JP2006320226A - 細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】これまで手作業で行われており，ばらつきや作業に伴うコンタミネーションが課題となっている．また細胞の培養に伴い培地中の酸素濃度が不足する場合の酸素の培地中への溶解促進手段が必要であった。
【解決手段】細胞培養装置に駆動機構を備え細胞培養容器10を運動させることにより，播種を自動化し，画像撮影装置およびその制御装置により，細胞の分布状態を認識し，動作パラメータデータベースにより，最適な動作パラメータを用いることができ，最適な細胞分布を得ることができる．また閉鎖系で実現することにより，コンタミネーションを抑止する．上記駆動機構を使用することにより，培地の界面を不安定化し，培地中への酸素の溶解促進を行うことができる。
【選択図】 図１

Description

本発明は細胞や組織の培養を行う培養装置に係り、特に再生医療に適用するための移植用の組織やその元となる細胞、さらに詳細には接着性の細胞や組織を培養する培養装置に関する。

間葉系幹細胞等の幹細胞は、様々な組織に分化でき、その組織を再生することができる細胞として知られており，再生医療などへの適用が進められている。間葉系幹細胞は骨髄液から採取できるが，骨髄液から採取可能な間葉系幹細胞はごく微量であり、組織の再生に必要な量の間葉系幹細胞を得るためには、採取した微量の細胞を培養することにより増殖させる必要がある。培養容器としてはT型フラスコやシャーレが用いられる。

一般に培養の手順としては，細胞の増殖に必要な養分を含む培養培地へ被培養細胞を添加し培養容器底面へ付着させる播種，培地中の養分が不足しないよう定期的に培地を新しい物へと交換する培地交換，増殖した細胞をトリプシン溶液を用いて培養容器底面より剥離させ，新たな培養容器へと移動させる継代，そして目標数まで細胞の培養が終了した場合は，再度トリプシン溶液を用いて培養容器より剥離させ回収を行う，とう手順で細胞の培養を実施する（非特許文献１ 参照）。

このようにいくつかの複雑な工程を経る事が必要であるが，現状では手作業による実施が主であり，この点が作業効率向上の際のボトルネックとなる事が考えられる。また手作業が入ることによって，細胞への外界からの汚染が発生するコンタミネーションの恐れがある。この場合手作業を排除し，密閉系内での細胞培養を実施することが有効であると考えられる（特許文献１ 参照）。

特開２００４−２３６５４７号公報

株式会社 秀潤社発行「バイオ実験イラストレイテッド（６）すくすく育て細胞培養」Ｐ９２，９３〜９５

従って将来的に再生医療などへ適用する際にはより作業の自動化を含めた一連の作業の効率向上が必要である。また播種工程の結果としての細胞の培養容器内での初期分布は，その後の細胞培養の効率に対して大きな影響を持つため，播種性能を維持しつつ自動化し，またその状態を観察できる事は重要である。加えて，生産段階以前の場合は，多様な特性を持つ細胞の培養を実施することが考えられる為，それぞれの特性によって異なる制御方法を適用することもできることが必要である。

また，細胞培養は長期間持続するが，その間細胞培養の培地に細胞に必要な酸素を供給する必要がある。通常気液界面からの拡散による酸素供給がなされるが，静止状態では拡散による供給が追いつかず培地内部の酸素濃度が低下する可能性が存在する。従って，そのような場合には酸素供給を促進する必要がある。

手作業による播種を置き換える方法として，播種の際に初期細胞を培養容器に滴下後，培養容器を水平方向に揺動させる事により播種を行うことのできる機構と，その培養容器内部の播種の状態を画像を撮影などで細胞の分布を取得できる機構と，その細胞の分布画像を処理して分布状態を取得し，適切な分布が得られていない場合は，それを認識し，あらかじめ作成された制御用データベースに基づき，最適と判断させる制御パラメータを選定し再度播種工程を実施することができる制御機構とを備えた。これにより，細胞培養工程における播種工程の自動化を実現した。また上記播種に利用した動作機構を細胞培養中に培養容器を運動させる機構として利用し，培地の界面を乱し，酸素の培地中への拡散を促進させる事で，培地中の酸素濃度低下を抑制することができる。

本発明によれば，接着依存性細胞を細胞培養するうえで、播種を自動化できるので、播種条件を一定化できること，播種状態を認識しフィードバックを行うことにより，多種の細胞種への対応や，生物である細胞の状態の変化を吸収し，おなじく播種条件を一定化できること，自動化により人手の介在を無くせるのでコンタミネーションによる細胞の死滅を押さえることができること、また密閉系を採用できることで培養環境の変化による細胞へのストレスを押さえることができるという効果がある。また培地中への酸素供給を促進することができる。

本発明の１実施例を図面をもとに説明する。

図1は本発明を含む細胞培養装置の構成の概略を示す。細胞培養装置は，細胞を培養する恒温槽20を持ち，側面には恒温槽20の内部へアクセスするための扉21を持つ。恒温槽扉21は閉じた状態では密閉状態となり，外気が隙間から混入することはない。恒温槽20内部には培養容器10および培養容器10を保持する為の培養容器設置台11が存在する。培養容器設置台11は可動用モーター40と可動軸30で接続されており，可動用モーター40により可動軸を中心として水平運動を行う事ができる。画像撮影装置50は，細胞の状態を観察するために培養容器の画像を取得するものである。本実施例ではCCDカメラを使用した。細胞の状態が観察できるものであれば適用可能である。制御装置60は可動用モータ40の制御および画像撮影装置50で得られたデータを蓄積，処理する。可動用モーター40の制御パラメータを保持する，パラメータデータベースを含み，画像撮影装置50で得られたデータに基づき処理を行うものである。

図２(a)は培養容器10である。本実施例では培養容器10は円形のシャーレを用いる。培養容器10は，培養容器内へ培地を注入する注入口12と培地の排出口13と，細胞を注入する14と細胞を回収する排出口15と培養容器内の換気を行う換気入口16および換気出口17を備える。培養容器は密閉されており，細胞や培地などのやりとりは，この各口を経由する。培養容器10の各口を共通化し，簡素化してもよい。図２(b)は培地の注入口12と細胞の注入口14と換気入口16を一箇所にまとめて導入口とし，培地排出口13と回収口15と換気出口17をまとめて排出口とした場合である。

図3に図1に示す恒温槽20と可動用モーター40と画像撮影装置50と細胞培養容器10の位置関係を示す。図3(a)は装置上方から見た図であり，図3(bは恒温槽10の側面の扉21側からから扉21を除き表示したものである。恒温槽20の内部に細胞培養容器10が位置し，その上側に画像撮影装置50が存在する。可動軸30の端部は可動用モーター40と接続しており，可動用モータ40も培養容器10の上方に位置している。図4に示すとおり画像撮影装置50を細胞培養容器10の下方へ設置するか，図5に示すとおり可動用モーター40を細胞培養容器10の下方へ設置してもよい。または画像撮影装置50および可動用モータの両方を細胞培養容器10の下方に設置しても良い。

図6では細胞培養容器10の動作概要を説明する。図6(a)は可動軸30の軸線に沿って見た場合，細胞培養容器10の内側に可動軸30が存在する場合であり，図6(b)は可動軸30が細胞培養容器の外側に存在する場合である。図6(a)および図6(b)は可動軸30を回転軸として細胞培養容器10が回転揺動運動をする。回転角度は角度θである。静止状態から−1/2θ回転し，揺動運動の端部に移動する。次に＋θ回転し，反対方向の揺動運動の端部へ移動し，回転を継続する場合−θ回転し再度揺動運動の端部へ移動し，この運動を任意回数繰り返す。静止状態へ復帰する場合は，位置に応じて±θ回転し元の位置へ復帰する。以上の機構を備えた細胞培養装置の処理フローを図7に示す。使用した細胞培養容器10は直径250mmのものを使用し，細胞培養容器中心と可動軸30までの距離は110mmとした。まず細胞培養容器10に培養される細胞が注入される。次に細胞培養容器10の初期運動パラメータを設定する。例えば回転加速度を60rpm/s，最高回転速度を30rpm，揺動角度θを120°，揺動により移動する角度を静止状態から半回転+全回転+半回転で静止状態に戻るとして60+120+60=240°とする。この時点で画像撮影装置により，細胞培養容器内の細胞の分布状態を撮影する。得られた画像は制御装置60へ転送し，画像処理を施し，分布状態の認識を行う。分布状態を定義する指標を定義するなどして点数化してもよいし，細胞の分布状態そのものをパターン認識してもよい。

次に得られた細胞の分布が必要十分な分布になっているか，細胞培養容器10全体に細胞が分布しているかなどの，設定した条件を満たしているかソフトウェアによる条件判断手段で判断する。条件が満たされていると判断された場合は，播種段階を終了する。条件に満たない場合は，制御装置60は内蔵したパラメータデータベースに問い合わせを行い，得られている細胞の分布状態から最適な分布状態を得るためのパラメータを得る。パラメータデータベースはニューラルネットワークなどの学習アルゴリズムを備えても良く，データを蓄積することができる。あらかじめ，実験ないしはシミュレーションなどを用いてパラメータデータベースに学習を行わせておくことで精度が向上すると考えられる。得られたパラメータを再度設定し，細胞培養容器10を運動させる。これを設定した基準を超えるまで繰り返す。設定値に達しない場合は設定した任意回数を上限として，運動を打ち切っても良い。

播種終了後，細胞培養容器10は静止状態で細胞の培養が行われる。このとき，細胞培養容器10は静止しているので培地界面も静止しており，このとき培地中への酸素の拡散速度は遅い。細胞の培養に伴い培地中の酸素濃度が不足する状態が起こった場合，培地中へ酸素を供給する必要があるが，可動用モータ40を動作し，細胞培養容器10を動かすことで培地の界面が不安定となり，空気の巻き込み，培地の混合の促進が起き，それにより酸素の培地中への供給を促進することができる。これにより拡散のみでは時間がかかる培地中への酸素供給を促進できる。

実施例1では，細胞培養容器10を可動用モーター40を用いて，可動軸30を回転の軸とした回転運動を行う事で，揺動運動を実現しているパターンを示した。図8(a)に実施例1での細胞培養容器10の揺動パターンを示す。本発明は培養容器の揺動パターンとして他の方式を用いても良い。図8(b)で示す揺動パターンは培養容器を水平並行運動させる事を特徴としたものである。培養容器は水平面上において，図8(a)では可動軸30を軸とした回転運動をするのに対し，図8(b)に示すパターンでは並行移動をするものである。この方式の場合，揺動運動に必要な最小空間は容器サイズと並行移動距離で決まり，図8(a)に示すパターンよりも小さく取れる場合がある。駆動方法としては，モーターを駆動源とし，ベルトまたはギアなどを用いて培養容器10を並行移動させるものである。図8(c)に示す揺道パターンは可動軸30が培養容器に対しその中心を通るように水平に設置されていることを特徴としたものである。可動軸30は水平に設置されているので，揺動運動としては，可動軸30に対し，培養容器10の端部が垂直方向に上下するものである。この方式では揺動運動に必要な最小空間は，水平面内に関しては小さく取れるが培養容器が上下に移動するので高さ方向には容器の回転角度に応じて大きくなる。図8(d)に示す揺動パターンは，図8(b)が水平方向に並行移動するものであるのに対し，垂直方向に並行移動することを特徴とする。図8(a)，図8(b)，図8(c)に示す方式と比較して培地をかき混ぜる効果が小さいので，比較的激しい揺動運動を加える必要のない場合に利用できる可能性がある。

自動播種装置全体の斜視図 細胞培養容器の概略図 恒温槽を含む機構の配置を説明するもの １ 恒温槽を含む機構の配置を説明するもの ２ 恒温槽を含む機構の配置を説明するもの ３ 細胞培養容器の動作パターンの説明図 装置処理フロー説明図 培養容器の揺動パターンの説明図

符号の説明

10・細胞培養容器,11培養容器設置台,20・恒温槽, 21・扉,30・可動軸,40・可動用モーター,50・画像撮影装置,60・制御装置(パラメータデータベースおよび可動用モーター制御)。

Claims (7)

1. 細胞培養容器を駆動装置を用いて制御し揺動させる事で、細胞の播種作業を行う事を特徴とする細胞培養装置。
2. 請求項１に記載した装置で、細胞培養容器が外気から密閉可能な恒温槽内に設置されている事を特徴とする細胞培養装置。
3. 請求項１に記載した装置で、画像撮影装置により細胞培養容器を撮影し、細胞の播種状態を取得する機能を持つことを特徴とする細胞培養装置。
4. 請求項１に記載した装置で、請求項３に記載した機能により、細胞の播種状態を測定し、細胞の播種が不十分な場合には、その状態から再度播種を実施するに最適な制御パラメータを返答するデータベース機能を持つことを特徴とする細胞培養装置。
5. 請求項１に記載した装置で、請求項1に記載したモーターを用いた揺動により、細胞培養容器内の培地の界面を運動させ、培地中へのガス拡散を促進することができる事を特徴とする細胞培養装置。
6. 細胞培養容器を揺動させる駆動装置と、該細胞培養容器を撮影する画像撮影装置と、撮影された画像から上記細胞培養容器内の細胞の分布状態が予め設定した条件を満たしているか判断する条件判断手段と、該条件が満たされていないという判断結果の場合に上記駆動装置で再度上記細胞培養容器を揺動させる制御装置とを有することを特徴とする細胞培養装置。
7. 請求項６に記載の装置において、該条件が満たされていないという判断結果の場合に上記駆動装置は、上記画像を元にデータベースから運動パラメータを得て、該運動パラメータに従って上記細胞培養容器を揺動させることを特徴とする細胞培養装置。
   

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