KR102227188B1 - 세포 배양용 밀폐용기 및 이를 이용한 세포 스페로이드 배양 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 배양용 밀폐용기 및 이를 이용한 세포 스페로이드 배양 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 개구부가 형성되고, 내부에 배양공간이 마련되는 본체와, 상기 본체에 내부 배양공간으로 관통형성되는 적어도 하나 이상의 통공과, 상기 통공에 결합되는 고무마개가 구비되는 유입부 및, 외주면 가장자리를 따라 상기 본체에 체결되는 걸림쇠가 마련되고, 상기 개구부에 결합되는 캡을 포함하는 세포 배양용 밀폐용기와 세포 배양용 밀폐 용기를 이용한 세포 스페로이드 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 값비싼 저산소 배양기의 구매 필요 없이 저렴한 세포 스페로이드 배양을 이룰 수 있으며, 밀폐능을 향상하여 배양 중 잦은 가스의 이탈을 방지할 수 있기 때문에 고수율로 세포 스페로이드를 제공할 수 있다.

Description

세포 배양용 밀폐용기 및 이를 이용한 세포 스페로이드 배양 방법{A airtight container for cell culture and method for culture of cell spheroid using the same}

본 발명은 세포 배양용 밀폐용기 및 이를 이용한 세포 스페로이드 배양 방법에 관한 것이다.

최근의 다양한 연구에 따르면 저농도(低濃度)의 산소(酸素) 배양은 생체의 다양한 반응의 변화를 유발한다. 예를 들면, 2% 산소환경에서의 세포 배양은 폐의 상피세포(Human Bronchial Epithelial Cell)의 모양을 좀 더 생체와 가까운 구형으로 변화 시켰으며, 또한 종양형성의 주요 유전자인 Kras의 발현을 변화시켰다(Schafer, Mohan et al. 2016).

이러한 변화는 대상 세포를 좀 더 실제 생체에 가까운 환경에 처하게 한 것으로, 관련된 생물학적 반응의 연구나 제약 산업 등의 적용에 큰 도움이 될 전망이다. 또한 근육세포의 노화에 따른 위축증을 연구하는 데에도 저농도 산소에서의 세포 배양은 상당한 변화를 수반하였다 (Stadler, Rahimov et al. 2013).

저농도 산소에서의 세포 배양은 또한 줄기세포의 특성에도 커다란 변화를 일으켰는데, 이는 세포내의 산소대사와 관련이 있으며 기존의 배양법보다 훨씬 더 생체에 가까운 모습을 보여 주었다 (Lavrentieva, Majore et al. 2010).

이러한 사실들은 기존의 21% 산소농도에서 행해지던 세포배양은 인체의 세포 내에서 일어나는 현상을 그대로 재연하지 못함을 의미하며, 결국 그러한 방식으로 얻어진 결과들을 실제로 적용하는 데에는 한계가 따른다.

실제 생체 내에서의 산소의 농도는 1% ~ 6% 정도인 것으로 알려져 왔다 (Guyton 1966). 따라서 저농도의 산소 환경에서 세포의 반응을 분석하고, 그에 따른 후속 연구개발이 필요하다.

국내에서도 서울대학교 연구진에 의해 저산소증 연구가 활발히 진행되고 있으며, 종양·중추신경 등의 분야에서 서서히 중요성이 입증되고 있다.

대부분의 동물세포는 대기산소 농도 (Normoxia, ~21%)에서 배양된다. 이 조건은 세포의 성장을 촉진하며 실험하기에 편리하다는 장점이 있지만, 생체의 환경과는 괴리가 있으므로 결과의 신뢰성이 낮다. 하지만 저산소 (Hypoxia, ~2%)를 적용한 배양은 생체환경과 매우 닮아있으며, 기존의 연구결과와 완전히 다른 세포의 반응을 보인다. 무산소 (Anoxia, ~0%) 배양과는 차이가 있으므로 주의를 요한다.

한편, 인체는 세포 및 조직들의 유기적인 상호작용으로 이루어진 3차원(3-Dimensional) 구조로 구성된다. 지금까지는 생명현상의 규명을 위해 생체 외 형태인 2차원(2D) 평면 세포배양 모델을 이용하였으나 인체 모방 측면에서는 현저한 한계점을 가진다.

따라서 최근에는 인체 내 조직/장기 수준의 복잡한 환경을 보다 정확히 구현하기 위하여 3차원으로 배양된 세포의 원형 집합체인 3D 세포 스페로이드 모델(3D Cell Spheroid)이 신약 발굴(Drug Discovery) 및 약동학 시험(ADME; Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion)에서 주요하게 활용되고 있다.

또한, 최근에는 항암제의 효과를 관찰하기 위한 방법으로 암세포 기반의 3D 스페로이드 모델을 구축하여 이용하고 있다. 그러나 암세포는 구조적으로 복잡하고(핵심영역-Core, 저산소성-Hypoxic 또는 괴사성-Necrotic 핵심영역, 세포 정지영역-Quiescent region, 세포 증식영역-Proliferating region), 세포의 성질 및 크기가 달라 각 영역의 두께가 비동질적인 (Heterogeneity) 문제점을 가지고 있다. 따라서 스페로이드 바깥에서 핵심(Core)영역까지의 각 영역을 정밀하게 관찰 및 분석할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.

한국등록특허 제1393108호 일본등록특허 제5703302호

따라서, 본 발명의 목적은, 저농도의 산소 환경에서 세포의 반응을 분석하고 특히, 스페로이드 바깥에서 핵심(Core)영역까지의 각 영역을 정밀하게 관찰 및 분석하기 적합한 세포 배양용 밀폐용기를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 세포 배양용 밀폐용기를 이용하여 종양 스페로이드 등의 세포 스페로이드 배양 방법을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 세포 배양용 밀폐용기는 개구부가 형성되고, 내부에 배양공간이 마련되는 본체; 상기 본체에 내부 배양공간으로 관통형성되는 적어도 하나 이상의 통공과, 상기 통공에 결합되는 고무마개가 구비되는 유입부; 및 외주면 가장자리를 따라 상기 본체에 체결되는 걸림쇠가 마련되고, 상기 개구부에 결합되는 캡;을 포함한다.

여기서, 상기 본체는 걸림쇠가 걸림 가능한 돌기가 형성되고, 상기 걸림쇠는 돌기를 수용하는 홈이 형성되어 폴딩 또는 언폴딩에 따라 돌기와 탈착될 수 있다.

또한, 캡은 내부 가장자리를 따라 상기 개구부의 끝단에 밀착되는 실링패커가 구비된다.

또한, 상기 고무마개는 길이방향으로 관통하여 유로가 형성된다.

또한, 상기 고무마개는 통공에 결합되어 유로가 밀폐될 수 있다.

한편, 본 발명의 다른 실시예에서 상기 세포 배양용 밀폐용기에 세포 배양액을 채우는 단계; 및 상기 용기 내부로 배양 기체를 공급하는 단계를 포함하는 세포 스페로이드 배양 방법을 제공한다.

여기서, 상기 배양 기체는, 2% 산소, 5% 이산화탄소 및 93% 질소가 혼합된 기체인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 배양액은 DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium), 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% Penicillin/Streptomycin을 배합한 배지에서 세포를 배양하는 것일 수 있다.

또한, 상기 밀폐용기는 배양공간의 산소 농도가 2.5%에 도달하면 구비된 고무마개의 탄성으로 유로를 폐쇄시키는 것을 특징으로 한다.

전술한 바와 같은 본 발명에 따르면, 값비싼 저산소 배양기의 구매 필요 없이 저렴한 세포 스페로이드 배양을 이룰 수 있으며, 밀폐능을 향상하여 배양중 잦은 가스의 이탈을 방지할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 세포 배양 방법은 세포 스페로이드 배양에서 고수율로 세포 스페로이드를 제공할 수 있다.

이상에서의 본 발명에 따른 효과는 상기에 한정되는 것은 아니며, 기타 본 발명의 효과들은 후술할 실시예 및 청구범위에 기재된 사항을 통하여 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 분명하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 세포 배양용 밀폐용기의 분해사시도이다.
도 2는 본 발명의 세포 배양용 밀폐 용기의 내부 산소 농도의 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 세포 스페로이드 배양에서의 산소 농도에 따른 스페로이드 모양의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 저산소(2.5%) 배양에 따른 스페로이드 유전자 발현의 변화를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.

본 발명은 세포 배양용 밀폐용기 및 이를 이용한 세포 스페로이드 배양 방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 세포 배양용 밀폐용기의 분해 사시도이다.

도시된 바와 같은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 내부에 세포를 배양하기 위한 배양공간(11a)이 마련되고, 이 배양공간(11a)에 세포, 바람직하게는 저산소 농도에서 세포 스페로이드를 배양하는데 적합한 세포 배양용 밀폐용기를 제공한다.

구체적으로 도 1을 참조하면, 본 발명의 세포 배양용 밀폐용기는 본체(10), 유입부(20) 및 캡(30)을 포함하여 구성된다.

본체(10)는 개구부(11)가 형성되고, 내부에 배양공간(11a)이 마련된다.

유입부(20)는 상기 본체(10)에 내부 배양공간(11a)으로 관통형성되는 적어도 하나 이상의 통공(21)과, 상기 통공(21)에 결합되는 고무마개(22)가 구비된다.

캡(30)은 외주면 가장자리를 따라 상기 본체(10)에 체결되는 걸림쇠(31)가 마련되고, 상기 개구부(11)에 결합되도록 구성된다.

여기서 상기 본체(10)는 걸림쇠(31)가 걸림 가능한 돌기(12)가 형성되고, 상기 걸림쇠(31)는 돌기(12)를 수용하는 홈(31a)이 형성되어 폴딩 또는 언폴딩에 따라 돌기(12)와 탈착된다. 여기서 캡(30) 내부 가장자리에는 상기 개구부(11)의 끝단 모서리에 밀착되는 실링패커(32)가 구비되어 본체(10)와 캡(30) 사이가 밀폐되게 된다. 본 발명에서 실링패커(32)의 재질은 고무재질이 바람직하나, 밀폐가능한 가요성이 있는 테프론 등의 재질을 이용하여도 무방하다.

한편, 고무마개(22)는 길이방향으로 관통하여 유로(22a)가 형성된다. 본 발명에서 유로(22a)는 기체를 주입하고 난 후 밀폐가 가능하도록 구비되며, 바람직하게 고무마개(22)는 통공(21)에 결합되어 유로(22a)가 밀폐되도록 한다. 이를 위해서는 고무마개(22)는 통공(21)에 삽입되어 고정되면서 고무의 탄성에 의해 유로(22a)가 오무려지면서 밀폐된다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면 상기 세포 배양용 밀폐용기를 이용한 세포 스페로이드 배양방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명의 세포 배양용 밀폐용기를 이용한 세포 스페로이드 배양 방법은 상기 세포 배양용 밀폐용기에 세포 배양액을 채우는 단계; 및, 상기 용기 내부로 배양 기체를 공급하는 단계;를 포함한다.

여기서 상기 배양 기체는 2% 산소, 5% 이산화탄소 및 93% 질소가 혼합된 기체를 주입한다. 본 발명에서 상기 밀폐용기는 배양공간(11a)의 산소 농도가 2.5%에 도달하면 구비된 고무마개(22)의 탄성으로 유로(22a)를 밀폐시킬 수 있다. 보다 자세하게는 상기 밀폐용기의 통공(21)에 고무마개(22)를 삽입하여 고정하면 고무마개(22)의 탄성에 의해 유로(22a)가 밀폐되어 배양공간(11a) 내부가 밀폐되도록 한다.

또한, 세포 배양액은 DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium), 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% Penicillin/Streptomycin을 배합한 배지에서 세포 배양하는 것 일수 있으며, 세포 스페로이드를 배양가능한 다양한 배지를 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화 하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.

<실시예 1> 세포 배양용 밀폐 용기 제조 및 준비

일반적으로 판매되는 밀폐용기를 이용하여 2개의 구멍을 뚫었으며, 고무마개를 이용하여 기체의 유입을 조절할 수 있도록 제작하였다(도 1). 고무마개는 가스의 유입이 원활하고, 가스 공급이 완료된 후, 자연스럽게 밀폐를 유도할 수 있도록 미세한 가스 유입 구멍을 뚫었다.

산소의 공급은 2개의 구멍에 2% 산소·5% 이산화탄소·93% 질소가 함유된 기체탱크를 통해서 수행하였고, 압력은 미세한 조정이 가능한 의료용 가스 레귤레이터 (Gas Regulator)를 통해 조정하였다. MG Scientific T618-1: ID 1/8 inch, OD 1/4 inch bubble ID 1/2 inch와 같은 튜브 (Bubble tubing)를 통해서 기체를 공급하여 용기 내로 주입된 기체는 즉시 고무마개에 의해 밀폐되어 37℃세포 배양기에 거치되었다.

<실시예 2> 밀폐 용기의 산소 농도 측정

밀폐 용기의 산소 농도는 휴대용 디지털 산소농도 감지기(KXL-803)를 이용하여 시간 간격을 두고 측정하였으며, 측정된 산소농도는 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면 본 발명의 밀폐 용기는 산소 농도 2.5%에서 일정하게 유지됨을 확인하였다.

<실시예 3> 밀폐 용기의 세포 배양

인간 대장암 세포인 HCT-15 (Colon adenocarcinoma)를 round-bottom culture plate 상에서 배양하여 스페로이드(spheroid) 형태로 만들었으며, DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium), 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% Penicillin/Streptomycin을 배합한 배지에 의해 배양하였다. 5% CO2를 지속적으로 공급하는 37℃배양기 내에서 유지되었으며, 스페로이드 형성이 확인된 후 저산소를 유도하여 24시간 배양하였다.

그 결과, 21%의 산소 (Normoxa)에서 배양된 스페로이드와 2.5%의 산소 (Hypoxia)에서 배양된 스페로이드의 모양을 비교한 결과, 외형상의 차이가 없음을 확인하였다(도 3).

<실시예 4> 밀폐 용기의 저산소 세포 배양

인간 대장암 세포인 HCT-15 (Colon adenocarcinoma)를 round-bottom culture plate 상에서 배양하여 스페로이드(spheroid) 형태로 만들었으며, DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium), 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% Penicillin/Streptomycin을 배합한 배지에 의해 배양하였다. 5% CO2를 지속적으로 공급하는 37℃배양기 내에서 유지하며 스페로이드 형성이 확인된 후 저산소(2.5%)를 유도하여 24시간 배양하였다. 이 후 배양액을 제거한 후, 96-well plate 상의 세포를 PBS (Phosphate-buffered saline)로 3회 세척하고, 수집된 세포에서 RNA를 정제한 후 cDNA를 합성하였으며, qPCR을 이용하여 유전자 정량분석을 수행하였다.

실시간 중합효소연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR, quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)은 중합효소 연쇄 반응을 기반으로 하는 실험방법이다. 실시간 중합효소연쇄반응은 목표 DNA분자의 증폭과 양의 측정을 동시에 하였다. DNA샘플에서 하나 또는 그 이상의 특정 서열을 위해, 실시간 중합효소연쇄반응은 검출과 양의 측정을 할 수 있게 하였다. 계량은 절대적인 복제 수 또는 상대적인 양을 셀 수 있었다.

실험의 진행은 일반적인 중합효소연쇄반응을 따랐다. 중요한 특징은, 증폭된 DNA가 실시간으로 측정하였다. 이는 마지막에서 DNA가 관측이 되는 기본적인 중합효소연쇄반응과의 차이점이다. 두 가지의 일반적인 방법이 실시간 중합효소연쇄반응에서 사용되고 있으나, 아무 DNA이중나선에 끼어들어갈 수 있는 불특정한 형광염색, 그리고 올리고뉴클레오티드로 이루어진 서열-특이적 DNA탐침- 형광으로 보고자가 라벨되어 있고, 상보적인 DNA목표에 결합한 뒤 검출된다. 본 실험에 사용한 기법은 SYBR 시약을 이용한 비특이선 이중나선의 검출법을 이용하였다.

결과는 저산소 환경에서 배양된 스페로이드는 유전자의 변화를 보임을 의미한다(도 4). 특히 암세포의 유지 및 형성에 중요한 OCT4, E-Selectin 등의 유전자량이 상당히 증가하였다. OCT4 는 octamer-binding transcription factor 4를 의미하며, DNA 합성에 필요한 인자로서 합성하고자 하는 DNA에 결합하여 합성을 개시한다. OCT4는 특히 종양세포의 줄기성(Stemness)을 부여하는 주요 단백질 중의 하나로서 암세포의 특징을 결정짓는 데에 핵심적인 요소이다. SELE 유전자에 의해 발현되는 E-Selectin은 종양세포를 혈관내피세포에 결합시키는 데에 핵심적인 역할을 하는 단백질로서 암세포의 이동과 면역조절 등에 중요한 역할을 수행한다. 이상의 결과는 저산소환경에서의 세포배양이 종양세포의 특징을 더욱더 생체와 가까운방향으로 변화시키며, 따라서 분석 및 항암제 탐색 등에 더욱 적합한 모델임을 보여준다. NFKB는 염증반응을 조절하는 핵심 유전자이며, 이 또한 저산소에 의해 발현양이 변화하는 양상을 보인다. VEGF-A는 생체 저산소 환경에서 발현이 증가하며, 새로운 혈관의 생성을 촉진하여 종양세포의 생존을 돕는 단백질이다.

따라서 스페로이드를 통한 항암제 탐색 등의 작업 시에 저산소 환경을 반드시 고려해야 하며, 이로 인해 더욱 적합한 모델을 만들 수 있고 추가적인 자원의 소모를 줄일 수 있을 것이다. 특히 본 발명에서 제시하는 저산소 배양용기는 매우 저렴한 가격으로 장기간 저산소 환경을 구축할 수 있는 장점이 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

10: 본체
11: 개구부
11a 배양공간
12: 돌기
20: 유입부
21: 통공
22: 고무마개
22a: 유로
30: 캡
31: 걸림쇠
31a: 홈
32: 실링패커

Claims (9)

1. 개구부가 형성되고, 내부에 배양공간이 마련되는 본체;
   상기 본체에 내부 배양공간으로 관통형성되는 적어도 하나 이상의 통공과, 상기 통공에 결합되는 고무마개가 구비되는 유입부; 및
   외주면 가장자리를 따라 상기 본체에 체결되는 걸림쇠가 마련되고, 상기 개구부에 결합되는 캡;
   을 포함하는, 세포 배양용 밀폐용기로서,
   상기 본체는 걸림쇠가 걸림 가능한 돌기가 형성되고,
   상기 걸림쇠는 돌기를 수용하는 홈이 형성되어 폴딩 또는 언폴딩에 따라 돌기와 탈착되는 것을 특징으로 하며,
   상기 캡은 내부 가장자리를 따라 상기 개구부의 끝단에 밀착되는 실링패커가 구비되고,
   상기 고무마개는 길이방향으로 관통하여 유로가 형성되며, 통공에 결합되어 유로가 밀폐되는 것을 특징으로 하고,
   상기 고무마개는 고무의 탄성에 의해 유로가 오무려지면서 밀폐되는 것인, 세포 배양용 밀폐용기.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항의 세포배양용 밀폐용기에 세포배양액을 채우는 단계; 및,
   상기 용기 내부로 2 농도% 산소, 5 농도% 이산화탄소 및 93 농도% 질소가 혼합된 배양 기체를 공급하는 단계;
   를 포함하는 세포 스페로이드 배양 방법으로서,
   상기 배양 방법은 산소가 2.5 농도%로 유지되는 저산소의 생체환경을 구현한 것을 특징으로 하고,
   상기 배양 방법에 의해 배양된 세포 스페로이드는 분석 및 항암제 탐색에 적합한 실험 모델이며,
   상기 배양 방법은 종양세포의 OCT4, E-selectin 및 VEGF-A의 발현량을 증가시키고, NFKB의 발현량을 감소시키는 것이고,
   상기 밀폐용기는 배양공간의 산소 농도가 2.5 농도%에 도달하면 구비된 고무마개의 탄성으로 유로가 폐쇄 시키는 것을 특징으로 하는, 세포 스페로이드 배양 방법.
   
7. 삭제
8. 제6항에 있어서,
   상기 배양액은 DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium), 10% FBS (Fetal Bovine Serum) 및 1% Penicillin/Streptomycin을 배합한 배지에서 세포 배양하는 것을 특징으로 하는 세포 스페로이드 배양 방법.
9. 삭제

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