みかつ細胞懸濁液と希釈液を混合するよう流路内部の細胞懸濁液の流動を制御する、前記自動継代培養システム。
（９）制御部が、第一の細胞培養装置または第二の細胞培養装置に備えられた送液ポンプを用いて細胞数調整装置の流路内部の細胞懸濁液の流動を制御する、（８）に記載の自動継代培養システム。
（１０）細胞を高濃度で含有する細胞懸濁液を所望の濃度に希釈するための方法であって、
細胞懸濁液を流動させた状態で、細胞懸濁液に照射した光の散乱光または透過光の強度を断続的または連続的に測定して、光強度値として細胞数濃度に関するデータを採取する工程、
得られたデータを予め求めた細胞数濃度と光強度値の関係に照らして細胞数濃度に変換する工程、および
所望の濃度に希釈するために必要な希釈液の量を算出し、その量の希釈液を細胞懸濁液に添加し混合する工程を含む、前記方法。

本発明によれば、作業者の熟練度に関係なく、拡大培養で得られた細胞懸濁液に含まれる細胞集塊を適切な強度で分散させることができ、安定した継代培養操作が可能となる。本発明は、再生医療などの現場において安定した細胞培養を実現するのに寄与する。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１４−１４８７６２号の明細書、特許請求の範囲および図面に記載された内容を包含する。

本発明の細胞分散装置の第１の実施形態を示す概略図である。 ペリスタポンプ４の回転向きを切り替えることにより細胞集塊を分散させた際の光強度値の経時変化のイメージ図である。 本発明の細胞分散装置の第２の実施形態を示す概略図である。 本発明の細胞分散装置の第３の実施形態を示す概略図である。 第３の実施形態の細胞分散装置に細胞集塊を含む細胞懸濁液を通した際の光強度値の経時変化のイメージ図である。 本発明の細胞分散装置の第４の実施形態を示す概略図である。 流路潰し機構９の構造の概略図である。左図は流路側面を、右図は流路断面をそれぞれ示す。 本発明の細胞分散装置の第５の実施形態を示す概略図である。 本発明の継代培養システムの全体像を示す概略図である。 開放系の細胞培養装置を用いた継代培養システムの全体像を示す概略図である。 本発明の細胞数調整機能つき細胞分散装置の第１の実施形態を示す概略図である。 本発明の細胞数調整機能つき細胞分散装置の第２の実施形態を示す概略図である。 本発明の細胞数調整機能つき細胞分散装置の第３の実施形態を示す概略図である。 第３の実施形態の変形例に係る細胞数調整機能つき細胞分散装置を示す概略図である。 第３の実施形態に係る細胞数調整機能つき細胞分散装置１２２またはその変形例１２３に細胞懸濁液を通した際に検出器７から出力される光強度値の経時変化を表すイメージ図である。 細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの全体像を示す概略図である。 細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの第１の変形例の構成の一部を示す概略図である。 細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの第２の変形例の構成の一部を示す概略図である。 細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの第３の変形例の構成の一部を示す概略図である。 細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの第４の変形例の構成の一部を示す概略図である。 細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの第５の変形例の構成の一部を示す概略図である。 細胞数調整機能つき細胞分散装置を利用した開放系継代培養システムの全体像を示す概略図である。 細胞懸濁液を供給した細胞分散装置のフローセルに設けられた検出器で散乱光強度測定を断続的に行った際の値の推移を示すプロット図である。 細胞分散条件の自動最適化に用いた細胞分散装置の概略図である。

（細胞分散装置：第１の実施形態）
図１は、本発明の細胞分散装置の第１の実施形態を示す概略図である。第１の実施形態に係る細胞分散装置１１０は、細胞の分散の程度が未知である細胞懸濁液を入口１から取り込み、内部で細胞集塊を分散させ、出口２から細胞が均一に分散した細胞懸濁液を排出する機能を有する。入口１と出口２の間は流路３で連通しており、流路内の液体を流動させるための送液ポンプであるペリスタポンプ４が設けられている。制御部１１は少なくともペリスタポンプ４を制御する。流路３は必ずしも管径が一様でなくてもよい。流路３は、その移動のための空間も含め、細胞懸濁液を保持するに十分な容積を有している。

流路３はその少なくとも一部に弾性素材からなる部分を有し、ペリスタポンプ４は流路３の弾性部分をしごいて流路内部の流体を流動させる。ペリスタポンプは羽根などの駆動部品が流体に直接触れないため、流体を汚染せずに流動させることができ、さらに分散している細胞に与えるダメージも小さいため好ましい。流体を流動させるためのポンプはペリスタポンプに限られないが、ペリスタポンプのように駆動部品が流体に直接触れないものが好ましい。そのようなポンプとしてはダイヤフラムポンプ、シリンジポンプなどが挙げられる。

流路３には流路狭窄部を構成するオリフィス８が挿入されている。オリフィス８により流路断面積を急変させて通過する流体に強力な剪断力を与え、細胞集塊の分散を促進する。ペリスタポンプ４の回転向きの切替えを繰り返すことにより、細胞懸濁液がオリフィス８を繰り返し通過するようにすると、細胞集塊がより分散されやすくなり好ましい。オリフィス８の径（断面径）は、一般的に細胞の大きさが１０μｍ程度であることに鑑みると、０．５ｍｍ〜１ｍｍの範囲とすると、細胞集塊を効率よく分散でき好ましい。また、細胞の大きさや接着性に基づいて、細胞ごとに適したオリフィス径に変えてもよい。オリフィス８は安価な樹脂製のものを使うと、必要に応じて流路ごと使い捨てとすることができるため好ましい。

流路３の一部にはフローセル５が設けられており、細胞懸濁液がここを通過する際に、細胞集塊の分散の程度に関するデータとして、光強度が測定される。光源６の光をフローセル５に向けて照射し、その透過光または散乱光、あるいはその両方を検出器７で検出する。この実施形態では、光源６と検出器７が細胞分散度測定器を構成している。

フローセル５から観測される透過光または散乱光は、細胞懸濁液の細胞分散度の変化に伴って光量が変化する。そこで、検出器７が検知した光強度の経時変化に着目し、光強度値の変化量が小さくなり、一定の値（好ましくは予め定めた目標値）に集束していくことに基づいて、十分な細胞分散が行われたと判断することが可能となる。制御部１１は、検出器７により得られた光強度データに基づいて、細胞が所定の分散度に達したか否かを判断し、所定の分散度に達していない場合、細胞懸濁液がオリフィス８を通過するようペリスタポンプ４を駆動する。例えば、ペリスタポンプ４の回転の向きを切り替えて、細胞懸濁液がオリフィス８を繰り返し通過するようにする。そのようにペリスタポンプ４を駆動すると、オリフィス８以外においても細胞懸濁液に剪断力が加わり、細胞集塊を分散させたり、あるいは流路内の細胞懸濁液を攪拌し均一にしたりする作用も得られる。また、ペリスタポンプ４の送液速度を変化させることによっても、細胞懸濁液に剪断力を与えることができる。図２は、ペリスタポンプ４の回転向きを切り替えることにより細胞集塊を分散させた際の光強度値の経時変化のイメージ図である。

細胞分散度を測定する方法として、上述のように、光源６をフローセル５に向けて照射し、その透過光または散乱光、あるいはその両方を検出器７で検出する方法を採用すると、細胞懸濁液を流動させたままの状態で細胞分散度を測定することができるため特に好ましい。しかしながら、細胞分散度の測定方法はこれに限定されるものではなく、他の方法を採用してもよい。例えば、流路３中に何らかの観察窓を備え、ＣＣＤカメラ付きの顕微鏡で画像（静止画または動画）を撮影し、画像から細胞分散度を算出するようにしてもよい。細胞懸濁液を流動させた状態で測定するためにはリアルタイムの処理が求められるが、そのような高速な画像処理が可能であれば、光強度測定に換えて細胞分散度測定手段として採用することができる。

流路３を構成するチューブの材質は、細胞への影響がないか、あるいは極めて少ないものを使用することが好ましい。そのような材質の一例として、医療用シリコンチューブが挙げられる。また、フローセル５はガラス製のものでもよいが、安価な樹脂製のものを用いると、一度細胞を通したものは流路３を含めて使い捨てとするようにしやすくなるためより好ましい。

（細胞分散装置：第２の実施形態）
図３は、本発明の細胞分散装置の第２の実施形態を示す概略図である。第２の実施形態に係る細胞分散装置１１１は、基本構成は第１の実施形態と同様であるが、ペリスタポンプ４通過後の流路を分岐し、その先を通過前の流路に戻し、流路を環状構造とした構成とした点において異なる。ポンプ通過前の流路を３ａ、通過後の流路を３ｂ、分岐した帰還流路を１２とする。帰還流路１２への分岐部には切替え弁１３を設置し、出口２側流路と帰還流路１２の選択を可能にする。このような構成とすると、ペリスタポンプ４の回転向きの切替えを行わなくても細胞懸濁液が繰り返しオリフィス８を通過するようにすることができ、光強度測定などによる細胞分散度測定の安定性の向上、ペリスタポンプ４の負担軽減、制御部１１による制御を単純化できる、および細胞への負担を軽減できるなどの効果が得られる。

帰還流路１２の合流点において、流路３ａのポンプ側の圧力は、入口１側より低圧なので、帰還流路１２から流れる液はポンプ側に流れ、入口１側に逆流することはない。しかし、その量は完全にゼロではないので、流路３ａの帰還流路１２の合流点より入口１側に、逆流防止用のピンチ弁や逆止弁があってもよい。

（細胞分散装置：第３の実施形態）
図４は、本発明の細胞分散装置の第３の実施形態を示す概略図である。第３の実施形態に係る細胞分散装置１１２は、基本構成は第２の実施形態と同様であるが、帰還流路１２にバッファタンク１４が設けられている点において相違する。

第２の実施形態のように循環流路構造すると細胞分散の制御において有利であるが、その一方で循環流路の容積内で細胞分散を行わなければならないという制約がある。入口１から取り込む細胞懸濁液の量は未知であり、循環流路内に保持すべき液の総量は可変的である。循環流路の容積が想定され得る最大の液量に対応できるよう、循環流路長を長くとることも考えられるが、実際の液量が最大液量よりも少ない場合には細胞分散の効率が悪くなると考えられる。図４に示した第３の実施形態では、バッファタンク１４を設けることにより循環容量を変えてこの問題を解決している。

バッファタンク１４は、帰還流路１２の途中に設けられており、バッファタンクの前後の流路をそれぞれ１２ａ、１２ｂとする。例えば、１２ａはバッファタンクの上部から入り、１２ｂはタンク下部から出るようにバッファタンク１４に接続される。バッファタンク１４は大気開放されていてもよく、その場合には途中にＨＥＰＡフィルタ１５を設けて外部からの菌の混入を防ぐことが好ましい。帰還流路１２ｂの合流点には、切替え弁１６を設け、入口１側の流路とペリスタポンプ側の流路を選択可能とする。切替え弁には、１つのアクチュエータで２つの流路を同時かつ互い違いに開閉制御できるユニバーサル型のものを用いると、制御部１１が切替え弁１６を制御するようにする場合に好ましい。この第３の実施形態の細胞分散装置に細胞集塊を含む細胞懸濁液を通すと、検出器７から出力される光強度値は図５に示したような経時変化を示す。

バッファタンクの目的は取扱い液量を可変にすることであり、必ずしも図示したような構造を有するタンクでなくてもよく、例えば、伸縮素材からなる液体バッグや、折紙構造で折り畳まれ容積を自在に変えられるバッグをバッファタンクとして用いてもよい。そのようなバッグは、空気を逃す構造が組み込まれていてもよく、あるいは空気を逃さずバッグ内に閉じ込める構造としてもよい。バッグの出口を下方に設置することにより、空気を混入させず液体のみを排出するようにすることができる。

（細胞分散装置：第４の実施形態）
図６は、本発明の細胞分散装置の第４の実施形態を示す概略図である。第４の実施形態に係る細胞分散装置１１３は、オリフィス８に代えて流路の潰し量を制御できる流路潰し機構９を備えることを特徴とする。図７は流路潰し機構９の構造の概略図である。流路潰し機構９は、弾性を持つ流路を外側から潰す機能を有し、ピンチ弁のように完全に閉塞するのではなく、ある間隙を保った状態で流路を潰す。流路潰し機構９は制御部１１により制御されていることが好ましい。流路の潰し量を変化させることにより、内部を流動する細胞懸濁液の細胞集塊に与えられる剪断力を変化させることができる。また、細胞集塊がまだ大きい場合は流路の狭窄部の断面積が小さすぎると流路に細胞が詰まることも考えられるが、流路の潰し量を変化させることができる流路潰し機構９を用いる場合には、適度な流路潰し量を選択することによりそのような問題を回避することができる。

制御部１１は、細胞分散度測定器から得た細胞分散度に関するデータに基づいて流路潰し機構９を制御し、流路のつぶし量を変化させることが好ましい。例えば、流路潰し機構９は、図７（ａ）に示すように、その間隙ｔを流路を全く潰さない全開の状態から流路を完全に潰して閉塞させる状態まで変化できるようにし、その間隙ｔの大きさをステッピングモータのような位置決めできるアクチュエータを使用して制御するようなものとすることができる。あるいは、図７（ｂ）に示すように、間隙ｔは間隙量の指標となる部材９ａを挟むことにより決定してもよい。そのような部材９ａは、複数の間隙量に対応できるようになっていてもよい。例えば図７（ｂ）に示した部材９ａの場合には、間隙量ｔ１、ｔ２および全開に対応が可能である。なお、図１および２を用いて説明した細胞分散装置１１０および１１１についても、オリフィス８に代えて流路潰し機構９を採用してもよい。

（細胞分散装置：第５の実施形態）
図８は、本発明の細胞分散装置の第５の実施形態を示す概略図である。第５の実施形態に係る細胞分散装置１１４は、オリフィス８が設けられた流路３ｃとオリフィスを有しない流路３ｄとが並列に接続されており、それぞれを切替え弁１０で選択可能とした並列流路部を有することを特徴とする。オリフィス８が設けられた流路３ｃは１つのみならず複数用意し、それぞれ異なる径のオリフィスを設けるようにしてもよい。そうすると、細胞分散度測定器から得た細胞分散度に関するデータに基づいて、例えば細胞集塊が比較的大きいと判断される場合には径が大きなオリフィスを通過するように、また細胞集塊がある程度ほぐれてきたと判断される場合にはより小さなオリフィスを通過するようにすることができる。流路３ｃの選択は、切替え弁１０を制御部１１により制御することにより行うことができる。このような構成とすることにより、図６および７を用いて説明した流路潰し機構９のような複雑な構造としなくとも、細胞分散度測定器から得た細胞分散度に関するデータに基づいた適切な細胞分散処理を行うことができ、オリフィス８が閉塞することも予防することができる。

（細胞分散装置を利用した閉鎖系継代培養システム）
以下、本発明の細胞分散装置を使用した継代培養システムについて説明する。本発明の細胞分散装置は、入口と出口を閉じると、外部から菌の混入がない閉鎖系を形成しているので、閉鎖系の細胞培養装置と接続すると、システム全体を閉鎖系とすることができる。以下、閉鎖系細胞培養装置との接続例を説明する。

図９は本発明の継代培養システムの全体像を示す概略図である。閉鎖系細胞培養装置２００において、培養容器１９は、供給バッグ２０および回収バッグ２１と接続され、一つの閉鎖系を形成している。閉鎖系内で培養を行うことで、外部からの菌の混入がない、安全かつ信頼ある培養を行うことができる。供給バッグ２０は複数あってもよく、それぞれのバッグに接続されている個別流路２２は並列に構成され、かついずれも共通流路２３に繋がっており、個別流路２２上に設置された切替え弁２４でいずれかの供給バッグ２０を選択できるようになっている。ここでは、細胞懸濁液２０ａ、培地２０ｂ、剥離液２０ｃ、滅菌空気２０ｄがそれぞれの供給バッグに入っていることとするが、供給バッグの内容物はこれらに限定されない。なお、滅菌空気は、先に入っている液体を後ろから押し出し、液体を排出するために使用する。供給バッグの代わりに、ＨＥＰＡフィルタを接続し大気開放としてもよい。ＨＥＰＡフィルタにより、菌の混入を防ぐことができる。

回収バッグ２１も同様に複数あってもよく、それぞれの個別流路２５は並列に構成され、かついずれも共通流路２６に繋がっており、個別流路２５上に設置された切替え弁２７で、いずれかの回収バッグ２１を選択できるようになっている。ここでは、廃液２１ａ、細胞懸濁液２１ｂをそれぞれの回収バッグに入れることとするが、回収バッグ２１の内容物はこれらに限定されない。

切替え弁２４、２７でいずれかの供給バッグ２０および回収バッグ２１を選択して、ペリスタポンプ２８を駆動することで、培養に必要な送液を行う。細胞懸濁液２０ａを培養容器１９に播種後、定期的に培地交換を実施し、培養を行う。培養後、剥離液２０ｃにより、細胞を培養容器１９から剥離させ、回収バッグ２１ｂに回収する。

閉鎖系細胞培養装置と細胞分散装置と接続し継代を行うには、以下のようにする。最初の拡大培養を行う閉鎖系細胞培養装置２００と、継代後の培養を行う閉鎖系細胞培養装置２１０の２つの培養装置がある。２つの培養装置の基本的な構成は同じである。培養量は後者が多いため、後者には、より大面積の容器を使用してもいいし、複数の培養容器を用意し、並列に接続して図示しない切替え弁で培養容器を切替えながら送液を行ってもよい。

培養装置２００の細胞懸濁液の入った回収バッグ２１ｂと細胞分散装置１１２の入口１ａ、細胞分散装置１１２の出口２ａと細胞数調整装置１０２の入口１ｂ、および細胞数調整装置１０２の出口２ｂと培養装置２１０の細胞懸濁液を入れる供給バッグ２０ａは、それぞれ接続流路で接続されている。細胞数調整装置１０２は、細胞数濃度が未知の細胞懸濁液を取り込み、所望の濃度に希釈した均一な細胞懸濁液を排出する機能を有する装置であり、その機能が実現される限りどのような構成を有していてもよい。また、例えば細胞分散装置１１２の流路に分岐流路とそこに繋がる希釈液バッグをさらに設け、細胞分散度測定器を構成する検出器７が検出した光強度データに基づいて細胞懸濁液濃度を判断し、必要な量の希釈液を希釈液バッグから取り込むような構成を追加することにより、細胞数調整装置１０２は省略することもできる。このシステムで用いている細胞分散装置１１２は、上述の第３の実施形態に係るものであるが、他の実施形態に係るものを用いてもよい。

細胞分散装置１１２は、ペリスタポンプ４を駆動して、回収バッグ２１ｂから細胞懸濁液の取り込みを行う。細胞懸濁液の量は拡大培養の結果などによって変化し得るため、ペリスタポンプ４を長めに駆動して、一旦全量をバッファタンク１４に送ることが好ましい。細胞分散装置１１２の帰還流路１２ｂの合流点には、切替え弁１６を設け、入口１ａ側の流路とペリスタポンプ側の流路を選択可能とする。切替え弁には、１つのアクチュエータで２つの流路を同時に閉開互い違いに制御できるユニバーサル型のものを用いるのが好ましい。次に、切替え弁１６が帰還流路１２ｂを選択するように切替えた後、バッファタンク１４を含めた帰還流路１２ａ、１２ｂおよび流路３ａ、３ｂから構成される循環流路内において細胞懸濁液を循環させることにより、細胞懸濁液がオリフィス８を繰り返し通過し、細胞集塊に剪断力がかかり分散するようにする。光源６と検出器７から構成される細胞分散度測定器は、フローセル５における透過光または散乱光、あるいはその両方を検出器７で検出し、制御部１１に出力する。制御部１１はその光強度値に基づいて細胞集塊の分散の程度を判断する。細胞集塊を分散させた後の細胞懸濁液は、切替え弁１３を制御するなどして細胞数調整装置１０２に送り、細胞数濃度を調整した後、細胞培養装置２１０の細胞懸濁液用供給バッグ２０ａに送られる。細胞懸濁液が投入された細胞培養装置２１０では、培養装置２００と同様にして培養を行う。

（細胞分散装置を利用した開放系継代培養システム）
ここまで細胞培養装置を閉鎖系のものを用いた継代培養システムを前提として説明したが、本発明の継代培養システムは、閉鎖系のみならず、開放系の細胞培養装置も利用することができる。開放系の細胞培養装置は、一般的な手法の細胞培養と同じく、培養容器のふたを外して培地交換するなど、密閉されてない培養容器で培養を行う装置である。菌の混入のリスクは高まるが、液体ハンドリングの自由度が高いのが利点である。前者のリスクは、クリーンルーム内に装置を設置することで減じることができる。

図１０は、開放系の細胞培養装置を用いた継代培養システムの全体像を示す概略図である。開放系の細胞培養装置３００は、密閉されていない培養容器３４と、同じく密閉されていない供給液容器３５、回収液容器３６を持つ。供給液として、細胞懸濁液３５ａ、培地３５ｂ、剥離液３５ｃがあり、回収液として、排液３６ａ、細胞懸濁液３６ｂがある。これらの液体は、分注機構３７により、吸引、吐出が行われる。培養容器はインキュベータ３８内に設置され、培養に適した環境で培養される。

細胞分散装置１１２の入口１ａおよび出口２ａにはそれぞれ取り込み流路および取り出し流路が接続され、取り込み流路は拡大培養用の細胞培養装置３００の回収液体ボトル３６ｂ内に延びている。取り出し流路は、細胞数調整装置１０２を経て、継代培養用の細胞培養装置３１０の供給液体ボトル３５ａ内に延びている。拡大培養用の細胞培養装置３００で培養され回収された細胞懸濁液は、分注機構３７により回収液容器３６ｂ内に回収される。細胞分散装置１１２は、取り込み流路から細胞懸濁液を取り込み、細胞集塊を分散させて細胞数調整装置１０２へと排出し、細胞数調整装置１０２は取り込み流路から細胞懸濁液を取り込み、細胞数濃度を調整した後取り出し流路から継代培養用の細胞培養装置３１０の供給液容器３５ａに排出する。このように、開放系の細胞培養装置と接続した場合でも、細胞分散装置１１２は閉鎖系の細胞培養装置と接続した場合と同様に利用できる。

（細胞数調整機能つき細胞分散装置：第１の実施形態）
図９および図１０に示した継代培養システムでは、細胞分散装置１１２の後に細胞数調整装置１０２を接続している。細胞数調整は、細胞培養装置２１０または３１０において細胞を再播種する際に細胞数濃度を一定にして安定した培養を行うために必要となる。図９および図１０に示した継代培養システムでは、細胞分散と細胞数調整を別個の装置で行っているが、以下に両者を同時に行うことができる装置について説明する。

図１１は、本発明の細胞数調整機能つき細胞分散装置の第１の実施形態を示す概略図である。第１の実施形態に係る細胞数調整機能つき細胞分散装置１２０は、図１に示した細胞分散装置１１０と近い構成を有するが、流路３の一部が分岐して分岐流路４８と接続されており、分岐部分には切替え弁４９が設けられている点で相違する。また、細胞数調整機能つき細胞分散装置１２０は、図８により示した細胞分散装置１１４と同様に、オリフィス４１が設けられた流路４３とオリフィスを有しない流路４４とが並列に接続されており、それぞれを切替え弁４５で選択可能とした並列流路部を有する。

細胞数調整機能つき細胞分散装置１２０では、検出器７で測定された光強度を単位量あたりの細胞数濃度に関するデータとしても利用する。検出器７で検出された透過光または散乱光の強度と細胞数の関係は別途予め求めておき、それと検出器７で検出した光強度とに基づいて細胞数濃度を算出する。透過光または散乱光の強度と細胞数の関係は、例えば培養予定の細胞の濃度既知の細胞懸濁液を数種用意しておき、それぞれについて光強度測定を行い、得られた結果から検量線を作成することにより求めることができる。なお、フローセル５を通過する細胞懸濁液の流量は、入口１から取り込んだ量に基づいて、あるいはフローセル５の容積または断面積とペリスタポンプ４の送液速度に基づいて求めることができる。

光強度に基づく細胞数濃度測定によれば、細胞懸濁液を流動させた状態で細胞数濃度を算出することができる。細胞懸濁液を流動させた状態で細胞数濃度を算出する場合、検出器７は連続的に絶え間なく光強度を測定していてもよく、あるいは断続的に、すなわち間をあけて、好ましくは一定間隔ごとに測定してもよい。なお、細胞数濃度の算出手段は他のものであってもよい。

分岐流路４８に設けられた切替え弁４９は、分岐流路４８と入口１側の流路を切替えることができる。切替え弁にはピンチ弁を使用することが好ましい。ピンチ弁は、弾性素材からなる流路を外側から押しつぶして（ピンチして）流れを制御するものであり、流体に直接触れることがないため、流体も弁自身も汚染せずに流体を制御することができる。切替え弁４９は、２つの流路を切替える機能を持ち、２つのピンチ弁を組み合わせても実現できるが、１つのアクチュエータで２つの流路を同時に閉開互い違いに制御できるユニバーサル型のものを用いてもよい。制御部１１は、切替え弁４９に設けられたアクチュエータを制御することにより弁の切替えを制御してもよい。

分岐流路４８の先には希釈液の入った希釈液容器４０が接続されている。制御部１１は、少なくともペリスタポンプ４を、好ましくは併せて切替え弁４９も制御し、検出器７の検出結果に応じて取り込んだ細胞懸濁液に希釈液を添加し、さらに細胞懸濁液と添加した希釈液が十分に撹拌され細胞数濃度が均一になるようにする。その制御部１１によるペリスタポンプ４および切替え弁４９などの制御について、以下詳細に説明する。

制御部１１は、切替え弁４９が分岐流路４８を閉塞して入口１側流路を選択している状態でペリスタポンプ４を駆動し、入口１から細胞懸濁液の原液を取り込む。取り込まれた細胞懸濁液はそのままフローセル５まで移送される。細胞懸濁液がフローセル５を通過する際に検出器７による光強度測定を行う。制御部１１は、その測定結果から細胞数濃度を算出し、予め定めてある目標値と比較した上で、取り込んだ原液の量と併せて計算し、必要となる希釈液の量を決定する。

制御部１１は、次に切替え弁４９を分岐流路４８側を選択している状態に切替え、ペリスタポンプ４を一定時間駆動し、希釈液容器４０から希釈液を流路３内に取り込む。流路３内は、調整前の細胞数濃度が高い細胞懸濁液と希釈液の２液が不均一に存在する状態となる。次に制御部１１は、ペリスタポンプ４の回転向きを正転・逆転に何度か切り替えて流路３内で液を前後に繰り返し移動させることにより２液を混合する。流路３は、その移動のための空間も含め、細胞懸濁液と希釈液とを保持するに十分な空間を有している。なお、２液の混合は、ペリスタポンプ４の回転の向きを切り替えるだけではなく、例えばペリスタポンプの回転速度を変えて流速を変化させることによっても行うことができる。

光強度測定の測定値は、最初のうちは流路３内における細胞数濃度が不均一であるため振れ幅が大きいが、ペリスタポンプ４の回転向きの切替えを繰り返し行うにつれ、細胞数濃度が徐々に均一となって振れ幅が小さくなっていき、最終的には目標値、すなわち予め定めた細胞数濃度に対応する光強度の値に収束する。そこで、光強度測定の測定値に時間的変化が所定の値（目標値±Δｘ）の範囲内となった時点、好ましくは変化が無くなった時点で、制御部１１は流路３内の液が均一になったと判断する。仮に収束した値が目標値と異なる場合には、制御部１１が上述した希釈工程を再度繰り返すようにしてもよい。希釈工程により所望の細胞数濃度となった細胞懸濁液は、ペリスタポンプ４を駆動させて出口２から排出される。

上述した希釈工程では、入口１からの細胞懸濁液の取り込みおよび希釈液容器４０からの希釈液の取り込みをそれぞれ１回ずつ行うとしたが、制御部１１は切替え弁４９をより短いスパンで切り替えて、細胞懸濁液と希釈液とを少量ずつ複数回に分け、交互に繰り返し取り込むようにしてもよい。そのようにすると、２液がより混合しやすくなり、細胞にかかる負担を低減することができるため好ましい。

細胞数調整機能つき細胞分散装置１２０には、上述のとおりオリフィス４１が設けられた流路４３とオリフィスを有しない流路４４とが並列に接続されており、それぞれを切替え弁４５で選択可能となっている。図８に示した細胞分散装置１１４と同様に、オリフィスが設けられた流路４３は１つのみならず複数用意し、それぞれ異なる径のオリフィスを設けるようにしてもよく、細胞分散度測定器から得た細胞分散度に関するデータに基づいて、例えば細胞集塊が比較的大きいと判断される場合には径が大きなオリフィスを通過するように、また細胞集塊がある程度ほぐれてきたと判断される場合にはより小さなオリフィスを通過するようにすることができる。また、オリフィスを通すと、剪断力がかかることにより細胞懸濁液と希釈液の混合が促進される効果も得られるため、希釈液との混合の状態によっても流路４３を選択するようにしてもよい。ただし、この並列流路部は必ずしも設けられている必要はなく、図１に示した細胞分散装置１１０のように、単一の流路に単一のオリフィスが設けられた構造となっていてもよく、あるいは図６に示した細胞分散装置１１３のように流路潰し機構を備えた構造となっていてもよい。

（細胞数調整機能つき細胞分散装置：第２の実施形態）
図１２は、本発明の細胞数調整機能つき細胞分散装置の第２の実施形態を示す概略図である。第２の実施形態に係る細胞数調整機能つき細胞分散装置１２１は、基本構成は第１の実施形態と同様であるが、ペリスタポンプ４通過後の流路を分岐し、その先を通過前の流路に戻し、流路を環状構造とした構成とした点において異なる。ポンプ通過前の流路を３ａ、通過後の流路を３ｂ、分岐した帰還流路を１２とする。帰還流路１２への分岐部には切替え弁１３を設置し、出口２側流路と帰還流路１２の選択を可能にする。希釈液容器４０が接続されている分岐流路４８は流路３ａ側に設置する。

第２の実施形態に細胞数調整機能つき細胞分散装置１２１による希釈工程は次のように行う。まず、制御部１１は、切替え弁１３は帰還流路１２を閉塞し出口２側流路を選択するように、また切替え弁４９は分岐流路４８を閉塞し入口１側流路を選択するようにし、その状態でペリスタポンプ４を駆動して入口１から細胞懸濁液の原液を取り込む。光強度測定、希釈液の取り込みは第１の実施形態と同様に行う。

第２の実施形態では、調整前の細胞数濃度が高い細胞懸濁液の原液と希釈液の２液の混合は、流路３ａ、３ｂおよび帰還流路１２を利用して行う。まず制御部１１は切替え弁１３を帰還流路１２を選択するように切替え、その状態でペリスタポンプ４を駆動させる。細胞懸濁液と希釈液は帰還流路１２、流路３ａおよび３ｂから構成される循環流路内を循環しながら撹拌され、細胞数濃度が徐々に均一となる。第２の実施形態によれば、帰還流路１２を設けたことにより、ペリスタポンプ４の回転向きの切替えを行わなくても液の混合が可能となり、光強度測定などによる細胞数濃度測定の安定性の向上、ペリスタポンプ４の負担軽減、制御部１１による制御を単純化できる、および細胞への負担を軽減できるなどの効果が得られる。

帰還流路１２の合流点において、流路３ａのポンプ側の圧力は、入口１側より低圧であるため、帰還流路１２から流入する液はポンプ側に流れ、入口１側に逆流することはない。しかし、必要に応じて、流路３ａの帰還流路１２の合流点より入口１側に逆流防止用のピンチ弁や逆止弁を設けてもよい。

（細胞数調整機能つき細胞分散装置：第３の実施形態）
図１３は、本発明の細胞数調整機能つき細胞分散装置の第３の実施形態を示す概略図である。第３の実施形態に係る細胞数調整機能つき細胞分散装置１２２は、基本構成は第２の実施形態と同様であるが、帰還流路１２にバッファタンク１４が設けられている点において相違する。バッファタンク１４については、図４を用いて説明した第３の実施形態に係る細胞分散装置１１２について既に説明したとおりである。

第３の実施形態に係る細胞数調整機能つき細胞分散装置１２２による希釈工程は次のように行う。まず、制御部１１は切替え弁１３を出口２側流路を閉塞し帰還流路１２ａ側を選択するように、また切換え弁１６を帰還流路１２ｂを閉塞し入口１側流路を選択するように制御し、その状態でペリスタポンプ４を駆動して入口１から細胞懸濁液の原液を取り込む。取り込まれた液はバッファタンク１４に送られる。この際、細胞懸濁液の原液はフローセルを通過し、光強度測定が行われる。制御部１１は、その測定結果から細胞数濃度を算出し、予め定めてある目標値と比較した上で、取り込んだ原液の量も併せて計算し必要となる希釈液の量を決定し、切替え弁４９を切り替えて希釈液容器４０から希釈液を取り込む。

取り込まれた細胞懸濁液の原液と希釈液は、切替え弁１６が帰還流路１２ｂを選択するように切替えた後、バッファタンク１４を含めた帰還流路１２ａ、１２ｂおよび流路３ａ、３ｂから構成される循環流路内を循環することにより混合される。所望の細胞数濃度となった細胞懸濁液は、切替え弁１３を出口２側流路を選択するように切替えた後、ペリスタポンプ４を駆動させて出口２より排出することができる。

循環流路内では、バッファタンク１４で上部から入った液が落下することにより、およびオリフィス４１を通過することにより混合が行われる。バッファタンク１４の容量および各流路の容量は、バッファタンク１４とその他の流路における攪拌効率、および想定され得る取り扱い液量などの観点から適宜決定できる。一例として、取り扱い液量がおおよそ１２０ｍＬ〜１８０ｍＬの範囲であれば、循環流路の容量を１００ｍＬとし、バッファタンク１４の容量を１００ｍＬとすることが挙げられる。バッファタンク１４を設けると、循環流路内から空気を除くことができるため、細胞数測定が安定するという利点も併せて得られる。

図１４は第３の実施形態の変形例に係る細胞数調整機能つき細胞分散装置を示す概略図である。これまで説明した実施形態では、希釈液の取り込みを、細胞懸濁液の取り込みや、細胞懸濁液と希釈液の混合に用いるものと同じペリスタポンプ４で行っていた。懸濁液の取り込みや混合のためにはポンプ流量がある程度大きい方が効率良いが、流量の大きいポンプは希釈液取り込み時の微調整にはあまり適していない。また、ペリスタポンプ４自体も流量のばらつきが大きく、微小量の液の注入にはあまり適していない。そこで、図１４に示した変形例に係る細胞数調整機能つき細胞分散装置１２３では、希釈液の添加を新たに設けた微量ポンプ４６により行うよう構成されている。微量ポンプ４６としては、例えばダイヤフラムポンプやシリンジポンプなどを利用することができる。この変形例において、希釈液の添加をバッファタンク１４に注入することにより行うようにすると、第３の実施形態で設けられていた切替え弁４９は不要となる。

図１５は、第３の実施形態に係る細胞数調整機能つき細胞分散装置１２２またはその変形例１２３に細胞集塊を含む細胞懸濁液を通し、しばらく細胞分散工程を実施した後に細胞数調整工程を実施した際、検出器７から出力される光強度値の経時変化を表すイメージ図である。

（細胞数調整機能つき細胞分散装置を利用した閉鎖系継代培養システム）
図１６は、細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの全体像を示す概略図である。図９を用いて示した継代培養システムと同様の閉鎖系の細胞培養装置２００および２１０をそれぞれ接続流路５０および５１を介して細胞数調整機能つき細胞分散装置１２２と接続することにより、閉鎖系継代培養システムを構成することができる。なお、細胞数調整機能つき細胞分散装置はこれまで説明した他の構成のものを用いてもよい。

図１７は、細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの第１の変形例の構成の一部を示す概略図である。この構成では、拡大培養用の細胞培養装置から排出された細胞懸濁液を細胞数調整機能つき細胞分散装置に直接送り込む。細胞培養装置２０１は細胞培養装置２００と基本的な構成は同じであるが細胞懸濁液の回収バッグがなく、接続流路５０で細胞数調整機能つき細胞分散装置１２４と接続されている。細胞数調整機能つき細胞分散装置１２４は、バッファタンク１４がペリスタポンプ４と入口１の間に置かれている構成を有する。入口１側の流路を３ａ１、ポンプ側の流路を３ａ２とし、３ａ１はバッファタンク１４の上部から入り、３ａ２はタンク下部から抜けていく。ペリスタポンプ４通過後の流路３ｂを分岐し、その一方を帰還流路１２とし、バッファタンク１４の上部に戻す。この構成では、帰還流路１２の合流点における切替え弁が不要になる。流路３ｂと帰還流路１２との分岐には切替え弁１３が設けられている。希釈液容器４０に繋がる分岐流路４８は、バッファタンク１４とペリスタポンプ４の間に設ける。細胞培養装置２０１から排出された細胞分散液は、細胞培養装置２０１のペリスタポンプ２８により細胞数調整機能つき細胞分散装置１２４のバッファタンク１４まで送られる。細胞数調整装置１２４で細胞集塊を分散し細胞数濃度を調整した細胞懸濁液は、細胞数調整機能つき細胞分散装置１２４のペリスタポンプ４通過後の流路に緩衝領域が設けられていないため、流路５１を介して継代培養用の細胞培養装置２１０の細胞懸濁液供給バッグ２０ａに送られる。

図１８は、細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの第２の変形例の構成の一部を示す概略図である。この構成では、継代培養用の細胞培養装置２１１に細胞懸濁液供給バッグが設けられていない。細胞数調整機能つき細胞分散装置１２５は、バッファタンク１４がペリスタポンプ４と出口２の間に設けられた構成を有する。ポンプ側の流路を３ｂ１、出口２側の流路を３ｂ２とする。３ｂ１はバッファタンク１４の上部から入り、３ｂ２はバッファタンク１４の下部から抜けていく。流路３ｂ２を分岐し、その一方を帰還流路１２とし、ペリスタポンプ通過前の流路３ａに戻す。合流点には切替え弁１６を設ける。希釈液容器４０に繋がる分岐流路４８は、流路３ａ側に設ける。この構成においては、流路３ｂ２と帰還流路１２の分岐部の切替え弁は不要である。流路３ｂ２から継代培養用の培養装置２１１のペリスタポンプ２８までの間には緩衝領域が存在せず液体の逃げ道はないため、帰還流路１２の分岐部に切替え弁がなくても、ペリスタポンプ４を駆動させた際に逆流が生じない。ただし、この空間の空気量が多い場合、空気が膨張し、その分出口２から帰還流路側への逆流がありうるため、逆流防止用に帰還流路との分岐から出口２の間にピンチ弁や逆流防止用の逆止弁を設置してもよい。なお、拡大培養用の細胞培養装置２００には回収バッグ２１ｂが設けられており、細胞数調整機能つき細胞分散装置１２５との間の緩衝領域として機能する。細胞数調整機能つき細胞分散装置１２５で細胞集塊を分散し細胞数濃度を調整した細胞懸濁液は、継代培養用の培養装置２１１のペリスタポンプ２８を駆動させることにより移送され、培養装置２１１にて直接播種される。

図１９は、細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの第３の変形例の構成の一部を示す概略図である。この構成では、拡大培養用の細胞培養装置、細胞数調整機能つき細胞分散装置および継代培養用の細胞培養装置のいずれにも緩衝領域が設けられていない。細胞数調整機能つき細胞分散装置１２６は、入口１と出口２を結ぶ流路３Ａと３Ｂの間にバッファタンク１４が設けられ、ペリスタポンプ４は帰還流路１２の途中に設けられている。帰還流路１２はバッファタンク１４の上部に入るようにし、切替え弁を不要とした。希釈液容器４０に繋がる分岐流路４８は、帰還流路１２の途中、ペリスタポンプ４の手前に設ける。この構成では、拡大培養用の細胞培養装置２０１からバッファタンク１４に送り込まれた細胞懸濁液は、ペリスタポンプ４を駆動させることにより循環流路内を循環する。必要に応じて、入口１とバッファタンク１４を繋ぐ流路３Ａ、または流路３Ｂの帰還流路１２への分岐の後かつ出口２の手前の流路に弁を設けてもよい。継代培養用の細胞培養装置２１１への細胞懸濁液の送り込みは、細胞培養装置２１１のペリスタポンプ２８を駆動させることにより行う。

図２０は、細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの第４の変形例の構成の一部を示す概略図である。ここで用いている細胞数調整機能つき細胞分散装置１２７は、帰還流路を有さず、液を前後に流動させることにより混合を行う。細胞数調整機能つき細胞分散装置１２７は、それ自体はペリスタポンプを持たず、培養装置のペリスタポンプを利用して液を流動させる。拡大培養用の培養装置２０１の切替え弁２７が流路５０を選択している状態で、細胞培養装置２０１のペリスタポンプ２８を駆動し、細胞懸濁液を細胞数調整機能つき細胞分散装置１２７へ送り込む。希釈液の取り込みは、切替え弁４９を切替えて分岐流路側を開放する状態とし、ペリスタポンプ２８の回転向きを逆転させて行う。切替え弁４９を元に戻し、ペリスタポンプの回転向きを何度か切替えて混合を行う。細胞数濃度を調整した細胞懸濁液は、細胞培養装置２０１のペリスタポンプにより、継代培養用の細胞培養装置２１０の供給バッグ２０ａまで送液される。その後、細胞培養装置２０１側の切替え弁２７を切替え、接続流路５０を閉鎖しておく。

図２１は、細胞数調整機能つき細胞分散装置を使用した継代培養システムの第５の変形例の構成の一部を示す概略図である。この構成は、第４の変形例をさらに変更したものであり、細胞培養装置と細胞数調整機能つき細胞分散装置の間の細胞懸濁液の受け渡しをすべて直接的に行うようにした。細胞数調整機能つき細胞分散装置１２８は、流路３の入口１側と出口２側にそれぞれ分岐流路５２を設け、２つの分岐流路を大気開放された共通流路５３に接続した構造となっている。共通流路５３は切替え弁５４で切替え可能となっており、共通流路にはＨＥＰＡフィルタ５５が接続され、外部からの菌の混入を防いでいる。まず、切替え弁５４を出口２側を解放した状態とし、かつ拡大培養用の細胞培養装置２０１の切替え弁２７を接続流路５０を選択した状態してペリスタポンプ２８を駆動すると、細胞懸濁液が細胞数調整機能つき細胞分散装置１２８へと送られる。検出器７で光強度測定を行い、必要に応じて、切替え弁４９を切替えて分岐流路側を開放する状態とし、ペリスタポンプ２８の回転向きを逆転させて希釈液を取り込む。その後、細胞培養装置２０１側の切替え弁２７を切替え、接続流路５０を閉鎖しておく。細胞集塊を分散させ細胞数濃度を調整した細胞懸濁液は、切替え弁５４を切替えて出口２側の分岐流路５２を閉塞させた状態で、細胞培養装置２１１のペリスタポンプ２８を駆動させることにより、細胞培養装置２１１に送液される。

（細胞数調整機能つき細胞分散装置を利用した開放系継代培養システム）
図２２は、細胞数調整機能つき細胞分散装置を利用した開放系継代培養システムの全体像を示す概略図である。図１０を用いて示した継代培養システムと同様、細胞数調整機能つき細胞分散装置は開放系の細胞培養装置と接続して利用することもできる。

（細胞分散試験）
−８０℃にて冷凍保存されているＣａｃｏ−２（ヒト大腸がん細胞株）４．６×１０^６ｃｅｌｌｓを１０％ＦＢＳ(Fetal Bovine Serum)を添加したＣａｃｏ−２細胞様培養液９ｍＬに浮遊させたものを、細胞培養装置の底面積７８．５ｃｍ^２の拡大培養容器に全量播種し培養したところ、２日後に８０％コンフルエントとなった。その後、３ｍＬのＰＢＳによる細胞洗浄、２ｍＬの０．２５％トリプシン−１ｍＭ ＥＤＴＡを導入し３７℃で４分間静置することによる細胞剥離、３ｍＬの培養液の導入によるトリプシン活性の停止、剥離された細胞を含む培養液の回収を行った。

回収された細胞を含む培養液５ｍＬを図３に示したものと同等の構成を有する細胞分散装置に供給した。細胞分散装置の流路は内径３．１５ｍｍのシリコンチューブからなり、その合計長は５２０ｍｍとした。流路の一部には、内径０．７ｍｍ×長さ１ｍｍのオリフィスを設けた。また、光強度測定を行うためのフローセルは５ｍｍ角のものを用いた。循環流路を１０回程度循環するようペリスタポンプを駆動させながら検出器により散乱光強度測定（波長７００ｎｍ、測定角度２０°）を断続的に行ったところ、測定値が時間とともに収束する様子が観察された（図２３）。細胞懸濁液の様子を目視で確認したところ、同じ試料を１０回程度手作業でピペッティングして細胞を分散させたものと同等の細胞分散状態であると判断された。

（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いた細胞分散条件の自動最適化）
図２４に示した細胞分散装置を用いて、細胞分散条件の自動最適化の一例を説明する。図２４に示した装置では、流路は環状となっており、流路の一部には並列流路が設けられており、オリフィスを有しない流路６０および内径が異なるオリフィス（８−２〜８−Ｎ）が設けられた複数の流路が並列に設けられている。その並列流路は多方バルブ６１を切り替えることにより一つの流路が選択可能となっている。

未分散のＮＩＨ／３Ｔ３細胞（３．０〜４．０×１０^６ｃｅｌｌｓ）を２０ｍＬの培地で回収したものを試料溜め６２に入れ、ペリスタポンプ４を駆動させて細胞分散液を環流させ、以下の手順で分散条件の最適化を行った。

はじめに、オリフィスの内径及び長さを最適化した。オリフィスを有しない流路６０は、全体として３．１５ｍｍｉ．ｄ．×７２０ｍｍの流路からなる。オリフィス８−２〜８−７には、それぞれ以下のサイズのものを用いた：１．６ｍｍｉ．ｄ．×１ｍｍ（８−２）、１．０ｍｍｉ．ｄ．×１ｍｍ（８−３）、０．７ｍｍｉ．ｄ．×１ｍｍ（８−４）、０．４ｍｍｉ．ｄ．×１ｍｍ（８−５）、０．４ｍｍｉ．ｄ．×１０ｍｍ（８−６）、および０．４ｍｍｉ．ｄ．×３０ｍｍ（８−７）。

流速とポンプ駆動時間を一定にし、オリフィスを有しない流路６０を通過した細胞懸濁液を検出器７が測定し、その結果を制御部に送信するようにした。制御部には予め基準値を設定しておき、分散が不十分と判断された場合、多方バルブ６１を切り替え、新たな試料を次のオリフィス８−２を通過させるようにした。同様に、制御部によりオリフィス８−２を通過した細胞試料の分散度合いを判断し、不十分な場合さらに８−３、８−４、８−５と順に試料を通過させるようにし、これを検出器７の結果が基準値をクリアするまで継続させた。なお、いずれの条件も基準値をクリアしない場合は最も基準値に近い分散手段を最適値とした。その結果、オリフィスの内径×長さは、０．４ｍｍｉ．ｄ．×３０ｍｍが最適と判断された。

次に、流速を最適化した。一定のオリフィスとポンプ駆動時間の条件で、ペリスタポンプ４を調節し、流速を２０ｍＬ／分、３０ｍＬ／分、４０ｍＬ／分と変更して細胞懸濁液を送液した。最も基準値に近い分散度となる流速を最適値とした。その結果、流速は４０ｍＬ／分が最適であると判断された。

次に細胞がオリフィスを通過する回数を最適化した。オリフィスを通過する回数は流速とポンプ駆動時間から算出できるため、ポンプ駆動時間を最適化した。オリフィスと流速を一定にし、通過回数に比例する通過時間９０秒、１８０秒、及び２７０秒における分散度合いを評価した。その結果、１８０秒が最適であった。

最適化された分散条件によりＮＩＨ／３Ｔ３細胞を分散し、継続して継代培養を行ったところ、２日後の生存率は９５％以上であった。なお、最適化された分散条件で処理しても、分散度合いが基準値をクリアしない場合、同一試料を分散条件を変更して再度処理してもよい。この場合、１）分散手段の内径を細くする、２）ペリスタポンプの流速を上げる、及び３）分散手段の長さを長くする、の順番で行うとよい。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

１…入口、２…出口、３…流路、４…ペリスタポンプ、５…フローセル、６…光源、７…検出器、８…オリフィス、９…流路潰し機構、１０…切替え弁、１１…制御部、１２…帰還流路、１３…切替え弁、１４…バッファタンク、１５…ＨＥＰＡフィルタ、１６…切替え弁、１９…培養容器、２０…供給バッグ、２１…回収バッグ、２２…個別流路、２３…共通流路、２４…切替え弁、２５…個別流路、２６…共通流路、２７…切替え弁、２８…ペリスタポンプ、３４…培養容器、３５…供給液容器、３６…回収液容器、３７…分注機構、３８…インキュベータ、４０…希釈液容器、４１…オリフィス、４３…流路、４４…流路、４５…切替え弁、４６…微量ポンプ、４７…希釈液流路、４８…分岐流路、４９…切替え弁、５０…接続流路、５１…接続流路、５２…分岐流路、５３…共通流路、５４…切替え弁、５５…ＨＥＰＡフィルタ、６０…オリフィスを有しない流路、６１…多方バルブ、６２…試料溜め、１０２…細胞数調整装置、１１０〜１１４…細胞分散装置、１２０〜１２８…細胞数調整機能つき細胞分散装置、２００，２１０…細胞培養装置（閉鎖系）、３００，３１０…細胞培養装置（開放系）

Claims (6)

1. 細胞懸濁液に含まれる細胞集塊を分散させる細胞懸濁液処理装置であって、
   細胞懸濁液を取り込む入口と、処理済みの細胞懸濁液を排出する出口と、入口と出口の間に設けられ細胞懸濁液を保持可能な流路とを有し、
   流路には、内部の細胞懸濁液を流動させるための送液ポンプ、細胞懸濁液中の細胞の分散度を測定する細胞分散度測定器、および内部を流動する細胞懸濁液に剪断力を与える狭窄部が設けられており、
   光源と検出器から構成される細胞分散度測定器により得た光強度値に基づいて少なくとも送液ポンプを制御する制御部を有し、
   制御部は、細胞分散度測定器により得た光強度値の、一定の値に集束していく経時変化に基づいて細胞が所定の分散度に達したか否かを判断し、所定の分散度に達していない場合、細胞懸濁液が前記狭窄部を通過するよう送液ポンプを駆動し、
   狭窄部は、弾性素材からなる流路を圧迫して流路の狭窄度を任意に設定する流路潰し機構により設けられたものであり、制御部は細胞分散度測定器により得たデータに基づいて流路潰し機構を制御する、前記細胞懸濁液処理装置。
2. 流路に、少なくとも２つ以上の流路が並列に設けられ、かつ切替え弁によりその一部の流路を選択して細胞懸濁液を通せるように構成された並列流路部を有し、狭窄部が並列流路部に含まれる少なくとも１つの流路に設けられている、請求項１に記載の細胞懸濁液処理装置。
3. 並列流路部に含まれる流路の２つ以上に狭窄部が設けられており、各狭窄部の断面積が異なる、請求項２に記載の細胞懸濁液処理装置。
4. 制御部が切替え弁を制御可能であり、制御部は細胞分散度測定器により得たデータに基づいて並列流路部の任意の流路を選択するよう切替え弁を制御する、請求項２または３に記載の細胞懸濁液処理装置。
5. 細胞分散度測定器は、細胞懸濁液に照射した光の散乱光または透過光の強度を測定し、光強度値として細胞分散度に関するデータを採取し、制御部は光強度値の経時変化に基づいて細胞集塊の分散の程度を判断する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞懸濁液処理装置。
6. 拡大培養用の第一の細胞培養装置、細胞懸濁液に含まれる細胞集塊を分散させる細胞懸濁液処理装置、および継代培養用の第二の細胞培養装置を含む自動継代培養システムであって、
   細胞懸濁液処理装置は、第一の細胞培養装置から排出された細胞懸濁液を取り込む入口と、処理済みの細胞懸濁液を排出する出口と、入口と出口の間に設けられ細胞懸濁液を保持可能な流路とを有し、
   流路には、内部の細胞懸濁液を流動させるための送液ポンプ、細胞懸濁液中の細胞の分散度を測定する細胞分散度測定器、および内部を流動する細胞懸濁液に剪断力を与える狭窄部が設けられており、
   光源と検出器から構成される細胞分散度測定器により得た光強度値に基づいて少なくとも送液ポンプを制御する制御部を有し、
   制御部は、細胞分散度測定器により得た光強度値の、一定の値に集束していく経時変化に基づいて細胞が所定の分散度に達したか否かを判断し、所定の分散度に達していない場合、細胞懸濁液が前記狭窄部を通過するよう送液ポンプを駆動し、
   狭窄部は、弾性素材からなる流路を圧迫して流路の狭窄度を任意に設定する流路潰し機構により設けられたものであり、制御部は細胞分散度測定器により得たデータに基づいて流路潰し機構を制御する、前記自動継代培養システム。

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