WO2015190090A1 - 接着系細胞用の閉鎖系培養容器 - Google Patents

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WO2015190090A1
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cell culture
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cell
sealed container
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PCT/JP2015/002888
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誠一 横尾
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誠一 横尾
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
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    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C12M37/04—Seals

Definitions

  • the present invention relates to a culture container capable of aseptic cell culture, aseptic transport to a place where cells are used (for example, an operating room or a culture room), and simple removal of cells.
  • the Cell Processing Center (CPC), a facility that maintains a high degree of cleanliness for the entire laboratory to perform culture operations, has been established and an environment with reduced risk of contamination has been realized.
  • the cost is very expensive. Therefore, in order to reduce the cost, development of an isolator capable of performing a culture operation in a closed culture environment has been promoted. However, the maintenance of the isolator is cheaper than CPC, but it is still expensive at 10 million yen. Even systems that are cheaper by dealing with only specific cell types are still expensive.
  • Patent Document 1 discloses a closed culture vessel for preventing deterioration of a culture medium.
  • This culture vessel is a vessel for culturing floating cells, and a vessel capable of increasing the culture volume with the culture time is disclosed.
  • the container of Patent Document 1 is a container for culturing floating cells, and does not consider culturing adhesive cells.
  • Patent Document 2 discloses an aircraft.
  • a transport container capable of transporting is disclosed.
  • these require the tissue for transplantation cultured in CPC or the like to be tightly sealed in CPC, which requires expensive aseptic facilities and equipment.
  • the present invention is an extremely inexpensive culture container that can be applied to various cells, and does not require expensive aseptic facilities and equipment. Therefore, it is possible to avoid major changes in manufacturing protocols and new applications due to facility and equipment changes.
  • the present invention provides a culture container capable of aseptic cell culture, aseptic transport to a place where cells are used (for example, an operating room), and simple removal of cells.
  • the present invention provides the following inventions.
  • a closed culture vessel for adherent cells An openable sealed container;
  • the cell culture body is a closed culture container provided to be removable from the sealed container.
  • the gas exchange means capable of aseptically exchanging gas is a filter capable of gas exchange between the inside and the outside of the sealed container.
  • the sealed container is a gas permeable cell culture bag.
  • a culture vessel according to claim 1. The closed container includes a cell introduction port capable of aseptically introducing a substrate having adherent cells attached to the cell adhesion surface, and the cell introduction port can be sealed after cell introduction.
  • the culture container according to any one of (1) to (10) above, wherein the substrate has a handle on the edge or side wall of the substrate.
  • the cell culture body has a bottom surface having a cell culture surface and a side surface extending upward from the periphery of the bottom surface, and the side surface is removable from the cell culture surface of the substrate.
  • the culture container in any one.
  • a set of an airtight container that can be sealed and opened and a cell culture body having a cell culture surface (15) The set according to (14) above, wherein the sealed container has a holding projection for holding the cell culture body from the outside. (16) The set according to (14) or (15), further comprising a saucer for receiving the medium inside the sealed container.
  • a closed cell culture system The culture vessel according to any one of (1) to (13) above, Medium supply means for supplying the culture medium to the culture container; A closed cell culture system comprising a medium discharge means for discharging a medium from a culture container.
  • culture can be performed in a sterile closed environment during culture, and after completion of the culture, the cells can be aseptically transported to the site where the cells are used.
  • the cell culture can be easily taken out of the container, and the taken-out culture can be used immediately. That is, according to the present invention, expensive aseptic facilities and equipment are not required, and a sterile closed environment can be maintained not only during culture but also during culture transport. It is extremely advantageous in that the possibility of contamination to the culture can be brought to zero as much as possible with a simple and inexpensive method. I can say that.
  • various open cell culture containers or substrates can be used as the cell culture body. That is, according to the present invention, it is possible to easily and inexpensively produce a wide variety of closed culture vessels.
  • FIG. 1 is a diagram showing a closed culture vessel 100 of the first embodiment.
  • FIG. 2 is a plan view of the closed culture vessel 100 of the first embodiment.
  • 3 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
  • FIG. 4 is a plan view of the cell culture body 10.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of the cell culture body 10.
  • FIG. 6 is a diagram showing a closed culture vessel 110 according to the second embodiment.
  • FIG. 7 is a plan view of the closed culture vessel 110 of the second embodiment.
  • 8 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
  • FIG. 9 is a plan view of the substrate 30.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view of the substrate 30.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating a closed culture vessel 120 according to the third embodiment.
  • FIG. 12 is a plan view of the closed culture vessel 120 of the third embodiment.
  • 13 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
  • FIG. 14 is a view showing the closed-system culture container 100 of the first embodiment further provided with a saucer.
  • FIG. 15 is a plan view of the closed culture vessel 100 of the first embodiment further provided with a saucer.
  • FIG. 16 is a cross-sectional view taken along the line AA in FIG.
  • FIG. 17 is a diagram showing a closed culture system 200 according to the first embodiment.
  • FIG. 18 is a diagram illustrating the substrate 30 including the handle 31.
  • FIG. 19 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
  • FIG. 20 is a photograph of the closed culture vessel prepared in Example 1.
  • FIG. 21 is a photograph of a closed culture container during cell culture in Example 2.
  • FIG. 22 shows corneal epithelial tissue obtained by culturing in Example 2.
  • FIG. 23 is a stained image of the cell adh
  • the cells are not limited, but, for example, corneal epithelial cells, corneal epithelial stem cells, corneal endothelial cells, corneal endothelial stem cells, oral mucosal epithelial cells, oral mucosal epithelial stem cells, conjunctival epithelial cells, conjunctival epithelial stem cells, skin epithelium Cells or skin epithelial stem cells.
  • the closed-system culture container 100 in this embodiment includes an openable sealed container 20, and a cell culture body 10 that is disposed in the sealed container and has a cell culture surface. It has.
  • the cell culture body 10 comprised separately from the sealed container 20 is arrange
  • the sealed container 20 includes a space in which a culture chamber is formed, a culture solution introduction port 21 for introducing the culture solution into the sealed vessel 20, and a culture solution discharge port 22 for discharging the culture solution from the sealed container 20. And are provided.
  • the inside of the sealed container 20 is maintained aseptically, and the culture solution is aseptically introduced into the space in the sealed container 20 from the introduction port 21.
  • the culture solution is discharged out of the sealed container 20 from the discharge port 22.
  • the culture solution introduction port 21 and the culture solution discharge port 22 are provided with an open / close valve 21a and an open / close valve 22a, respectively, and the culture solution introduction port 21 and the culture solution discharge port 22 are closed.
  • the open / close valve provided at the culture medium inlet 21 is preferably a valve capable of adjusting the introduction speed of the culture liquid.
  • the valve is not necessarily provided in the culture vessel 100, and may be provided in a tube that supplies or discharges the medium connected to the culture medium inlet 21 or the culture medium outlet 22. As an example of the valve provided in the tube, there is a clamp used for an infusion tube.
  • the culture medium inlet 21 and the culture medium outlet 22 can be sealed with a stopper such as a rubber stopper, respectively.
  • the inner surface of the sealed container 20 is not particularly limited, but is non-cell-adhesive, and preferably neither the surface treatment of the adhesive surface nor the cell-adhesive coating is performed.
  • the inner surface of the sealed container 20 is preferably provided with a cell non-adhesive coating.
  • the airtight container 20 is not particularly limited, but is preferably a container capable of aseptic gas exchange between the inside and the outside, and includes a gas exchange means 24 capable of aseptic gas exchange, for example, a vent cap. Yes.
  • a vent cap capable of aseptic gas exchange a vent cap for gas exchange through a hydrophobic membrane is commercially available and can be used as the gas exchange means 24 of the sealed container 20 of the present invention.
  • the hydrophobic membrane may have pores with a pore size of 1 ⁇ m or less or 0.5 ⁇ m or less, for example. Since gas exchange is possible between the inside and outside of the hermetic container 20, the concentration of gases such as oxygen and carbon dioxide in the culture medium can be easily maintained.
  • the sealed container 20 is not particularly limited, but is preferably a sterile gas exchangeable container between the inside and the outside. In a specific aspect, at least a part of the container wall is sterile inside and outside the container.
  • the sealed container 20 is a gas permeable cell culture bag.
  • the gas permeable cell culture bag is commercially available and can be preferably used as the sealed container 20.
  • the gas permeable cell culture bag is advantageous in that the bag can be easily opened with, for example, a blade.
  • the gas permeable cell culture bag is also advantageous in that it can be sealed by introducing a cell culture body 10 with cells adhered to the cell culture surface and then sealing with a commercially available sealer.
  • the gas permeable cell culture bag is filled with a medium and, if necessary, a gas, so that a space is formed in the inside, so that the cell culture surface and attached cells can be protected from physical damage. it can.
  • the gas permeable cell culture bag maintains the gas concentration of the internal medium at a concentration suitable for cell culture.
  • the sealed container 20 is an openable sealed container.
  • the sealed container 20 can be opened after completion of the culture, and the cell culture body 10 can be detached from the sealed container 20 after opening.
  • the sealed container 20 may be provided with a lid (not shown) having a shape from which the cell culture body 10 can be taken out. Further, the cell culture body 10 may be taken out from the sealed container 20 through the cell inlet 23 described below.
  • the sealed container 20 may be provided with a region that can be cut with a knife such as scissors or a scalpel, or the entire sealed container 20 may be made of a material that can be cut with a blade, or the sealed container 20. A part of the film may be heat-sealed so as to be peeled off by a film, whereby the cell culture body 10 can be taken out of the sealed container 20.
  • the sealed container 20 can be provided in a state in which the cell culture body 10 is disposed in advance. By doing in this way, it becomes easy to maintain the inside of the airtight container 20 in an aseptic environment.
  • the sealed container 20 may be a container that can introduce the cell culture body 10 in which cells adhere to the cell culture surface 10a and can be sealed after the introduction. By doing in this way, it becomes unnecessary to seed
  • the sealed container 20 may also be provided in a state in which the cell culture body 10 is arranged in advance, but the cell culture body 10 can be taken out from the inside and the cells are seeded on the cell adhesion surface 10a. It is good also as a container which can be sealed again in the airtight container 20 for the cell culture body 10 which carried out. By doing in this way, the cell culture body 10 can be provided in the state maintained aseptically by the airtight container 20 at the time of sale.
  • the sealed container 20 may further include a cell inlet 23 that can supply cells therein and can be sealed. Sealing may be performed by a rubber stopper or by means such as sealing.
  • the cells are stored in the sealed container 20 without removing the rubber plug using a syringe equipped with an injection needle that penetrates the rubber plug through the cell introduction port.
  • the hole formed in the rubber stopper can be sealed with a resin or the like with an injection needle, and the aseptic condition in the sealed container can be maintained.
  • the cell inlet 23 may be large enough to take the cell culture body 10 out of the sealed container and introduce it into the inside.
  • the cell culture body 10 has a bottom surface 10a having a cell culture surface and a side surface 10b extending upward from the periphery of the bottom surface.
  • the bottom surface 10a having the cell culture surface is subjected to a surface treatment of an adhesive surface capable of adhering adhesive cells.
  • the side surface 10b of the cell culture body 10 is preferably neither subjected to a surface treatment of the adhesive surface nor a cell adhesive coating.
  • the side surface 10b extending upward from the peripheral edge of the bottom surface of the cell culture body 10 is preferably provided with a non-cell-adhesive coating.
  • the surface treatment of the adhesive surface can be performed using a technique well known in the art such as plasma treatment.
  • the sealed container 20 is provided with a plurality of culture solution inlets 21.
  • a tank into which a fresh culture solution is introduced can be connected to the culture solution introduction port 21.
  • the first tank can be connected to the first inlet 21 and the fresh medium inside can be introduced into the sealed container 20.
  • the second tank is connected to the second inlet 21 to put the fresh culture medium inside the sealed container 20.
  • the culture medium inlet 21 to which the first tank is connected may be closed when the first tank is no longer needed.
  • the culture medium inlet 21 can be closed by a valve or a clamp.
  • the culture medium introduction port 21 may also have a portion made of a sealable film material, and the portion may be closed by a sealer.
  • the volume of the culture solution by increasing the volume of the sealed container 20, thereby reducing the change in the composition of the medium and reducing the frequency of replacement. It becomes. Further, when the volume of the sealed container 20 is increased, there is an advantage that a stable culture environment can be provided even for cells having a high rate of deterioration of the culture medium.
  • the volume of the airtight container 20 is 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, or 10 times or more of the volume of the cell culture body 10.
  • the planar shape of the cell culture body 10 is not particularly limited, but is preferably a circle, an ellipse, a quadrangle, or a regular polygon, for example, a square or a regular hexagon.
  • the cell culture body 10 is detachably installed from the sealed container 20. That is, the cell culture body 10 is configured separately from the sealed container 20. As a result, the cell culture body 10 and the cells adhered to the cell culture surface 10a can be taken out from the sealed container 20, and the subsequent operation, for example, peeling the cell from the cell culture body 10 is possible. Moreover, it becomes easy to process the peripheral part of a cell appropriately. In a certain aspect, the cell culture body 10 is simply mounted in the airtight container 20, and it is easy to remove the cell culture body 10 from the airtight container 20.
  • the cell culture body 10 is detachably disposed in the sealed container 20. That is, in this aspect, the cell culture body 10 can be introduced into the sealed container 20 and can be removed.
  • the cell culture body 10 in which cells are seeded on the cell adhesion surface 10a can be aseptically introduced into the sealed container 20 and sealed, and then the cells can be cultured.
  • the cell culture body 10 can be taken out from the sealed container 20 and introduced into the sealed container 20 through the cell inlet 23.
  • the cell culture body 10 is detachably disposed on the bottom surface of the sealed container 20. Thereby, the cell culture body 10 can be taken out from the airtight container 20, and handling of the cell adhering to the cell culture body 10 becomes easy. Further, by using the cell culture body 10 having a cell culture surface suitable for the cells to be cultured, various cells can be cultured using the same sealed container 20. Furthermore, a wide variety of open culture containers can be introduced into the sealed container 20 as the cell culture body 10. For example, the cell culture body 10 is a dish for cell culture in a preferable aspect. Accordingly, there is an advantage that a variety of culture containers can be manufactured at low cost without the need to prepare a new mold for each closed culture container.
  • various open culture containers (which may be commercially available) are sealed in a sealed container 20 and sterilized to make various open culture containers inexpensively and easily closed. It is possible to remake it. Therefore, in the present invention, there is provided a method for producing a closed culture container, which comprises detachably disposing an open culture container in a sealed container and then sealing the sealed container.
  • the cell culture body 10 preferably has a handle on the side surface. By grasping the handle, the cell culture body 10 can be easily taken out from the sealed container.
  • the handle is preferably not subjected to a surface treatment of the adhesive surface or a cell adhesive coating, more preferably a cell non-adhesive coating.
  • the cell culture body 10 has a bottom surface 10a having a cell culture surface made of a membrane.
  • a membrane is Trans Well (trademark) (manufactured by Corning).
  • the closed-system culture container in this embodiment may further include a medium tray 40 in the sealed container 20, as shown in FIGS.
  • the receiving tray 40 may be comprised integrally with the airtight container 20, and may be comprised as a different body.
  • the saucer 40 is a saucer for a medium overflowing from the sealed container when the sealed container 20 is opened, and is advantageous in that it prevents contamination of the surrounding area with the medium overflowing from the sealed container.
  • the saucer 40 can also be advantageously used in aligning closed culture vessels in an incubator utilizing the edge shape of the saucer 40.
  • the closed-system culture system 20 in the present embodiment includes a closed-system culture container 100 of the present invention, a medium supply means 50 for supplying a medium into the closed-system culture container, and a closed-system culture container.
  • the medium supply means 50 is connected to the culture medium inlet 21 of the closed culture vessel 100 of the present invention.
  • the medium supply means 50 can send a medium necessary for cell culture to the closed culture vessel 100 of the present invention.
  • the culture medium supply means 50 may include a liquid supply means (not shown) for supplying the culture medium.
  • An example of the liquid feeding means is a liquid feeding pump.
  • the culture medium supply means 50 may be arranged at a higher position than the closed system culture container 100 and the culture medium discharge means 51, and supply the culture medium to the closed system culture container 100 by gravity.
  • the culture medium supply unit 50 preferably includes an adjustment mechanism 50 a that adjusts the feeding speed of the culture solution in a flow path that connects the sealed container 20 and the culture medium supply unit 50.
  • the adjustment mechanism 50a is, for example, a valve that can adjust the flow rate and stop the flow.
  • the medium discharge means 51 is connected to the culture medium discharge port 22 of the closed culture vessel 100 of the present invention.
  • the medium discharge means 51 includes a closing mechanism 51a that can stop the discharge of the culture solution.
  • the closing mechanism 51a is, for example, a valve that can stop the flow.
  • the closed culture container in the present embodiment is a container that can be sealed after introducing the cell culture body 10 with the cells adhered to the cell culture surface, first, the cells are placed on the cell culture surface 10a of the cell culture body 10. Seeding and allowing the cells to adhere to the cell culture surface 10a. Thereafter, the cell culture body 10 is introduced into the opened sealed container 10. After the cell culture body 10 is introduced, the sealed container 10 is sealed.
  • the culture medium supply means 50 is aseptically connected to the culture medium introduction port 21 of the sealed hermetic container 10 and the culture medium discharge means 51 is aseptically connected to the culture liquid outlet 22 of the hermetic container, a closed culture system 200 is obtained. be able to.
  • it does not specifically limit in the airtight container 20 as long as the cell culture surface 10a is covered with a culture medium, Preferably, it can be filled until the culture medium is completely filled or the cell culture body 10 is completely submerged.
  • the closed-system culture container 100 when the cell culture body 10 is disposed in advance, first, a cell suspension is introduced into the sealed container 20 and then the culture of the sealed container 10 is performed.
  • the culture medium supply means 50 is aseptically connected to the liquid introduction port 21 and the culture medium discharge means 51 is aseptically connected to the culture solution discharge port 22 of the sealed container, the closed culture system 200 can be obtained.
  • it does not specifically limit in the airtight container 20 as long as the cell culture surface 10a is covered with a culture medium, Preferably, it can be filled until the culture medium is completely filled or the cell culture body 10 is completely submerged.
  • the cell culture body 10 when the cell culture body 10 is disposed in advance, the cell culture body 10 is first removed from the sealed container 20 and the cells are cultured on the cell culture surface in the same manner as described above.
  • the airtight container 20 may be sealed by adhering to 10a and aseptically introducing the airtight container 20 into the airtight container 20.
  • the culture medium supply means 50 is aseptically connected to the culture medium introduction port 21 of the sealed container 10 via the connection means 50a, and the culture medium discharge means 51 is aseptically connected to the culture medium discharge port 22 of the closed container via the connection means 51a. By connecting, the closed culture system 200 can be obtained.
  • the closed culture system 200 in which cells are attached to the cell culture surface 10a can be introduced and incubated in a CO 2 incubator for cell culture.
  • the medium can be supplied from the medium supply means 50 into the sealed container 20 at a constant speed from the viewpoint of keeping the medium in the sealed container 20 constant.
  • the medium supply can be performed by the medium discharge means 51 while discharging the medium.
  • the open / close valves 21 a and 22 a are closed, and the closed culture vessel 100 is removed from the closed culture system 200.
  • the inside of the closed culture vessel 100 is maintained aseptically by the closed on-off valves 21a and 22a. Therefore, the closed culture container 100 removed from the closed culture system 200 can be taken out of the culture room to another place (for example, an operating room) while maintaining the inside aseptic environment.
  • the closed container of the closed culture container 100 can be opened, and the cultured fresh cells (or cell sheets) can be taken out from the sealed container 20 together with the cell culture body 10.
  • the cells can be easily detached from the cell culture body 10 taken out from the sealed container, and the transplantation of the cells into the patient becomes easy.
  • the cell culture body 10 can be cultured in a state in which the cell culture body 10 is aseptically sealed in the sealed container 20, and the cell culture body 10 is aseptically sealed in the sealed container 20 after the culture is completed. It can be carried around.
  • the sealed container 20 is used as an outer wall of a closed culture container, and the cell culture body 10 is protected from physical impact during transportation and contamination of bacteria while maintaining the sterility of the cell culture body 10. The technical idea of using as a means is provided. Further, when the cell culture body 10 has a defect such as a minute pinhole, the defect can be easily detected from the leakage of the medium or the change in the internal pressure.
  • the sealed container 20 can be opened, it is easy to remove cells and cell culture bodies from the sealed container 20. Further, since the cell culture body 10 can be taken out from the sealed container, operations such as detachment of the cells from the cell culture body 10 and shape processing of the cell sheet on the cell culture body 10 can be easily performed. Further, the closed culture container 100 of the present invention may be used for washing, differentiating, or stimulating cells adhered to the cell culture body 10, and is advantageous in that these can be performed aseptically. is there.
  • FIGS. 6 to 8 The closed-system culture container of the second embodiment shown in FIGS. 6 to 8 is only different in the form of the cell culture body 10, and the other configuration is the closed-system culture of the first embodiment shown in FIGS. Similar to the container 100. 6 to 8, the same parts as those in the closed culture vessel of the first embodiment shown in FIGS. 1 to 3 are denoted by the same reference numerals, and description thereof is omitted.
  • the cell culture body 10 is a substrate 30 having a cell culture surface 30a.
  • the cell culture surface 30a of the substrate 30 is preferably subjected to a surface treatment of an adhesive surface capable of adhering adhesive cells.
  • the planar shape of the substrate 30 is not particularly limited, but preferably has a shape such as a circle, an ellipse, or a square, for example, a square, a regular hexagon, or a regular polygon.
  • the substrate 30 is a biological membrane in a certain aspect.
  • the biological membrane used as the substrate 30 include a collagen film and an amniotic membrane.
  • the cell culture body 10 is the substrate 30 from the viewpoint of reducing cell waste and controlling the cell culture conditions to be constant. Is preferred. In addition, this eliminates the need to separately control the cell adhesion between the bottom surface and the side wall, and also provides the advantage that the processing cost of the cell culture is greatly reduced.
  • the cell culture body 10 preferably has a handle 31 on a side surface. By grasping the handle 31, the cell culture body 10 can be easily taken out from the sealed container 20.
  • the handle 31 can be, for example, a protrusion extending upward from a part of the periphery of the substrate 30.
  • the handle 31 is preferably not subjected to a surface treatment of the adhesive surface or a cell adhesive coating, and more preferably a cell non-adhesive coating.
  • FIGS. 11 to 13 The closed-type culture container of the third embodiment shown in FIGS. 11 to 13 is different only in the form of the sealed container 20, and the other configurations are the closed-type culture container 110 of the second form shown in FIGS. It is the same. 11 to 13, the same parts as those in the closed type culture container of the second embodiment shown in FIGS.
  • the sealed container 20 has a holding protrusion 25 that holds the substrate 30 from the outside.
  • the holding protrusion 25 can hold the substrate 30 from the outside and hold the position of the substrate 30 at a fixed position.
  • concentration of the medium may be uneven depending on the location. Therefore, by maintaining the position of the substrate 30 at a constant position, it becomes easy to maintain a constant culture environment in which the substrate 30 is placed in a closed culture vessel, and the physiological state and proliferation state of the cells for each substrate 30 can be kept constant. Less.
  • the holding protrusions 25 are shown over the entire circumference of the substrate 30 for convenience. However, as long as the position of the substrate 30 can be held at a fixed position, the shape, number and arrangement of the holding protrusions 25 are not limited. It is not limited.
  • the height of the holding protrusion 25 is preferably larger than the thickness of the substrate 30. In this way, for example, the cell culture surface 30a can be protected from physical damage.
  • the substrate 30 has a handle 31.
  • the height of the handle 31 is preferably higher than the height of the holding projection 25. By doing in this way, it becomes easy to collect
  • the holding protrusion 25 is interrupted at an arbitrary position on the periphery of the substrate 30. By doing in this way, it becomes easy to collect
  • Modified Example of Third Embodiment A modified example (not shown) of the third embodiment is different only in the form of the cell culture body 10, and other configurations are the same as those of the third embodiment shown in FIGS. It is the same as the closed system culture container of the embodiment.
  • the cell culture body 10 has a bottom surface 10a having a cell culture surface and a side surface 10b extending upward from the periphery of the bottom surface, and the cell culture body in the closed culture container of the first embodiment. 10.
  • the side surface 10b extending upward from the periphery of the bottom surface can protect the bottom surface 10a having the cell culture surface from physical damage.
  • the fourth embodiment relates to a set of the sealed container 20 and the cell culture body 10 for manufacturing the closed culture container of the first, second and third embodiments.
  • the sealed container 20 and the cell culture body 10 are provided in different forms, and the sealed container 20 can be opened and sealed.
  • the rest is the same as the first, second, and third embodiments.
  • the sealed container 20 may be any sealed container 20 described in the first, second, and third embodiments as long as it can be opened and sealed. From this viewpoint, in the fourth embodiment, the sealed container 20 is preferably a cell culture bag.
  • the cell culture body 10 may be any of the cell culture bodies 10 described in the first, second, and third embodiments.
  • the cell culture body 10 is preferably packaged aseptically by itself. Thereby, the aseptic state of the cell culture body 10 can be maintained at the time of sale or the like.
  • the cell culture body 10 in which the cells are seeded on the cell culture surface 10a is aseptically introduced into the sealed container 20, and then the sealed container 20 is sealed to form a closed culture container. Let it form.
  • the closed culture vessel formed using the set of the fourth embodiment is different only in that the cells are adhered to the cell adhesion surface 10a or 30a.
  • the first, second and second It is one of the closed-system culture containers of the third embodiment, or is the same as the closed-system culture container according to the modification of the third embodiment.
  • Example 1 Production of Closed System Culture Container
  • a cell culture dish was introduced into a cell culture bag to produce a closed system culture container of the present invention.
  • Trans Well Corneal limbal cells containing human corneal epithelial stem cells were seeded in Trans Well (product number: 3050) manufactured by Corning, USA.
  • DMEM / F12 medium containing 10 ng / mL of B27 (manufactured by Life Technologies, product number: 17504044) and keratinocyte growth factor (KGF, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product number: 116-00811) was used.
  • KGF keratinocyte growth factor
  • Example 2 Culture of corneal epithelial cells using a closed culture vessel
  • corneal limbal cells were cultured using a closed culture vessel.
  • the means for draining the medium was connected to the closed culture vessel of the present invention.
  • the culture medium outlet of the closed culture vessel was aseptically connected to an empty Nipro pediatric infusion set (product number: TK-U750P).
  • the culture medium was introduced into the closed culture vessel, and when the cells were sufficiently immersed in the culture medium, the flow rate adjusting clamp attached to the tube of the Nipro infant infusion set was closed.
  • the obtained closed culture system was introduced into a CO 2 incubator to start cell culture.
  • the means for supplying the medium is arranged on the upper shelf in the incubator
  • the closed culture vessel of the present invention is arranged on the middle shelf in the incubator
  • the means for draining the medium is the lower shelf in the incubator.
  • the cells were cultured for 1 week without changing the medium. From the 8th day when cell colonies were sufficiently generated, the cells were cultured for 1 week while changing the medium once every two days.
  • the medium was exchanged by adjusting the clamp for adjusting the flow rate attached to the tube of the Nipro pediatric infusion set, releasing the flow path, introducing a new medium, and then closing the clamp.
  • TransellWell was taken out from the bag, and the membrane to which cells adhered was cut out from Trans Well.
  • the cut out membrane was fixed with 10% neutral buffered formalin solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product number: 062-01661), and the tissue specimen was stained with hematoxylin eosin according to a conventional method.
  • the cross section of the obtained tissue specimen was as shown in FIG. According to FIG. 22, the cultured corneal epithelial cells had a tissue structure similar to the corneal epithelial tissue of about 5 layers.
  • Trans Well taken out of the bag was stained with Rhodamine B (product number 180-00132, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in an appropriate amount of water, and it was observed that cells were attached to the side wall of Trans Well (Fig. 23).
  • Rhodamine B product number 180-00132, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

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Abstract

　本発明は、無菌的な細胞培養、細胞を使用する場（例えば、手術室）への無菌的な搬送、および、細胞の簡便な取り出しが可能な培養容器を提供する。　閉鎖系培養容器であって、開封可能な密閉容器と、該密閉容器内に配置され、細胞培養面を有する細胞培養体とを備え、細胞培養体は、密閉容器から取り外し可能に設けられた、閉鎖系培養容器。

Description

接着系細胞用の閉鎖系培養容器
　本発明は、無菌的な細胞培養、細胞を使用する場（例えば、手術室や培養室）への無菌的な搬送、および、細胞の簡便な取り出しが可能な培養容器に関する。
　近年、再生医療が著しい発達を見せ、細胞をフィーダーフリーおよびゼノフリーで培養する技術や細胞を無菌的に培養する様々な技術が開発されている。
　培養操作を行うために研究室全体の清浄度を高度に保つ施設であるセルプロセッシングセンター（ＣＰＣ）が設置され、汚染リスクが低減された環境が実現されているが、施設の建設や整備、ランニングコストには多額の費用がかかる。そのため、コストを低くするために閉鎖系の培養環境で培養操作ができるアイソレーターなどの開発も進められている。しかし、アイソレーターの整備もＣＰＣより安価ではあるが１台数千万円と依然として高額である。特定の細胞種のみに対応することにより低価格化されたシステムでも依然として高額である。
　また、近年の再生医療の発展により、自己の細胞を用いる再生医療技術の開発が活発化している。細胞の調製は、個々人ごとに分けて行なう必要があり、１人の細胞の培養で上記のＣＰＣやアイソレーターなどの設備が占有されることもまた、大きな問題である。
　更に、培養施設や機器の高額な投資にかかわらず、これらの施設や機器の変更は、製造手順の変更に直結し、治験薬、医薬品または医療機器として製造される再生医療製品の製作プロトコールに影響を与え、製造承認などを再度取得せねばならず多大なコストと労力が必要であり大きな問題である。
　ここで、例えば、特許文献１では、培地の劣化を防止するための閉鎖系培養容器が開示される。この培養容器は浮遊細胞の培養のための容器であり、培養時間と共に培養容積を大きくすることができる容器が開示されている。しかし、特許文献１の容器は浮遊系細胞の培養のための容器であり、接着系細胞の培養を行なうことは考慮されていない。
　また、接着系細胞の無菌的な培養、細胞を使用する場（例えば、手術室）への無菌的な搬送、および、細胞の簡便な取り出しを可能とする技術として、特許文献２では、航空機での輸送が可能な輸送容器が開示されている。しかし、これらはＣＰＣなどで培養された移植用組織をＣＰＣ内で固く密封する必要があり、高額な無菌施設や機器を必要とする。
特開２００８－２７１８５０号公報 特開２０１３－１２８４５８号公報
　本発明は、極めて安価で様々な細胞に適用可能な培養容器であって、高額な無菌施設や機器を必要とせず、ゆえに施設や機器変更に伴う製造プロトコールの大幅な変更や新規申請を回避でき、無菌的な細胞培養、細胞を使用する場（例えば、手術室）への無菌的な搬送、および、細胞の簡便な取り出しが可能な培養容器を提供する。
　具体的には、本発明では以下の発明が提供される。
（１）接着系細胞用の閉鎖系培養容器であって、
　　開封可能な密閉容器と、
　　該密閉容器内に配置され、細胞培養面を有する細胞培養体と
を備え、
　細胞培養体は、密閉容器から取り外し可能に設けられた、閉鎖系培養容器。
（２）細胞培養体が、細胞培養面を有する底面と、底面周縁から上方へ延びる側面とを有する、上記（１）に記載の培養容器。
（３）細胞培養体の底面周縁から上方へ延びる側面が細胞非接着性である、上記（２）に記載の培養容器。
（４）細胞培養体が、細胞培養面を有する基板である、上記（１）に記載の培養容器。
（５）密閉容器が、無菌的にガス交換が可能なガス交換手段を備え、密閉容器の内部と外部とで無菌的にガス交換可能な容器である、上記（１）～（４）のいずれかに記載の培養容器。
（６）無菌的にガス交換が可能なガス交換手段が、密閉容器の内部と外部とでガス交換可能なフィルターである、上記（１）～（５）のいずれかに記載の容器。
（７）密閉容器が、ガス透過性細胞培養バッグである、上記（１）～（６）のいずれかに記載の容器。
（８）細胞培養体の細胞培養面のみが細胞接着性であり、および／または、基板の他方の面および密閉容器の内面は細胞非接着性である、上記（１）～（７）のいずれかに記載の培養容器。
（９）密閉容器が、細胞接着面に接着系細胞が付着した基板を無菌的に導入することが可能な細胞導入口を備え、細胞導入口は細胞導入後に密封することが可能である、上記（１）～（８）のいずれかに記載の培養容器。
（１０）密閉容器が、細胞培養体を外方から保持する保持突起を有する、上記（１）～（９）のいずれかに記載の培養容器。
（１１）基板が、基板の縁または側壁に、取っ手を有する、上記（１）～（１０）のいずれかに記載の培養容器。
（１２）細胞培養体が、細胞培養面を有する底面と、底面周縁から上方へ延びる側面とを有し、側面が基板の細胞培養面から取り外し可能である、上記（１）～（１１）のいずれかに記載の培養容器。
（１３）密閉容器内部の培地を受けるための受け皿をさらに備えた、上記（１）～（１２）のいずれか一項に記載の培養容器。
（１４）密閉可能で開封可能な密閉容器と、細胞培養面を有する細胞培養体とのセット。
（１５）密閉容器が、細胞培養体を外方から保持する保持突起を有する、上記（１４）に記載のセット。
（１６）密閉容器内部の培地を受けるための受け皿をさらに備えた、上記（１４）または（１５）に記載のセット。
（１７）閉鎖系細胞培養システムであって、
　　上記（１）～（１３）のいずれかに記載の培養容器と、
　　培養容器に培地を供給する培地供給手段と、
　　培養容器から培地を排出する培地排出手段と
を備えた、閉鎖系細胞培養システム。
　本発明によれば、培養時には無菌的な閉鎖的環境での培養が可能であり、培養終了後は、細胞を使用する現場まで無菌的に搬送することが可能である。本発明によればまた、細胞培養体を容易に容器外部に取り出し可能であるとともに、取り出した培養体を直ちに使用することが可能である。すなわち、本発明によれば、高額な無菌施設や機器は必要とされず、無菌的な閉鎖的環境を培養時のみならず培養体搬送時にも維持することができ、医療現場で培養体を容器から取り出し、取り出した培養体をその場で使用することができることから、培養体へのコンタミネーションの可能性を簡便かつ安価な方法で限りなくゼロに近づけることができるという点で極めて有利であるといえる。本発明によればまた、細胞培養体として様々な開放系細胞培養容器または基板を用いることができる。すなわち、本発明によれば、多種多様な閉鎖系培養容器を簡便かつ安価に作製することが可能となる。
図１は、第一の実施形態の閉鎖系培養容器１００を示す図である。 図２は、第一の実施形態の閉鎖系培養容器１００の平面図である。 図３は、図２におけるＡ－Ａ断面図である。 図４は、細胞培養体１０の平面図である。 図５は、細胞培養体１０の断面図である。 図６は、第二の実施形態の閉鎖系培養容器１１０を示す図である。 図７は、第二の実施形態の閉鎖系培養容器１１０の平面図である。 図８は、図７におけるＡ－Ａ断面図である。 図９は、基板３０の平面図である。 図１０は、基板３０の断面図である。 図１１は、第三の実施形態の閉鎖系培養容器１２０を示す図である。 図１２は、第三の実施形態の閉鎖系培養容器１２０の平面図である。 図１３は、図１２におけるＡ－Ａ断面図である。 図１４は、受け皿をさらに備えた第一の実施形態の閉鎖系培養容器１００を示す図である。 図１５は、受け皿をさらに備えた第一の実施形態の閉鎖系培養容器１００の平面図である。 図１６は、図１２におけるＡ－Ａ断面図である。 図１７は、第一の実施形態の閉鎖系培養システム２００を示す図である。 図１８は、取っ手３１を備えた基板３０を示す図である。 図１９は、図１８におけるＡ－Ａ断面図である。 図２０は、実施例１で作製した閉鎖系培養容器の写真である。 図２１は、実施例２で細胞培養中の閉鎖系培養容器の写真である。 図２２は、実施例２で培養して得られた角膜上皮組織である。 図２３は、実施例２で用いた細胞培養体における細胞接着面の染色像である。
発明の具体的な説明
　本明細書では、細胞は、限定されないが、例えば、角膜上皮細胞、角膜上皮幹細胞、角膜内皮細胞、角膜内皮幹細胞、口腔粘膜上皮細胞、口腔粘膜上皮幹細胞、結膜上皮細胞、結膜上皮幹細胞、皮膚上皮細胞または皮膚上皮幹細胞である。
　以下の実施形態においては、矛盾のない範囲ですべてのあらゆる組み合わせが可能である。
第一の実施形態
　以下、図１～３により第一の実施形態について説明する。
（閉鎖系培養容器）
　本実施形態における閉鎖系培養容器１００は、図１、図２および図３に示されるように、開封可能な密閉容器２０と、密閉容器内に配置され、細胞培養面を有する細胞培養体１０とを備えている。密閉容器２０内には、密閉容器２０とは別体として構成される細胞培養体１０が密閉容器から取り外し可能に配置されている。
　密閉容器２０には、内部に培養室を形成する空間と、密閉容器２０内に培養液を導入する培養液の導入口２１と、密閉容器２０内から培養液を排出する培養液の排出口２２とが設けられている。密閉容器２０内は無菌的に保たれ、導入口２１から培養液が密閉容器２０内の空間に無菌的に導入される。また、排出口２２から培養液が密閉容器２０外に排出される。
　ある態様では、培養液の導入口２１および培養液の排出口２２にはそれぞれ、開閉バルブ２１ａおよび開閉バルブ２２ａが設けられ、培養液の導入口２１および培養液の排出口２２は、閉止することができる。培養液の導入口２１に設けられた開閉バルブは、好ましくは、培養液の導入速度を調節することが可能なバルブである。バルブは必ずしも培養容器１００に備えられている必要はなく、培養液の導入口２１または培養液の排出口２２に接続された培地を供給または排出するチューブに備えられていてもよい。チューブに備えられたバルブの例としては、輸液チューブに用いられるクランプが挙げられる。密閉容器２０を搬送する際には、培養液の導入口２１および培養液の排出口２２にはそれぞれゴム栓などの栓で密封することができる。
　密閉容器２０の内面は、特に限定されないが、細胞非接着性であり、好ましくは、接着面の表面処理も細胞接着性コーティングもなされていない。密閉容器２０の内面は、好ましくは、細胞非接着性コーティングがなされている。
　密閉容器２０は、特に限定されないが、好ましくは、その内部と外部とで無菌的なガス交換可能な容器であり、無菌的なガス交換が可能なガス交換手段２４、例えば、ベントキャップを備えている。無菌的なガス交換が可能なベントキャップとしては、疎水性膜を介してガス交換するベントキャップが市販され、本発明の密閉容器２０のガス交換手段２４として用いることができる。疎水性膜は、例えば、１μｍ以下または０．５μｍ以下の孔径のポアを有していてもよい。密閉容器２０の内外とでガス交換が可能であることにより、培地内の酸素や二酸化炭素などのガス濃度を一定に保ちやすくなる。
　密閉容器２０は、特に限定されないが、好ましくは、その内部と外部とで無菌的なガス交換可能な容器であり、ある特定の態様では、その容器壁の少なくとも一部が、容器の内外で無菌的にガス交換が可能な素材で構成され、より好ましい態様では、密閉容器２０は、ガス透過性細胞培養用バッグである。ガス透過性細胞培養バッグは、市販されており、密閉容器２０として好ましく用いることができる。ガス透過性細胞培養バッグは、バッグを、例えば刃物により、容易に開封することができる点で有利である。ガス透過性細胞培養バッグはまた、細胞培養面に細胞が接着した細胞培養体１０を導入した後に市販のシーラーによりシールすることにより密封可能である点で有利である。また、ガス透過性細胞培養バックは、内部を培地および必要に応じてガスにより満たすことで、その内部に空間が形成されるので、細胞培養面および付着した細胞を物理的損傷から保護することができる。ガス透過性細胞培養バッグは、内部の培地のガス濃度を細胞の培養に適した濃度に保つ。
　密閉容器２０は、開封可能な密閉容器である。密閉容器２０は、培養終了後、開封することが可能であり、開封後、細胞培養体１０を密閉容器２０から取り外すことができる。
開封可能とするために、密閉容器２０には、細胞培養体１０を取り出すことが可能な形状を有する蓋（図示せず）を設けてもよい。また、細胞培養体１０は、密閉容器２０から下記に説明される細胞導入口２３を介して取り出してもよい。あるいは、密閉容器２０には、はさみやメスなどの刃物で切開可能な領域を設けてもよいし、密閉容器２０全体が刃物で切開可能な素材で作られていてもよく、または、密閉容器２０の一部がフィルムにより剥離可能にヒートシールされていてもよく、これにより密閉容器２０の外部に細胞培養体１０を取り出すことを可能とすることができる。
　密閉容器２０は、あらかじめ細胞培養体１０が内部に配置された状態で提供することができる。このようにすることで、密閉容器２０内を無菌的環境に維持しやすくなる。
　密閉容器２０はまた、細胞培養面１０ａに細胞が接着した細胞培養体１０を導入することが可能であり、かつ導入後に密封可能な容器としてもよい。このようにすることで、密閉容器２０全体に細胞を播種する必要がなくなり、細胞の播種量を低減することが可能である。
　密閉容器２０はまた、あらかじめ細胞培養体１０が内部に配置された状態で提供されてもよいが、内部から細胞培養体１０を取り出すことが可能であり、かつ、細胞を細胞接着面１０ａに播種した細胞培養体１０を再び密閉容器２０内に密封することが可能な容器としてもよい。このようにすることで、販売時などに、細胞培養体１０を密閉容器２０により無菌的に維持した状態で提供することができる。密閉容器２０は、細胞をその内部に供給可能であり、かつ密封可能な細胞導入口２３をさらに備えていてもよい。密封はゴム栓により行なってもよいし、シールなどの手段で行なってもよい。細胞導入口２３がゴム栓で密封されている場合には、例えば、細胞は、細胞導入口を通してゴム栓を貫通する注射針を備えた注射器などを用いてゴム栓を抜かずに密閉容器２０内に無菌的に導入することができ、例えば、細胞導入後は、注射針でゴム栓に空いた穴を樹脂などで密封することができ、密閉容器内の無菌状態を維持することができる。細胞導入口２３は、細胞培養体１０を密閉容器の外に取り出し、内部に導入するために十分な大きさを有していてもよい。
　細胞培養体１０は、細胞培養面を有する底面１０ａと底面周縁から上方へ延びる側面１０ｂとを有する。細胞培養面を有する底面１０ａには、接着系細胞の接着が可能な接着面の表面処理がなされている。また、細胞培養体１０の側面１０ｂは、好ましくは、接着面の表面処理も細胞接着性コーティングもなされていない。細胞培養体１０の底面周縁から上方へ延びる側面１０ｂは、好ましくは、細胞非接着性コーティングがなされている。接着面の表面処理は、プラズマ処理など当分野で周知の技術を用いて行なうことができる。
　本発明のある態様では、密閉容器２０は、培養液の導入口２１が複数設けられている。
この態様では、培養液の導入口２１にはそれぞれ新鮮な培養液が導入されたタンクを接続することができる。例えば、１つ目のタンクを１つ目の導入口２１に接続し、内部の新鮮な培地を密閉容器２０内に導入することができる。そして、タンク内部の新鮮な培養液が消費されたら、またはその鮮度が低下したら、２つ目のタンクを２つ目の導入口２１に接続して内部の新鮮な培養液を密閉容器２０内に導入することができる。このようにすることで、密閉容器２０内に鮮度の高い培地を供給し続けることが可能になる。この態様では、１つ目のタンクが接続された培養液の導入口２１は、１つ目のタンクが不要になったときに閉じてもよい。培養液の導入口２１は、バルブまたはクランプにより閉じることができる。培養液の導入口２１はまた、シール可能なフィルム素材からなる部分を有していてもよく、該部分をシーラーにより閉じてもよい。
　本発明ではまた、密閉容器２０の容積を大きくすることで、培養液の容量を増やすことが可能であり、これにより培地の組成変化を低減させることができ、交換の頻度を低減することが可能となる。また、密閉容器２０の容積を大きくすると培地を劣化させる速度の速い細胞に対しても安定的な培養環境を与えることができるというメリットもある。ある態様では、密閉容器２０の容積は、細胞培養体１０の容積の２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上または１０倍以上である。
　細胞培養体１０の平面形状は特に限定されないが、好ましくは、円、楕円、四角形または正多角形、例えば、正方形若しくは正六角形などの形状である。
　細胞培養体１０は、密閉容器２０から取り外し可能に設置されている。すなわち、細胞培養体１０は密閉容器２０とは別体に構成されている。これにより、細胞培養体１０とその細胞培養面１０ａに接着した細胞とを密閉容器２０から取り出すことが可能となり、取り出したことにより、その後の作業、例えば、細胞を細胞培養体１０から剥離することや、細胞の周縁部を適切に加工することが容易になる。ある態様では、細胞培養体１０は、密閉容器２０内に単に載置されており、細胞培養体１０を密閉容器２０から取り外すことが容易である。
　ある態様では、細胞培養体１０は、密閉容器２０内に脱着可能に配置されている。すなわち、この態様では、細胞培養体１０は、密閉容器２０内に導入することが可能であり、かつ、取り外すことも可能である。例えば、細胞接着面１０ａに細胞を播種した細胞培養体１０を密閉容器２０内に無菌的に導入してから密封し、その後、細胞を培養することが可能である。細胞培養体１０の密閉容器２０からの取り出しおよび密閉容器２０への導入は、細胞導入口２３を介して行なうことができる。
　上述のように、細胞培養体１０は、密閉容器２０の底面に取り外し可能に配置される。
これにより、細胞培養体１０は、密閉容器２０から取り出すことができ、細胞培養体１０に付着した細胞のハンドリングが容易になる。また、培養する細胞に適した細胞培養面を有する細胞培養体１０を用いることにより、様々な細胞を同一の密閉容器２０を用いて培養することができるのである。さらに、細胞培養体１０として多種多様な開放系培養容器を密閉容器２０内に導入することができる。例えば、細胞培養体１０は、ある好ましい態様では、細胞培養用ディッシュである。これにより、閉鎖系培養容器毎に新たな金型を作製する必要が無く、低コストに多種多様な培養容器を製造することができるというメリットがある。具体的には、本発明では、様々な開放系培養容器（市販のものでも良い）を密閉容器２０内に密封して滅菌することで様々な開放系培養容器を安価かつ簡便に閉鎖系培養容器に作り替えることが可能である。従って、本発明では、開放系培養容器を密閉容器内に取り外し可能に配置することと、その後、密閉容器を密封することを含んでなる、閉鎖系培養容器の製造方法が提供される。
　細胞培養体１０は、好ましくは、側面に取っ手を有する。取っ手を掴むことにより、密閉容器から細胞培養体１０を取り出しやすくなる。取っ手は、好ましくは、接着面の表面処理も細胞接着性コーティングもなされておらず、より好ましくは、細胞非接着性コーティングがなされている。
　細胞培養体１０は、ある態様では、細胞培養面を有する底面１０ａが膜からなる。底面１０ａが膜からなる細胞培養体としては、Trans Well（商標）（コーニング社製）が挙げられる。
　本実施形態における閉鎖系培養容器は、図１４～１６に示すように、密閉容器２０内の培地の受け皿４０をさらに備えていてもよい。また、受け皿４０は、密閉容器２０と一体として構成されていてもよいし、別体として構成されていてもよい。受け皿４０は、密閉容器２０を開封した際に密閉容器からあふれる培地の受け皿であり、密閉容器からあふれた培地で周囲を汚染することを防ぐ点で有利である。受け皿４０はまた、受け皿４０の縁の形状を利用してインキュベータ内で閉鎖系培養容器を整列させる際にも有利に用いられ得る。
（閉鎖系培養システム）
　本実施形態における閉鎖系培養システム２０は、図１７に示されるように、本発明の閉鎖系培養容器１００と、閉鎖系培養容器内に培地を供給する培地供給手段５０と、閉鎖系培養容器から培地を排出する培地排出手段５１とを備える。
　培地供給手段５０は、本発明の閉鎖系培養容器１００の培養液の導入口２１に接続されている。培地供給手段５０は、細胞の培養に必要な培地を本発明の閉鎖系培養容器１００に送液することが可能である。培地供給手段５０は、培地を送液する送液手段（図示せず）を備えていてもよい。送液手段としては、送液ポンプが挙げられる。培地供給手段５０はまた、閉鎖系培養容器１００や培地排出手段５１より高所に配置され、重力によって培地を閉鎖系培養容器１００に供給するものとしてもよい。培地供給手段５０は、好ましくは、密閉容器２０と培地供給手段５０とを連結する流路に培養液の送液速度を調節する調節機構５０ａを備える。調節機構５０ａは、例えば、流速を調節することおよび流れを止めることが可能なバルブである。
　培地排出手段５１は、本発明の閉鎖系培養容器１００の培養液の排出口２２に接続されている。培地排出手段５１は、培養液の排出を止めることができる閉止機構５１ａを備えている。閉止機構５１ａは、例えば、流れを止めることが可能なバルブである。
（第一の実施形態における閉鎖系培養容器および閉鎖系培養システムの動作）
　次に、第一の実施形態における閉鎖系培養容器１００および閉鎖系培養システム２００の動作を説明する。
　本実施形態における閉鎖系培養容器が、細胞培養面に細胞が接着した細胞培養体１０を導入した後に密封可能な容器である場合には、まず、細胞培養体１０の細胞培養面１０ａに細胞を播種し、細胞を細胞培養面１０ａに接着させる。その後、細胞培養体１０を開封した密閉容器１０の内部に導入する。細胞培養体１０を導入した後に、密閉容器１０を密封する。密封した密閉容器１０の培養液導入口２１に培地供給手段５０を無菌的に接続し、密閉容器の培養液排出口２２に培地排出手段５１を無菌的に接続すると、閉鎖系培養システム２００を得ることができる。密閉容器２０内には、細胞培養面１０ａが培地に覆われる限り特に限定されないが、好ましくは、培地を完全に満たすか、または細胞培養体１０が完全に没するまで満たすことができる。
　本実施形態における閉鎖系培養容器１００が、あらかじめ細胞培養体１０が内部に配置されている場合には、まず、細胞の懸濁液を密閉容器２０内に導入し、その後、密閉容器１０の培養液導入口２１に培地供給手段５０を無菌的に接続し、密閉容器の培養液排出口２２に培地排出手段５１を無菌的に接続すると、閉鎖系培養システム２００を得ることができる。密閉容器２０内には、細胞培養面１０ａが培地に覆われる限り特に限定されないが、好ましくは、培地を完全に満たすか、または細胞培養体１０が完全に没するまで満たすことができる。
　本実施形態における閉鎖系培養容器１００が、あらかじめ細胞培養体１０が内部に配置されている場合には、細胞培養体１０をまず密閉容器２０から取り出して、上述と同様に、細胞を細胞培養面１０ａに接着させ、密閉容器２０内に無菌的に導入して密閉容器２０を密封してもよい。密閉容器１０の培養液導入口２１に培地供給手段５０を接続手段５０ａを介して無菌的に接続し、密閉容器の培養液排出口２２に培地排出手段５１を接続手段５１ａを介して無菌的に接続して、閉鎖系培養システム２００を得ることができる。
　細胞培養面１０ａに細胞が付着した閉鎖系培養システム２００は、細胞培養用のＣＯ２インキュベータ内に導入してインキュベートすることができる。インキュベート中は、密閉容器２０内の培地を一定に保つ観点で、培地供給手段５０から一定速度で密閉容器２０内に培地を供給することができる。培地供給は、培地排出手段５１により、培地を排出しながら行なうことができる。
　細胞の培養後、開閉バルブ２１ａおよび２２ａを閉止し、閉鎖系培養システム２００から、閉鎖系培養容器１００を取り外す。閉鎖系培養容器１００は、閉止した開閉バルブ２１ａおよび２２ａにより、内部が無菌的に保たれている。従って、閉鎖系培養システム２００から取り外された閉鎖系培養容器１００は、内部の無菌的環境を保ったまま、培養部屋から他の場所（例えば、手術室）に持ち出すことが可能となる。手術室では、閉鎖系培養容器１００の密閉容器を開封して、培養した新鮮な細胞（または細胞シート）を細胞培養体１０と共に密閉容器２０から取り出すことができる。密閉容器から取り出した細胞培養体１０上からは細胞を簡便に剥離させることができ、細胞の患者への移植が容易になる。
　このように、本発明では、細胞培養体１０が密閉容器２０に無菌的に密閉された状態で培養することができ、培養終了後は、細胞培養体１０が密閉容器２０に無菌的に密閉された状態で持ち運びが可能である。本発明は、密閉容器２０は、閉鎖系培養容器の外壁として用いると共に、細胞培養体１０の無菌状態を維持したまま、細胞培養体１０を運搬時の物理的衝撃や雑菌のコンタミネーションからの保護手段として用いるという技術思想を提供するものである。更に細胞培養体１０に微小なピンホールなどの欠陥があった場合、培地の漏れや内圧の変化から欠陥を容易に検出可能である。密閉容器２０は開封可能であることから、細胞および細胞培養体の密閉容器２０からの取り出しが簡単である。また、細胞培養体１０は密閉容器から取り出すことができるため、細胞培養体１０からの細胞の剥離や、細胞培養体１０上での細胞シートの形状加工などの操作が簡便に行える。また、本発明の閉鎖系培養容器１００は、細胞培養体１０に接着した細胞を洗浄すること、分化させること、または刺激することに用いてもよく、これらが無菌的に実施できる点で有利である。
第二の実施形態
　次に図６～８により、第二の実施形態の閉鎖系培養容器１１０について説明する。図６～８に示す第二の実施形態の閉鎖系培養容器は、細胞培養体１０の形態が異なるのみであり、その他の構成は、図１～３に示す第一の実施形態の閉鎖系培養容器１００と同様である。図６～８において、図１～３に示す第一の実施形態の閉鎖系培養容器と同一部分には同一符号を付して説明は省略する。
　図９および１０に示されるように、第二の実施形態の閉鎖系培養容器において、細胞培養体１０は、細胞培養面３０ａを有する基板３０である。基板３０の細胞培養面３０ａは、好ましくは接着系細胞の接着が可能な接着面の表面処理がなされている。基板３０の平面形状は特に限定されないが、好ましくは、円、楕円、四角、例えば、正方形、正六角形または正多角形などの形状を有する。
　基板３０は、ある態様では、生体膜である。基板３０として用いられる生体膜としては、例えば、コラーゲンフィルムおよび羊膜が挙げられる。
　細胞培養体１０を基板３０とすることの利点は、実施例により示されている。すなわち、実施例２および図２０によれば、細胞培養体の底面１０ａに播種した細胞は、培養中に細胞培養体の側壁にまで広がる。様々な応用において細胞培養体の底面１０ａに接着した細胞のみが用いられるので、細胞の無駄を低減すると共に、細胞の培養条件を一定に制御する観点では、細胞培養体は、基板３０とすることが好ましい。また、これにより底面と側壁との細胞接着性を別々に制御する必要がなくなり、細胞培養体の加工コストが大きく低減されるというメリットも得られる。
　図１８および１９に示すように、細胞培養体１０は、好ましくは、側面に取っ手３１を有する。取っ手３１を掴むことにより、密閉容器２０から細胞培養体１０を取り出しやすくなる。取っ手３１は、例えば、基板３０の周縁の一部から上方に延びる突起とすることができる。取っ手３１は、好ましくは、接着面の表面処理も細胞接着性コーティングもなされておらず、より好ましくは、細胞非接着性コーティングがなされている。
第三の実施形態
　次に図１１～１３により、第三の実施形態の閉鎖系培養容器１２０について説明する。
図１１～１３に示す第三の実施形態の閉鎖系培養容器は、密閉容器２０の形態が異なるのみであり、その他の構成は、図６～８に示す第二の形態の閉鎖系培養容器１１０と同様である。図１１～１３において、図６～８に示す第二の形態の閉鎖系培養容器と同一部分には同一符号を付して説明は省略する。
　図１１～１３に示される第三の実施形態の閉鎖系培養容器において、密閉容器２０は、基板３０を外方から保持する保持突起２５を有する。保持突起２５は、基板３０を外方から保持し、基板３０の位置を一定の位置に保持することができる。閉鎖系培養容器内では、場所により培地の濃度が不均一である可能性がある。そのため、基板３０の位置を一定の位置に保持することにより、閉鎖系培養容器内での基板３０のおかれる培養環境を一定に保ち易くなり、基板３０毎の細胞の生理状態や増殖状態のブレが少なくなる。保持突起２５は、図１１～１３では、便宜的に基板３０の円周全体にわたり図示されているが、基板３０の位置を一定の位置に保持することができる限り、その形状、個数および配置は限定されない。
　基板３０の細胞培養面３０ａを物理的に保護する観点では、保持突起２５の高さは基板３０の厚みより大きいことが好ましい。このようにすることで、例えば、細胞培養面３０ａを物理的ダメージから保護することが可能となる。
　ある特定の態様では、基板３０は、取っ手３１を有する。取っ手３１の高さは、保持突起２５の高さよりも高いことが好ましい。このようにすることで、基板３０を密閉容器２０から回収することが容易になる。ある特定の態様では、保持突起２５は、基板３０の周縁の任意の箇所で途切れている。このようにすることで、途切れた箇所（すなわち、切り欠き部分）からピンセットを挿入することでピンセットで基板３０を回収することが容易になる。
第三の実施形態の変形例
　第三の実施形態の変形例（図示せず）では、細胞培養体１０の形態が異なるのみであり、その他の構成は、図１１～１３に示される第三の実施形態の閉鎖系培養容器と同一である。
　第三の実施形態の変形例では、細胞培養体１０は、細胞培養面を有する底面１０ａと底面周縁から上方へ延びる側面１０ｂとを有する、第一の実施形態の閉鎖系培養容器における細胞培養体１０である。底面周縁から上方へ延びる側面１０ｂにより、細胞培養面を有する底面１０ａを物理的ダメージから保護することができる。
第四の実施形態
　第四の実施形態は、第一、第二および第三の実施形態の閉鎖系培養容器を製造するための、密閉容器２０と細胞培養体１０とのセットに関する。
第四の実施形態によるセットは、密閉容器２０と細胞培養体１０とは別々の形態で提供され、かつ密閉容器２０が開封可能であると共に密封可能である点で、密閉容器２０内に細胞培養体１０が配置された第一、第二および第三の実施形態とは異なるが、それ以外は第一、第二および第三の実施形態と同一である。
　すなわち、第四の実施形態では、密閉容器２０は、開封可能であると共に密封可能である限り、第一、第二および第三の実施形態で記載されたいずれの密閉容器２０としてもよい。この観点では、第四の実施形態において、密閉容器２０は、好ましくは、細胞培養用バッグである。
　また、第四の実施形態では、細胞培養体１０は、第一、第二および第三の実施形態で記載されたいずれの細胞培養体１０でもよい。第四の実施形態のキットでは、細胞培養体１０は、好ましくは、単独で無菌的に包装されている。これにより、販売等の際に細胞培養体１０の無菌状態を保持することができる。
　第四の実施形態のセットでは、細胞培養面１０ａ上に細胞が播種された細胞培養体１０を密閉容器２０内に無菌的に導入し、その後、密閉容器２０を密封して閉鎖系培養容器を形成させる。第四の実施形態のセットを用いて形成された閉鎖系培養容器は、細胞接着面１０ａまたは３０ａに細胞が接着している点が異なるのみであり、それ以外は、第一、第二および第三の実施形態の閉鎖系培養容器のいずれかであるか、第三の実施形態の変形例による閉鎖系培養容器と同一である。
実施例１：閉鎖系培養容器の作製
　本実施例では、細胞培養用バッグ内に細胞培養用ディッシュを導入して本発明の閉鎖系培養容器を作製した。
　米国コーニング社製Trans Well（製品番号：3050）にヒト角膜上皮幹細胞を含む角膜輪部細胞を播種した。培地としては、Ｂ２７（Life Technologies社製、製品番号：17504044）およびケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ、和光純薬社製、製品番号：116-00811）１０ｎｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いた。播種１日後、無菌的環境下でニプロ製カルチャーバッグ（製品番号：87-352）を開封して、Trans Wellをカルチャーバッグ内部に導入してシーラーを用いて密封して、閉鎖系培養容器を得た（図２０参照）。
実施例２：閉鎖系培養容器を用いた角膜上皮細胞の培養
　本実施例では、閉鎖系培養容器を用いて角膜輪部細胞を培養した。
　次に、本発明の閉鎖系培養容器内に、ミリポア製　滅菌フィルターマイレクスＧＰ（ＳＬＧＰ０３３ＲＢ）を装着したテルモ社製テルモシリンジ２０ｍｌ（ＳＳ－２０ＥＳＺ）を用いて滅菌された空気を導入し、バッグがTrans Well を圧迫しない程度に膨らませた。その後、培地を供給する手段と本発明の閉鎖系培養容器とを連結させた。具体的には、実施例１で得られた閉鎖系培養容器の培地導入口をB27およびKGF１０ｎｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を充填した別のニプロ製カルチャーバッグと無菌的に連結した。
　さらに、培地を廃液する手段と本発明の閉鎖系培養容器とを連結させた。具体的には、閉鎖系培養容器の培地排出口を空のニプロ製小児用輸液セット（製品番号：ＴＫ－Ｕ７５０Ｐ）と無菌的に連結した。
　このようにして、閉鎖系培養システムを構築した（図２１参照）。
　次に、閉鎖系培養容器内に培地を導入し、細胞が十分培地に浸ったところで、ニプロ製小児用輸液セットのチューブに付属している流速調整用のクランプを閉じた。
　その後、得られた閉鎖系培養システムをＣＯ２インキュベータ内に導入して細胞培養を開始した。ここで、培地を供給する手段をインキュベータ内の上段の棚に配置し、本発明の閉鎖系培養容器をインキュベータ内の中段の棚に配置し、培地を排液する手段をインキュベータ内の下段の棚に配置した。細胞は、１週間は培地の交換を行わず培養し、細胞コロニーが十分に発生した８日目から、培地を２日に１度のペースで交換しながら１週間培養した。培地の交換は、ニプロ製小児用輸液セットのチューブに付属している流速調整用のクランプを調整し、流路を解放して新しい培地を導入し、その後、クランプを閉じることにより行なった。細胞が十分に増殖したのを確認した培養１５日目から、ニプロ製小児用輸液セットのチューブに付属している流速調整用のクランプを調整し、廃液の滴下速度を３分間計測し、培地の流速が１．７５ｍＬ／時間となるようにした。この後、細胞は通常の培養条件下で１週間にわたり培養し、合計３週間の培養を行なった。
　培養後、Trans Wellをバッグから取り出し、Trans Wellから細胞が付着したメンブレンを切り出した。切り出したメンブレンを１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬社製、製品番号：062-01661）で固定し、組織標本を常法に従ってヘマトキシリンエオジンにより染色した。得られた組織標本の断面は、図２２に示される通りであった。図２２によれば、培養した角膜上皮細胞は、５層前後の角膜上皮組織と類似する組織構造を有した。
　バッグから取り出したTrans WellをローダミンＢ（和光純薬社製、製品番号１８０－００１３２を適量水に溶かし、染色した。すると、Trans Wellの側壁に細胞が付着しているようすが観察された（図２３）。

Claims (17)

  1. 　接着系細胞用の閉鎖系培養容器であって、
    　　開封可能な密閉容器と、
    　　該密閉容器内に配置され、細胞培養面を有する細胞培養体と
    を備え、
    　細胞培養体は、密閉容器から取り外し可能に設けられた、閉鎖系培養容器。
  2. 　細胞培養体が、細胞培養面を有する底面と、底面周縁から上方へ延びる側面とを有する、請求項１に記載の培養容器。
  3. 　細胞培養体の底面周縁から上方へ延びる側面が細胞非接着性である、請求項２に記載の培養容器。
  4. 　細胞培養体が、細胞培養面を有する基板である、請求項１に記載の培養容器。
  5. 　密閉容器が、無菌的にガス交換が可能なガス交換手段を備え、密閉容器の内部と外部とで無菌的にガス交換可能な容器である、請求項１～４のいずれか一項に記載の培養容器。
  6. 　無菌的にガス交換が可能なガス交換手段が、密閉容器の内部と外部とでガス交換可能なフィルターである、請求項５に記載の培養容器。
  7. 　密閉容器が、ガス透過性細胞培養バッグである、請求項５に記載の培養容器。
  8. 　細胞培養体の細胞培養面のみが細胞接着性であり、および／または、基板の他方の面および密閉容器の内面は細胞非接着性である、請求項１～７のいずれか一項に記載の培養容器。
  9. 　密閉容器が、細胞接着面に接着系細胞が付着した基板を無菌的に導入することが可能な細胞導入口を備え、細胞導入口は細胞導入後に密封することが可能である、請求項１～８のいずれか一項に記載の培養容器。
  10. 　密閉容器が、細胞培養体を外方から保持する保持突起を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の培養容器。
  11. 　基板が、基板の縁または側壁に、取っ手を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の培養容器。
  12. 　細胞培養体が、細胞培養面を有する底面と、底面周縁から上方へ延びる側面とを有し、側面が基板の細胞培養面から取り外し可能である、請求項４～１１のいずれか一項に記載の培養容器。
  13. 　密閉容器内部の培地を受けるための受け皿をさらに備えた、請求項１～１２のいずれか一項に記載の培養容器。
  14. 　密封可能で開封可能な密閉容器と、細胞培養面を有する細胞培養体とのセット。
  15. 　密閉容器が、細胞培養体を外方から保持する保持突起を有する、請求項１４に記載のセット。
  16. 　密閉容器内部の培地を受けるための受け皿をさらに備えた、請求項１４または１５に記載のセット。
  17. 　閉鎖系細胞培養システムであって、
    　　請求項１～１３のいずれか一項に記載の培養容器と、
    　　培養容器に培地を供給する培地供給手段と、
    　　培養容器から培地を排出する培地排出手段と
    を備えた、閉鎖系細胞培養システム。
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