WO2015111348A1

WO2015111348A1 - 細胞培養装置

Info

Publication number: WO2015111348A1
Application number: PCT/JP2014/084016
Authority: WO
Inventors: 島瀬　明大; 今井　一成; 英一郎高田; 定光麻生
Original assignee: 株式会社日立ハイテクノロジーズ
Priority date: 2014-01-27
Filing date: 2014-12-24
Publication date: 2015-07-30
Also published as: JPWO2015111348A1; US10266801B2; JP6134816B2; US20170037351A1

Abstract

　本発明により、空気残りない確実な送液、容易な培養容器の着脱、を簡単な構造で実現できるから、信頼性の高い閉鎖系細胞培養装置を低コストで構築できる。　培養容器を傾斜させた状態で、液体を供給または排出するものであって、培養容器は、培養室と接続部材とを繋ぐ２つの流路すなわち流入流路と排出流路を持ち、培養室との繋合箇所をそれぞれ流入口、排出口とし、排出口は、前記傾斜の軸に最も近い位置に設け、流入口は、この軸を含む鉛直面からの被投影面に設ける。

Description

細胞培養装置

　本発明は、培養容器を用いて細胞を培養する細胞培養装置に関する。

　従来、細胞培養の作業は、限りなく除菌されたクリーンルームの中で、厳格な製造工程の下で、熟練された作業者の手作業により行われていた。そのため、細胞を大量に培養する場合、多大な人手コスト、設備コストを必要とし、産業化の大きな壁となっていた。

　手作業による一連の培養操作をロボットによって自動化し、人手コストを削減することは可能である。しかし、培養容器の蓋を開けて培地交換するなど、培養容器内部を開放する動作があるため、外部からの汚染のリスクが除外できない。そのため、ロボットを含めたシステム全体を大規模なクリーンルーム内に設置する必要があり、設備コストの大きな削減は難しい。

　そこで、培地の入った液体バッグや培養容器、排液バッグなどを、接続して一つの密閉した系を形成し（以下、閉鎖培養系）、この系の内部で培地交換等を行うことで、細胞を培養するシステムが考案されている。特開２０１１－１４２８３７号公報（特許文献１）にその一例が記載されている。これにより、外部からの汚染のリスクが除外できるから、システム設置場所の清浄度は必要最低限に保てばよく、設備コストの大幅な削減が可能となる。

　一方、閉鎖培養系は、系の外部からの液体駆動力で送液を行わなければならないなど、送液の扱いに制限があるため、その扱いに工夫が必要である。例えば、培養容器内への送液の際、空気残りがないように送液する工夫が必要である。特開２００９－１２５０２７号公報（特許文献２）では、培養容器の導入口と排出口を間隔を隔てて配置し、送液時は、鉛直方向に傾けて行う例が記載されている。

特開２０１１－１４２８３７号公報特開２００９－１２５０２７号公報

　ところで、培養容器の流入流路、排出流路に液体バッグや排液バッグからのチューブを接続するのに、それぞれ別々に接続するよりは、培養容器側の流路同士、バッグ側のチューブ同士でそれぞれまとめて、それぞれ１つの流路ソケットのような状態とし、この流路ソケット同士を接続するようにすると、接続が１回で済むので便利である。しかし、特許文献２記載の培養容器では、培養容器の流入流路と排出流路が、培養面に対し正反対に繋合されているため、これを実現するには、片方の流路を折り返すなど、流路の向きを変えなければならない。その場合、流路形状が複雑になるので、培養容器のコストアップにつながるという課題がある。

　上記課題を解決するために、本発明の細胞培養装置は、培養容器と、
　培養容器と接続する接続部材と、接続部材を傾斜させる傾斜機構と、
　培養容器へ流体の供給を行う駆動機構と、
を有し、前記傾斜機構は、前記接続部材を前記培養容器と共に傾斜させた状態で、前記培養容器へ液体を供給し、上記傾斜方向とは反対側に傾斜させた状態で前記培養容器へ気体の供給を行い、前記培養容器から液体を排出するものであって、前記培養容器は、培養室と、前記培養室と前記接続部材とを繋ぐ２つの流路すなわち流入流路と排出流路を持ち、前記培養室と前記２つの流路の繋合箇所をそれぞれ流入口、排出口とし、前記排出口は、前記傾斜機構による傾斜軸に最も近い位置に設け、前記流入口は、前記傾斜軸を含む鉛直面からの被投影面に設けるようにする。

　本発明より、着脱容易な培養容器を簡単な構造で実現でき、培養容器のコストダウンが可能となる。

本発明における細胞培養装置の概略説明図である。本発明における、培養容器への送液の様子を示す図である。本発明の培養容器の変形例を示す図である。細胞培養装置の全体構成を示す図である。培養容器を傾けて送液する様子を示す図である。制御タイムチャートを示す図である。

　以下、実施例を図面を用いて説明する。

　図１は、本発明における細胞培養装置の概略説明図である。培養容器１は、培養室２と流入流路３、排出流路４、接続口５を持った構造をしている。排出流路４は培養室２の培養面の法線方向に延び、接続口５に繋がる。流入流路３は、排出流路４のすぐ隣に、排出流路４と平行に置かれ、培養室２と接続口５を繋ぐ。培養室２は流入流路３と排出流路４を塞げば密閉された空間となる。ただし、培養室２の壁の一部はガス透過膜でできていて、培養室２内は閉鎖系を維持しつつガス交換できるようになっている。

　培養容器１は、液体の供給元および排出先と接続することになるが、接続部材６を介して行うとよい。接続部材６は、培養容器１と対の形で流入流路７と排出流路８、ポート９を持っている。流入流路７および排出流路８は、チューブ１０、１１を介して供給バッグ１２、排液バッグ１３と接続されている。ポート９は、接続口５に合った形状をしており、培養容器１の一方向からの着脱を可能にしている。接続部材は、複数のポートを持ち、複数の培養容器と接続できるようにしてもよい。

　チューブ１０または１１に、図示しないしごきポンプを設置し、チューブを外側からしごくことで、培養容器への送液が可能となる。

　供給バッグは複数あってもよく、並列にチューブ１０と接続し、図示しない切替え弁で送液したい流体の供給バッグを選択してからしごきポンプを駆動することで、所望の流体の送液が可能となる。

　培地交換を確実に行うためには、一旦古い培地を排出してから新しい培地を送液するのがよく、古い培地を排出するために空気で押し出すとよい。滅菌された空気が封入されたバッグを供給バッグの一つとして用意し、上述の切替え送液方法で空気を送り出すとよい。滅菌空気が入った供給バッグの代わりに、ＨＥＰＡフィルタを接続してもよい。フィルタの径を小さくすることで、実質的に閉鎖系とみなせる。

　流路断面積は、培養容器の流入流路３から培養室２に移るときに急拡大しているため、培養容器を水平のまま送液するのでは、培養室全体に液を行き渡らせることは難しい。そこで、培養容器を傾けながら送液するとよい。接続部材６には傾斜機構１４が取り付けられ、培養容器を傾けながら送液することが可能となっている。図２に、その様子を示す。

　図２（ａ）は、培養容器が空の状態から送液する様子を示したものである。空の状態から送液するときは、培養室の排出口３ａが最上位になるように傾ける。この状態で送液すると、培養室の流入口４ａから入った液は下から順に埋まっていき、元々中にあった気体は液で押し上げられるようにして排出口３ａから抜けていく。排出口３ａを最上位とすることで、空気が残ることはない。

　逆に、液交換のために、今入っている液を排出する場合の方法を図２（ｂ）に示す。液を排出するときは、排出口３ａが最下位になるように傾ける。この状態で空気を送ると、流入口４ａを出た空気は比重が小さいため浮上し、元々中に入っていた液は空気で押し下げられるようにして排出口３ａから抜けていく。排出口３ａを最下位とすることで、液を残さず抜くことができる。

　傾けた時に培養室の排出口を最上位または最下位にすればいいのであって、排出流路の向きは、必ずしも培養面の法線方向である必要はない。図３は本発明の培養容器の変形例を示す。

　（ａ）は、図１、２で示したものであり、排出流路３が培養面２の法線方向に出ているものである。（ｂ）は排出流路３を法線方向からθだけ傾けたものである。傾けることによって、例えば、接続口５における流入流路の入口と排出流路の出口を、中心線に対し対称に配置できるから、対称性を持った接続部材の設計が可能となる。これは接続部材のコストダウンにつながり得る。
　傾けた時に培養室の排出口を最上位または最下位にするには、傾斜の軸から最も近い箇所を排出口にすればよい。なお、排出口が厳密な意味で最上位または最下位にならなくとも問題にならない場合がある。排出口がわずかに最上位または最下位に至らなくとも、流体の表面張力の関係で空気残しなく送液できることがある。また、排出口位置の関係でごくわずかに空気残りが発生したとしてもその量が些少で問題にならない場合もある。これらのような場合の排出口の位置も、最上位または最下位にあると見なす。

　流入流路も、必ずしも排出流路と平行である必要はない。（ｃ）は、流入流路と排出流路がθの角度を持っているものである。角度が異なると製作が難しくなるから、コストアップにつながる。しかし、必要に応じ角度を持たせてもよい。この場合、円周面に沿ったなめらかな送液が可能になる利点がある。

　傾けた時に培養室の排出口が最上位または最下位になれば、流入口の位置は任意である。（ｄ）のように、培養面の大きさが変わっても、流入口の位置を相似的位置にするのではなく排出口との距離を変えないようにすれば、接続口の大きさを変えずに済み、同じ接続部材を使用することが可能になる。
　なお、流入口は、傾斜の軸を含む鉛直面から培養面に投影した時に、その被投影面にあるとよい。つまり、前記鉛直面から見ると、流入口と排出口は同じ側にあり、流路の折り返しが不要となる。さらに流入流路と排出流路が直線かつ平行ならば、培養容器の製作上特に有利となり、特に培養容器を樹脂成型する際に有利となる。
　接続口およびポートは、望ましくは、それぞれが１つの面を有し、その面にそれぞれの流路が繋がり、面同士を合わせることで、流路同士が相対するようになっていることである。こうすることで、一方向からの培養容器の着脱が行え、着脱が容易になる。ただし、位置決めや封止目的のために複数の面を持ってもよいが、それぞれの面の法線のなす角が１８０°を超えないようにすべきである。そうすれば、面の配置にもよるが、複数面持ったとしても一方向からの着脱が可能である。

　以下実施例では、本発明の培養容器での細胞培養の例を述べる。

　図４において、４個の培養容器（１６－１～１６－４）は、４個のポートを持つ接続部材１７に接続されている。接続部材１７の内部には流路切替え部材１８を含んでおり、任意の培養容器への送液を可能にする。培養容器含めたこれらの部材は、一体となってインキュベータ１９内に設置される。インキュベータ内の環境は培養の種類に合わせて設定される。例えば、温度３７度、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％といった環境設定がよく使用される。

　接続部材１７にはまた、上流側および下流側にチューブ２０、２１が接続され、さらにそれぞれ供給バッグ２２－１、２２－２、回収バッグ２３が接続され閉鎖培養系を成している。

　供給バッグは複数あってもよく、ここでは、交換用の培地が封入された供給バッグ２２－１と、古い培地の排出用の滅菌空気が封入された供給バッグ２２－２がある。これらは、切替え弁２４により、送液選択ができるようになっている。供給バッグは、内容物の品質保持のため、保冷庫２５に保管してもよい。

　送液駆動源として、しごきポンプ２６がチューブ２０に設置される。チューブ２０は例えばシリコンゴムでできており、その弾性により、流路をしごいて送液することが可能である。

　培養容器の培養面は流入口に比べ大きく広がっているので、培養容器を水平な状態で空の状態から送液する際、空気が残りやすい。培養容器内の空気が残らず抜けるよう、培養容器を傾けながら送液するとよい。本実施例に記載の培養容器は、接続部材１７と一体なので、接続部材ごと傾ければよい。傾斜機構２７は接続部材を傾ける機構である。

　図５（ａ）に培養容器を傾けて送液する様子を示す。培養容器を下にすなわち培養容器の出口が上になるように傾けながら送液することで、液は下から埋まるように送られるから、空気を残さず送り出すことができる。また、培養容器の液体を抜くときは、（ｂ）のように、培養容器を上にすなわち培養容器の排出口が下になるように傾けながら空気を送ると、送られた空気は液中を浮上し、上
にたまった空気によって液が押し出され、残さず液を抜き取ることができる。

　流路切替え部材１８の切替えには、流路切替え部材駆動機構２８があり、切替え弁２４、しごきポンプ２６、傾斜機構２７、流路切替え部材駆動機構２８を制御部２９にて制御することで、所望の送液が実現される。

　培地を送液する際の、制御タイムチャートを図６（ａ）に示す。流路切替え部材駆動機構２８により、流路切替え部材１８を所望の培養容器へ向けると共に、傾斜機構により、接続部材ごと培養容器を下にすなわち培養容器の排出口が上になるように傾ける。切替え弁は培地のった供給バッグ２２－１を選択し、この状態でしごきポンプ２６を駆動すると、所望の培養容器への送液が開始される。この状態で一定時間送液し、培養容器が培地で満たされたら、流路切替え部材１８を駆動し、別の培養容器を選択し、傾斜機構で選択した培養容器を傾けた上で、送液を開始する。これを繰り返すことで、４個全ての培養容器に培地を供給することが可能である。なお、流路切替えにあたって、流路切替え部材と接続部材は相対的な位置が変わればよいのであり、流路切替え部材を固定し、接続部材を駆動してもよい。こうすることで傾斜機構の傾きを維持したまま、送液する培養容器の切替えが可能となる。図６はこのような方法として記載してある。送液時間は、一定の時間で送っても、あるいは、培養容器が液で一杯になったことを検知する何らかのセンサをつけて制御してもよい。４個全ての培養容器への送液が完了したら、傾斜機構を駆動し培養容器を水平に戻す。

　図６（ｂ）は、古い培地を排出する際の制御タイムチャートである。供給バッグの選択と、傾斜機構の向きが異なるが、その他の動きは培地送液とほぼ同じである。

　インキュベータ内にはカメラ３０が備えられ、培養容器内の培養の様子を観察することができる。観察結果により、何らかの差異が認められれば、アラームを出したり、その内容により制御内容を変えたりすることができる。

　カメラにはカメラ駆動機構３１が付き、これも制御部２９で制御する。

　なお、複数のポートを備えた接続部材の全てに培養容器を接続するとは限らないので、ポートの形状に合わせた栓があってもよい。栓は、液を封止する機能だけを持たせればよいので、安価に製造できる。接続部材に、必要な個数の培養容器を接続し、余ったポートは栓をすればよい。

　培養容器や接続部材、流路切替え部材は、樹脂モールド品であることが価格の面から好ましい。材料として、一般的な培養容器に使用される材料である、ポリスチレンやポリプロピレン、ポリカーボネートなどがよい。

　接続された培養容器の種類により、送液量を制御するポンプ機構を設けてもよい。

Claims

　細胞培養装置であって、
　培養容器と、
　培養容器と接続する接続部材と、
　接続部材を傾斜させる傾斜機構と、
　培養容器へ流体の供給を行う駆動機構と、
を有し、
　前記傾斜機構は、前記接続部材を前記培養容器と共に傾斜させた状態で、前記培養容器へ液体を供給し、
上記傾斜方向とは反対側に傾斜させた状態で前記培養容器へ気体の供給を行い、前記培養容器から液体を排出するものであって、
　前記培養容器は、培養室と、前記培養室と前記接続部材とを繋ぐ２つの流路すなわち流入流路と排出流路を持ち、
前記培養室と前記２つの流路の繋合箇所をそれぞれ流入口、排出口とし、
前記排出口は、前記傾斜機構による傾斜軸に最も近く、
前記流入口は、前記傾斜軸を含む鉛直面からの被投影面にあることを特徴とする、細胞培養装置。
　請求項１に記載の細胞培養装置において、
　前記２つの流路は前記培養室と前記接続部材と繋ぐ、直線状の流路であることを特徴とする細胞
培養装置。
　請求項１に記載の細胞培養装置において、
　前記接続部材は、複数の前記培養容器を着脱可能であることを特徴とする細胞培養装置。
　請求項１に記載の細胞培養装置において、
　前記培養容器は１つの接続口を有し、前記接続部材に対して、一方向からの着脱が可能であることを特徴とする細胞培養装置。
　請求項１に記載の細胞培養装置において、
　前記培養容器は、前記接続口の大きさが同じで、培養面の大きさが異なることを特徴とする細胞培養装置。
　請求項３に記載の細胞培養装置において、
　前記接続部材に、前記培養容器が接続されていない箇所を封止する栓を有することを特徴とする細胞培養装置。
　請求項１に記載の細胞培養装置において、
　前記培養容器、前記接続部材は、樹脂成型品であることを特徴とする細胞培養装置。
　請求項１に記載の細胞培養装置において、
　接続された培養容器の種類により、送液量を制御するポンプ機構を有することを特徴とする細胞培養装置。