JP2020054234A - 細胞培養装置、撮像ユニット及び培養監視方法 - Google Patents

細胞培養装置、撮像ユニット及び培養監視方法 Download PDF

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Abstract

【課題】採取行為を不要とし且つ細胞懸濁液の大部分を対象とした培養細胞の計測を行うことができる細胞培養装置、撮像ユニット及び培養監視方法を提供する。【解決手段】細胞培養装置は、細胞及び細胞塊の少なくとも一方を粒状体として含む細胞懸濁液が流通する流路と、流路の途中に設けられ、細胞懸濁液が流路を流れている間、細胞懸濁液に含まれる複数の粒状体を連続的に撮像して複数の画像を取得する撮像ユニットと、を含む。【選択図】図１

Description

開示の技術は、細胞培養装置、撮像ユニット及び培養監視方法に関する。
培養中の細胞を撮像する手段を含む細胞培養装置が知られている。
例えば、特許文献１には、複数の異なる粒径の細胞塊が存在する懸濁培養液内の特定領域を撮像し、撮影した特定領域について画像解析する状態解析システムが記載されている。状態解析システムは、画像解析により細胞塊の分布特徴量における各基底情報の基底混合比を推定し、推定した混合比に基づいて、懸濁培養容器全体における細胞塊の粒径分布、及び細胞塊の総粒子数を算出する。
特許文献２には、第１の培養容器から採取された細胞を含む細胞懸濁液が注入された第２の培養容器を撮影する撮像手段と、第２の培養容器を動揺させて細胞懸濁液を撹拌する撹拌手段と、撮像手段で撮影された画像に基づき決定された撹拌動作で第２の培養容器が動揺するように撹拌手段を制御する制御手段と、を備えた細胞培養装置が記載されている。
特許文献３には、細胞培養容器を駆動装置を用いて制御し揺動させる事で、細胞の播種作業を行う事を特徴とする細胞培養装置において、画像撮影装置により細胞培養容器を撮影し、細胞の播種状態を取得することが記載されている。
特許文献４には、培養容器と、培養容器に保持される細胞の細胞画像を撮影する撮影部と、撮影部で撮影した細胞画像の複数の分割領域の、異なる培養時期の細胞画像の情報に基づき、再生の品質を評価可能とする制御部を備えた自動培養装置が記載されている。
特開２０１６−１５４４５０号公報 特開２０１０−９９０１１号公報 特開２００６−３２０２２６号公報 国際公開第２０１５／１０７６６７号
再生医療用の浮遊培養では、複数の細胞が凝集して球状の細胞塊を形成し、細胞の増殖が進行すると細胞塊の粒径は次第に大きくなる。細胞塊の径が、過大となると細胞塊の中心部は栄養や酸素が届きにくくなり壊死してしまう。そこで、細胞塊の粒径がある程度の大きさになった段階で、細胞塊をより小さな粒径の細胞塊に分割する分割処理（継代処理）が再生医療用の浮遊培養では必要になる。分割され粒径が小さくなった細胞塊は、再び栄養や酸素の吸収効率が改善され、時間経過とともに増殖が進行し、粒径は大きくなる。細胞塊の粒径の拡大は、細胞塊に含まれる細胞の数の増加を意味している。細胞塊を分割する適切なタイミングを把握するためには、細胞塊の粒径がどの程度にまで成長したかを把握することが必要である。細胞塊の粒径がどの程度にまで成長したかは、細胞塊の粒度分布を見ることで把握することができる。
また、細胞は、培養期間中、定期的に、栄養分が消費された使用済みの培養液を新鮮な培養液に交換することが必要になる。この培養液交換においては、細胞塊を系内に残したまま使用済みの培養液を新鮮な培養液に交換する必要がある。このとき、死細胞を使用済みの培養液とともに排出することが、その後の正常な細胞増殖のために重要である。培養液交換処理においては、フィルタを用いて使用済みの培養液と細胞とを分離することで、培養液中の細胞濃度を高めていく濃縮処理が行われる。濃縮処理が適切に実施されたか否かを把握するためには、濃縮処理後の細胞塊の粒度分布を把握すればよい。その後、濃縮された細胞に栄養に富んだ新鮮な培養液を添加して混合する希釈混合処理が行われる。希釈混合処理においては、細胞を含んだ濃縮培養液と新鮮な培養液が所定の割合で均一に混合することが目標となる。
細胞の大量培養において、継代、濃縮、希釈混合の各処理は、細胞培養の成否を左右する重要な工程ではあるが、それ以前に培養容器の中で培養そのものが順調に進行している事が重要である。培養の順調さは、培養容器内の細胞数や細胞塊の粒度分布の経時変化を捉えればよい。
以上のように、細胞の大量培養においては、培養中の細胞または細胞塊の粒度分布を知るということが、非常に有用である。すなわち、培養中の細胞塊の粒度分布の経時変化を捉えることで、培養状況を一目瞭然に把握することができる。また、分割処理（継代処理）前後で細胞塊の粒度分布を比較することで分割処理（継代処理）の状況を把握することができる。また、濃縮処理後及び希釈混合処理後における細胞塊の粒度分布を捉えることで、濃縮処理及び希釈混合処理の状況を把握することができる。
細胞塊の粒度分布を取得する既存の方法は、細胞塊を培養液ごと採取して、顕微鏡を用いて細胞塊を目視観察し、粒径毎の細胞塊の個数をカウントするというものである。しかしながら、この方法は、以下の問題を含んでいる。
１つ目の問題は、細胞塊の採取行為が、培養装置に生物学的汚染を引き起こすリスクを増大させるということである。
２つ目の問題は、細胞塊のカウントに多大な手間と時間を要することである。顕微鏡の視野中には多数の細胞塊が含まれており、それらの各々に焦点を合わせて粒径を測定していくことを、人手によって行うことは容易ではなく、多数の細胞塊を計測することは困難である。従って、細胞塊を含む培養液の採取量は少量とならざるを得ない。
３つ目の問題は、少量の培養液の採取による計測が、全体を正しく代表したものにならないおそれがあり、計測結果が常に不確かさを含んでいるということである。
４つ目の問題は、計測のために採取した細胞塊は、培養を継続することができず、計測のたびに細胞を消費してしまうということである。
一方、培養容器の内部を、撮像装置で観察することで、培養の状況を把握する方法も提案されている。この方法によれば、生物学的汚染のリスクはなく、手間と時間を削減することができ、細胞を消費することもない。しかしながら、再生医療では多量の細胞を必要とし、培養容器は例えば２Ｌ〜１０Ｌの規模になるところ、従来の撮像装置を用いた計測手法は、０．０１Ｌ程度の細胞塊を観察対象とするものであり、計測誤差が２００倍〜１０００倍に拡大されるおそれがある。２Ｌ〜１０Ｌ規模の大型培養容器では、細胞の存在する領域が偏るローカリティの問題も懸念されるので、全体の培養状況を的確に把握するには、撮像装置が少なくとも１０セット相当分は必要になりコスト増になる。
従来の細胞または細胞塊の観測手法における他の問題点は、観察手段に起因する。すなわち、細胞観察では、コントラストを得るため位相差顕微鏡が通常使用され、高解像度を得るために高開口角撮像を行う。このため、焦点深度が浅くなり、奥行きのある液体を観察した場合、ピントの合った面に存在する細胞または細胞塊しか観察することができない。つまり、この問題は、培養液の一部しか測定できないというローカリティの問題を含有している。上記の各特許文献に記載の技術は、上記の問題点を解決し得るものではない。
例えば、特許文献１に記載のような円注形の培養容器内で、側面から特定領域に照明光を照射し、照明光の進行方向に対して９０度方向から撮像装置で撮像する場合、特定領域以外に照明光が当たらないので、特定領域よりも奥（すなわち遠方）の細胞によるノイズは防止できるものの、特定領域と撮像装置との間に浮遊する細胞は、影となるので細胞懸濁液における細胞の濃度が高いほど測定精度への影響が高くなる。更に、培養容器が円柱形の場合、撮像装置が撮像する特定領域は、培養容器（一般的に水の屈折率は1.3、樹脂やガラスの屈折率も物性により変化するが１より大きい）と空気（屈折率が１）との界面が曲面となるので撮像した像は容器の表面形状による歪みが発生する。そのため正確な細胞の大きさを得るには像の歪の影響を軽減するために撮像装置の視野を狭くする必要がある。
開示の技術は、上記の点に鑑みてなされたものであり、採取行為を不要とし且つ細胞懸濁液の大部分を対象とした培養細胞の計測を行うことを目的とする。
開示の技術に係る細胞培養装置は、細胞及び細胞塊の少なくとも一方を粒状体として含む細胞懸濁液が流通する流路と、上記流路の途中に設けられ、上記細胞懸濁液が上記流路を流れている間、上記細胞懸濁液に含まれる複数の粒状体を連続的に撮像して複数の画像を取得する撮像ユニットと、を含む。
上記の細胞培養装置は、上記複数の画像に基づいて、複数の粒状体について統計データを導出する導出部を更に含み得る。上記統計データは、複数の粒状体の、所定粒径範囲ごとの個数、単位体積あたりの所定粒径範囲ごとの個数、所定真円度範囲ごとの個数及び粒状体を構成する細胞の総個数の少なくとも１つを含み得る。
上記撮像ユニットは、上記細胞懸濁液が通過するフローセルと、上記フローセルに撮像視野が設定された複数の撮像素子を含む撮像部と、を含み得る。
上記フローセルは、上記細胞懸濁液が流入する流入口と、上記流入口から流入した上記細胞懸濁液を流出させる流出口と、上記流入口と上記流出口との間に設けられ、上記撮像部の光軸方向における厚さが、上記流入口及び上記流出口の上記光軸方向における厚さよりも薄く且つ光透過性を有する部材で構成された扁平流路と、を含み得る。上記扁平流路の、上記撮像部における光軸方向に沿った厚さが、上記フローセルの内部を流れる上記細胞懸濁液の流れ方向と交差する幅方向における長さよりも薄く且つ光透過性を有する部材で構成されていてもよい。撮像部の撮像視野は、上記扁平流路に設定されていてもよい。
上記フローセル内の上記光軸方向における上記扁平流路の厚さは均一であることが好ましい。また、上記複数の撮像素子は、上記扁平流路の上記細胞懸濁液の流れ方向と交差する幅方向における全域を上記撮像視野に含んでいることが好ましい。
上記撮像部は、上記複数の撮像素子を有するエリアセンサと、上記エリアセンサの光入射側に設けられた第１のテレセントリックレンズと、を含み得る。
上記撮像ユニットは、上記扁平流路に照明光を照射する照明部を更に含み得る。上記照明部は、上記照明光を出射する光源と、上記光源の光出射側に設けられた第２のテレセントリックレンズと、を含み得る。上記第１のテレセントリックレンズの光軸と、上記第２のテレセントリックレンズの光軸とが一致していることが好ましい。
上記撮像部は、上記フローセルの内部を通過する複数の粒状体の各々を、１回以上撮像することが好ましい。
上記扁平流路を流れる上記細胞懸濁液の最高速度と、上記流入口及び上記流出口を流れる上記細胞懸濁液の最高速度とが同等であることが好ましい。
細胞培養装置は、上記流路に接続され、上記細胞懸濁液が収容される少なくとも１つの容器と、上記流路に接続され、上記細胞懸濁液に処理を施す少なくとも１つの処理部と、上記流路に上記細胞懸濁液の液流を発生させるポンプと、を更に含み得る。
上記細胞培養装置は、上記細胞懸濁液に含まれる細胞塊を分割する分割部を上記処理部として含み得る。この場合、上記撮像ユニットは、上記分割部の上流側及び下流側にそれぞれ設けられていてもよい。
上記細胞培養装置は、上記細胞懸濁液を濃縮する濃縮部を上記処理部として含み得る。この場合、上記撮像ユニットは、上記濃縮部の上流側及び下流側にそれぞれ設けられてもよい。
上記細胞培養装置は、細胞懸濁液を混合する混合部を上記処理部として含み得る。この場合、上記撮像ユニットは、上記混合部の下流側に設けられていてもよい。
上記細胞培養装置において上記ポンプと上記撮像ユニットとが連動して動作してもよい。
開示の技術の第１の観点による撮像ユニットは、複数の撮像素子を有する撮像部と、細胞及び細胞塊の少なくとも一方を粒状体として含む細胞懸濁液が流入する流入口、上記流入口から流入した上記細胞懸濁液を流出させる流出口、及び上記流入口と上記流出口との間に設けられた扁平流路を有するフローセルと、を含む。開示の技術の第１の観点による撮像ユニットにおいて、上記扁平流路の、上記撮像部における光軸方向に沿った厚さが、上記流入口及び上記流出口の上記光軸方向における厚さよりも薄く且つ光透過性を有する部材で構成され、上記撮像部の撮像視野が上記扁平流路に設定されている。
開示の技術の第２の観点による撮像ユニットは、複数の撮像素子を有する撮像部と、細胞及び細胞塊の少なくとも一方を粒状体として含む細胞懸濁液が流入する流入口、上記流入口から流入した上記細胞懸濁液を流出させる流出口、及び上記流入口と上記流出口との間に設けられた扁平流路を有するフローセルと、を含む。開示の技術の第２の観点による撮像ユニットにおいて、上記扁平流路は、上記撮像部の光軸方向における厚さが、上記フローセルの内部を流れる細胞懸濁液の流れ方向と交差する幅方向における長さよりも薄く且つ光透過性を有する部材で構成され、上記撮像部の撮像視野が上記扁平流路に設定されている。
開示の技術に係る培養監視方法は、細胞及び細胞塊の少なくとも一方を粒状体として含む細胞懸濁液が流路を流れている間、上記流路を通過する上記細胞懸濁液に含まれる複数の粒状体を連続的に撮像して複数の画像を取得し、上記複数の画像に基づいて、複数の粒状体について統計データを取得して細胞培養の状況を監視するというものである。
上記の培養監視方法において、上記統計データは、複数の粒状体の、所定粒径範囲ごとの個数、単位体積あたりの所定粒径範囲ごとの個数、所定真円度範囲ごとの個数及び粒状体を構成する細胞の総個数の少なくとも１つを含み得る。
上記培養監視方法において、上記細胞懸濁液に含まれる細胞塊を分割する分割処理の前後における、複数の粒状体の所定粒径範囲ごとの個数を上記統計データとして取得してもよい。上記分割処理は、上記細胞懸濁液を所定の流速でメッシュに通す処理を含んでいてもよく、この場合、上記統計データに基づいて、上記流速を定めてもよい。
上記培養監視方法において、上記細胞懸濁液を濃縮する濃縮処理の後における複数の粒状体の所定粒径範囲ごとの個数を上記統計データとして取得してもよい。上記の濃縮処理は、上記細胞懸濁液をフィルタ膜を用いて複数回に亘って膜分離する処理を含んでいてもよく、この場合、上記統計データに基づいて上記濃縮処理の完了を判定してもよい。また、上記統計データに基づいて上記フィルタ膜の目詰まりを検出してもよい。
上記培養監視方法において、上記細胞懸濁液を混合する混合処理の後における複数の粒状体の密度の経時変化を上記統計データとして取得してもよい。上記の混合処理は、上記細胞懸濁液を複数回に亘ってミキサーに通して、複数の粒状体と培地とを混合する処理を含んでいてもよく、この場合、上記統計データに基づいて上記混合処理の完了を判定してもよい。
上記培養監視方法において、培養期間内における所定のタイミングで複数の粒状体の所定粒径範囲ごとの個数を上記統計データとして取得してもよい。
開示の技術によれば、採取行為を不要とし且つ細胞懸濁液の大部分を対象とした培養細胞の計測を実現することが可能となる。
開示の技術の実施形態に係る撮像ユニットの構成を示す斜視図である。 図１における２Ａ−２Ａ線に沿ったフローセルの断面図である。 図１における２Ｂ−２Ｂ線に沿ったフローセルの断面図である。 開示の技術の実施形態に係るフローセル、撮像部及び照明部の各々の相対的な位置を固定するための構成の一例を示す斜視図である。 開示の技術の実施形態に係る筐体の内部に収容された撮像部、照明部及びその他の光学系の構成を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る撮像ユニットによって取得された細胞及び細胞塊を捉えた画像の一例である。 開示の技術の実施形態に係る画像解析装置の構成の一例を示すブロック図である。 開示の技術の実施形態に係る画像解析装置のＣＰＵが、画像解析プログラムを実行することにより実施する処理の流れを示すフローチャートである。 開示の技術の実施形態に係る画像解析装置によって導出された統計データとしての粒度分布の出力形態の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る画像解析装置によって導出された統計データとしての真円度分布の出力形態の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る濃縮部によるフィルトレーションの態様の一例を示す斜視図である。 開示の技術の実施形態に係る制御部において実施される濃縮処理の完了判定の一例を示すフローチャートである。 開示の技術の実施形態に係る制御部において実施され混合処理の完了判定の一例を示すフローチャートである。 開示の技術の実施形態に係る撮像ユニットを用いて取得した細胞等の粒度分布と、市販システムを用いて取得した細胞等の粒度分布とを示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る撮像ユニットを用いて取得した、分割部による分割処理の直前及び直後における細胞等の粒度分布を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る撮像ユニットを用いて取得した、分割部による分割処理の直前及び直後における細胞等の粒度分布を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る撮像ユニットを用いて取得した、濃縮部による濃縮処理前の細胞等の粒度分布、及び濃縮部による濃縮処理後の細胞等の粒度分布を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る撮像ユニットを用いて取得した、濃縮部による濃縮処理前の細胞等の粒度分布、及び濃縮部による濃縮処理後の細胞等の粒度分布を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る混合部の下流側の流路を流れる細胞懸濁液を、撮像ユニットによって連続的に撮像し、取得した各画像に含まれる細胞等の個数を画像順に並べた結果を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置による培養の１サイクル期間中の異なるタイミングで取得した細胞等の粒度分布を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置による培養の１サイクル期間中の異なるタイミングで取得した細胞等の粒度分布を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置による培養の１サイクル期間中の異なるタイミングで取得した細胞等の粒度分布を示すグラフである。 チューブポンプの入口と出口に開示の技術の実施形態に係る撮像ユニットを設置して、細胞懸濁液を繰り返しチューブポンプに通した場合の、細胞塊の粒度分布の変化を観察した結果を示すグラフである。
以下、開示の技術の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。
図１は、開示の技術の実施形態に係る撮像ユニット１０の構成を示す斜視図である。撮像ユニット１０は、細胞懸濁液が流通する流路の途中に設けられ、細胞懸濁液が流路を流れている間、細胞懸濁液に含まれる細胞及び細胞塊の少なくとも一方（以下、細胞等という）を連続的に撮像して複数の画像を取得する。撮像ユニット１０によって取得された複数の画像は、複数の細胞等についての統計データの導出に用いられる。上記統計データは、細胞懸濁液に含まれる複数の細胞等の、所定粒径範囲ごとの個数（粒度分布）、単位体積あたりの所定粒径範囲ごとの個数（密度分布）、所定真円度範囲ごとの個数（真円度分布）及び細胞の総個数の少なくとも１つを含み得る。なお、細胞塊とは、複数の細胞が凝集して形成される球状の凝集体である。撮像ユニット１０は、フローセル２０、撮像部３０及び照明部４０を含んで構成されている。
フローセル２０は、細胞等を含む細胞懸濁液が通過する流路を形成する。フローセル２０は、全体が光学ガラスまたはプラスチック等の光透過性部材で構成されており、フローセル２０の内部を通過する細胞等をフローセル２０の外側に配置された撮像部３０によって撮像することが可能である。
フローセル２０は、細胞懸濁液が流入する流入口２１と、流入口２１から流入した細胞懸濁液を流出させる流出口２２とを有する。すなわち、フローセル２０の内部を通過する細胞懸濁液は、図１において矢印で示される流れ方向Ｄ１に沿って流れる。なお、細胞等の個数のカウントを容易にする観点から、フローセル２０の内部を通過する細胞懸濁液の流れが層流となることが好ましい。流入口２１及び流出口２２の形状は、例えば円筒形である。なお、流入口２１及び流出口２２の形状は、三角筒、四角筒等の角筒形であってもよい。
フローセル２０は、流入口２１と流出口２２との間に設けられた扁平流路２３を有し、扁平流路２３に撮像部３０における撮像視野Ｑ１が設定されている。撮像部３０における光軸方向Ｄ２は、細胞懸濁液の流れ方向Ｄ１と直交する方向に設定されている。なお、図１において、撮像部３０の光軸ＡＸが破線で示されている。
図２Ａは、図１における２Ａ−２Ａ線に沿ったフローセル２０の断面図であり、図２Ｂは、図１における２Ｂ−２Ｂ線に沿ったフローセル２０の断面図である。すなわち、図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれ、フローセル２０の内部を通過する細胞懸濁液の流れ方向Ｄ１に対して平行な断面を示している。
図２Ｂに示すように、扁平流路２３の、光軸方向Ｄ２に沿った（光軸方向Ｄ２と平行な）厚さＬ１は、流入口２１及び流出口２２の同方向における厚さＬ２よりも薄く、且つ均一である。ここで、扁平流路２３の光軸方向における厚さＬ１が均一であるとは、誤差を許容した範囲内において均一であることを意味する。一方、図２Ａに示すように、扁平流路２３の、流れ方向Ｄ１と直交する幅方向Ｄ３における長さＬ３は、流入口２１及び流出口２２の同方向における長さＬ２よりも長くなっている。扁平流路２３は、光透過性を有する部材で構成された板厚が略一定の２枚の平板を、それらの主面が互いに平行となるように配置した構成を有しており、光軸方向における厚さＬ１が幅方向Ｄ３における長さＬ３に対して顕著に薄い扁平形状を有している。
扁平流路２３の厚さＬ１は、薄い方がフローセル２０の内部を通過する細胞等の重なりが発生しにくくなり、且つ、光軸方向Ｄ２の全域が撮像部３０の焦点深度の範囲内に収まりやすくなる。一方、扁平流路２３の厚さＬ１が薄すぎると、扁平流路２３の幅方向Ｄ３の長さＬ３を長くする必要性が生じ、これに合わせて撮像部３０における撮像視野Ｑ１を拡大する必要性が生じる。また、フローセル２０において、細胞懸濁液の流れ方向Ｄ１と交差する方向における流路の断面積（以下、流路面積という）が小さくなると細胞懸濁液の流速が大きくなり、撮像部３０におけるフレームレートを高くする必要性が生じる。以上を勘案すると、扁平流路２３の光軸方向Ｄ２に沿った厚さＬ１は、例えば１．５ｍｍ〜２．５ｍｍ程度が好ましく、典型的には２ｍｍ程度である。
フローセル２０を通過する細胞等に与えるダメージを軽減する観点から、扁平流路２３を通過する細胞懸濁液の流速の最大値と、流入口２１及び流出口２２を通過する細胞懸濁液の流速の最大値とが略同等であることが好ましい。ここで、流速の最大値が略同等とは、扁平流路２３を通過する細胞懸濁液の流速の最大値と、流入口２１及び流出口２２を通過する細胞懸濁液の流速の最大値の差が、例えば１０％以内であることを意味する。また、流入口２１、流出口２２及び扁平流路２３における流路面積を互いに等しくすることは、フローセル２０を通過する細胞懸濁液の流速を均一にするための手法として有効である。また、流入口２１、流出口２２及び扁平流路２３における流路面積は８ｍｍ２以上であることが好ましい。流路面積が小さすぎると細胞へのダメージが過大となるところ、流路面積を８ｍｍ２以上とすることでフローセル２０の通過中に細胞に与えるダメージを軽減することができる。
撮像部３０は、フローセル２０の扁平流路２３に撮像視野Ｑ１が設定された複数の撮像素子を含んで構成されている。撮像部３０は、扁平流路２３の内部を通過する細胞懸濁液の流れ方向Ｄ１と直交する幅方向Ｄ３における全域を撮像視野Ｑ１に含んでいる。撮像部３０は、撮像視野Ｑ１内を通過する細胞等を連続的に撮像し、複数の画像を生成する。
照明部４０は、フローセル２０を間に挟んで、撮像部３０の反対側に設けられており、扁平流路２３の撮像視野Ｑ１に対応する領域に照明光を照射する。
図３は、フローセル２０、撮像部３０及び照明部４０の各々の相対的な位置を固定するための構成の一例を示す斜視図である。図３に示す例では、撮像部３０及び照明部４０は、筐体５０の内部に収容されている。筐体５０の形状は、概略直方体であるが、その一部に筐体５０の中央部に向けて凹んだ凹部５１が形成されている。フローセル２０は、扁平流路２３の少なくとも一部が、筐体５０の凹部５１によって形成される空間内に配置されている。フローセル２０は、筐体５０の上面に固定されたクランパ５２によって把持されることで、フローセル２０と撮像部３０及び照明部４０との相対的な位置が固定される。
筐体５０の凹部５１を画定する互いに対向する壁面Ａ１及びＡ２には、それぞれ窓部Ｗ１及びＷ２（図４参照）が設けられている。照明部４０から出射される照明光は、窓部Ｗ２、フローセル２０及び窓部Ｗ１を透過して撮像部３０に入射する。筐体５０の底面には４本の脚部５３が設けられている。脚部５３は、それぞれ伸縮可能であり、筐体５０の高さは可変となっている。
図４は、筐体５０の内部に収容された撮像部３０、照明部４０及びその他の光学系の構成を示す図である。
撮像部３０は、複数の撮像素子がマトリックス状に配置されたエリアセンサ３１と、エリアセンサ３１の光入射側に設けられたテレセントリックレンズ３２と、を含んで構成されている。すなわち、テレセントリックレンズ３２は、照明部４０から出射された照明光の進行方向に沿った経路上においてフローセル２０とエリアセンサ３１との間に設けられている。エリアセンサ３１は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラやＣＭＯＳ（Complementary metal oxide semiconductor）カメラの形態を有するものであってもよい。エリアセンサ３１は、細胞懸濁液がフローセル２０の内部を流れている間、フローセル２０の内部を通過する個々の細胞等を１回以上撮像することができるフレームレートを有していることが好ましい。なお、撮像部３０による連続的な撮像により取得された複数の画像に同一の細胞等が重複して含まれていてもよい。換言すれば、個々の細胞等は、フローセル２０の内部を１回通過する間、撮像部３０によって２回以上撮像されてもよい。エリアセンサ３１は、最大フレームレートが例えば１００ｆｐｓまたはそれよりも高速であることが好ましい。
エリアセンサ３１を構成する撮像素子の１つのサイズは、レンズ倍率を含めた撮像分解能が、単一細胞のサイズである数十μｍよりも小さいことが好ましい。例えば、テレセントリックレンズ３２の倍率が１倍である場合、撮像素子のサイズは、５μｍ程度であってもよい。また、撮像素子の数は、レンズ倍率及び撮像視野Ｑ１の大きさに応じて定められる。扁平流路２３の内部を通過する細胞懸濁液の流れ方向Ｄ１と直交する幅方向Ｄ３における全域が撮像視野Ｑ１に含まれるように、撮像素子の数が定められる。撮像部３０は、一例として撮像素子数が２０００×１０００のエリアセンサ３１を備えている。なお、本実施形態では、撮像部３０がエリアセンサ３１を含む場合を例示しているが、エリアセンサ３１に代えてラインセンサを使用することも可能である。
フローセル２０の側から到来する光は、テレセントリックレンズ３２を介してエリアセンサ３１に受光される。テレセントリックレンズ３２は、主光線が光軸に対して平行なレンズである。テレセントリックレンズ３２を用いることで、フローセル２０の内部を通過する細胞等をシルエット像として撮像することが可能となる。これは、照明部４０からフローセル２０に照射された照明光が、フローセル２０の内部を通過する細胞等によって散乱され、細胞等に対応する部分が、エリアセンサ３１の撮像面に結像されないためである。このように、細胞等をシルエット像として撮像することで、細胞等の粒径及び個数を極めて正確に計測することが可能となる。また、テレセントリックレンズ３２は、撮像対象物が光軸方向に移動した場合でも像の大きさが殆ど変化しないという特長を有する。この特長とフローセル２０が作る平行平面により、フローセル２０の内部を通過する細胞等の粒径を極めて正確に計測することが可能となる。
テレセントリックレンズ３２は、少なくともフローセル２０側がテレセントリック性を有していればよい。すなわち、テレセントリックレンズ３２として、物体側テレセントリックレンズを好適に用いることが可能である。なお、テレセントリックレンズ３２として、フローセル２０側及びエリアセンサ３１側の双方にテレセントリック性を有する両側テレセントリックレンズを用いることも可能である。テレセントリックレンズ３２の倍率は、例えば１倍であってもよい。撮像部３０によって取得される画像は、主に細胞等の個数のカウントに用いられるので撮像視野の広さが重要となる。レンズ倍率が高すぎると、撮像視野が小さくなり、取得すべき画像の数が増加し、画像処理の負担が増加するので好ましくない。撮像部３０における主な撮像対象である細胞塊の粒径は、数十〜数百μｍ程度であるので、撮像素子のサイズが５μｍ程度である場合、レンズ倍率は１倍でも、撮像部３０によって取得された画像を用いた細胞等の粒径及び個数の計測は十分可能である。
照明部４０は、撮像部３０における撮像視野Ｑ１を照明するための照明光を出射する光源４１と、光源４１とフローセル２０との間に配置されたテレセントリックレンズ４２と、を含んで構成されている。光源４１としては、ＬＥＤ（Light Emitting Diode）ランプ、白熱電球、蛍光ランプ等のあらゆる発光部品を用いることが可能である。光源４１から出射された照明光は、テレセントリックレンズ４２によって平行光とされる。テレセントリックレンズ４２の光軸ＡＸ２は、撮像部３０側のテレセントリックレンズ３２の光軸ＡＸ１と一致している。ここで、テレセントリックレンズ３２及び４２の光軸が一致しているとは、誤差を許容した範囲内において一致していることを意味する。このように撮像部３０側のテレセントリックレンズ３２の光軸ＡＸ１に平行な平行光を照明光として用いることで、撮像部３０によって取得される画像において、細胞等の輪郭をシャープにすることができ、撮像部３０によって取得された画像を用いて細胞等の粒径を極めて正確に計測することができる。
照明部４０から出射された照明光は、反射プリズム６１によって進行方向が９０°折り曲げられ、筐体５０の凹部５１に配置されたフローセル２０に照射され、フローセル２０内を流れる細胞懸濁液に含まれる細胞等を照明する。照明光によって照明されたフローセル２０及び細胞等の像は、反射プリズム６２によって進行方向がさらに９０°折り曲げられ、撮像部３０に入射する。このように、反射プリズム６１及び６２を用いて、光の進行方向を折り曲げることにより、撮像ユニット１０をコンパクトに構成することが可能となる。
以上のように照明部４０と撮像部３０とを対向するように配置することで、照明部４０からの照明光はフローセル２０内に細胞が無い部分は、そのまま撮像部３０に到達し、細胞がある部分は、細胞が照明光を乱反射するため、当該部分の照明光は撮像部３０に届かなくなるため影として記録される。なお、照明部４０からの照明光は平行光であることが好ましい。照明光に含まれる拡散成分が少ないほど撮像部３０で得られる影は濃くなり、高い検出精度を得ることができる。
以下に、撮像ユニット１０の動作について説明する。撮像ユニット１０は、細胞培養装置に設置される。細胞培養装置は、例えば、細胞を培養するための培養容器、細胞懸濁液に対して所定の処理を施す各種の処理部、培養容器及び各種の処理部を相互に接続する流路、及び送液手段としてのポンプを含み得る。撮像ユニット１０のフローセル２０は、細胞培養装置の流路の途中に挿入される。撮像ユニット１０は、細胞培養装置において培養されている全ての細胞が通過する流路の途中に設置されることが好ましい。これにより、細胞培養装置において培養している全ての細胞等を撮像ユニット１０において撮像し、全ての細胞等を捉えた複数の画像を取得することが可能となる。
細胞培養装置の流路を流れる細胞懸濁液は、流入口２１からフローセル２０の内部に流入し、扁平流路２３を通過して流出口２２からフローセル２０の外部に流出する。撮像部３０は、その撮像視野Ｑ１が扁平流路２３の一領域に設定されており、扁平流路２３を移動する細胞等を連続的に撮像して複数の画像を生成する。扁平流路２３の内部を通過する細胞懸濁液の流れ方向Ｄ１と直交する幅方向Ｄ３における全域が、撮像視野Ｑ１に含まれる。また、撮像部３０は、フローセル２０の内部を通過する個々の細胞等を１回以上撮像することができるフレームレートで撮像を行う。従って、培養中の全ての細胞等が撮像部３０によって漏れなく撮像される。照明部４０は、撮像部３０が撮像を行っている間、フローセル２０に照明光を照射する。
図５は、撮像ユニット１０によって取得された細胞及び細胞塊を捉えた画像の一例である。図５に示すように、本実施形態に係る撮像ユニット１０によれば、フローセル２０の内部を通過する細胞等をシルエット像として撮像することができる。
本実施形態に係る撮像ユニット１０は、撮像部３０によって取得された複数の画像を解析して、細胞等について粒度分布等の統計データを導出する画像解析装置７０を更に含み得る。画像解析装置７０は、開示の技術における導出部の一例である。図６は画像解析装置７０の構成の一例を示すブロック図である。
画像解析装置７０は、バス７１を介して相互に接続されたＣＰＵ（Central Processing Unit）７２、主記憶装置７３、補助記憶装置７４、入力装置７５、出力装置７６及びインターフェース装置７７を含むコンピュータによって構成されている。
ＣＰＵ７２は、画像解析プログラム７８を実行することにより、撮像部３０によって取得された複数の画像を解析して細胞等について粒度分布等の統計データを導出する。主記憶装置７３は、実行中のプログラムやデータを一時的に格納するための記憶領域を有し、例えば、ＲＡＭ(Random Access Memory)を含んで構成されている。入力装置７５は、一例として、キーボード、マウス、タブレット等を含んで構成されている。出力装置７６は、一例として、ディスプレイ、プリンタ等を含んで構成されている。
補助記憶装置７４は、例えばハードディスク装置等の不揮発性の記憶装置であり、画像解析プログラム７８及び撮像部３０によって取得された複数の画像を示す画像データ７９が補助記憶装置７４に格納されている。撮像部３０によって取得された複数の画像は、インターフェース装置７７を介して補助記憶装置７４に取り込まれる。
図７は、ＣＰＵ７２が、画像解析プログラム７８を実行することにより実施する処理の流れを示すフローチャートである。
ステップＳ１において、ＣＰＵ７２は、撮像部３０によって取得され、補助記憶装置７４に格納された画像データ７９によって示される複数の画像の各々について平均画像を差し引く処理を行う。フローセル２０の汚れ及び傷は、全画像に共通して映り込む。全画像に共通する画像はバックグラウンドとして差し引くことが望ましい。このバックグラウンドの濃度分布は、取得した複数の画像を平均した平均画像から取得することができる。なお、本ルーチンの開始前に平均画像を生成しておいてもよい。
ステップＳ２において、ＣＰＵ７２は、ステップＳ１の処理を経た複数の画像の各々について二値化処理を行う。これにより、細胞等と背景とが分離される。また、各画像に含まれる個々の細胞等は、画像処理における１つのオブジェクトに変換される。
ステップＳ３において、ＣＰＵ７２は、画像の外縁（撮像視野Ｑ１の外縁）に接するオブジェクトを削除する。すなわち、画像の外縁（撮像視野Ｑ１の外縁）に接し、全体が写っていない細胞等は、画像解析の対象から除外される。全体が写っていない細胞等は、粒径が実際よりも小さく計測されるからである。このように、画像の外縁（撮像視野Ｑ１の外縁）に接するオブジェクトを削除したとしても、個々の細胞等を、撮像部３０において複数回に亘り重複して撮像することで、削除の影響は軽減される。
ステップＳ４において、ＣＰＵ７２は、所定サイズよりも小さいオブジェクトを削除する処理を行う。細胞塊を形成しない培養においては、細胞の粒径よりも小さいデブリスを除去するためにこの処理を行う。一方、細胞塊を形成する培養においては、例えば、粒径が５０μｍ以下の細胞塊は、その後の増殖は期待できず死細胞になる場合が多いので、そのような細胞塊を画像解析の対象から除外するためにこの処理を行う。
ステップＳ５において、ＣＰＵ７２は、所定サイズよりも大きいオブジェクトを削除する処理を行う。培養液中に細胞塊の粒径よりも顕著に大きい気泡が混入することが起こり得る。従って、通常の細胞塊の大きさと比較して顕著に大きいオブジェクトは、削除して画像解析の対象から除外することが好ましい。
ステップＳ６において、ＣＰＵ７２は、個々のオブジェクトについて粒子解析を行う。具体的には、オブジェクトの各々について粒径及び真円度を導出する。粒径として円相当直径を導出してもよい。円相当直径は、オブジェクトの輪郭線によって画定される領域を、同じ面積を有する円とみなした場合の円の直径である。
ステップＳ７において、ＣＰＵ７２は、ステップＳ６において実施した粒子解析の結果を集計したものを統計データとして導出する。ＣＰＵ７２は、統計データとして、例えば、細胞等の所定粒径範囲ごとの個数（粒度分布）、細胞等の単位体積あたりの所定粒径範囲ごとの個数（密度分布）、細胞等の所定真円度範囲ごとの個数（真円度分布）及び細胞の総個数を導出する。導出された統計データは、出力装置７６に出力される。
図８Ａは、画像解析装置７０によって導出された統計データとしての粒度分布の出力形態の一例を示す図である。画像解析装置７０は、撮像部３０によって取得された全ての画像から抽出したオブジェクトの数を、粒径の階級ごとに積算して得られた値を積算個数Ｎａとして導出する。撮像部３０において、個々の細胞等を２回以上重複して撮像している場合、積算個数Ｎａは、実際の細胞等の個数（実個数）よりも多くなる。そこで、画像解析装置７０は、以下のようにして積算個数Ｎａを実個数Ｎｂに換算する。
フローセル２０の内寸は既知であるので、撮像部３０における撮像視野Ｑ１内の体積ｖは既知である。積算個数Ｎａの導出に用いた画像の全数ｔと撮像視野Ｑ１内の体積ｖとの積ｔ×ｖを、総体積として求める。フローセル２０の内部を通過した細胞懸濁液の全量（全体積）をＭとすると、ある粒径の階級に属する積算個数Ｎａに対応する実個数Ｎｂは、下記の（１）式によって表される。

画像解析装置７０は、上記のようにして求めた積算個数Ｎａ及び実個数Ｎｂを二次元配列として表現したものを、粒度分布として出力装置７６に出力する。
図８Ｂは、画像解析装置７０によって導出された統計データとしての真円度分布の出力形態の一例を示す図である。画像解析装置７０は、撮像部３０によって取得された全ての画像から抽出したオブジェクトの数を、真円度の階級ごとに積算して得たられた値を積算個数Ｎａとして導出する。画像解析装置７０は、上記の（１）式に従って積算個数Ｎａを実個数Ｎｂに換算する。画像解析装置７０は、上記のようにして求めた積算個数Ｎａ及び実個数Ｎｂを二次元配列として表現したものを、真円度分布として出力装置７６に出力する。
また、画像解析装置７０は、単位体積あたりのオブジェクトの数を、粒径の階級ごとに求めた結果を、細胞等の密度分布として導出する。細胞等の密度分布は、以下のようにして導出することができる。すなわち、フローセル２０の内寸は既知であるので、撮像部３０における撮像視野Ｑ１内の体積ｖは既知である。粒度分布の導出に用いた画像の全数ｔと撮像視野Ｑ１内の体積ｖとの積ｔ×ｖを、総体積として求める。粒径の階級ごとに積算した積算個数Ｎａとすると、ある粒径の階級に属する細胞等の、単位体積あたり個数（密度）ｄは、下記の（２）式によって表される。
また、画像解析装置７０は、フローセル２０を通過した細胞懸濁液の全量（全体積）に含まれる単一細胞の総個数を以下のように導出する。上記の（２）式から、細胞懸濁液の単位体積あたりの細胞等の所定粒径範囲ごとの個数（密度分布）を求めることができる。また、単一細胞の平均的な粒径は既知であるので、単一細胞を球体とみなした場合の単一細胞の体積を求めることができる。同様に、細胞塊の粒径は計測済みであるので、細胞塊を球体とみなした場合の各細胞塊の体積を粒径に基づいて求めることができる。各細胞塊の体積を、単一細胞の体積で除算することで、各細胞塊を構成する単一細胞の数を求めることができる。このような計算により、細胞懸濁液の単位体積あたりの単一細胞の数Ｎｃを求めることができる。そして、下記の（３）式に示すように、フローセル２０を通過した細胞懸濁液の全量（全体積）Ｍと細胞懸濁液の単位体積あたりの単一細胞の数Ｎｃとの積を、フローセル２０を通過した細胞懸濁液の全量（全体積）に含まれる単一細胞の総個数Ｎｘとして求めることができる。
以上のように、本実施形態に係る撮像ユニット１０は、フローセル２０の内部を通過する細胞等を捉えた複数の画像を取得する。また、撮像ユニット１０は、複数の画像の各々について画像解析を行うことで、細胞等の各々について粒径及び真円度を導出し、粒度分布、密度分布、真円度分布及び細胞の総個数を細胞等の統計データとして導出する。
本実施形態に係る撮像ユニット１０による細胞等の計測手法によれば、細胞等の採取行為が不要である。これにより、生物学的汚染のリスクを回避することができ、また、細胞を消費することもない。また、細胞等の計測を自動で行うことができるので、従来の人手による手法と比較して、手間と時間を大幅に削減することができる。
また、細胞培養装置において培養されている全ての細胞が通過する流路の途中に撮像ユニット１０を設置することで、細胞培養装置において培養されている全ての細胞を計測対象とすることができる。従って、採取された一部の細胞のみを計測対象とする従来の計測手法と比較して、計測精度を高めることができる。
また、フローセル２０は、光軸方向Ｄ２に沿った厚さＬ１が幅方向Ｄ３における長さＬ３に対して顕著に小さい扁平形状を有している。これにより、フローセル２０の内部を通過する細胞等の重なりが発生しにくくなり、且つ、光軸方向Ｄ２の全域が撮像部３０の焦点深度の範囲内に収まりやすくなる。従って、撮像部３０における撮像において、深度方向の影響を少なくすることができる。また、フローセル２０を扁平形状にすることで、撮像部３０における撮像視野Ｑ１内により多くの細胞等を含めることができ、撮像及びその後の画像解析を効率的に行うことが可能となる。また、フローセル２０が板厚が略一定の２枚の平板を、それらの主面が互いに平行となるように配置した構成を有しているので、フローセル２０の表面形状に起因する像の歪は、発生しない。
また、フローセル２０の幅方向Ｄ３における全域が、撮像部３０における撮像視野Ｑ１内に収まっている。従って、フローセル２０の内部に細胞懸濁液を導入しつつ、撮像部３０が連続的な撮像を行うことで、細胞懸濁液の液量にかかわらず、細胞懸濁液中に含まれる全ての細胞等を撮像することが可能である。
また、撮像部３０が、テレセントリックレンズ３２を備えることで、フローセル２０の内部を通過する細胞等をシルエット像として撮像することが可能となる。このように、細胞等をシルエット像として撮像することで、細胞等の粒径及び個数を正確に計測することが可能となる。また、テレセントリックレンズ３２は、撮像対象物が光軸方向に移動した場合でも像の大きさが殆ど変化しないという特長を有するので、フローセル２０の内部を通過する細胞等の粒径を極めて正確に計測することが可能となる。
また、本実施形態に係る撮像ユニット１０は、光源４１及びテレセントリックレンズ４２を含んで構成される照明部４０を有する。照明部４０は、撮像部３０側のテレセントリックレンズ３２の光軸に略平行な平行光を照明光として出射する。これにより、撮像部３０によって取得される画像において、細胞等の輪郭をシャープにすることができ、細胞等の粒径を正確に計測することができる。
図９は、複数の撮像ユニット１０を備えた、本開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置１００の構成の一例を示す図である。なお、細胞培養装置１００が備える３つの撮像ユニット１０を互いに区別するために、それぞれ、撮像ユニット１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃと表記する。
細胞培養装置１００は、細胞懸濁液が収容される培養容器１１０及び貯留容器１２０を有する。また、細胞培養装置１００は、細胞懸濁液に所定の処理を施す処理部として、分割部１３０、濃縮部１４０及び混合部１５０を有する。また、細胞培養装置１００は、培養容器１１０、貯留容器１２０、分割部１３０、濃縮部１４０及び混合部１５０の相互間で、細胞懸濁液の移送を行うための流路Ｆ１〜Ｆ１３を有する。また、細胞培養装置１００は、細胞懸濁液の液流を発生させるポンプＰ１及びＰ２と、細胞懸濁液の流れ方向を制御する方向制御弁Ｖ１〜Ｖ５と、を有する。また、細胞培養装置１００は、ポンプＰ１及びＰ２、方向制御弁Ｖ１〜Ｖ５、後述する開閉バルブ１７１〜１７３及び撮像ユニット１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの駆動制御を行う制御部１６０を有している。なお、ポンプＰ１及びＰ２、方向制御弁Ｖ１〜Ｖ５、開閉バルブ１７１〜１７３及び撮像ユニット１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、それぞれ、制御配線によって制御部１６０に接続され得るが、図９においては、各制御配線の図示を省略している。
培養容器１１０は、細胞等を培地とともに収容し、収容された細胞を培養するための容器である。培養容器１１０の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器やプラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。培養容器１１０は、例えば、温度３０℃〜４０℃（好ましくは３７℃）且つＣＯ２濃度２％〜１０％（好ましくは５％）に制御され且つ密閉されたインキュベータ（図示せず）内に収容され得る。
培養容器１１０に接続された流路Ｆ１上の、培養容器１１０の流通口１１１の近傍には、開閉バルブ１７１が設けられている。開閉バルブ１７１は、培養容器１１０から細胞懸濁液を流出させる場合及び培養容器１１０に細胞懸濁液を流入させる場合に開状態に制御され、それ以外の場合は閉状態に制御される。開閉バルブ１７１の開閉制御は、制御部１６０によって行われる。
分割部１３０は、培養容器１１０内において細胞を培養することによって生じる細胞塊を、粒径のより小さい複数の細胞塊に分割する分割処理を行う処理部である。多能性幹細胞の培養においては、細胞を培養することによって複数の単一細胞が凝集して細胞塊が形成され、細胞の増殖に伴い細胞塊の粒径は大きくなってゆく。細胞塊の粒径が過大となると、細胞塊同士が接着融合し、細胞塊の中心部の細胞が壊死するといった問題が生じ得る。従って、細胞塊の粒径が過大となることを防止するために、培養期間中の適切な時期に、細胞塊を、粒径がより小さい複数の細胞塊に分割する分割処理が必要となる。
分割部１３０は、細胞塊の粒径よりも小さいサイズの網目のメッシュを有する。細胞塊をメッシュに通すことで、細胞塊はメッシュの網目サイズに応じた粒径の複数の細胞塊に分割される。分割部１３０は、流入口１３１及び流出口１３２を有し、流入口１３１から流入した細胞懸濁液に含まれる細胞塊を分割して、処理済みの細胞懸濁液を流出口１３２から流出する。なお、分割部１３０によって分割された細胞塊は、培養容器１１０内に収容され、新たな培養サイクルが開始される。このように、分割処理後に、新たな培養サイクルが開始されることから、分割処理を継代処理と捉えることができる。
濃縮部１４０は、細胞懸濁液に含まれる培地と細胞等とを膜分離することによって細胞懸濁液中の細胞の濃度を高める濃縮処理を行う処理部である。濃縮部１４０は、例えば、タンジェンシャルフローフィルタの構成を有しており、細胞懸濁液が濾過膜の表面に沿って流れるように構成されている。図１０は、濃縮部１４０によるフィルトレーションの態様の一例を示す図である。濃縮部１４０は、例えば、中空糸からなる濾過膜１４３を有する。なお、濃縮部１４０は、細胞懸濁液の流れ方向が、濾過膜の膜面に対して交差する方向となるデッドエンドフローフィルタの構成を有していてもよい。濃縮部１４０は、流入口１４１及び流出口１４２を有し、流入口１４１から流入した細胞懸濁液に濃縮処理を施して、処理済みの細胞懸濁液を流出口１４２から流出する。濃縮部１４０の濾過膜１４３を透過したデブリスを含む使用済みの培地は、廃液として廃棄される。ろ過側には負圧を印加するポンプＰ３が接続されている。
混合部１５０は、濃縮された細胞懸濁液と培地供給部（図示せず）から供給される新鮮培地とを混合して、培地中の細胞の密度を均一する混合処理を行う処理部である。混合部１５０は、駆動部を有しないスタティックミキサとしての構成を有していることが好ましく、例えば、管状体と、管状体の内部に固定設置され、管状体の内部にらせん状の流路を形成する撹拌エレメントと、を含んで構成され得る。なお、混合部１５０は、撹拌翼を回転駆動することにより撹拌及び混合を行うものであってもよい。
貯留容器１２０は、細胞懸濁液を一次的に貯留しておくための容器である。貯留容器１２０の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。
貯留容器１２０に接続された流路Ｆ９上の、貯留容器１２０の流出口１２１の近傍には、開閉バルブ１７２が設けられている。開閉バルブ１７２は、貯留容器１２０から細胞懸濁液を流出させる場合に開状態に制御され、それ以外の場合は閉状態に制御される。開閉バルブ１７２の開閉制御は、制御部１６０によって行われる。
流路Ｆ３は、分割部１３０の流入口１３１に接続された流路Ｆ４と、濃縮部１４０の流入口１４１に接続された流路Ｆ５とに分岐し、流路Ｆ３、Ｆ４及びＦ５の交差部に方向制御弁Ｖ３が設けられている。また、分割部１３０の流出口１３２に接続された流路Ｆ６と、濃縮部１４０の流出口１４２に接続された流路Ｆ７は、流路Ｆ８に合流し、流路Ｆ６、Ｆ７及びＦ８の交差部に方向制御弁Ｖ４が設けられている。方向制御弁Ｖ３及びＶ４を切り替えることにより、分割部１３０による分割処理または濃縮部１４０による濃縮処理を選択的に実施することが可能である。
撮像ユニット１０Ａは、分割部１３０及び濃縮部１４０の上流側（流入口側）の流路Ｆ３の途中に設けられている。すなわち、撮像ユニット１０Ａのフローセル２０は、流路Ｆ３の途中に挿入されている。撮像ユニット１０Ｂは、分割部１３０及び濃縮部１４０の下流側（流出口側）の流路Ｆ８の途中に設けられている。すなわち、撮像ユニット１０Ｂのフローセル２０は、流路Ｆ８の途中に挿入されている。撮像ユニット１０Ｃは、混合部１５０の下流側の流路Ｆ１２の途中に設けられている。すなわち、撮像ユニット１０Ｃのフローセル２０は、流路Ｆ１２の途中に挿入されている。
細胞培養装置１００において、分割処理を行う場合の各部の動作について以下に説明する。制御部１６０は、方向制御弁Ｖ１〜Ｖ４を制御することにより、培養容器１１０に収容された細胞懸濁液が、分割部１３０を経由して貯留容器１２０に至る送液ルートを形成する。その後、制御部１６０は、開閉バルブ１７１を開状態に制御するとともに、ポンプＰ１を稼働させる。これにより、培養容器１１０に収容されている細胞懸濁液が、流路Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３及びＦ４を経由して分割部１３０に流入する。
制御部１６０は、流路Ｆ３の途中に設けられた撮像ユニット１０Ａのフローセル２０に細部懸濁液が到達するタイミングで撮像ユニット１０Ａにおける撮像を開始させる。ポンプＰ１による送液の開始時点から撮像ユニット１０Ａによる撮像の開始時点までのタイムラグは、ポンプＰ１における単位時間あたりの送液流量と、ポンプＰ１と撮像ユニット１０Ａとの間の流路の容積から推定することが可能である。細胞懸濁液が、流路Ｆ３を通過している間、細胞懸濁液に含まれる細胞等が撮像ユニット１０Ａによって連続的に撮像され、複数の画像が取得される。撮像ユニット１０Ａは、取得した複数の画像に基づいて、分割処理の直前における細胞等の統計データを導出する。培養容器１１０に収容されている全ての細胞等が、撮像ユニット１０Ａのフローセル２０を通過するので、培養細胞の全てが統計データに反映される。制御部１６０は、細胞懸濁液の終端が撮像ユニット１０Ａのフローセル２０を通過し終わるタイミングで撮像ユニット１０Ａにおける撮像を終了させる。このように、本実施形態に係る細胞培養装置１００において、ポンプＰ１による送液動作と撮像ユニット１０Ａによる撮像動作は連動している。
分割部１３０に流入した細胞懸濁液に含まれる細胞塊は、より粒径の小さい複数の細胞塊に分割される。分割処理が施された細胞懸濁液は、流路Ｆ６及びＦ８を経由して貯留容器１２０内に収容される。
制御部１６０は、流路Ｆ８の途中に設けられた撮像ユニット１０Ｂのフローセル２０に細部懸濁液が到達するタイミングで撮像ユニット１０Ｂにおける撮像を開始させる。細胞懸濁液が、流路Ｆ８を通過している間、細胞懸濁液に含まれる細胞等が撮像ユニット１０Ｂによって連続的に撮像され、複数の画像が取得される。撮像ユニット１０Ｂは、取得した複数の画像に基づいて、分割処理の直後における細胞等の統計データを導出する。培養容器１１０に収容されている全ての細胞等が、撮像ユニット１０Ｂのフローセル２０を通過するので、培養細胞の全てが統計データに反映される。制御部１６０は、細胞懸濁液の終端が撮像ユニット１０Ｂのフローセル２０を通過し終わるタイミングで撮像ユニット１０Ｂにおける撮像を終了させる。
分割処理が完了すると、制御部１６０は、方向制御弁Ｖ１、Ｖ２及びＶ５を制御することにより、貯留容器１２０に貯留された細胞懸濁液が、流路Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１３及びＦ１を経由して培養容器１１０に至る送液ルートを形成する。その後、制御部１６０は、開閉バルブ１７１及び１７２をそれぞれ開状態に制御するとともに、ポンプＰ２を稼働させる。これにより、貯留容器１２０に収容されていた細胞懸濁液が、流路Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１３及びＦ１を経由して培養容器１１０に流入し、培養容器１１０において、新たな培養サイクルが開始される。
以上のように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、分割部１３０による分割処理が実施されると、分割処理の前後における細胞等の統計データが取得される。
細胞培養においては、細胞から分泌される代謝物などによって培地が変質する。そのため、培養期間内における適切な時期に、培養容器１１０内の培地を、新鮮な培地に交換する培地交換処理が必要となる。培地交換処理は、細胞懸濁液に含まれる使用済み培地と細胞等とを分離することによって細胞懸濁液中の細胞の濃度を高める濃縮処理と、濃縮された細胞懸濁液に新鮮培地を添加し、その後、これらを混合する希釈・混合処理と、を含む。
細胞培養装置１００において、濃縮処理を行う場合の各部の動作について以下に説明する。制御部１６０は、方向制御弁Ｖ１〜Ｖ４を制御することにより、培養容器１１０に収容された細胞懸濁液が、濃縮部１４０を経由して貯留容器１２０に至る送液ルートを形成する。その後、制御部１６０は、開閉バルブ１７１を開状態に制御するとともに、ポンプＰ１を稼働させる。これにより、培養容器１１０に収容されている細胞懸濁液が、流路Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３及びＦ５を経由して濃縮部１４０に流入する。
制御部１６０は、流路Ｆ３の途中に設けられた撮像ユニット１０Ａのフローセル２０に細部懸濁液が到達するタイミングで撮像ユニット１０Ａにおける撮像を開始させる。ポンプＰ１による送液の開始時点から撮像ユニット１０Ａによる撮像の開始時点までのタイムラグは、ポンプＰ１における単位時間あたりの送液流量と、ポンプＰ１と撮像ユニット１０Ａとの間の流路の容積から推定することが可能である。細胞懸濁液が、流路Ｆ３を通過している間、細胞懸濁液に含まれる細胞等が撮像ユニット１０Ａによって連続的に撮像され、複数の画像が取得される。撮像ユニット１０Ａは、取得した複数の画像に基づいて、濃縮処理の直前における細胞等の統計データを導出する。培養容器１１０に収容されている全ての細胞等が、撮像ユニット１０Ａのフローセル２０を通過するので、培養細胞の全てが統計データに反映される。制御部１６０は、細胞懸濁液の終端が撮像ユニット１０Ａのフローセル２０を通過し終わるタイミングで撮像ユニット１０Ａにおける撮像を終了させる。このように、本実施形態に係る細胞培養装置１００において、ポンプＰ１による送液動作と撮像ユニット１０Ａによる撮像動作は連動している。
濃縮部１４０に流入した細胞懸濁液は、使用済み培地と細胞等とに膜分離される。濃縮された細胞懸濁液は、流路Ｆ６及びＦ８を経由して貯留容器１２０内に収容される。一方、濃縮部１４０の濾過膜を透過したデブリスを含む使用済みの培地は、廃液として廃棄される。
制御部１６０は、流路Ｆ８の途中に設けられた撮像ユニット１０Ｂのフローセル２０に細部懸濁液が到達するタイミングで撮像ユニット１０Ｂにおける撮像を開始させる。細胞懸濁液が、流路Ｆ８を通過している間、細胞懸濁液に含まれる細胞等が撮像ユニット１０Ｂによって連続的に撮像され、複数の画像が取得される。撮像ユニット１０Ｂは、取得した複数の画像に基づいて、濃縮処理の直後における細胞等の統計データを導出する。培養容器１１０に収容されている全ての細胞等が、撮像ユニット１０Ｂのフローセル２０を通過するので、培養細胞の全てが統計データに反映される。制御部１６０は、細胞懸濁液の終端が撮像ユニット１０Ｂのフローセル２０を通過し終わるタイミングで撮像ユニット１０Ｂにおける撮像を終了させる。
濃縮部１４０と貯留容器１２０との間で細胞懸濁液を循環させることにより、細胞懸濁液の濃度が所望の濃度になるまで、濃縮処理を複数回に亘って実施してもよい。この場合、制御部１６０は、撮像ユニット１０Ｂによって取得される濃縮処理後の統計データに基づいて、濃縮処理の完了を判定してもよい。
図１１は、制御部１６０において実施される濃縮処理の完了判定の一例を示すフローチャートである。ステップＳ１１において、制御部１６０は、撮像ユニット１０Ｂによって導出された、直近の濃縮処理後における、細胞等の所定粒径範囲ごとの個数（粒度分布）が、目標とする状態に達しているか否かを判定する。なお、本ステップにおいて、細胞等の単位体積あたりの個数（密度分布）が、目標とする状態に達しているか否かを判定してもよい。制御部１６０は、濃縮処理後における細胞等の粒度分布または密度分布が、目標とする状態に達していないと判定した場合には、処理をステップＳ１２に移行する。
ステップＳ１２において、制御部１６０は、濃縮処理を再度実施する。すなわち、制御部１６０は、方向制御弁Ｖ２、Ｖ３及びＶ４を制御することにより、貯留容器１２０に貯留された細胞懸濁液が、濃縮部１４０を経由して再び貯留容器１２０に戻る送液ルートを形成する。その後、制御部１６０は、開閉バルブ１７２を開状態に制御するとともに、ポンプＰ２を稼働させる。これにより、貯留容器１２０に収容されている細胞懸濁液が、流路Ｆ９、Ｆ３及びＦ５を経由して濃縮部１４０に流入し、濃縮部１４０において濃縮処理が再び実施される。２回目以降の濃縮処理においても、撮像ユニット１０Ａ及び１０Ｂのそれぞれにおいて、細胞等の統計データが取得される。その後処理は、ステップＳ１１に戻される。
一方、ステップＳ１１において制御部１６０が、濃縮処理後における細胞等の粒度分布または密度分布が、目標とする状態に達したと判定した場合には、処理はステップＳ１３に移行される。ステップＳ１３において、制御部１６０は、濃縮処理は完了したものと判定し、濃縮処理を終了させる。
以上のように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、濃縮部１４０による濃縮処理が実施されると、濃縮処理の前後における細胞等の統計データが取得される。
細胞培養装置１００において、希釈・混合処理を行う場合の各部の動作について以下に説明する。制御部１６０は、開閉バルブ１７３を開状態に制御することにより、濃縮処理済みの細胞懸濁液が貯留された貯留容器１２０内に新鮮培地を供給する。これにより、細胞懸濁液が希釈され、細胞懸濁液中の細胞の濃度が低下する。
続いて、制御部１６０は、方向制御弁Ｖ２及びＶ５を制御することにより、貯留容器１２０内に貯留された希釈処理済みの細胞懸濁液が、混合部１５０を経由して再び貯留容器１２０に戻る送液ルートを形成する。その後、制御部１６０は、開閉バルブ１７２を開状態に制御するとともに、ポンプＰ２を稼働させる。これにより、貯留容器１２０に収容されている希釈処理済みの細胞懸濁液が、流路Ｆ９、Ｆ１０及びＦ１１を経由して混合部１５０に流入し、混合部１５０において混合処理が実施される。混合処理が施された細胞懸濁液は、流路Ｆ１２を経由して貯留容器１２０に戻される。
制御部１６０は、流路Ｆ１２の途中に設けられた撮像ユニット１０Ｃのフローセル２０に細部懸濁液が到達するタイミングで撮像ユニット１０Ｃにおける撮像を開始させる。細胞懸濁液が、流路Ｆ１２を通過している間、細胞懸濁液に含まれる細胞等が撮像ユニット１０Ｃによって連続的に撮像され、複数の画像が取得される。撮像ユニット１０Ｃは、取得した複数の画像に基づいて、混合処理の直後における細胞等の統計データを導出する。培養容器１１０に収容されていた全ての細胞等が、撮像ユニット１０Ｃのフローセル２０を通過するので、培養細胞の全てが統計データに反映される。制御部１６０は、細胞懸濁液の終端が撮像ユニット１０Ｃのフローセル２０を通過し終わるタイミングで撮像ユニット１０Ｃにおける撮像を終了させる。
混合部１５０と貯留容器１２０との間で細胞懸濁液を循環させることにより、細胞懸濁液の混合状態が所望の状態になるまで、混合処理を複数回に亘って実施してもよい。この場合、制御部１６０は、撮像ユニット１０Ｃによって取得される混合処理の直後における細胞等の統計データに基づいて、混合処理の完了を判定してもよい。
図１２は、制御部１６０において実施され混合処理の完了判定の一例を示すフローチャートである。ステップＳ２１において、制御部１６０は、撮像ユニット１０Ｃによって取得された各画像に含まれる細胞等の個数を画像順に並べ、１画像に含まれる細胞等の個数の画像間における変動の幅を取得する。すなわち、制御部１６０は、混合処理後における細胞等の密度の経時変化を取得する。制御部１６０は、１画像に含まれる細胞等の個数の画像間における変動の幅が、所定の範囲内に収まっているか否かを判定する。すなわち、この判定処理において、培地中における細胞等の密度が均一であるか否かが判定される。制御部１６０は、１画像に含まれる細胞等の個数の画像間における変動の幅が、所定の範囲内に収まっていないと判定した場合には、処理をステップＳ２２に移行する。
ステップＳ２２において、制御部１６０は、混合処理を再度実施する。すなわち、制御部１６０は、方向制御弁Ｖ２及びＶ５を制御することにより、貯留容器１２０に貯留された細胞懸濁液が、混合部１５０を経由して再び貯留容器１２０に戻る送液ルートを形成する。その後、制御部１６０は、開閉バルブ１７２を開状態に制御するとともに、ポンプＰ２を稼働させる。これにより、貯留容器１２０に収容されている希釈処理済みの細胞懸濁液が、流路Ｆ９、Ｆ１０及びＦ１１を経由して混合部１５０に流入し、混合部１５０において混合処理が再び実施される。２回目以降の混合処理においても、撮像ユニット１０Ｃにおいて統計データが取得される。その後処理は、ステップＳ２１に戻される。
一方、ステップＳ２１において制御部１６０が１画像に含まれる細胞等の個数の画像間における変動の幅が、所定の範囲内に収まっていると判定した場合には、処理はステップＳ２３に移行される。ステップＳ２３において、制御部１６０は、混合処理は完了したものと判定し、混合処理を終了させる。
以上のように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、混合部１５０による混合処理が実施されると、混合処理の後における細胞等の統計データが取得される。
濃縮処理及び希釈・混合処理を含む培地交換処理が完了すると、制御部１６０は、方向制御弁Ｖ１、Ｖ２及びＶ５を制御することにより貯留容器１２０に貯留された細胞懸濁液が流路Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１３及びＦ１を経由して培養容器１１０に至る送液ルートを形成する。その後、制御部１６０は、開閉バルブ１７１及び１７２をそれぞれ開状態に制御とするとともに、ポンプＰ２を稼働させる。これにより、貯留容器１２０に収容されている細胞懸濁液が、流路Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１３及びＦ１を経由して培養容器１１０に流入し、培養容器１１０において、細胞培養が継続される。
図１３は、本開示の技術の実施形態に係る撮像ユニット１０を用いて取得した細胞等の粒度分布と、市販システムを用いて取得した細胞等の粒度分布とを示すグラフである。市販システムとしてベックマン・コールター社製のMultisizer 4eを用いた。図１３において、横軸は細胞等の粒径を示し、縦軸は、細胞懸濁液１ｍＬあたりの細胞等の個数を示す。Multisizer 4eにおいて正確な測定を行うためには、細胞の濃度を測定に適した濃度に調整する必要がある。このため、本実施形態に係る撮像ユニット１０による計測を終了した細胞懸濁液を２０倍に希釈し、２０ｍＬ程度サンプリングしたものを、Multisizer 4eによる計測に用いた。Multisizer 4eは、粒度分布を１ｍＬあたりの個数に換算して出力する。図１３において、本実施形態に係る撮像ユニット１０を用いて取得した粒度分布を、Multisizer 4eを用いて取得した粒度分布と比較できるスケールにまで縮小して表示した。本実施形態に係る撮像ユニット１０を用いて取得した粒度分布と、Multisizer 4eを用いて取得した粒度分布との差異は±１０％程度であり、両者で略一致した結果が得られた。このように、本実施形態に係る撮像ユニット１０によれば、高精度な粒度分布を取得できる市販システムと同等の精度で粒度分布を取得できることが確認された。
図１４Ａ及び図１４Ｂは、それぞれ、本開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置１００に設けられた撮像ユニット１０Ａ及び１０Ｂを用いて取得した、分割部１３０による分割処理の直前及び直後における細胞等の粒度分布を示すグラフである。図１４Ａ及び図１４Ｂにおいて、横軸は細胞等の粒径を示し、縦軸は細胞等の個数を示している。分割部１３０の上流側（流入口１３１側）に設けられた撮像ユニット１０Ａを用いて分割処理の直前における細胞等の粒度分布を取得し、分割部１３０の下流側（流出口１３２側）に設けられた撮像ユニット１０Ｂを用いて分割処理の直後における細胞等の粒度分布を取得した。分割処理を行うことにより、粒径が２００μｍを超える細胞塊の個数が減少する一方、粒径が２００μｍよりも小さい細胞塊の個数が増加していることがわかる。また、分割処理を行うことにより、細胞塊の総個数が増加していることがわかる。
このように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、分割部１３０による分割処理の直前及び直後における細胞等の粒度分布を取得することが可能である。分割処理の直前における細胞等の粒度分布を見ることで、分割処理の直前の細胞塊が、どの程度にまで成長したものなのかを把握することができる。また、分割処理の直前における細胞等の粒度分布と、分割処理の直後における細胞等の粒度分布とを比較して分布のピークシフトを見ることで、分割処理の実態を把握することができる。このように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、分割処理の実態を可視化することができるので、分割処理が想定通りに実施されているか否かを監視することができる。
分割処理後における細胞塊の粒度分布は、細胞塊が分割部１３０を構成するメッシュを通過する際の流速に依存する。従って、分割処理後における細胞塊の粒度分布に基づいて、細胞塊がメッシュを通過する際の流速を定めてもよい。例えば、流速と粒度分布との相関を予め求めておき、この相関を用いて、分割処理後における細胞塊の粒度分布が所望の粒度分布となるように流速を定めてもよい。
図１５Ａ及び図１５Ｂは、撮像ユニット１０Ａ及び１０Ｂを用いて取得した、濃縮部１４０による濃縮処理前の細胞等の粒度分布、及び濃縮部１４０による濃縮処理を１回、３回、５回、１５回及び２３回実施した後の細胞等の粒度分布を示すグラフである。図１５Ａ及び図１５Ｂにおいて、横軸は細胞等の粒径を示し、縦軸は細胞等の個数を示している。図１５Ｂは、図１５Ａと同じ測定結果を、縦軸のスケールを拡大して示したものである。濃縮部１４０の上流側（流入口１４１側）に設けられた撮像ユニット１０Ａを用いて濃縮処理前（処理回数０回目）の細胞等の粒度分布を取得し、濃縮部１４０の下流側（流出口１４２側）に設けられた撮像ユニット１０Ｂを用いて濃縮処理後の細胞等の粒度分布を取得した。なお、濃縮部１４０を構成するフィルタ膜の供給側を流れる細胞懸濁液の流速（本流の流速）を１２０ｍＬ／ｍｉｎとし、濃縮部１４０を構成するフィルタ膜の濾過側を流れる廃液の流速５ｍＬ／ｍｉｎとした。図１５Ａに示すように、濃縮処理の回数が増すごとに粒径が５０μｍ以下の細胞等の個数が減少する一方、粒径が６５μｍ以上の細胞等の個数が殆ど変化していないことがわかる。すなわち、濃縮部１４０において濃縮処理が、適切に行われていることが確認できた。
このように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、濃縮部１４０による濃縮処理の前後における細胞等の粒度分布を取得することが可能である。また、濃縮処理を複数回に亘って実施した場合における細胞等の粒度分布の推移を把握することができる。このように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、濃縮処理の実態を可視化することができるので、濃縮処理が想定通りに実施されているか否かを監視することができる。例えば、濃縮処理後において粒径が比較的小さい粒子の個数が、目標値を大きく上回る場合、ろ過側の引圧が小さい、またはフィルタが目詰まりを起こしているものと推定することができる。また、粒径が比較的大きい粒子の個数が濃縮処理の途中より減少し始めた場合には、フィルタが目詰まりを起こし、フィルタの局所でろ過側への引圧が上昇し、粒子が砕かれてろ過側に流れ出たものと推定できる。この場合、引圧条件を変更する、またはフィルタを交換する等の措置を速やかに実施することができる。
また、濃縮処理を複数回に亘って実施する場合に、濃縮部１４０による濃縮処理後における細胞等の粒度分布または密度分布が、目標とする状態に達した場合に、濃縮処理が完了したものと判定してもよい。すなわち、図１１に示すように、濃縮処理後の粒度分布を濃縮処理の完了の判定に用いてもよい。
図１６は、混合部１５０の下流側の流路Ｆ１２を流れる細胞懸濁液を、撮像ユニット１０Ｃによって連続的に撮像し、取得した各画像に含まれる細胞等の個数を画像順に並べた結果を示すグラフである。すなわち、図１６のグラフは、流路Ｆ１２を流れる細胞等の密度の均一性を示している。換言すれば、細胞等と培地との混合の状態を示している。また、図１６には、濃縮部１４０の上流側の流路Ｆ３を流れる細胞懸濁液を、撮像ユニット１０Ａによって連続的に撮像し、取得した各画像に含まれる細胞等の個数を画像順に並べた結果も併せて示されている。図１６に示すように、混合部１５０の下流側の流路Ｆ１２を通過する細胞等の密度が大きく変動していることがわかる。混合部１５０による混合処理によって細胞等と培地とが均一に混合されている場合には、各画像に含まれる細胞等の個数は、画像間で略同じになるものと考えられる。すなわち、図１６に示す結果から、培地中の細胞等の密度が不均一であり、混合部１５０による混合処理について改善の余地があることが理解できる。
このように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、混合部１５０による混合処理後における細胞等と培地との混合状態を把握することができる。すなわち、混合処理の実態を把握することができ、混合処理の結果を可視化することができる。従って、混合処理が想定通りに実施されているか否かを監視することができる。例えば、上記のように、混合部１５０の下流側の流路Ｆ１２を通過する細胞等の密度が大きく変動している場合には、細胞等が混合部１５０を通過する際の流速を変化させる等の措置を速やかに実施することができる。
また、混合処理を複数回に亘って実施する場合に、混合部１５０による混合処理後における細胞等の密度の経時変化が、目標とする状態に達した場合に、混合処理が完了したものと判定してもよい。すなわち、図１２に示すように、１画像中に含まれる細胞等の個数の経時変化を混合処理の完了の判定に用いてもよい。
また、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、撮像ユニット１０Ｃによって取得された複数の画像に基づいて細胞等の密度分布を導出することで、希釈処理後における細胞懸濁液の濃度を把握することができる。
本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、培養が順調であるか否かを定量的に把握することも可能である。培養が順調であるか否かを確認するための直接的な指標としては、培養中の細胞塊の個数及び個々の細胞塊の粒径が挙げられる。分割部１３０による分割処理（継代処理）は細胞塊の個数を増加させる工程ではあるが、分割時に細胞にストレスが加わるため、増加した細胞塊の全てが生存できるわけではない。増加した細胞塊のうちの一部が死細胞となり分解してしまうことがある。
本実施形態に係る細胞培養装置１００を用いた細胞培養においては、所定期間毎（例えば５日おき）に分割部１３０による分割処理（継代処理）が実施される。そこで、前回の分割処理（継代処理）の直前における細胞塊の粒度分布と、今回の分割処理（継代処理）の直前における細胞塊の粒度分布とを取得して、両者を比較する。これにより、細胞塊の個数の、継代による実質的な増加量を把握することができる。分割処理の直前における細胞塊の粒度分布は、撮像ユニット１０Ａによって取得された複数の画像に基づいて取得することができる。また、各培養サイクルにおいて、分割処理の直前における細胞塊の粒度分布のデータを蓄積していくことで、培養が、過去の平均的な実績と比較して順調であるか否かを判断することが可能となる。
また、前回の分割処理（継代処理）の直後における細胞等の粒度分布と、今回の分割処理（継代処理）の直前における細胞等の粒度分布とを比較して、粒度分布のピークのシフト量を見ることで、培養の１サイクル期間中に細胞塊がどの程度成長したかを把握することができる。このデータを培養のバッチごとに蓄積することで、分割処理（継代処理）後の粒径とその後の細胞の増殖の因果関係を求めることができる。すなわち、分割処理後の細胞塊の粒径をどの程度にすれば、分割処理後の細胞の増殖が最も促進されるのかを求めることができる。この結果は、分割処理の処理条件にフィードバックすることが可能であり、より好ましい処理条件を定めるための有効な手段となる。なお、分割処理（継代処理）の直後における細胞等の粒度分布は、撮像ユニット１０Ｂによって取得された複数の画像に基づいて取得することができる。分割処理（継代処理）の直前における細胞等の粒度分布は、撮像ユニット１０Ａによって取得された複数の画像に基づいて取得することができる。
図１７Ａ、図１７Ｂ及び図１７Ｃは、それぞれ、細胞培養装置１００による培養の１サイクル期間中の異なるタイミングで取得した細胞等の粒度分布を示すグラフである。培養サイクルの初日を０日目とした場合、図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃは、それぞれ、１日目、３日目及び５日目の粒度分布である。各粒度分布は、混合部１５０の上流側に設けられた撮像ユニット１０Ａによって取得された複数の画像に基づいて取得した。図１７Ａ〜１７Ｃに示される各粒度分布を比較して明らかなように、時間経過とともに細胞塊の粒度分布のピークが、粒径が大きくなる方向にシフトしていることがわかる。このように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、培養の１サイクル期間中における細胞塊の粒度分布の経時変化を把握することも可能であり、培養が日々順調に進行しているか否かを把握することができる。
本実施形態に係る撮像ユニット１０は、細胞の培養状態の監視のみならず、細胞培養装置を構成するエレメントが、培養に適しているか否かを判定するために使用することも可能である。例えば、細胞懸濁液の送液手段として用いられるチューブポンプは、外部環境と絶縁して送液を行うことができるので、生物的汚染が起きにくい。このため、細胞懸濁液の送液手段として使用されことが多い。しかしながら、チューブポンプは、チューブを機械的にしごくことで送液を行うので、細胞塊を破壊してしまうおそれがある。そこで、本実施形態に係る撮像ユニット１０を用いて、チューブポンプが細胞塊に与える影響について確認した。
図１８は、チューブポンプの入口と出口に本実施形態に係る撮像ユニット１０を設置して、細胞懸濁液を繰り返しチューブポンプに通した場合の、細胞塊の粒度分布の変化を観察した結果を示したグラフである。図１８には、細胞懸濁液をチューブポンプに通す前の粒度分布（通過回数０回）及び細胞懸濁液をチューブポンプに１回、３回及び６回後の細胞塊の粒度分布が示されている。
細胞懸濁液がチューブポンプを通過する前（通過回数０回）においては、粒径１５５μｍ近辺に、細胞塊の個数のピークがあることがわかる。細胞懸濁液をチューブポンプに１回通すだけで、粒度分布のピークが、粒径が小さくなる方向にシフトしていることがわかる。その後、細胞懸濁液を繰り返しチューブポンプに通すと、粒度分布の変化は小さいものの、粒径が小さくなる方向に変化していることがわかる。以上の結果から、細胞懸濁液をチューブポンプが細胞塊を砕いていると推測することができる。
以上の説明から明らかなように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、細胞懸濁液が流通する流路の途中に設けられた撮像ユニット１０によって取得された複数の画像に基づいて培養細胞の計測を行うので、細胞等の採取行為が不要である。これにより、生物学的汚染のリスクを回避することができ、また、細胞を消費することもない。また、培養細胞の計測を自動で行うことができるので、従来の人手による手法と比較して、手間と時間を大幅に削減することができる。
また、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、細胞培養装置１００において培養されている全ての細胞が通過する流路の途中に撮像ユニット１０が設置されているので、全ての細胞を計測対象とすることができる。従って、採取された一部の細胞のみを計測対象とする従来の計測手法と比較して、細胞の計測精度を高めることができる。
また、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、分割部１３０、濃縮部１４０、混合部１５０によって実施される各処理の実態を可視化することができる。換言すれば、分割部１３０、濃縮部１４０、混合部１５０によって実施される各処理が、想定通りに実施されているか否かを監視することができる。従って、各処理部における異常の早期発見が可能となり、必要な措置を速やかに講じることができる。また、異常が発見された場合に、培養の打ち切りの判断を早期に行うことも可能となり、無駄なコストの発生を最小化できる。
また、本実施形態に係る撮像ユニット１０による、細胞の計測は、培養中のみならず、細胞培養装置の立ち上げ時においても利用することが可能である。例えば、撮像ユニット１０によって取得された統計データを、分割処理、濃縮処理及び混合処理における処理条件を決定する場合に利用することができる。本実施形態に係る撮像ユニット１０を用いることで、的確な条件評価を省力的に行うことができるので、人的テスト負荷の削減のみならず、テスト水準数の削減も可能になる。その結果、テスト期間の短縮とテストに用いる培養液及び細胞のコストを削減することができる。
１０、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ 撮像ユニット
２０ フローセル
２１ 流入口
２２ 流出口
２３ 扁平流路
３０ 撮像部
３１ エリアセンサ
３２ テレセントリックレンズ
４０ 照明部
４１ 光源
４２ テレセントリックレンズ
５０ 筐体
５１ 凹部
５２ クランパ
５３ 脚部
６１、６２ 反射プリズム
７０ 画像解析装置
７１ バス
７２ ＣＰＵ
７３ 主記憶装置
７４ 補助記憶装置
７５ 入力装置
７６ 出力装置
７７ インターフェース装置
７８ 画像解析プログラム
７９ 画像データ
１００ 細胞培養装置
１１０ 培養容器
１１１ 流通口
１２０ 貯留容器
１２１ 流出口
１３０ 分割部
１３１ 流入口
１３２ 流出口
１４０ 濃縮部
１４１ 流入口
１４２ 流出口
１４３ 濾過膜
１５０ 混合部
１６０ 制御部
１７１、１７２、１７３ 開閉バルブ
Ｄ１ 流れ方向
Ｄ２ 光軸方向
Ｄ３ 幅方向
Ｆ１〜Ｆ１２ 流路
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３ ポンプ
Ｑ１ 撮像視野
Ｖ１〜Ｖ５ 方向制御弁
Ｗ１、Ｗ２ 窓部

Claims (38)

  1. 細胞及び細胞塊の少なくとも一方を粒状体として含む細胞懸濁液が流通する流路と、
    前記流路の途中に設けられ、前記細胞懸濁液が前記流路を流れている間、前記細胞懸濁液に含まれる複数の前記粒状体を連続的に撮像して複数の画像を取得する撮像ユニットと、
    を含む細胞培養装置。
  2. 前記複数の画像に基づいて、複数の前記粒状体について統計データを導出する導出部を更に含む
    請求項１に記載の細胞培養装置。
  3. 前記統計データは、複数の前記粒状体の、所定粒径範囲ごとの個数、単位体積あたりの所定粒径範囲ごとの個数、所定真円度範囲ごとの個数及び前記粒状体を構成する細胞の総個数の少なくとも１つを含む
    請求項２に記載の細胞培養装置。
  4. 前記撮像ユニットは、
    前記細胞懸濁液が通過するフローセルと、
    前記フローセルに撮像視野が設定された複数の撮像素子を含む撮像部と、
    を含む請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  5. 前記フローセルは、
    前記細胞懸濁液が流入する流入口と、
    前記流入口から流入した前記細胞懸濁液を流出させる流出口と、
    前記流入口と前記流出口との間に設けられ、前記撮像部の光軸方向における厚さが、前記流入口及び前記流出口の前記光軸方向における厚さよりも薄く且つ光透過性を有する部材で構成された扁平流路と、
    を含み、
    前記扁平流路に前記撮像視野が設定されている
    請求項４に記載の細胞培養装置。
  6. 前記フローセルは、
    前記細胞懸濁液が流入する流入口と、
    前記流入口から流入した前記細胞懸濁液を流出させる流出口と、
    前記流入口と前記流出口との間に設けられ、前記撮像部の光軸方向における厚さが、前記フローセルの内部を流れる前記細胞懸濁液の流れ方向と交差する幅方向における長さよりも薄く且つ光透過性を有する部材で構成された扁平流路と、
    を含み、
    前記扁平流路に前記撮像視野が設定されている
    請求項４または請求項５に記載の細胞培養装置。
  7. 前記扁平流路の前記光軸方向における厚さが均一である
    請求項５または請求項６に記載の細胞培養装置。
  8. 前記複数の撮像素子は、前記扁平流路の前記細胞懸濁液の流れ方向と交差する幅方向における全域を前記撮像視野に含んでいる
    請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  9. 前記撮像部は、
    前記複数の撮像素子を有するエリアセンサと、
    前記エリアセンサの光入射側に設けられた第１のテレセントリックレンズと、
    を含む
    請求項５から請求項８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  10. 前記撮像ユニットは、前記扁平流路に照明光を照射する照明部を更に含む、
    請求項９に記載の細胞培養装置。
  11. 前記照明部は、
    前記照明光を出射する光源と、
    前記光源の光出射側に設けられた第２のテレセントリックレンズと、
    を含む請求項１０に記載の細胞培養装置。
  12. 前記第１のテレセントリックレンズの光軸と、前記第２のテレセントリックレンズの光軸とが一致している
    請求項１１に記載の細胞培養装置。
  13. 前記撮像部は、前記フローセルの内部を通過する複数の前記粒状体の各々を、１回以上撮像する
    請求項４から請求項１２のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  14. 前記扁平流路を流れる前記細胞懸濁液の最高速度と、前記流入口及び前記流出口を流れる前記細胞懸濁液の最高速度とが同等である
    請求項５から請求項１２のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  15. 前記流路に接続され、前記細胞懸濁液が収容される少なくとも１つの容器と、
    前記流路に接続され、前記細胞懸濁液に処理を施す少なくとも１つの処理部と、
    前記流路に前記細胞懸濁液の液流を発生させるポンプと、
    を更に含む請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  16. 前記細胞懸濁液に含まれる細胞塊を分割する分割部を前記処理部として含み、
    前記撮像ユニットは、前記分割部の上流側及び下流側にそれぞれ設けられている
    請求項１５に記載の細胞培養装置。
  17. 前記細胞懸濁液を濃縮する濃縮部を前記処理部として含み、
    前記撮像ユニットは、前記濃縮部の上流側及び下流側にそれぞれ設けられている
    請求項１５または請求項１６に記載の細胞培養装置。
  18. 前記細胞懸濁液を混合する混合部を前記処理部として含み、
    前記撮像ユニットは、前記混合部の下流側に設けられている
    請求項１５から請求項１７のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  19. 前記ポンプと前記撮像ユニットとが連動して動作する
    請求項１５から請求項１８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  20. 複数の撮像素子を有する撮像部と、
    細胞及び細胞塊の少なくとも一方を粒状体として含む細胞懸濁液が流入する流入口、前記流入口から流入した前記細胞懸濁液を流出させる流出口、及び前記流入口と前記流出口との間に設けられた扁平流路を有するフローセルと、
    を含み、
    前記扁平流路は、前記撮像部の光軸方向における厚さが、前記流入口及び前記流出口の前記光軸方向における厚さよりも薄く且つ光透過性を有する部材で構成され、
    前記撮像部の撮像視野が前記扁平流路に設定されている
    撮像ユニット。
  21. 複数の撮像素子を有する撮像部と、
    細胞及び細胞塊の少なくとも一方を粒状体として含む細胞懸濁液が流入する流入口、前記流入口から流入した前記細胞懸濁液を流出させる流出口、及び前記流入口と前記流出口との間に設けられた扁平流路を有するフローセルと、
    を含み、
    前記扁平流路は、前記撮像部の光軸方向における厚さが、前記フローセルの内部を流れる細胞懸濁液の流れ方向と交差する幅方向における長さよりも薄く且つ光透過性を有する部材で構成され、
    前記撮像部の撮像視野が前記扁平流路に設定されている
    撮像ユニット。
  22. 前記扁平流路の前記光軸方向における厚さが均一である
    請求項２０または請求項２１に記載の撮像ユニット。
  23. 前記複数の撮像素子は、前記扁平流路の前記細胞懸濁液の流れ方向と交差する幅方向における全域を前記撮像視野に含んでいる
    請求項２０から請求項２２のいずれか１項に記載の撮像ユニット。
  24. 前記撮像部は、
    前記複数の撮像素子を有するエリアセンサと、
    前記エリアセンサの光入射側に設けられた第１のテレセントリックレンズと、
    を含む
    請求項２０から請求項２３のいずれか１項に記載の撮像ユニット。
  25. 前記撮像ユニットは、前記扁平流路に照明光を照射する照明部を更に含む
    請求項２４に記載の撮像ユニット。
  26. 前記照明部は、
    前記照明光を出射する光源と、
    前記光源の光出射側に設けられた第２のテレセントリックレンズと、
    を含む請求項２５に記載の撮像ユニット。
  27. 第１のテレセントリックレンズの光軸と、前記第２のテレセントリックレンズの光軸が一致している
    請求項２６に記載の撮像ユニット。
  28. 前記撮像部は、前記フローセルの内部を通過する複数の前記粒状体の各々を、１回以上撮像する
    請求項２０から請求項２７のいずれか１項に記載の撮像ユニット。
  29. 細胞及び細胞塊の少なくとも一方を粒状体として含む細胞懸濁液が流路を流れている間、前記流路を通過する前記細胞懸濁液に含まれる複数の前記粒状体を連続的に撮像して複数の画像を取得し、
    前記複数の画像に基づいて、複数の前記粒状体について統計データを取得して細胞培養の状況を監視する
    培養監視方法。
  30. 前記統計データは、複数の前記粒状体の、所定粒径範囲ごとの個数、単位体積あたりの所定粒径範囲ごとの個数、所定真円度範囲ごとの個数及び前記粒状体を構成する細胞の総個数の少なくとも１つを含む
    請求項２９に記載の培養監視方法。
  31. 前記細胞懸濁液に含まれる細胞塊を分割する分割処理の前後における、複数の前記粒状体の所定粒径範囲ごとの個数を前記統計データとして取得する
    請求項２９または請求項３０に記載の培養監視方法。
  32. 前記分割処理は、前記細胞懸濁液を所定の流速でメッシュに通す処理を含み、
    前記統計データに基づいて、前記流速を定める
    請求項３１に記載の培養監視方法。
  33. 前記細胞懸濁液を濃縮する濃縮処理の後における複数の前記粒状体の所定粒径範囲ごとの個数を前記統計データとして取得する
    請求項２９または請求項３０に記載の培養監視方法。
  34. 前記濃縮処理は、前記細胞懸濁液をフィルタ膜を用いて複数回に亘って膜分離する処理を含み、
    前記統計データに基づいて前記濃縮処理の完了を判定する
    請求項３３に記載の培養監視方法。
  35. 前記統計データに基づいて前記フィルタ膜の目詰まりを検出する
    請求項３４に記載の培養監視方法。
  36. 前記細胞懸濁液を混合する混合処理の後における複数の前記粒状体の密度の経時変化を前記統計データとして取得する
    請求項２９または請求項３０に記載の培養監視方法。
  37. 前記混合処理は、前記細胞懸濁液を複数回に亘ってミキサーに通して、複数の前記粒状体と培地とを混合する処理を含み、
    前記統計データに基づいて前記混合処理の完了を判定する
    請求項３６に記載の培養監視方法。
  38. 培養期間内における所定のタイミングで複数の前記粒状体の所定粒径範囲ごとの個数を前記統計データとして取得する
    請求項２９または請求項３０に記載の培養監視方法。
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