KR20230158117A - 세포 배양 장치 및 생세포 농도 조정 방법 - Google Patents

세포 배양 장치 및 생세포 농도 조정 방법 Download PDF

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후지필름 가부시키가이샤
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Abstract

세포 현탁액을 유지하는 제1 용기, 세포 현탁액을 희석하는 희석액을 유지하는 제2 용기, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포에 대하여 개별적으로 생사 판정을 행함으로써, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도의 측정을 행하는 생세포 농도 측정 장치, 생세포 농도 및 세포 현탁액의 액량 데이터를 유지하여 제어하는 제어 장치, 세포 현탁액과 희석액을 혼합하는 혼합부, 및 희석된 세포 현탁액을 파종하여 세포 배양을 행하는 배양 용기를 갖고, 제어 장치는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 소정의 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정하며, 상기 액량의 세포 현탁액과 상기 액량의 희석액을 혼합부로 송액하고, 희석된 세포 현탁액을 파종하는, 세포 배양 장치 및 생세포 농도 조정 방법.

Description

세포 배양 장치 및 생세포 농도 조정 방법
본 개시는, 세포 배양 장치 및 생(生)세포 농도 조정 방법에 관한 것이다.
세포 배양 기술에서는, 파종에 이용하는 세포 현탁액에 대하여, 목적 세포의 생세포 농도를 적절히 조절하는 것이 필요하다. 이와 같은 생세포 농도 조정에 관한 기술이, 예를 들면, 국제 공개공보 제2016/013394호에 개시되어 있다.
국제 공개공보 제2016/013394호 등을 비롯하여, 생세포 농도의 조정에 관한 기술이 종래부터 검토되고 있지만, 충분하지 않은 것이 현재 상황이다.
본 개시는, 이와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것이며, 본 개시의 일 실시형태가 해결하고자 하는 과제는, 목적 세포의 생세포 농도를 신속히 조정할 수 있는 세포 배양 장치를 제공하는 것이다.
본 개시의 다른 실시형태가 해결하고자 하는 과제는, 목적 세포의 생세포 농도를 신속히 조정할 수 있는 생세포 농도 조정 방법을 제공하는 것이다.
본 개시는, 이하의 양태를 포함한다.
<1> 세포 현탁액을 유지하는 제1 용기,
세포 현탁액을 희석하는 희석액을 유지하는 제2 용기,
세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포에 대하여 개별적으로 생사 판정을 행함으로써, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도의 측정을 행하는 생세포 농도 측정 장치,
생세포 농도 및 세포 현탁액의 액량 데이터를 유지하여 제어하는 제어 장치,
세포 현탁액과 희석액을 혼합하는 혼합부, 및
희석된 세포 현탁액을 파종하여 세포 배양을 행하는 배양 용기를 갖고,
제어 장치는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정하며, 상기 액량의 세포 현탁액과 상기 액량의 희석액을 혼합부로 송액하고, 희석된 세포 현탁액을 파종하는, 세포 배양 장치.
<2> 생세포 농도 측정 장치가, 제1 용기와 혼합부의 사이의 유로로부터 분기된 유로, 또는 제1 용기와 혼합부의 사이의 유로에 배치된, <1>에 기재된 세포 배양 장치.
<3> 제1 용기로부터 혼합부에 세포 현탁액이 도달할 때까지의 송액 시간의 적어도 일부의 시간으로, 생세포 농도의 측정을 행하는, <2>에 기재된 세포 배양 장치.
<4> 혼합부가, 배양 용기를 겸하고 있는, <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 장치.
<5> 혼합부가, 부유 배양 장치인 배양 용기를 겸하고 있는, <1> 내지 <4> 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 장치.
<6> 혼합부가, 제2 용기를 겸하는, <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 장치.
<7> 배양 용기가, 다층 배양 용기인, <1> 내지 <6> 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 장치.
<8> 생세포 농도 측정 장치가,
목적 세포에 광을 조사하는 광원,
목적 세포를 촬상하는 촬상 장치,
초점면을 변화시키는 수단,
광이 조사된 목적 세포의 광이 조사된 측과는 반대의 방향으로부터, 목적 세포의 포커싱면을 포함하는 복수의 초점면에서 촬상된, 목적 세포의 화상을 취득하는 화상 취득부,
각 화상으로부터, 목적 세포의 중심부 및 외주부를 포함하는 화상편을 취득하는 화상편 취득부,
초점면의 촬상 방향의 순서로 화상편을 연결하여, 해석용 연결 화상을 작성하는 해석용 연결 화상 작성부,
해석용 연결 화상으로부터 특징량을 추출하는 특징량 추출부, 및
해석용 연결 화상의 특징량과, 미리 정해진 특징량의 범위에 근거하여, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정을 행하는 생사 판정부, 및
생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 결정하는 생세포 농도 결정부를 구비한, <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 장치.
<9> 초점면을 변화시키는 수단이, 목적 세포를 유지하는 유지 용기를 재치한 스테이지를 이동시켜 목적 세포와 촬상 장치의 사이의 거리를 변화시키는 스테이지 이동 기구인, <8>에 기재된 세포 배양 장치.
<10> 초점면을 변화시키는 수단이, 촬상 장치를 이동시켜 목적 세포와 촬상 장치의 사이의 거리를 변화시키는 촬상 장치 이동 기구인, <8>에 기재된 세포 배양 장치.
<11> 초점면을 변화시키는 수단으로서, 촬상 장치가 액체 렌즈를 구비한, <8>에 기재된 세포 배양 장치.
<12> 생세포 농도 측정 장치가,
목적 세포를 촬상하는 디지털 홀로그래픽 현미경,
목적 세포의 위상 이미지를 취득하는 위상 이미지 취득부,
상기 위상 이미지의 위상량 분포와, 미리 정해진 위상량 분포에 근거하여, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정을 행하는 생사 판정부, 및
생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 결정하는 생세포 농도 결정부를 구비한, <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 장치.
<13> 생세포 농도 측정 장치가, 생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 세포 생존율을 결정하는 세포 생존율 결정부를 구비한, <1> 내지 <12> 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 장치.
<14> 광이 조사된 목적 세포의 광이 조사된 측과는 반대의 방향으로부터, 목적 세포의 포커싱면을 포함하는 복수의 초점면에서 촬상된, 목적 세포의 화상을 취득하는 공정,
세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포에 대하여 개별적으로 생사 판정을 행함으로써, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 측정하는 공정,
생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조제하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정하는 공정, 및
상기 액량의 세포 현탁액과 상기 액량의 희석액을 혼합하는 공정을 포함하는, 생세포 농도 조정 방법.
<15> 생세포 농도를 측정하는 공정이,
광이 조사된 목적 세포의 광이 조사된 측과는 반대의 방향으로부터, 목적 세포의 포커싱면을 포함하는 복수의 초점면에서 촬상된, 목적 세포의 화상을 취득하는 공정,
각 화상으로부터, 목적 세포의 중심부 및 외주부를 포함하는 화상편을 취득하는 공정,
초점면의 촬상 방향의 순서로 화상편을 연결하여, 해석용 연결 화상을 작성하는 공정,
해석용 연결 화상으로부터 특징량을 추출하는 공정,
해석용 연결 화상의 특징량과, 미리 정해진 특징량의 범위에 근거하여, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정을 행하는 공정, 및
생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 결정하는 공정을 포함하는, <14>에 기재된 생세포 농도 조정 방법.
<16> 생세포 농도를 측정하는 공정이,
디지털 홀로그래픽 현미경으로 목적 세포를 촬상하고, 목적 세포의 위상 이미지를 취득하는 공정,
위상 이미지의 위상량 분포와, 미리 정해진 위상량 분포에 근거하여, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정을 행하는 공정, 및
생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 결정하는 공정을 포함하는, <14>에 기재된 생세포 농도 조정 방법.
<17> 생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 세포 생존율을 결정하는 공정을 포함하는, <14> 내지 <16> 중 어느 하나에 기재된 생세포 농도 조정 방법.
<18> 목적 세포가 인간 활막 유래 간엽계 줄기 세포인 <1> 내지 <13> 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 장치.
<19> 목적 세포가 인간 활막 유래 간엽계 줄기 세포인 <14> 내지 <17> 중 어느 하나에 기재된 생세포 농도 조정 방법을 이용한 관절증 치료제의 제조 방법.
<20> <19>에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법에 의하여 제조되는 관절증 치료제.
본 개시의 일 실시형태에 의하면, 목적 세포의 생세포 농도를 신속히 조정할 수 있는 세포 배양 장치가 제공된다.
본 개시의 다른 실시형태에 의하면, 목적 세포의 생세포 농도를 신속히 조정할 수 있는 생세포 농도 조정 방법이 제공된다.
도 1은, 세포 배양 장치의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 2는, 세포 배양 장치를 구성하는 제어 장치의 일례를 나타내는 블록도이다.
도 3은, 세포 배양 장치의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 4는, 세포 배양 장치의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 5는, 세포 배양 장치의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 6은, 세포 배양 장치의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 7은, 세포 배양 장치의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 8은, 세포 배양 장치의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 9는, 세포 배양 장치의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 10은, 생세포 농도 측정 장치의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 11은, 초점면의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 12는, 초점면을 변화시키면서 생세포를 촬상하여 얻어지는 화상의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 13은, 초점면을 변화시키면서 사(死)세포를 촬상하여 얻어지는 화상의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 14는, 생세포로부터 얻어지는 연결 화상의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 15는, 사세포로부터 얻어지는 연결 화상의 일례를 나타내는 모식적 개략도이다.
도 16은, 기계 학습기의 학습 페이즈 및 운용 페이즈에 있어서의 처리의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 17은, 생사 판정 공정의 생사 판정 플로의 일례를 나타내는 플로도이다.
도 18은, 세포 생사 판정 장치를 구성하는 제어부의 일례를 나타내는 블록도이다.
도 19는, 세포 생사 판정 장치의 처리의 일례를 나타내는 블록도이다.
이하, 본 개시에 관한 세포 배양 장치 및 생세포 농도 조정 방법의 상세를 설명한다.
본 개시에 있어서 "~"를 이용하여 나타난 수치 범위는, "~"의 전후에 기재되는 수치를 각각 최솟값 및 최댓값으로서 포함하는 범위를 의미한다.
본 개시에 단계적으로 기재되어 있는 수치 범위에 있어서, 소정 수치 범위로 기재된 상한값 또는 하한값은, 다른 단계적인 기재의 수치 범위의 상한값 또는 하한값으로 치환해도 된다. 또, 본 개시에 기재되어 있는 수치 범위에 있어서, 소정 수치 범위로 기재된 상한값 또는 하한값은, 실시예에 나타나 있는 값으로 치환해도 된다.
본 개시에 있어서, 2 이상의 바람직한 양태의 조합은, 보다 바람직한 양태이다.
본 개시에 있어서, 각 성분의 양은, 각 성분에 해당하는 물질이 복수 종 존재하는 경우에는, 특별히 설명하지 않는 한, 복수 종의 물질의 합계량을 의미한다.
본 개시에 있어서, "공정"이라는 말은, 독립적인 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없는 경우이더라도, 그 공정의 소기의 목적이 달성되면, 본 용어에 포함된다.
이하의 설명에 있어서 참조하는 도면은, 예시적, 또한, 개략적으로 나타난 것이며, 본 개시는, 이들 도면에 한정되지 않는다. 동일한 부호는, 동일한 구성 요소를 나타낸다. 또, 도면의 부호는 생략하는 경우가 있다.
<세포 배양 장치>
본 개시에 관한 세포 배양 장치는,
세포 현탁액을 유지하는 제1 용기,
세포 현탁액을 희석하는 희석액을 유지하는 제2 용기,
세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포에 대하여 개별적으로 생사 판정을 행함으로써, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도의 측정을 행하는 생세포 농도 측정 장치,
생세포 농도 및 세포 현탁액의 액량 데이터를 유지하여 제어하는 제어 장치,
세포 현탁액과 희석액을 혼합하는 혼합부, 및
희석된 세포 현탁액을 파종하여 세포 배양을 행하는 배양 용기를 갖고,
제어 장치는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정하며, 상기 액량의 세포 현탁액과 상기 액량의 희석액을 혼합부로 송액하고, 희석된 세포 현탁액을 파종한다.
생세포 농도 조정에 관한 기술로서, 예를 들면, 국제 공개공보 제2016/013394호 특허문헌 1에 기재된 기술을 들 수 있지만, 국제 공개공보 제2016/013394호 특허문헌 1의 기술에서는, 생세포 농도를 측정할 때, 미리 준비한 검량선을 이용하기 때문에, 목적 세포의 종류, 세포 현탁액 중의 다른 세포종의 혼입 등도 고려하여, 다수의 검량선을 준비할 필요가 있다. 또, 국제 공개공보 제2016/013394호 특허문헌 1의 기술에서는, 세포 현탁액과 희석액을 혼합할 때, 순환로를 이용하여 혼합할 필요가 있다. 그 때문에, 국제 공개공보 제2016/013394호 특허문헌 1의 기술에서는, 생세포 농도 조정에 많은 시간을 필요로 한다.
이에 대하여, 본 개시에 관한 세포 배양 장치에서는, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포에 대하여, 개별적으로 생사 판정을 행하기 때문에, 단시간에 목적 세포의 생세포 농도(이하, 간단히 "생세포 농도"라고 부르는 경우가 있다)를 측정할 수 있어, 생세포 농도를 신속히 조정할 수 있다.
생체 조직 유래의 세포를 이용하는 경우, 예를 들면 인간 조직 유래의 세포를 이용하는 경우, 인간 조직 유래의 세포로부터 세포 제제(製劑)를 제조하는 경우 등에 있어서는, 채취할 수 있는 세포량에 한계가 있으며, 또, 제제로서의 성능을 감약(減弱)시키지 않기 위하여, 신속한 세포 조제가 필요하다. 구체적으로는, 인간 활막 유래 간엽계 줄기 세포로부터 관절증 치료제로서의 세포 제제의 제조에 있어서, 본 개시에 관한 세포 배양 장치를 이용할 수도 있다.
"목적 세포"란, 생사 판정의 대상으로 하는 특정 종류의 세포를 의미하고, 예를 들면, 세포 배양 등의 목적인 세포여도 된다.
"미리 정해진 생세포 농도"란, 예를 들면, 파종에 이용하는 목적 세포의 세포 현탁액에 대하여 결정된 목표의 생세포 농도여도 된다.
목적 세포의 종류는 특별히 한정되지 않고, 다양한 생세포의 생사 판정을 행할 수 있다. 구체적으로는, 생체 조직으로부터 채취, 단리(單離)된 간엽계 줄기 세포여도 되고, 예를 들면, 상기와 같은 인간 활막 유래 간엽계 줄기 세포를 들 수 있다. 또한, 활막 유래 간엽계 줄기 세포는 활막 유래 줄기 세포라고도 호칭된다.
이하, 각 구성에 대하여 상세를 설명한다.
[제1 용기]
제1 용기는, 세포 현탁액을 유지한다. 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여 결정된 액량의 세포 현탁액이 혼합부로 송액된다.
제1 용기의 재질, 형상 등은 특별히 한정되지 않고, 세포 배양 장치의 구성을 고려하여 적절히 선택해도 된다. 목적 세포의 종류는 특별히 한정되지 않고, 다양한 목적 세포의 생세포 농도를 측정하여 희석한 후, 파종할 수 있다. 균일한 농도에서의 송액을 보다 용이하게 하는 관점에서, 제1 용기는, 예를 들면, 교반기 등의 혼합 기구, 제1 용기를 요동 가능한 요동 기구 등을 구비해도 된다.
[제2 용기]
제2 용기는, 세포 현탁액을 희석하는 희석액을 유지한다. 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여 결정된 액량의 희석액이 혼합부로 송액된다.
제2 용기의 재질, 형상 등은 특별히 한정되지 않고, 세포 배양 장치의 구성을 고려하여 적절히 선택해도 된다. 희석액의 종류는 특별히 한정되지 않고, 목적 세포의 종류도 고려하여 적절히 선택해도 된다. 또, 후술한 바와 같이, 혼합부는, 제2 용기를 겸해도 된다.
[생세포 농도 측정 장치]
생세포 농도 측정 장치는, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포에 대하여 개별적으로 생사 판정을 행함으로써, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도의 측정을 행한다.
생세포 농도 측정 장치는, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 세포 생존율을 결정하는 세포 생존율 결정부를 구비해도 된다. 생세포 농도 측정 장치의 세포 생존율 결정부는, 이후에 상세를 설명하는 생세포 농도 조정 방법의 세포 생존율 결정 공정에 대응한다.
생세포 농도 측정 장치는, 세포 배양 장치의 임의의 위치에 배치해도 된다. 세포 현탁액을 외부 환경에 폭로하지 않고 생세포 농도를 측정하는 관점에서, 생세포 농도 측정 장치는, 제1 용기와 혼합부의 사이의 유로로부터 분기된 유로, 또는 제1 용기와 혼합부의 사이의 유로에 배치되어 있는(이하, "생세포 농도 측정 장치가 인라인인"이라고 부르는 경우가 있다) 것이 바람직하다. 이로써, 세포 현탁액을 보다 청정한 상태로 유지할 수 있다.
생세포 농도 측정 장치가 인라인인 경우, 생세포 농도의 측정은, 제1 용기로부터 혼합부에 세포 현탁액이 도달할 때까지의 송액 시간의 적어도 일부의 시간으로 행해도 된다. 생세포 농도를 측정하면서, 세포 분산액을 혼합부를 향하여 송액함으로써, 생세포 농도를 보다 신속히 조정할 수 있다.
생세포 농도의 측정을 행하는 방법은, 특별히 한정되지 않는다.
예를 들면, 상세를 후술하는 바와 같이, 목적 세포의 복수의 화상으로부터 얻어지는 연결 화상을 해석함으로써, 목적 세포의 생사 판정을 행하고, 생세포 농도의 측정을 행하는 생세포 농도 측정 장치(이하, "양태 1의 생세포 농도 측정 장치"라고 부르는 경우가 있다)를 들 수 있다.
또, 예를 들면, 디지털 홀로그래픽 현미경으로 촬상한 목적 세포의 위상 이미지를 해석함으로써, 목적 세포의 생사 판정을 행하고, 생세포 농도의 측정을 행하는 생세포 농도 측정 장치(이하, "양태 2의 생세포 농도 측정 장치"라고 부르는 경우가 있다)를 들 수 있다.
이하, 양태 1 및 양태 2의 생세포 농도 측정 장치에 대하여 구체적으로 설명한다.
(양태 1의 생세포 농도 측정 장치)
양태 1의 생세포 농도 측정 장치는,
목적 세포에 광을 조사하는 광원,
목적 세포를 촬상하는 촬상 장치,
초점면을 변화시키는 수단,
광이 조사된 목적 세포의 광이 조사된 측과는 반대의 방향으로부터, 목적 세포의 포커싱면을 포함하는 복수의 초점면에서 촬상된, 목적 세포의 화상을 취득하는 화상 취득부,
각 화상으로부터, 목적 세포의 중심부 및 외주부를 포함하는 화상편을 취득하는 화상편 취득부,
초점면의 촬상 방향의 순서로 화상편을 연결하여, 해석용 연결 화상을 작성하는 해석용 연결 화상 작성부,
해석용 연결 화상으로부터 특징량을 추출하는 특징량 추출부,
해석용 연결 화상의 특징량과, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정을 행하는 생사 판정부, 및
생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 결정하는 생세포 농도 결정부를 구비한다.
생세포는, 세포막으로 덮여 있기 때문에, 세포 현탁액 중에서 구상이 되는 성질이 있으며(또한, 완전한 구상을 의미하는 것은 아니다), 또, 생세포는, 투광성을 갖는다. 그 때문에, 생세포는 구상 렌즈로서의 성질을 갖고 있으며, 이것을 "렌즈 효과"라고 한다.
따라서, 생세포에 광을 조사하면, 렌즈 효과에 의하여, 생세포의 광을 조사하는 측과는 반대의 방향으로 집광점(이하, "렌즈 효과의 집광점"이라고 부르는 경우가 있다)이 형성된다. 생세포의 광을 조사하는 측과는 반대의 방향으로부터 생세포를 촬상하면, 생세포의 포커싱면에서, 렌즈 효과의 집광점을 포함하는 화상을 취득할 수 있다.
그 때문에, 생세포에 대하여, 포커싱면을 포함하는 복수의 초점면에서 취득한 화상으로부터 작성된 연결 화상은, 생세포에 특유의 정보를 포함하는 것이 된다.
한편, 사세포는, 세포막이 찢어져 있기 때문에 구상은 되지 않고, 또, 세포 현탁액의 액체 매질이 사세포에 유입되어 있다. 그 때문에, 사세포는 렌즈 효과를 나타내지 않는다.
따라서, 사세포에 광을 조사해도, 렌즈 효과의 집광점은 형성되지 않고, 사세포의 포커싱면에서 사세포를 촬상해도, 렌즈 효과의 집광점을 포함하는 화상을 취득할 수 없다.
이상과 같이, 생세포로부터 작성된 연결 화상은, 사세포로부터 작성된 연결 화상과는 상이한 것이기 때문에, 생세포에 특유의 특징량을 갖는다. 그 때문에, 생사가 불명한 목적 세포의 해석용 연결 화상의 특징량과, 미리 정해진 특징량의 범위에 근거하여, 목적 세포의 생사 판정을 행할 수 있다.
또, 양태 1의 세포 배양 장치는, 세포의 광학적 성질을 이용하고 있기 때문에, 염색 시약을 이용하지 않고, 보다 간편하게 생세포 농도의 조정을 행할 수 있다.
해석용 연결 화상 및 참조용 연결 화상을 간단히 "연결 화상"이라고 부르는 경우가 있다. 또, "목적 세포"를 간단히 "세포"라고 부르는 경우가 있다.
생사 판정부는, 기계 학습기에 의하여 구성되어 있어도 된다.
양태 1의 생세포 농도 측정 장치에 있어서의 화상 취득부, 화상편 취득부, 해석용 연결 화상 작성부, 특징량 추출부, 생사 판정부 및 생세포 농도 결정부는 각각, 이후에 상세를 설명하는 양태 1의 생세포 농도 측정 공정의 화상 취득 공정, 화상편 취득 공정, 해석용 연결 화상 작성 공정, 특징량 추출 공정, 생사 판정 공정 및 생세포 농도 결정 공정에 대응한다.
촬상 장치는, 촬상 렌즈와 에어리어 센서의 조합으로 이루어진다. 촬상 렌즈는, 텔레센트릭 렌즈, 현미경 대물 렌즈 등이어도 된다.
광원은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, LED(Light Emitting Diode) 등을 들 수 있다.
초점면을 변화시키는 수단은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 세포를 유지하는 유지 용기를 재치한 스테이지를 이동시켜 세포와 촬상 장치의 사이의 거리를 변화시키는 스테이지 이동 기구여도 된다. 생세포 농도 측정 장치(200)는, 예를 들면, 도 10에 나타내는 바와 같이, 목적 세포(C)에 광을 조사하는 광원(10)과, 목적 세포(C)를 촬상하는 촬상 장치(20)와, 목적 세포(세포 현탁액)(C)를 유지하는 유지 용기(40)와, 유지 용기(40)를 이동시켜 목적 세포(C)와 촬상 장치(20)의 사이의 거리를 변화시키는 스테이지(30)(스테이지 이동 기구)와, 제어부(106)를 구비해도 된다.
초점면을 변화시키는 수단은, 촬상 장치를 이동시켜 세포와 촬상 장치의 사이의 거리를 변화시키는 촬상 장치 이동 기구여도 된다.
또, 초점면을 변화시키는 수단으로서, 촬상 장치가 액체 렌즈를 구비하고 있어도 된다.
생세포 농도 측정 장치는, 데이터를 입력하기 위한 입력 장치, 및 생세포 농도의 측정 결과 등을 표시하기 위한 표시 장치를 구비해도 된다.
생세포 농도 측정 장치는, 세포 배양 장치에 구비된 입력 장치를 통하여 데이터를 입력할 수 있도록 구성되어 있어도 된다. 또, 생세포 농도 측정 장치는, 세포 배양 장치에 구비된 표시 장치에 생세포 농도의 측정 결과 등을 표시할 수 있도록 구성되어 있어도 된다.
이하, 도 10에 나타나는 생세포 농도 측정 장치(200)를 예로서, 생세포 농도 측정 장치를 보다 구체적으로 설명한다.
도 18은, 도 10에 나타나는 생세포 농도 측정 장치(200)를 구성하는 제어부(106)의 일례를 나타내는 블록도이다. 제어부(106)가 구비하는 CPU(Central Processing Unit)(101)는, 생세포 농도 측정 장치(200)를 전체적으로 제어하는 프로세서이다. CPU(101)는, ROM(Read Only Memory)(102)에 저장된 시스템 프로그램을, 버스(105)를 통하여 독출하고, 시스템 프로그램에 따라 생세포 농도 측정 장치(200)의 전체를 제어한다. RAM(Random Access Memory)(103)에는 일시적인 계산 데이터, 세포 배양 장치의 제어 장치(350)의 표시 장치(500)로의 표시 데이터, 세포 배양 장치의 제어 장치(350)의 입력 장치(400)를 통하여 입력된 각종 데이터 등이 일시적으로 저장된다.
불휘발성 메모리(104)에는, 예를 들면 도시하지 않은 배터리로 백업된 SRAM(Static Random Access Memory), SSD(Solid State Drive) 등을 이용하여, 광원(10)으로부터 취득된 데이터, 촬상 장치(20)로부터 취득된 데이터, 스테이지(30)로부터 취득된 데이터, 입력 장치(50)로부터 입력된 데이터 등이 기억된다. 불휘발성 메모리(104)에 기억된 데이터, 프로그램 등은, 이용 시에는 RAM(103)에 전개되어도 된다. 또, ROM(102)에는, 촬상 장치(20)로부터 취득된 화상 데이터를 화상 해석을 위하여 필요해지는 각종 알고리즘, 그 외의 필요해지는 처리를 실행하기 위한 시스템 프로그램 등이 미리 기입되어 있다.
도 19는, 도 10에 나타나는 생세포 농도 측정 장치의 처리의 일례를 나타내는 블록도이다. 도 19에 나타낸 각 기능 블록은, 도 10에 나타나는 제어부(106)에 구비되는 CPU(101)가 시스템 프로그램을 실행하고, 생세포 농도 측정 장치(200)의 각 부의 동작을 제어함으로써 실현된다.
제어부(106)는, 불휘발성 메모리(104)에 기억된 촬상용 프로그램에 근거하여, 광원(10), 촬상 장치(20) 및 스테이지(30)를 제어하여, 세포(C)를 촬상한다. 제어부(106)는, 광원(10)을 점등하여 세포(C)에 광을 조사하고, 세포(세포 현탁액)(C)를 유지하는 유지 용기(40)를 이동시켜 초점면을 변화시키도록 스테이지(30)를 구동한다. 제어부(106)는, 소정의 초점면에 스테이지(30)를 이동시킨 후, 촬상 장치(20)에 대하여 촬상 동작을 지령한다. 제어부(106)는, 촬상용 프로그램에 따라, 광이 조사된 세포의 광이 조사된 측과는 반대의 방향으로부터, 세포의 포커싱면을 포함하는 복수의 초점면에서 세포를 촬상한다.
화상 취득부(107)는, 촬상 장치(20)가 촬상한 목적 세포의 화상을 취득한다. 화상 취득부(107)가 취득하는 목적 세포의 화상은, 하나의 목적 세포를 촬상하여 얻어진 복수의 화상을 1세트의 화상 데이터군으로서 정리하여 관리해도 된다.
화상편 취득부(108)는, 화상 취득부(107)에서 취득한 목적 세포의 화상에 화상 처리를 행하고, 목적 세포의 화상으로부터 목적 세포의 중심부 및 외주부를 포함하는 화상편을 취득한다. 화상편 취득부(108)가 취득하는 화상편은, 하나의 목적 세포를 촬상하여 얻어진 복수의 화상편을 1세트의 화상편 데이터군으로서 정리하여 관리해도 된다.
해석용 연결 화상 작성부(109)는, 화상편 취득부(108)에서 얻어진 화상편에 화상 처리를 행하고, 상기 초점면의 촬상 방향의 순서로 화상편을 연결하여, 해석용 연결 화상을 작성한다.
특징량 추출부(110)는, 해석용 연결 화상 작성부(109)에서 얻어진 해석용 연결 화상에 화상 처리를 행하고, 해석용 연결 화상으로부터 특징량을 추출한다.
생사 판정부(111)는, 특징량 추출부(110)에서 추출된 해석용 연결 화상의 특징량과, 미리 정해진 특징량의 범위에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행한다. 다른 실시형태에 있어서, 생사 판정부(111)는, 특징량 추출부(110)에서 추출된 해석용 연결 화상의 특징량과, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 목적 세포의 생사 판정을 행한다.
생세포 농도 결정부(112)는, 생사 판정 결과, 즉, 생세포라고 판정된 해석용 연결 화상의 수에 근거하여, 목적 세포의 생세포 농도를 결정한다. 생세포 농도 결정부(112)는, 목적 세포의 생세포 농도를, 세포 배양 장치의 제어 장치(350)를 통하여 표시 장치(500)에 출력한다.
세포 생존율 결정부(113)는, 생사 판정 결과, 즉, 생세포라고 판정된 해석용 연결 화상의 수와 해석용 연결 화상의 총수에 근거하여, 세포 생존율을 결정한다. 세포 생존율 결정부(113)는, 세포 생존율을, 세포 배양 장치의 제어 장치(350)를 통하여 표시 장치(500)에 출력한다.
(양태 2의 생세포 농도 측정 장치)
양태 2의 생세포 농도 측정 장치는,
목적 세포를 촬상하는 디지털 홀로그래픽 현미경,
목적 세포의 위상 이미지를 취득하는 위상 이미지 취득부,
상기 위상 이미지의 위상량 분포와, 미리 정해진 위상량 분포에 근거하여, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정을 행하는 생사 판정부, 및
생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 결정하는 생세포 농도 결정부를 구비한다.
생세포에는, 렌즈 효과의 근원이 되는 세포 내부와 세포 주위의 굴절률차가 있으며, 굴절률 분포도 갖는다. 한편, 사세포는, 세포막이 찢어져 있기 때문에 세포 현탁액의 액체 매질이 세포 내부에 유입하여 세포 주위와의 굴절률차가 작고 굴절률 분포도 작다. 내부 굴절률은 위상량으로서 검출할 수 있기 때문에, 디지털 홀로그래픽 현미경에 의하여 얻어진 목적 세포의 위상 이미지는, 생세포에 특유의 위상량 분포를 갖는다.
그 때문에, 생사가 불명한 목적 세포의 위상 이미지의 위상량 분포와, 미리 정해진 위상량 분포의 범위에 근거하여, 목적 세포의 생사 판정을 행할 수 있다.
또, 양태 2의 세포 배양 장치는, 세포의 광학적 성질을 이용하고 있기 때문에, 염색 시약을 이용하지 않고, 보다 간편하게 생세포 농도의 조정을 행할 수 있다.
양태 2의 생세포 농도 측정 장치의 제어부에 대해서도, 양태 1에 대하여 예시한 것과 동일하게, 적절히 설계해도 된다.
양태 2의 생세포 농도 측정 장치에 있어서의 위상 이미지 취득부, 생사 판정부 및 생세포 농도 결정부는 각각, 이후에 상세를 설명하는 양태 2의 생세포 농도 측정 공정의 위상 이미지 취득 공정, 생사 판정 공정 및 생세포 농도 결정 공정에 대응한다.
디지털 홀로그래픽 현미경에 의하여, 목적 세포를 촬상한다. 위상 이미지 취득부는, 촬상된 목적 세포의 위상 이미지를 취득한다.
이상, 양태 1 및 양태 2의 생세포 농도 측정 장치에 대하여 설명했지만, 그 외의 상세한 것에 대해서는, 생세포 농도 조정 방법에 대하여 후술하는 바와 같다.
[제어 장치]
제어 장치는, 생세포 농도 및 세포 현탁액의 액량 데이터를 유지하여 제어한다.
제어 장치는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정한다. 그리고, 제어 장치는, 액량의 세포 현탁액과 액량의 희석액을 혼합부로 송액하고, 희석된 세포 현탁액을 파종한다.
[혼합부]
혼합부는, 세포 현탁액과 희석액을 혼합한다.
어느 실시형태에 있어서, 혼합부는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여 결정된 액량의 세포 현탁액 및 희석액을 혼합하는 용기여도 된다. 혼합부인 용기는, 예를 들면, 교반기 등의 혼합 기구, 혼합부를 요동 가능한 요동 기구 등을 구비해도 된다. 희석된 세포 분산액은 배양 용기로 송액된다.
요동의 양태로서, 예를 들면, 회전시키는 것, 상하 방향으로 흔드는 것, 횡방향으로 흔드는 것 등을 들 수 있다.
요동 기구는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 캠 기구, 링크 기구, 직동 기구를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 다관절 로봇, 단축 로봇, 직동 실린더의 조합, 셰이커 등을 들 수 있다.
요동의 양태 및 요동 기구에 대하여, 본 개시의 다른 설명에 있어서도 동일하다.
다른 실시형태에 있어서, 혼합부는, 배양 용기를 겸해도 된다. 즉, 배양 용기는, 세포 현탁액 및 희석액을 혼합하는 기능을 구비해도 된다.
혼합부가 배양 용기를 겸하는 경우, "세포 배양액 및 희석액을 혼합부로 송액한다"란, 세포 배양액 및 희석액을, 혼합부를 겸한 배양 용기로 송액하는 것을 의미한다.
혼합부가 배양 용기를 겸하는 경우, 혼합부는, 예를 들면, 배양 용기를 요동 가능한 요동 기구여도 된다. 이로써, 세포 현탁액과 희석액을 혼합하면서, 희석된 세포 현탁액을 파종할 수 있다. 요동의 양태로서, 예를 들면, 회전시키는 것, 상하 방향으로 흔드는 것, 횡방향으로 흔드는 것 등을 들 수 있다.
혼합부는, 부유 배양 장치인 배양 용기를 겸해도 된다. 혼합부가 부유 배양 장치인 배양 용기를 겸하는 경우, 혼합부는, 예를 들면, 희석된 세포 현탁액을 순환 가능한 순환 기구여도 된다. 부유 배양 장치는, 세포를 순환시킴으로써 세포를 부유시키면서 배양하는 것이 가능한 배양 장치이다. 이로써, 세포 현탁액과 희석액을 혼합하면서, 희석된 세포 현탁액을 파종할 수 있다. 순환 기구로서, 예를 들면, 교반 기구 등을 들 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 혼합부는, 제2 용기를 겸해도 된다. 즉, 제2 용기는, 세포 현탁액 및 희석액을 혼합하는 기능을 구비해도 된다.
혼합부가 배양 용기를 겸하는 경우, "세포 배양액 및 희석액을 혼합부로 송액한다"란, 세포 배양액을, 혼합부를 겸하고, 또한, 희석액을 유지하는 배양 용기로 송액하는 것을 의미한다.
혼합부의 재질, 형상 등은 특별히 한정되지 않고, 세포 배양 장치의 구성을 고려하여 적절히 선택해도 된다.
[배양 용기]
배양 용기는, 희석된 세포 현탁액을 파종하여 세포 배양을 행하는 것이다.
배양 용기는, 파종을 보다 용이하게 하기 위하여, 배양 용기를 요동 가능한 요동 기구를 구비해도 된다.
배양 용기는, 다층 배양 용기여도 된다. 다층 배양 용기는, 세포를 파종하여 배양하는 것이 가능한 층을 복수 구비하는 배양 용기이다.
또, 상술한 바와 같이, 배양 용기는, 혼합부를 겸한 부유 배양 장치여도 된다.
세포 배양 장치는, 제1 용기, 제2 용기, 생세포 농도 측정 장치, 제어 장치, 혼합부(330) 및 배양 용기를 연결하는 유로를 구비한다. 또한, 본 개시에 있어서, 도면을 간결하게 하기 위하여, 유로에 대해서는 부호를 붙이지 않았다.
세포 배양 장치는, 유로 중에, 밸브, 펌프, 유량계 등을 구비해도 된다. 밸브의 개폐도의 조정, 펌프의 출력의 조정 등을 행함으로써, 유로 중의 유량을 제어하는 것이 보다 용이해진다. 또, 유량계를 이용함으로써, 유로 중의 원하는 위치에서 유량을 용이하게 파악할 수 있다.
밸브는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 핀치 밸브여도 된다. 또, 펌프는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 페리스타 펌프여도 된다.
세포 배양 장치는, 생세포 농도의 측정에 이용한 세포 현탁액을 폐기하기 위한 폐액 용기를 구비해도 된다. 폐액 용기는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 가방, 보틀, 시린지 등을 들 수 있다.
세포 배양 장치는, 데이터를 입력하기 위한 입력 장치, 그리고 생세포 농도 측정 장치로부터 취득한 생세포 농도, 희석된 세포 현탁액의 생세포 농도 등을 표시하기 위한 표시 장치를 구비해도 된다.
(실시형태 1)
이하, 도 1에 나타나는 세포 배양 장치(300)를 예로서, 본 개시에 관한 세포 배양 장치를 보다 구체적으로 설명한다.
도 1에 나타나는 세포 배양 장치(300)는, 제1 용기(310), 제2 용기(320), 생세포 농도 측정 장치(200), 제어 장치(350), 혼합부(330) 및 배양 용기(340)를 구비하고 있다. 또한, 세포 배양 장치(300)는, 입력 장치(400), 및 표시 장치(500)를 구비하고 있다
제1 용기(310)와 혼합부(330)가, 밸브(362) 및 펌프(372)를 통하여 유로로 연결되어 있다. 또, 제2 용기(320)와 혼합부(330)가, 밸브(363) 및 펌프(373)를 통하여 유로로 연결되어 있다. 또, 혼합부(330)와 배양 용기(340)가, 밸브(360) 및 펌프(370)를 통하여 유로로 연결되어 있다.
제1 용기(310)와 생세포 농도 측정 장치(200)가, 밸브(361) 및 펌프(371)를 통하여 유로로 연결되어 있다. 또, 생세포 농도 측정 장치(200)는, 제1 용기(310)와 혼합부(330)의 사이의 유로로부터 분기된 유로에 배치되어 있다. 또, 폐액 용기(380)가 생세포 농도 측정 장치(200)에 연결되어 있다.
세포 배양 장치는, 데이터를 입력하기 위한 입력 장치, 및 생세포 농도의 측정 결과 등을 표시하기 위한 표시 장치를 구비해도 된다. 입력 장치로서, 예를 들면, 키보드를 이용할 수 있고, 표시 장치로서 예를 들면, 모니터를 이용할 수 있다.
제어 장치(350)는, 제1 용기(310), 제2 용기(320), 혼합부(330), 배양 용기(340), 밸브(360)~밸브(363), 펌프(371)~펌프(373), 생세포 농도 측정 장치(200), 입력 장치(400), 및 표시 장치(500)와 통신 가능하도록 접속되어 있다.
도 2는, 도 1에 나타나는 세포 배양 장치(300)를 구성하는 제어 장치(350)의 일례를 나타내는 블록도이다. 제어 장치(350)가 구비하는 CPU(Central Processing Unit)(351)는, 세포 배양 장치(300)를 전체적으로 제어하는 프로세서이다. CPU(351)는, ROM(Read Only Memory)(352)에 저장된 시스템 프로그램을, 버스(355)를 통하여 독출하고, 시스템 프로그램에 따라 세포 배양 장치(300)의 전체를 제어한다. RAM(Random Access Memory)(353)에는 일시적인 계산 데이터, 표시 장치(500)로의 표시 데이터, 입력 장치(400)를 통하여 입력된 각종 데이터 등이 일시적으로 저장된다.
불휘발성 메모리(354)에는, 예를 들면 도시하지 않은 배터리로 백업된 SRAM(Static Random Access Memory), SSD(Solid State Drive) 등을 이용하고, 제1 용기(310)로부터 취득된 세포 현탁액의 액량 데이터 등의 데이터, 제2 용기(320)로부터 취득된 희석액의 액량 데이터 등의 데이터, 및 생세포 농도 측정 장치(200)로부터 취득된 생세포 농도 등의 데이터가 기억된다. 또, 불휘발성 메모리(354)에는, 혼합부(330)로부터 취득된 데이터, 배양 용기(340)로부터 취득된 데이터, 밸브(360)~밸브(363)로부터 취득된 데이터, 펌프(371)~펌프(373)로부터 취득된 데이터, 입력 장치(400)로부터 입력된 데이터 등이 기억된다. 불휘발성 메모리(354)에 기억된 데이터, 프로그램 등은, 이용 시에는 RAM(353)에 전개되어도 된다. 또, ROM(352)에는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정하기 위하여 필요로 하는 각종 알고리즘, 그 외의 필요로 하는 처리를 실행하기 위한 시스템 프로그램 등이 미리 기입되어 있다.
세포 배양 장치(300)를 예로서, 이하의 세포 배양예 1 및 세포 배양예 2를 설명한다.
-세포 배양예 1-
제어 장치(350)는, 밸브(361)를 개방하여 펌프(371)를 구동하고, 제1 용기(310)로부터 생세포 농도 측정 장치(200)에 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(361)를 폐쇄하여 펌프(371)를 정지시킨다.
생세포 농도 측정 장치(200)로 세포 현탁액의 생세포 농도가 측정되고, 측정에 사용된 세포 현탁액은 폐액 용기(380)로 배출된다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도 측정 장치(200)로부터 세포 현탁액의 생세포 농도를 취득하고, 또, 제1 용기(310)로부터 세포 현탁액의 액량 데이터를 취득한다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정한다.
제어 장치(350)는, 밸브(362)를 개방하여 펌프(372)를 구동하고, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(362)를 폐쇄하여 펌프(372)를 정지시킨다.
또, 제어 장치(350)는, 밸브(363)를 개방하여 펌프(373)를 구동하고, 제2 용기(320)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 희석액을 송액한 후, 밸브(363)를 폐쇄하여 펌프(373)를 정지시킨다.
제어 장치(350)는, 혼합부(330)에 구비된 혼합 기구(도시하지 않음)를 구동하고, 세포 현탁액과 희석액을 혼합하여, 세포 현탁액을 희석한다.
제어 장치(350)는, 밸브(360)를 개방하여 펌프(370)를 구동하고, 혼합부(330)로부터 배양 용기(340)에 희석된 세포 현탁액을 송액하여, 배양 용기(340)에 파종한다.
-세포 배양예 2-
제어 장치(350)는, 밸브(361)를 개방하여 펌프(371)를 구동함과 동시에, 밸브(362)를 개방하여 펌프(372)를 구동한다. 이로써, 제어 장치(350)는, 제1 용기(310)로부터 생세포 농도 측정 장치(200)에 세포 현탁액을 송액하면서, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)를 향하여 세포 현탁액의 송액을 개시한다. 제어 장치(350)는, 생세포 농도 측정 장치(200)에 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(361)를 폐쇄하여 펌프(371)를 정지시킨다.
제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에 세포 현탁액이 도달할 때까지의 송액 시간의 적어도 일부의 시간에 있어서, 생세포 농도 측정 장치(200)에서 세포 현탁액의 생세포 농도가 측정된다. 측정에 사용된 세포 현탁액은 폐액 용기(380)로 배출된다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도 측정 장치(200)로부터 세포 현탁액의 생세포 농도를 취득하고, 또, 제1 용기(310)로부터 세포 현탁액의 액량 데이터를 취득한다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정한다.
제어 장치(350)는, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(362)를 폐쇄하여 펌프(372)를 정지시킨다.
또, 제어 장치(350)는, 밸브(363)를 개방하여 펌프(373)를 구동하고, 제2 용기(320)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 희석액을 송액한 후, 밸브(363)를 폐쇄하여 펌프(373)를 정지시킨다.
이상과 같이, 생세포 농도를 측정하면서, 세포 분산액을 혼합부(330)를 향하여 송액함으로써, 생세포 농도를 보다 신속히 조정할 수 있다.
세포 배양예 1과 동일하게 하여, 혼합부(330)에서 세포 현탁액을 희석한 후, 희석된 세포 현탁액을 배양 용기(340)에 파종한다.
(실시형태 2)
다른 실시형태에 있어서, 세포 배양 장치(300A)는, 세포 배양 장치(300)와는 달리, 도 3에 나타나는 바와 같이, 생세포 농도 측정 장치(200)가 제1 용기(310)와 혼합부(330)의 사이의 유로에 배치되어 있다.
세포 배양 장치(300A)를 예로서, 이하의 세포 배양예 3 및 세포 배양예 4를 설명한다.
-세포 배양예 3-
제어 장치(350)는, 밸브(362)를 개방하여 펌프(372)를 구동하고, 제1 용기(310)로부터 생세포 농도 측정 장치(200)로 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(362)를 폐쇄하여 펌프(372)를 정지시킨다.
생세포 농도 측정 장치(200)로 세포 현탁액의 생세포 농도가 측정된 후, 제어 장치(350)는, 생세포 농도 측정 장치(200)로부터 세포 현탁액의 생세포 농도를 취득하고, 또, 제1 용기(310)로부터 세포 현탁액의 액량 데이터를 취득한다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정한다.
제어 장치(350)는, 밸브(362)를 개방하여 펌프(372)를 구동하고, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(362)를 폐쇄하여 펌프(372)를 정지시킨다.
또, 제어 장치(350)는, 밸브(363)를 개방하여 펌프(373)를 구동하고, 제2 용기(320)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 희석액을 송액한 후, 밸브(363)를 폐쇄하여 펌프(373)를 정지시킨다.
세포 배양예 1과 동일하게 하여, 혼합부(330)에서 세포 현탁액을 희석한 후, 희석된 세포 현탁액을 배양 용기(340)에 파종한다.
-세포 배양예 4-
제어 장치(350)는, 밸브(362)를 개방하여 펌프(372)를 구동하고, 제1 용기(310)로부터 생세포 농도 측정 장치(200)에 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(362)의 폐쇄 및 펌프(372)의 정지를 하지 않고, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)를 향하여 세포 현탁액의 송액을 개시한다.
제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에 세포 현탁액이 도달할 때까지의 송액 시간의 적어도 일부의 시간에 있어서, 생세포 농도 측정 장치(200)에서 세포 현탁액의 생세포 농도가 측정된다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도 측정 장치(200)로부터 세포 현탁액의 생세포 농도를 취득하고, 또, 제1 용기(310)로부터 세포 현탁액의 액량 데이터를 취득한다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정한다.
제어 장치(350)는, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(362)를 폐쇄하여 펌프(372)를 정지시킨다.
또, 제어 장치(350)는, 밸브(363)를 개방하여 펌프(373)를 구동하고, 제2 용기(320)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 희석액을 송액한 후, 밸브(363)를 폐쇄하여 펌프(373)를 정지시킨다.
이상과 같이, 생세포 농도를 측정하면서, 세포 분산액을 혼합부(330)를 향하여 송액함으로써, 생세포 농도를 보다 신속히 조정할 수 있다.
세포 배양예 1과 동일하게 하여, 혼합부(330)에서 세포 현탁액을 희석한 후, 희석된 세포 현탁액을 배양 용기(340)에 파종한다.
(실시형태 3)
다른 실시형태에 있어서, 세포 배양 장치(300B)는, 세포 배양 장치(300)와는 달리, 도 4에 나타나는 바와 같이, 제1 용기(310)와 혼합부(330)의 사이, 및 제2 용기(320)와 혼합부(330)의 사이에, 단일의 펌프(372)가 배치되어 있다.
세포 배양 장치(300B)를 예로서, 이하의 세포 배양예 5를 설명한다.
-세포 배양예 5
제어 장치(350)는, 밸브(361)를 개방하여 펌프(371)를 구동하고, 제1 용기(310)로부터 생세포 농도 측정 장치(200)에 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(361)를 폐쇄하여 펌프(371)를 정지시킨다.
생세포 농도 측정 장치(200)로 세포 현탁액의 생세포 농도가 측정되고, 측정에 사용된 세포 현탁액은 폐액 용기(380)로 배출된다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도 측정 장치(200)로부터 세포 현탁액의 생세포 농도를 취득하고, 또, 제1 용기(310)로부터 세포 현탁액의 액량 데이터를 취득한다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정한다.
제어 장치(350)는, 밸브(362) 및 밸브(364)를 개방하여 펌프(372)를 구동하고, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액을 송액함과 동시에, 제2 용기(320)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 희석액을 송액한다. 그 후, 제어 장치(350)는, 밸브(362) 및 밸브(364)를 폐쇄하여 펌프(372)를 정지시킨다.
세포 배양예 1과 동일하게 하여, 혼합부(330)에서 세포 현탁액을 희석한 후, 희석된 세포 현탁액을 배양 용기(340)에 파종한다.
-세포 배양예 6-
제어 장치(350)는, 밸브(361)를 개방하여 펌프(371)를 구동함과 동시에, 밸브(362) 및 밸브(364)를 개방하여 펌프(372)를 구동한다. 이로써, 제어 장치(350)는, 제1 용기(310)로부터 생세포 농도 측정 장치(200)에 세포 현탁액을 송액하면서, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)를 향하여 세포 현탁액의 송액을 개시하고, 또한, 제2 용기(320)로부터 혼합부(330)를 향하여 희석액의 송액을 개시한다. 제어 장치(350)는, 생세포 농도 측정 장치(200)에 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(361)를 폐쇄하여 펌프(371)를 정지시킨다.
제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에 세포 현탁액이 도달할 때까지의 송액 시간의 적어도 일부의 시간에 있어서, 생세포 농도 측정 장치(200)에서 세포 현탁액의 생세포 농도가 측정된다. 측정에 사용된 세포 현탁액은 폐액 용기(380)로 배출된다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도 측정 장치(200)로부터 세포 현탁액의 생세포 농도를 취득하고, 또, 제1 용기(310)로부터 세포 현탁액의 액량 데이터를 취득한다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정한다.
제어 장치(350)는, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액을 송액하고, 또한, 제2 용기(320)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 희석액을 송액한 후, 밸브(362) 및 밸브(340)를 폐쇄하여 펌프(372)를 정지시킨다.
이상과 같이, 생세포 농도를 측정하면서, 세포 분산액을 혼합부(330)를 향하여 송액함으로써, 생세포 농도를 보다 신속히 조정할 수 있다.
세포 배양예 1과 동일하게 하여, 혼합부(330)에서 세포 현탁액을 희석한 후, 희석된 세포 현탁액을 배양 용기(340)에 파종한다.
(실시형태 4)
다른 실시형태에 있어서, 세포 배양 장치(300C)는, 세포 배양 장치(300)와는 달리, 도 5에 나타나는 바와 같이, 생세포 농도 측정 장치(200)가 제1 용기(310)와 혼합부(330)의 사이의 유로에 배치되어 있다. 또, 제1 용기(310)와 혼합부(330)의 사이, 및 제2 용기(320)와 혼합부(330)의 사이에, 단일 펌프(372)가 배치되어 있다.
세포 배양 장치(300C)를 예로서, 이하의 세포 배양예 7 및 세포 배양예 8을 설명한다.
-세포 배양예 7-
제어 장치(350)는, 밸브(362)를 개방하여 펌프(372)를 구동하고, 제1 용기(310)로부터 생세포 농도 측정 장치(200)로 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(362)를 폐쇄하여 펌프(372)를 정지시킨다.
생세포 농도 측정 장치(200)로 세포 현탁액의 생세포 농도가 측정된 후, 제어 장치(350)는, 생세포 농도 측정 장치(200)로부터 세포 현탁액의 생세포 농도를 취득하고, 또, 제1 용기(310)로부터 세포 현탁액의 액량 데이터를 취득한다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정한다.
제어 장치(350)는, 밸브(362) 및 밸브(364)를 개방하여 펌프(372)를 구동하고, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액을 송액함과 동시에, 제2 용기(320)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 희석액을 송액한다. 그 후, 제어 장치(350)는, 밸브(362) 및 밸브(364)를 폐쇄하여 펌프(372)를 정지시킨다.
세포 배양예 1과 동일하게 하여, 혼합부(330)에서 세포 현탁액을 희석한 후, 희석된 세포 현탁액을 배양 용기(340)에 파종한다.
-세포 배양예 8-
제어 장치(350)는, 밸브(362)를 개방하여 펌프(372)를 구동하고, 제1 용기(310)로부터 생세포 농도 측정 장치(200)에 세포 현탁액을 송액한 후, 밸브(362)의 폐쇄 및 펌프(372)의 정지를 하지 않고, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)를 향하여 세포 현탁액의 송액을 개시한다.
제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에 세포 현탁액이 도달할 때까지의 송액 시간의 적어도 일부의 시간에 있어서, 생세포 농도 측정 장치(200)에서 세포 현탁액의 생세포 농도가 측정된다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도 측정 장치(200)로부터 세포 현탁액의 생세포 농도를 취득하고, 또, 제1 용기(310)로부터 세포 현탁액의 액량 데이터를 취득한다.
제어 장치(350)는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정한다.
제어 장치(350)는, 밸브(364)를 개방하고, 제1 용기(310)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액을 송액함과 동시에, 제2 용기(320)로부터 혼합부(330)에, 상기 결정된 액량의 희석액을 송액한다. 그 후, 제어 장치(350)는, 밸브(362) 및 밸브(364)를 폐쇄하여 펌프(372)를 정지시킨다.
이상과 같이, 생세포 농도를 측정하면서, 세포 분산액을 혼합부(330)를 향하여 송액함으로써, 생세포 농도를 보다 신속히 조정할 수 있다.
세포 배양예 1과 동일하게 하여, 혼합부(330)에서 세포 현탁액을 희석한 후, 희석된 세포 현탁액을 배양 용기(340)에 파종한다.
(실시형태 5)
다른 실시형태에 있어서, 세포 배양 장치(300D)는, 세포 배양 장치(300)와는 달리, 도 6에 나타나는 바와 같이, 배양 용기(340)가 혼합부(330)를 겸한 부유 배양 장치이다. 배양 용기(340)는, 희석된 세포 현탁액을 순환 가능한 순환 기구(도시하지 않음)를 구비하고 있다.
세포 배양 장치(300D)를 예로서, 이하의 세포 배양예 9 및 세포 배양예 10을 설명한다.
-세포 배양예 9-
세포 배양예 1과 동일하게 하여, 생세포 농도 측정 장치(200)로 생세포 농도를 측정하고, 세포 현탁액 및 희석액의 액량을 결정한 후, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액 및 희석액을 배양 용기(340)(혼합부(330))로 송액한다.
제어 장치(350)는, 배양 용기(340)에 구비된 순환 기구를 구동하여, 세포 현탁액과 희석액을 혼합하면서, 희석된 세포 현탁액을 파종한다.
-세포 배양예 10-
세포 배양예 2와 동일하게 하여, 생세포 농도 측정 장치(200)로 생세포 농도를 측정하고, 세포 현탁액 및 희석액의 액량을 결정한 후, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액 및 희석액을 배양 용기(340)(혼합부(330))로 송액한다.
제어 장치(350)는, 배양 용기(340)에 구비된 순환 기구를 구동하여, 세포 현탁액과 희석액을 혼합하면서, 희석된 세포 현탁액을 파종한다.
(실시형태 6)
다른 실시형태에 있어서, 세포 배양 장치(300E)는, 세포 배양 장치(300A)와는 달리, 도 7에 나타나는 바와 같이, 배양 용기(340)가 혼합부(330)를 겸하고 있고, 배양 용기(340)는, 배양 용기(340)를 요동 가능한 요동 기구(도시하지 않음)를 구비하고 있다.
세포 배양 장치(300E)를 예로서, 이하의 세포 배양예 11 및 세포 배양예 12를 설명한다.
-세포 배양예 11-
세포 배양예 3과 동일하게 하여, 생세포 농도 측정 장치(200)로 생세포 농도를 측정하고, 세포 현탁액 및 희석액의 액량을 결정한 후, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액 및 희석액을 배양 용기(340)(혼합부(330))로 송액한다.
제어 장치(350)는, 배양 용기(340)에 구비된 요동 기구를 구동하여, 세포 현탁액과 희석액을 혼합하면서, 희석된 세포 현탁액을 파종한다.
-세포 배양예 12-
세포 배양예 4와 동일하게 하여, 생세포 농도 측정 장치(200)로 생세포 농도를 측정하고, 세포 현탁액 및 희석액의 액량을 결정한 후, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액 및 희석액을 배양 용기(340)(혼합부(330))로 송액한다.
제어 장치(350)는, 배양 용기(340)에 구비된 요동 기구를 구동하여, 세포 현탁액과 희석액을 혼합하면서, 희석된 세포 현탁액을 파종한다.
(실시형태 7)
다른 실시형태에 있어서, 세포 배양 장치(300F)는, 세포 배양 장치(300)와는 달리, 도 8에 나타나는 바와 같이, 제2 용기(320)가 혼합부(330)를 겸하고 있다. 제2 용기(320)는, 혼합 기구(도시하지 않음)를 구비하고 있다.
세포 배양 장치(300F)를 예로서, 이하의 세포 배양예 13을 설명한다.
-세포 배양예 13-
세포 배양예 1과 동일하게 하여, 생세포 농도 측정 장치(200)로 생세포 농도를 측정하고, 세포 현탁액 및 희석액의 액량을 결정한다.
제어 장치(350)는, 제2 용기(320)에 유지되어 있는 희석액이 상기 결정된 액량보다 많은 경우, 밸브(365)를 개방하여 펌프(370)를 구동하고, 과잉인 희석액을 폐액 용기(381)로 송액한 후, 밸브(365)를 폐쇄하여 펌프(370)를 정지시킨다. 이로써, 상기 결정된 액량의 희석액이 제2 용기(320)에 잔존한다.
제어 장치(350)는, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액을 제2 용기(320)(혼합부(330))로 송액한다. 제2 용기(320)에 구비된 혼합 기구(도시하지 않음)를 구동하고, 세포 현탁액과 희석액을 혼합하여, 세포 현탁액을 희석한다.
제어 장치(350)는, 밸브(360)를 개방하여 펌프(370)를 구동하고, 제2 용기(320)로부터 배양 용기(340)에 희석된 세포 현탁액을 송액하여, 배양 용기(340)에 파종한다.
(실시형태 8)
다른 실시형태에 있어서, 세포 배양 장치(300G)는, 세포 배양 장치(300A)와는 달리, 도 9에 나타나는 바와 같이, 제2 용기(320)가 혼합부(330)를 겸하고 있다. 제2 용기(320)는, 혼합 기구(도시하지 않음)를 구비하고 있다.
세포 배양 장치(300G)를 예로서, 이하의 세포 배양예 14를 설명한다.
-세포 배양예 14-
세포 배양예 3과 동일하게 하여, 생세포 농도 측정 장치(200)로 생세포 농도를 측정하고, 세포 현탁액 및 희석액의 액량을 결정한다.
제어 장치(350)는, 제2 용기(320)에 유지되어 있는 희석액이 상기 결정된 액량보다 많은 경우, 밸브(365)를 개방하여 펌프(370)를 구동하고, 과잉인 희석액을 폐액 용기(381)로 송액한 후, 밸브(365)를 폐쇄하여 펌프(370)를 정지시킨다. 이로써, 상기 결정된 액량의 희석액이 제2 용기(320)에 잔존한다.
제어 장치(350)는, 상기 결정된 액량의 세포 현탁액을 제2 용기(320)(혼합부(330))로 송액한다. 제2 용기(320)에 구비된 혼합 기구(도시하지 않음)를 구동하고, 세포 현탁액과 희석액을 혼합하여, 세포 현탁액을 희석한다.
제어 장치(350)는, 밸브(360)를 개방하여 펌프(370)를 구동하고, 제2 용기(320)로부터 배양 용기(340)에 희석된 세포 현탁액을 송액하여, 배양 용기(340)에 파종한다.
실시형태 1, 실시형태 3, 실시형태 5 및 실시형태 7(도 1, 도 4, 도 6 및 도 8)에 있어서, 생세포 농도 측정에 이용되는 세포 현탁액은, 펌프(371)에 의하여 제1 용기(310)로부터 생세포 농도 측정 장치(200)로 송액되고, 측정에 사용된 세포 현탁액은 폐액 용기(380)로 배출된다.
다른 실시형태에 있어서, 폐액 용기(380)로서 시린지를 이용하고, 시린지 펌프(도시하지 않음)로 구동함으로써, 세포 현탁액을 생세포 농도 측정 장치(200)로 송액하며, 또한, 측정에 사용된 세포 현탁액을 회수할 수 있다.
이상과 같이 하여, 본 개시에 관한 세포 배양 장치에 의하여, 목적 세포의 생세포 농도를 신속히 조정할 수 있다.
<생세포 농도 조정 방법>
본 개시에 관한 생세포 농도 조정 방법은,
세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포에 대하여 개별적으로 생사 판정을 행함으로써, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 측정하는 공정(이하, "생세포 농도 측정 공정"이라고 부르는 경우가 있다),
생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조제하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정하는 공정(이하, "액량 결정 공정"이라고 부르는 경우가 있다), 및
상기 액량의 세포 현탁액과 상기 액량의 희석액을 혼합하는 공정(이하, "희석 공정"이라고 부르는 경우가 있다)을 포함한다.
이하, 각 공정의 상세를 설명한다.
[생세포 농도 측정 공정]
생세포 농도 측정 공정에서는, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포에 대하여 개별적으로 생사 판정을 행함으로써, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 측정한다.
생세포 농도의 측정을 행하는 방법은, 특별히 한정되지 않는다.
예를 들면, 상세를 후술하는 바와 같이, 목적 세포의 복수의 화상으로부터 얻어지는 연결 화상을 해석함으로써, 목적 세포의 생사 판정을 행하고, 생세포 농도의 측정을 행하는 공정(이하, "양태 1의 생세포 농도 측정 공정"이라고 부르는 경우가 있다)을 들 수 있다.
또, 예를 들면, 디지털 홀로그래픽 현미경으로 촬상한 목적 세포의 위상 이미지를 해석함으로써, 목적 세포의 생사 판정을 행하고, 생세포 농도의 측정을 행하는 공정(이하, "양태 2의 생세포 농도 측정 공정"이라고 부르는 경우가 있다)을 들 수 있다.
이하, 양태 1 및 양태 2의 생세포 농도 측정 공정에 대하여 구체적으로 설명한다.
(양태 1의 생세포 농도 측정 공정)
양태 1의 생세포 농도 측정 공정은,
광이 조사된 목적 세포의 광이 조사된 측과는 반대의 방향으로부터, 목적 세포의 포커싱면을 포함하는 복수의 초점면에서 촬상된, 목적 세포의 화상을 취득하는 공정(이하, "화상 취득 공정"이라고 부르는 경우가 있다),
각 화상으로부터, 목적 세포의 중심부 및 외주부를 포함하는 화상편을 취득하는 공정(이하, "화상편 취득 공정"이라고 부르는 경우가 있다),
초점면의 촬상 방향의 순서로 화상편을 연결하여, 해석용 연결 화상을 작성하는 공정(이하, "해석용 연결 화상 작성 공정"이라고 부르는 경우가 있다),
해석용 연결 화상으로부터 특징량을 추출하는 공정(이하, "특징량 추출 공정"이라고 부르는 경우가 있다),
해석용 연결 화상의 특징량과, 미리 정해진 특징량의 범위에 근거하여, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정을 행하는 공정(이하, "생사 판정 공정"이라고 부르는 경우가 있다), 및
생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 결정하는 공정(이하, "생세포 농도 결정 공정"이라고 부르는 경우가 있다)을 포함한다.
해석용 연결 화상의 작성 조건(촬상 조건 등)은, 특별히 설명하지 않는 한, 적어도, 목적 세포의 생사 판정 및 목적 세포의 식별이 가능한 한도에서, 참조용 연결 화상의 작성 조건과 동일하게 한다. 또, 다른 해석용 연결 화상끼리를 비교하는 경우에도, 적어도, 목적 세포의 생사 판정 및 목적 세포의 식별에 관하여 비교가 가능한 한도에서, 이들 해석용 연결 화상의 작성 조건을 동일하게 한다.
-화상 취득 공정-
화상 취득 공정에서는, 광이 조사된 목적 세포의 광이 조사된 측과는 반대의 방향으로부터, 목적 세포의 포커싱면 또는 그 근방의 초점면을 포함하는 복수의 초점면에서 촬상된, 목적 세포의 화상을 취득한다.
목적 세포의 화상은, 세포 현탁액을 촬상 장치로 촬상함으로써 취득할 수 있다.
초점면을 변화시키는 수단은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 목적 세포와 촬상 장치의 사이의 거리를 변화시키는 방법을 들 수 있다. 또, 목적 세포와 촬상 장치의 사이의 거리를 일정하게 한 채로 촬상하는 방법으로서, 액체 렌즈를 탑재한 촬상 장치를 이용하여 액체 렌즈의 초점을 변화시키는 방법 등을 들 수 있다. 초점 거리의 변화에 따라, 초점면이 이동한다.
예를 들면, 도 10에 나타내는 바와 같이, 광원(10)과 촬상 장치(20)의 사이에, 목적 세포(세포 현탁액)(C)를 수용한 유지 용기(40)를 배치하여, 유지 용기(40)를 재치한 스테이지(30)를 이동시킴으로써 초점면을 변화시키면서, 목적 세포를 촬상해도 된다.
또, 광원과 촬상 장치의 사이에, 세포(세포 현탁액)를 수용한 유지 용기를 배치하여, 촬상 장치를 이동시킴으로써 초점면을 변화시키면서, 세포를 촬상해도 된다.
또, 광원과 촬상 장치의 사이에, 세포(세포 현탁액)를 수용한 유지 용기를 배치하여, 촬상 장치 및 스테이지를 이동시키지 않고, 촬상 장치가 구비한 액체 렌즈의 초점을 변화시킴으로써 초점면을 변화시키면서, 세포를 촬상해도 된다.
광원(10)으로부터 촬상 장치(20)를 향하여 초점면을 이동시키면서 목적 세포를 촬상해도 되고, 촬상 장치(20)로부터 광원(10)을 향하여 초점면을 변화시키면서 목적 세포를 촬상해도 된다.
촬상 장치는, 촬상 렌즈와 에어리어 센서의 조합으로 이루어진다. 촬상 렌즈는, 텔레센트릭 렌즈, 현미경 대물 렌즈 등이어도 된다.
촬상 장치의 렌즈의 종류, 개구각, 배율 등은 특별히 한정되지 않지만, 이들은 연결 화상에 있어서의 집광 및 광의 발산에 영향을 줄 수 있기 때문에, 적절히 촬상할 수 있도록 적절히 선택해도 된다.
렌즈의 배율이 높을수록 시야가 좁아져, 1시야당 촬상할 수 있는 세포 현탁액의 양이 적어지기 때문에, 보다 많은 세포 현탁액을 측정 대상으로 하는 관점에서, 배율은, 예를 들면, 2배~4배 정도로 하는 것이 바람직하다. 또, 렌즈의 개구각은, 좁은 편이 집광점의 식별 감도가 높은 경향이 있다.
촬상 장치의 에어리어 센서로서는, 예를 들면, CCD(Charge-Coupled Device), CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 등을 이용할 수 있다. 에어리어 센서의 분해능은, 렌즈 배율도 고려하여, 예를 들면, 1픽셀이 1μm~3μm 정도가 되는 설정이 바람직하다.
광원은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, LED(Light Emitting Diode) 등을 들 수 있다.
렌즈 효과의 관점에서, 광원은, 평행광을 조사하는 것이 바람직하다.
목적 세포를 촬상하는 복수의 초점면의 위치 및 수는, 목적 세포의 포커싱면을 포함하는 한은 특별히 한정되지 않지만, 연결 화상에 있어서의 집광 및 광의 발산이 보이도록 설정하는 것이 바람직하다.
예를 들면, 유지 용기의 바닥면으로부터 상면까지를 포함하여, 유지 용기의 하방으로부터 상방의 넓은 범위에 걸쳐 초점면을 이동시키면서, 목적 세포를 촬상해도 된다.
인접하는 초점면 간의 거리는, 일정한 것이 바람직하다. 예를 들면, 도 10에 나타내는 바와 같은 스테이지(30)를 이용하는 경우, 스테이지(30)의 위치를 인코더로 특정하고, 등간격으로 이동시키면서 목적 세포를 촬상해도 된다.
초점면의 이동 간격은, 예를 들면, 0.01mm 정도인 것이 바람직하다. 또, 세포 현탁액 중에서의 초점면의 이동 거리는, 세포 현탁액의 굴절률의 영향에 의하여, 스테이지의 이동 거리보다 짧아지기 때문에, 그것을 고려하여, 스테이지의 이동 거리를 결정하는 것이 바람직하다.
초점면을 변화시킬 때의 편의를 위하여, 예를 들면, 목적 세포를 유지하는 유지 용기의 바닥면(또는 그 근방)에 초점을 맞추어 화상을 취득하여 기준면으로 해도 된다.
또, 기준면을 정하고, 기준면으로부터 미리 정해진 범위 내에서 초점면을 이동시킨 연결 화상을 얻음으로써, 동일 조건에서 연결 화상을 작성할 수 있기 때문에, 연결 화상의 해석에 유익하다.
유지 용기로서는, 시판 중인 카운팅 셀 및 혈구 계산반(計算盤), 이들과 유사한 구조를 갖는 측정 셀을 사용할 수 있다. 유지 용기에 세포 현탁액을 수용했을 때, 예를 들면, 액후(液厚)가 0.1mm 정도이고 세포 농도가 1×106개/ml 정도가 될 수 있지만, 세포 농도가 더 낮은 경우에는, 액후가 커지는 유지 용기를 이용해도 된다.
예를 들면, 세포 현탁액에 다른 물질(예를 들면, 다른 세포, 적혈구, 유적(油滴) 등)이 포함되는 경우, 화상 처리 소프트웨어를 이용한 화상 처리에 의하여, 직경이 미리 정해진 범위 내이며, 또한, 형상의 진원도가 미리 정해진 범위 내인 물질을 미리 선정해도 된다. 목적 세포와는 명확하게 상이한 물질을 제외함으로써, 세포 생사 판정에 필요로 하는 전체의 시간을 단축하는 효과가 얻어진다.
예를 들면, 도 11에 나타내는 바와 같이, 목적 세포(C)에 광을 조사하고, 초점면을 변화시키면서, 목적 세포(C)의 포커싱면 P0을 포함하는 복수의 초점면 Pn~초점면 P-m에서, 목적 세포(C)의 광을 조사하는 측과는 반대의 방향으로부터 목적 세포(C)를 촬상하여, 복수의 화상을 취득해도 된다.
초점면 Pn은, 목적 세포(C)의 포커싱면 P0으로부터, 촬상 장치(20)의 방향으로 n번째의 초점면이다. 초점면 P-m은, 목적 세포(C)의 포커싱면 P0으로부터, 광원(10)의 방향으로 m번째의 초점면이다. m 및 n 중 적어도 일방이 1 이상의 정수이며, 또한, m+n이 1 이상의 정수이면 되고, 도 11은, m이 2 이상, 또한, n이 4 이상인 예이다.
이하, 목적 세포(C)가 생세포인 경우의 예에 대하여 설명한다.
목적 세포(C)가 생세포인 경우, 예를 들면, 초점면을 변화시키면서, 생세포의 포커싱면 P0을 포함하는 복수의 초점면 P7~초점면 P-2에서 생세포를 촬상함으로써, 도 12에 나타내는 바와 같이, 생세포의 화상 I7~화상 I-2가 얻어진다.
화상 I0은, 생세포의 포커싱면 P0으로 촬상한 것이며, 생세포의 윤곽은 명료하다. 또, 생세포의 중심부에는, 윤곽이 불명료한 렌즈 효과의 집광점이 있다.
화상 I1은, 생세포의 포커싱면 P0으로부터 촬상 장치(20)의 방향으로 1번째의 초점면 P1에서 촬상한 것이며, 생세포의 윤곽은 불명료하다. 또, 생세포의 중심부에는, 렌즈 효과의 집광점이 있고, 집광점의 윤곽은 명료하다. 즉, 초점면 P1은, 렌즈 효과의 집광점의 포커싱면의 예이다.
화상 I2 및 화상 I3은 각각, 생세포의 포커싱면 P0으로부터 촬상 장치(20)의 방향으로 2번째의 초점면 P2 및 3번째의 초점면 P3으로 촬상한 것이며, 생세포의 윤곽은 불명료하다. 또, 생세포의 중심부에는, 윤곽이 불명료한 렌즈 효과의 집광점이 있다.
화상 I4~화상 I7은 각각, 생세포의 포커싱면 P0으로부터 촬상 장치(20)의 방향으로 4번째의 초점면 P4~7번째의 초점면 P7에서 촬상한 것이며, 생세포의 윤곽은 불명료하다. 또, 렌즈 효과의 집광점은 보이지 않는다.
화상 I-1은, 생세포의 포커싱면 P0으로부터 광원(10)의 방향으로 1번째의 초점면 P-1에서 촬상한 것이며, 생세포의 윤곽은 불명료하다. 또, 생세포의 중심부에는, 윤곽이 불명료한 렌즈 효과의 집광점이 있다.
화상 I-2는, 생세포의 포커싱면 P0으로부터 광원(10)의 방향으로 2번째의 초점면 P-2에서 촬상한 것이며, 생세포의 윤곽은 불명료하다. 또, 렌즈 효과의 집광점은 보이지 않는다.
생세포의 윤곽은, 예를 들면, 화상 I7~화상 I-2에 나타내는 바와 같이, 생세포의 포커싱면 P0으로부터 떨어진 초점면일수록, 커지는 경향이 있다.
렌즈 효과의 집광점의 크기는, 렌즈 효과의 집광점이 형성되는 측(즉, 촬상 장치(20)의 옆)에서는, 예를 들면, 화상 I1 및 화상 I2에 나타내는 바와 같이, 렌즈 효과의 집광점의 포커싱면 P1로부터 떨어진 초점면일수록, 커지는 경향이 있다. 그러나, 렌즈 효과의 집광점의 포커싱면 P1로부터 크게 떨어진 초점면 P3에서는, 화상 I3에 나타내는 바와 같이, 렌즈 효과의 집광점의 크기는 작아져, 더 떨어진 초점면 P4에서는 집광점이 보여지지 않게 된다.
또, 렌즈 효과의 집광점의 크기는, 렌즈 효과의 집광점이 형성되는 측과는 반대 측(즉, 광원(10)의 측)에서는, 예를 들면, 화상 I-1에 나타내는 바와 같이, 렌즈 효과의 집광점의 포커싱면 P1로부터 떨어지면 작아지는 경향이 있다. 그리고, 더 떨어진 초점면 P-2에서는, 렌즈 효과의 집광점이 보이지 않게 된다.
다음으로, 목적 세포가 사세포인 경우의 예에 대하여 설명한다.
세포가 사세포인 경우, 예를 들면, 초점면을 변화시키면서, 사세포의 포커싱면 P0을 포함하는 복수의 초점면 P7~초점면 P-2에서 사세포를 촬상함으로써, 도 13에 나타내는 바와 같이, 사세포의 화상 I'7~화상 I'-2가 얻어진다.
화상 I'0은, 사세포의 포커싱면 P0에서 촬상한 것이며, 사세포의 윤곽은 명료하다.
화상 I'1은, 사세포의 포커싱면 P0으로부터 촬상 장치(20)의 방향으로 1번째의 초점면 P1에서 촬상한 것이며, 사세포의 윤곽은 불명료하다.
화상 I'2는, 사세포의 포커싱면 P0으로부터 촬상 장치(20)의 방향으로 2번째의 초점면 P2에서 촬상한 것이며, 사세포의 윤곽은 불명료하다. 또, 사세포는, 세포막이 찢어져 있으며, 사세포의 외주면에서 광의 산란이 일어나기 때문에, 생세포와 비교하여 불투명하다. 그 결과, 사세포에 광을 조사하면, 광의 평면파에 놓여진 차폐물이 일으키는 회절과 유사한 현상이 일어나, 사세포의 광을 조사하는 측과는 반대의 방향의 사세포의 중심 부근에 밝아지는 부분이 형성된다. 이것은, 회절광이 중첩된 결과에서 온 것이다(이하, 상기 부분을 "회절광의 집광점"이라고 부르는 경우가 있다). 화상 I'2의 사세포의 중심부에는, 회절광의 집광점이 있으며, 집광점의 윤곽은 명료하다. 즉, 초점면 P2는, 회절광의 집광점의 포커싱면의 예이다.
화상 I'3~화상 I'7은 각각, 사세포의 포커싱면 P0으로부터 촬상 장치(20)의 방향으로 3번째의 초점면 P3~7번째의 초점면 P7에서 촬상한 것이며, 사세포의 윤곽은 불명료하다. 또, 사세포의 중심부에는, 윤곽이 불명료한 회절광의 집광점이 있다.
화상 I'-1 및 화상 I'-2는 각각, 사세포의 포커싱면 P0으로부터 광원(10)의 방향으로 1번째의 초점면 P-1 및 2번째의 초점면 P-2에서 촬상한 것이며, 사세포의 윤곽은 불명료하다.
사세포의 윤곽은, 생세포와 동일하게, 예를 들면, 화상 I7~화상 I-2에 나타내는 바와 같이, 사세포의 포커싱면 P0으로부터 떨어진 초점면일수록, 커지는 경향이 있다.
회절광의 집광점의 크기는, 예를 들면, 화상 I'7~화상 I'2에 나타내는 바와 같이, 회절광의 집광점의 포커싱면 P2로부터 떨어진 초점면일수록, 커지는 경향이 있다.
이상의 것은, 도 12 및 도 13을 이용하여 설명한 일례이며, 목적 세포의 구형도, 크기 등에 의하여, 목적 세포의 윤곽 및 집광점의 보이는 모습이 상이할 수 있다.
렌즈 효과의 집광점 및 회절광의 집광점을 간단히 "집광점"이라고 부르는 경우가 있다.
-화상편 취득 공정-
화상편 취득 공정에서는, 화상 취득 공정에서 얻어진 각 화상으로부터, 목적 세포의 중심부 및 외주부를 포함하는 화상편을 취득한다.
화상편 취득 공정은, 예를 들면, 화상 처리 소프트웨어를 이용한 화상 처리에 의하여 행해도 된다.
목적 세포의 화상으로부터 화상편을 취득하는 위치는, 목적 세포의 중심부 및 외주부를 포함하는 한은 특별히 한정되지 않는다.
화상편은, 목적 세포의 길이가 최대가 되는 부분(즉, 목적 세포의 윤곽상의 임의의 2점을 연결하는 직선의 길이가 최대가 되는 부분)을 포함하는 것이 바람직하다.
예를 들면, 도 12에 나타내는 바와 같이, 생세포의 길이가 최대가 되는 부분을 포함하는 화상편 S7~화상편 S-2를 취득해도 되고, 또, 사세포의 길이가 최대가 되는 부분을 포함하는 화상편 S'7~화상편 S'-2를 취득해도 된다.
또, 목적 세포의 각 화상으로부터 화상편을 취득하기 전에, 각 화상에 전처리를 실시해도 된다. 전처리로서, 예를 들면, 목적 세포의 중심부를 중심으로 하는 반경이 다른 동심원을 화소 단위로 설정하고, 각 동심원에 대하여, 원주상의 명도의 평균값을 구하며, 원주상의 명도가 상기 평균값인 동심원(즉, 원주상의 명도가 평균화되고, 또한, 원의 동심원과 동일한 반경을 갖는다)을 그림으로써, 목적 세포의 화상을 재구축한다는 처리를 들 수 있다. 이로써, 목적 세포의 중심부를 중심으로 하여 대칭인 화상을 얻을 수 있다. 그 때문에, 화상편을 취득할 때, 화상편을 잘라내는 방향에 의한 영향을 제거할 수 있다.
이와 같은 전처리를 실시한 화상으로부터 취득되는 화상편을 이용함으로써, 대칭인 연결 화상(예를 들면, 도 5 및 도 6과 같이, 좌우 대칭인 연결 화상)을 얻을 수 있고, 이후의 특징량 추출 공정에서, 연결 화상으로부터 특징량을 추출하는 것이 보다 용이해진다.
-해석용 연결 화상 작성 공정-
해석용 연결 화상 작성 공정에서는, 화상편 취득 공정에서 얻어진 각 화상편을 초점면의 촬상 방향의 순서로 연결하여, 해석용 연결 화상을 작성한다.
해석용 연결 화상 작성 공정은, 예를 들면, 화상 처리 소프트웨어를 이용한 화상 처리에 의하여 행해도 된다.
화상편을 연결하는 방법은, 초점면의 촬상 방향의 순서로 연결하는 한은 특별히 한정되지 않는다. 각 화상편의 목적 세포의 중심부를 연결하는 직선을 따라, 화상편의 장변끼리가 접하도록 연결하는 것이 바람직하다.
예를 들면, 도 12로부터 취득한 생세포의 화상편 S7~화상편 S-2를, 도 14에 나타내는 바와 같이, 초점면의 촬상 방향의 순서로, 각 화상편의 생세포의 중심부를 연결하는 선을 따라 연결함으로써, 생세포의 해석용 연결 화상 L이 얻어진다.
또, 예를 들면, 도 13으로부터 취득한 사세포의 화상편 S'7~화상편 S'-2를, 도 15에 나타내는 바와 같이, 초점면의 촬상 방향의 순서로, 각 화상편의 사세포의 중심부를 연결하는 선을 따라 연결함으로써, 사세포의 해석용 연결 화상 L'이 얻어진다.
-특징량 추출 공정-
특징량 추출 공정에서는, 해석용 연결 화상 작성 공정에서 얻어진 해석용 연결 화상으로부터 특징량을 추출한다.
특징량 추출 공정은, 예를 들면, 화상 처리 소프트웨어를 이용한 화상 처리에 의하여 행해도 된다.
(연결 화상으로부터 추출되는 특징량)
연결 화상은, 목적 세포에 관한 다양한 정보를 포함하고 있으며, 예를 들면, 이하의 특징량 1~특징량 11을 얻을 수 있다.
-특징량 1-(렌즈 효과의 집광점의 유무에 근거하는 세포의 생사 판정)
연결 화상은, 렌즈 효과의 집광점의 유무에 근거하는 세포의 생사에 관한 정보를 포함한다.
연결 화상은, 세포의 포커싱면의 화상편을 포함하고 있으며, 세포의 포커싱면에 있어서, 생세포는, 렌즈 효과의 집광점을 갖지만, 사세포는, 렌즈 효과의 집광점을 갖지 않는다.
예를 들면, 도 14에 나타나는 생세포의 연결 화상 L은, 생세포의 포커싱면 P0의 화상편 S0에 렌즈 효과의 집광점을 갖는다. 한편, 예를 들면, 도 15에 나타나는 사세포의 연결 화상 L'은, 사세포의 포커싱면 P0의 화상편 S'0에 렌즈 효과의 집광점을 갖지 않는다.
그 때문에, 렌즈 효과의 집광점의 유무에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행할 수 있다.
예를 들면, 세포의 포커싱면의 화상편의 중심부의 휘도를 특징량 1로 하고, 미리 정해진 특징량 1의 범위에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행해도 된다. 이로써, 해석용 연결 화상에 대하여, 특징량 1이 상기 범위 내인 경우에, 세포가 생세포라고 판정할 수 있다.
또, 다른 실시형태에 있어서, 해석용 연결 화상의 특징량 1과, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 1 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 생사 판정을 행해도 된다.
-특징량 2-(집광점의 개시 위치에 근거하는 세포의 생사 판정)
연결 화상은, 집광점의 개시 위치에 근거하는 세포의 생사에 관한 정보를 포함한다.
"집광점의 개시 위치"란, 렌즈 효과 또는 회절광의 집광점의 포커싱면을 의미한다.
연결 화상에 있어서, "집광점의 개시 위치"란, 렌즈 효과 또는 회절광의 집광점의 포커싱면의 화상편을 의미한다.
생세포에 있어서, 렌즈 효과의 집광점의 개시 위치는, 세포의 평균 굴절률을 반영한 것이다.
생세포의 경우, 예를 들면, 도 12에 나타내는 바와 같이, 렌즈 효과의 집광점의 포커싱면 P1이 렌즈 효과의 집광점의 개시 위치이다.
한편, 사세포의 경우, 예를 들면, 도 13에 나타내는 바와 같이, 회절광의 집광점의 포커싱면 P2가 회절광의 집광점의 개시 위치이다.
예를 들면, 도 12 및 도 13에 나타내는 바와 같이, 렌즈 효과의 집광점의 개시 위치는, 회절광의 집광점의 개시 위치보다, 세포에 가깝다. 렌즈 효과의 집광점은, 생세포를 투과한 광이 생세포의 근처에 집광하여 형성된 것인데 대하여, 회절광의 집광점은, 사세포의 외주면 근방을 통과한 광이 사세포로부터 비교적 멀리 집광하여 형성된 것이기 때문이다. 즉, 생세포에 있어서 형성되는 렌즈 효과의 집광점은, 사세포에 있어서 형성되는 회절광의 집광점과 비교하여, 세포에 가까운 측에 형성된다.
예를 들면, 도 14에 나타나는 생세포의 연결 화상 L에 있어서, 렌즈 효과의 집광점의 개시 위치(포커싱면 P1)의 화상편 S1은, 생세포의 포커싱면 P0의 화상편 S0에 인접하고 있으며, 렌즈 효과의 집광점의 개시 위치는, 생세포의 포커싱면 P0에 가깝다.
한편, 예를 들면, 도 15에 나타나는 사세포의 연결 화상 L'에 있어서, 회절광의 집광점의 개시 위치(포커싱면 P2)의 화상편 S'2는, 사세포의 포커싱면 P0의 화상편 S'0에 인접하고 있지 않고, 회절광의 집광점의 개시 위치는, 사세포의 포커싱면 P0으로부터 멀다.
그 때문에, 집광점의 개시 위치에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행할 수 있다.
예를 들면, 세포의 포커싱면을 기준으로 한 거리에 의하여 집광점의 개시 위치를 특정하여 특징량 2로 해도 된다. 예를 들면, 세포의 포커싱면의 화상편과, 집광점의 개시 위치(즉, 집광점의 포커싱면)의 화상편의 사이의, 화상편이 연결된 방향을 따른 길이를 특징량 2로 하고, 미리 정해진 특징량 2의 범위에 근거하여, 목적 세포의 생사 판정을 행해도 된다. 이로써, 해석용 연결 화상에 대하여, 특징량 2가 상기 범위 내인 경우에, 세포가 생세포라고 판정할 수 있다.
또, 다른 실시형태에 있어서, 해석용 연결 화상의 특징량 2와, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 2 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 생사 판정을 행해도 된다.
-특징량 3-(집광점의 계속 길이에 근거하는 세포의 생사 판정)
연결 화상은, 집광점의 계속 길이에 근거하는 세포의 생사에 관한 정보를 포함한다.
"집광점의 계속 길이"란, 렌즈 효과 또는 회절광의 집광점의 개시 위치에서 집광점이 소실되는 초점면까지의 거리를 의미한다.
연결 화상에 있어서, "집광점의 계속 길이"란, 렌즈 효과 또는 회절광의 집광점의 포커싱면의 화상편으로부터 집광점이 소실되는 초점면의 화상편까지의 최단의 길이를 의미한다.
생세포에 있어서, 렌즈 효과의 집광점의 계속 길이는, 세포의 평균 굴절률을 반영한 것이다.
생세포의 경우, 예를 들면, 도 12에 나타내는 바와 같이, 렌즈 효과의 집광점의 개시 위치(포커싱면 P1)로부터 렌즈 효과의 집광점이 소실되는 초점면 P4까지의 거리가 렌즈 효과의 집광점의 계속 길이이다.
한편, 사세포의 경우, 예를 들면, 도 13에 나타내는 바와 같이, 회절광의 집광점의 개시 위치(포커싱면 P2)로부터 회절광의 집광점이 소실되는 초점면까지의 거리가 회절광의 "집광점의 계속 길이"이다. 도 13에는 나타나지 않지만, 초점면 P4보다 더 포커싱면 P0으로부터 떨어진 초점면에 걸쳐, 집광점이 계속된다.
렌즈 효과의 집광점에 있어서, 생세포의 중심에 가까운 부분을 투과한 광일수록, 생세포로부터 떨어진 위치에 집광하고, 생세포의 중심으로부터 떨어진 부분을 투과한 광일수록, 생세포로부터 가까운 위치에 집광한다. 그 결과, 생세포를 투과하는 부분에 따라 집광점이 이어지기 때문에, 렌즈 효과의 집광점은, 집광점의 계속 길이를 갖는다. 또, 렌즈 효과의 집광점에 대하여, 광의 강도는 발산에 의하여 짧은 거리에서 감소한다. 또한, 생세포에 백색광을 조사한 경우에는, 청색의 성분(단파장 성분)은, 적색의 성분(장파장 성분)과 비교하여, 세포로부터 가까운 위치에 집광하기 때문에, 파장의 차이도 렌즈 효과의 집광점의 계속 길이에 기여한다.
한편, 회절광의 집광점은, 사세포의 외주면 근방을 통과한 광이 집광하여 형성된 것이며, 사세포로부터의 거리에 의한 간섭 패턴의 변화가 비교적 긴 거리에 걸쳐 있다. 그 때문에, 회절광의 집광점은, 렌즈 효과보다 긴 집광점의 계속 길이를 갖고 있다. 즉, 생세포의 집광점은, 사세포의 집광점과 비교하여, 집광점의 계속 길이가 짧다.
예를 들면, 도 14에 나타나는 생세포의 연결 화상 L에 있어서, 렌즈 효과의 집광점이 화상편 S-1로부터 화상편 S3에 걸쳐 연속하고 있다.
한편, 예를 들면, 도 15에 나타나는 사세포의 연결 화상 L'에 있어서, 회절광의 집광점이 화상편 S'2로부터 화상편 S7에 걸쳐 연속하고 있다.
도 14 및 도 15에 나타내는 바와 같이, 생세포의 연결 화상 L의 집광점의 계속 길이는, 사세포의 연결 화상 L'의 집광점의 계속 길이보다 짧다.
그 때문에, 집광점의 계속 길이에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행할 수 있다.
예를 들면, 집광점이 연속된 영역에 대하여, 화상편을 연결한 방향을 따른 길이를 특징량 3으로 하고, 미리 정해진 특징량 3의 범위에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행해도 된다. 이로써, 해석용 연결 화상에 대하여, 특징량 3이 상기 범위 내인 경우에, 세포가 생세포라고 판정할 수 있다.
또, 다른 실시형태에 있어서, 해석용 연결 화상의 특징량 3과, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 3 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 생사 판정을 행해도 된다.
-특징량 4-(집광점의 개시 위치에 근거하는 세포의 식별)
연결 화상은, 집광점의 개시 위치에 근거하는 세포의 식별에 관한 정보를 포함한다.
생세포에 있어서, 렌즈 효과의 집광점의 개시 위치는, 세포의 평균 굴절률을 반영한 것이며, 목적 세포와는 평균 굴절률이 상이한 다른 물질(예를 들면, 다른 세포, 적혈구, 유적 등)은, 집광점의 개시 위치가 목적 세포와는 상이하다.
그 때문에, 집광점의 개시 위치에 근거하여, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지의 판정을 행할 수 있다.
예를 들면, 세포의 포커싱면을 기준으로 한 거리에 의하여 집광점의 개시 위치를 특정하여 특징량 4로 해도 된다. 예를 들면, 세포의 포커싱면의 화상편과, 집광점의 개시 위치(즉, 집광점의 포커싱면)의 화상편의 사이의, 화상편이 연결된 방향을 따른 길이를 특징량 4로 하고, 미리 정해진 특징량 4의 범위에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행해도 된다. 이로써, 해석용 연결 화상에 대하여, 특징량 4가 상기 범위 내인 경우에, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포라고 판정할 수 있다.
또, 다른 실시형태에 있어서, 해석용 연결 화상의 특징량 4와, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 4 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 생사 판정을 행해도 된다.
특징량 4는, 특징량 2와 동일해도 된다. 또, 특징량 4는 특징량 2와 상이해도 되고, 예를 들면, 세포의 식별을 행함으로써 적당하도록 특징량 4를 설정하며, 또, 세포의 생사 판정을 행함으로써 적당하도록 특징량 2를 설정해도 된다.
-특징량 5-(집광점의 계속 길이에 근거하는 세포의 식별)
연결 화상은, 집광점의 계속 길이에 근거하는 세포의 식별에 관한 정보를 포함한다.
생세포에 있어서, 렌즈 효과의 집광점의 계속 길이는, 세포의 평균 굴절률을 반영한 것이기 때문에, 목적 세포와는 평균 굴절률이 상이한 다른 물질(예를 들면, 다른 세포, 적혈구, 유적 등)은, 집광점의 계속 길이가 목적 세포와는 상이하다.
그 때문에, 집광점의 계속 길이에 근거하여, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지의 판정을 행할 수 있다.
예를 들면, 집광점이 연속된 영역에 대하여, 화상편을 연결한 방향을 따른 길이를 특징량 5로 하고, 미리 정해진 특징량 5의 범위에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행해도 된다. 이로써, 해석용 연결 화상에 대하여, 특징량 5가 상기 범위 내인 경우에, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포라고 판정할 수 있다.
또, 다른 실시형태에 있어서, 해석용 연결 화상의 특징량 5와, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 5 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 생사 판정을 행해도 된다.
특징량 5는, 특징량 3과 동일해도 된다. 또, 특징량 5는 특징량 3과 상이해도 되고, 예를 들면, 세포의 식별을 행함으로써 적당하도록 특징량 5를 설정하며, 또, 세포의 생사 판정을 행함으로써 적당하도록 특징량 3을 설정해도 된다.
특징량 4 및 특징량 5에 관하여, 예를 들면, 적혈구는, 생세포와는 달리, 오목 렌즈와 같은 형상을 갖고 있기 때문에, 적혈구에 광을 조사했을 때, 적혈구의 광을 조사하는 측과는 반대 측에 집광점이 형성되고, 또한, 광을 조사한 측에도 집광점이 형성된다. 적혈구는, 이와 같은 집광점의 나타나는 방법의 차이에 더하여, 집광점의 개시 위치 및 집광점의 계속 길이도 생세포와는 상이할 수 있다.
-특징량 6-(포커싱면의 세포의 크기에 근거하는 세포의 식별)
연결 화상은, 포커싱면의 세포의 크기에 근거하는 세포의 식별에 관한 정보를 포함할 수 있다.
연결 화상은, 세포의 포커싱면의 화상편을 포함하고 있다. 그 때문에, 세포의 포커싱면의 화상편이, 세포의 길이가 최대가 되는 부분(즉, 세포의 윤곽상의 임의의 2점을 연결하는 직선의 길이가 최대가 되는 부분)을 포함하고 있는 경우, 상기 최대가 되는 부분의 길이를 세포의 직경으로 할 수 있다. 그리고, 예를 들면, 생사 판정의 대상인 세포의 직경이, 목적 세포의 이미 알려진 직경과 동일한 정도인지 아닌지를 검토하고, 그렇지 않은 경우, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포가 아니라고 판정할 수 있다.
그 때문에, 포커싱면의 세포의 크기에 근거하여, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지의 판정을 행할 수 있다.
예를 들면, 생사 판정의 대상인 세포의 포커싱면의 화상편에 대하여, 세포의 길이가 최대가 되는 부분(즉, 세포의 윤곽상의 임의의 2점을 연결하는 직선의 길이가 최대가 되는 부분)의 길이를 특징량 6으로 하고, 미리 정해진 특징량 6의 범위에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행해도 된다. 이로써, 해석용 연결 화상에 대하여, 특징량 6이 상기 범위 내인 경우에, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포라고 판정할 수 있다.
또, 다른 실시형태에 있어서, 해석용 연결 화상의 특징량 6과, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 6 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 생사 판정을 행해도 된다.
-특징량 7-(포커싱면의 위치에 근거하는 세포의 식별)
연결 화상은, 포커싱면의 위치에 근거하는 세포의 식별에 관한 정보를 포함한다.
예를 들면, 목적 세포와 다른 물질(예를 들면, 다른 세포, 적혈구, 유적 등)을 포함하는 세포 현탁액에 있어서, 세포의 비중이 다른 물질의 비중과 상이한 경우, 세포와 다른 물질과는, 세포 현탁액 중에서의 가라앉는 방법(가라앉는 정도)에 차이가 있으며, 세포 현탁액의 깊이 방향에 있어서, 세포의 위치가 다른 물질의 위치와 상이하다. 그 때문에, 세포 및 다른 물질을 각각 동일한 초점면에서 촬상하여 연결 화상을 작성했을 때, 세포의 포커싱면의 화상편의 위치와, 다른 물질의 포커싱면의 화상편의 위치(예를 들면, 화상편의 연결 방향의 높이)가 상이하다. 그리고, 예를 들면, 생사 판정의 대상인 세포의 포커싱면의 화상편의 위치가, 목적 세포의 이미 알려진 포커싱면의 화상편의 위치와 동일한 정도인지 아닌지를 검토하고, 그렇지 않은 경우, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포가 아니라고 판정할 수 있다.
그 때문에, 포커싱면의 위치에 근거하여, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지의 판정을 행할 수 있다.
예를 들면, 생사 판정의 대상인 세포의 포커싱면의 화상편과 가장 하방의 초점면의 화상편의 사이의, 화상편을 연결한 방향을 따른 길이를 특징량 7로 하고, 미리 정해진 특징량 7의 범위에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행해도 된다. 이로써, 해석용 연결 화상에 대하여, 특징량 7이 상기 범위 내인 경우에, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포라고 판정할 수 있다.
또, 다른 실시형태에 있어서, 해석용 연결 화상의 특징량 7과, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 7 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 생사 판정을 행해도 된다.
-특징량 8-(집광점의 연결 형상에 근거하는 세포의 식별)
연결 화상은, 집광점의 연결 형상에 근거하는 세포의 식별에 관한 정보를 포함한다.
"집광점의 연결 형상"이란, 연결 화상에 있어서, 집광점이 연결되어 형성된 부분의 형상을 의미한다.
예를 들면, 해석용 연결 화상에 대하여, 초광점이 연결된 부분의 화상을 특징량 8로 하고, 기계 학습기에 의하여, 해석용 연결 화상의 특징량 8과, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 9 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지를 판정해도 된다.
집광점의 연결 형상은, 집광점의 개시 위치 및 집광점의 계속 길이에 더하여, 집광점의 크기에도 관계하고 있으며, 또한, 생세포에 있어서, 세포의 평균 굴절률을 반영한 것이다. 따라서, 목적 세포와는 평균 굴절률이 상이한 다른 물질(예를 들면, 다른 세포, 적혈구, 유적 등)은, 집광점의 연결 형상이 목적 세포와는 상이하다.
그 때문에, 집광점의 연결 형상에 근거하여, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지의 판정을 행할 수 있다.
-특징량 9-(집광점의 색분포에 근거하는 세포의 식별)
연결 화상은, 집광점의 색분포에 근거하는 세포의 식별에 관한 정보를 포함할 수 있다.
생세포에 백색광을 조사한 경우, 청색의 성분(단파장 성분)은, 적색의 성분(장파장 성분)과 비교하여, 세포로부터 가까운 위치에 집광하기 때문에, 렌즈 효과의 집광점으로 색의 분포가 보인다. 렌즈 효과의 집광점의 색분포는, 세포의 평균 굴절률을 반영한 것이다. 따라서, 목적 세포와는 평균 굴절률이 상이한 다른 물질(예를 들면, 다른 세포, 적혈구, 유적 등)은, 집광점의 색분포가 목적 세포와는 상이하다.
그 때문에, 집광점의 색분포에 근거하여, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지의 판정을 행할 수 있다.
예를 들면, 생세포의 경우, 상기와 같은 렌즈 효과의 집광점의 색의 분리가 보이고, 세포의 근방이 청색으로 착색되며, 비교적 원방(遠方)에서 적색으로 착색된다는 색분포를 나타낸다. 한편, 예를 들면, 적혈구는, 오목 렌즈와 같은 형상에 기인하여, 집광점의 색의 분리는 약하고, 집광점은 비교적 흰색으로 보이는 경향이 있다.
예를 들면, 해석용 연결 화상에 대하여, 초광점이 연결된 부분의 화상을 특징량 9로 하고, 기계 학습기에 의하여, 해석용 연결 화상의 특징량 9와, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 8 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지를 판정해도 된다.
-특징량 10-(연결 화상의 일치도에 근거하는 세포의 생사 판정 및 식별)
연결 화상은, 상술한 바와 같이, 세포의 생사 판정 및 세포의 식별에 관한 정보를 포함하고 있다. 그 때문에, 해석용 연결 화상과 참조용 연결 화상과의 일치도에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행하여, 또한, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지의 판정을 행할 수 있다.
그래서, 해석용 연결 화상 자체를 특징량 10으로 하고, 기계 학습기에 의하여, 해석용 연결 화상의 특징량 10과, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 10 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 생사 판정의 대상인 세포가 생세포인지 아닌지, 목적 세포인지 아닌지를 판정해도 된다.
-특징량 11-(세포의 렌즈 효과의 투과량에 근거하는 세포의 생사 판정)
연결 화상은, 세포의 렌즈 효과의 투과량에 근거하는 생사에 관한 정보를 포함한다.
세포의 "렌즈 효과의 투과량"이란, 세포가 렌즈 효과를 갖는 경우에 있어서, 세포를 통과하는 광의 투과량을 의미한다.
연결 화상에 있어서, 세포의 "렌즈 효과의 투과량"이란, 세포가 렌즈 효과를 갖는 경우에 있어서, 세포의 포커싱면의 화상편을 기점으로 한 "촬상 방향의 복수 화상편"의 평균 명도와, 세포의 포커싱면의 화상편을 기점으로 한 "광원 방향의 복수 화상편"의 평균 명도의, 중부가 합을 의미한다. 가중치 계수는 특별히 한정되지 않고, 적절히 설정해도 된다.
세포막이 찢어진 직후의 사세포에 있어서, 중간 상태로서, 생세포와 동일하게 렌즈 효과에 의한 집광점을 갖는 경우가 있다. 이 사세포는, 세포막이 찢어짐으로써 외주면에서 광의 산란이 일어나기 때문에, 렌즈 효과의 투과량은, 생세포와 비교하여 낮아진다. 그 때문에, 렌즈 효과의 투과량에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행할 수 있다. 또한, 광원의 출력은 일정하게 관리되고 있는 것으로 한다.
세포의 포커싱면에 대하여 촬상 방향의 화상편의 평균 명도는, 예를 들면, 도 2에 나타나는 포커싱면 P0의 화상편 S0~초점면 Pn의 화상편 Sn의 평균 명도이다.
세포의 포커싱면에 대하여 광원 방향의 화상편의 평균 명도는, 예를 들면, 도 2에 나타나는 포커싱면 P0의 화상편 S0~초점면 P-m의 화상편 S-m의 평균 명도이다(예를 들면, n=m이 바람직하다).
세포의 포커싱면의 화상편을 기점으로 한 "촬상 방향의 복수 화상편"의 평균 명도와, 세포의 포커싱면을 기점으로 한 "광원 방향의 복수 화상편"의 평균 명도의, 중부가 합을 특징량 11로 하고, 미리 정해진 특징량 11의 범위에 근거하여, 세포의 생사 판정을 행해도 된다.
다파장 광원(예를 들면, 백색 LED) 및, 분광 가능한 촬상 장치(예를 들면, RGB 컬러 카메라)의 경우는, 색마다 연결 화상을 작성하고, "촬상 방향의 복수 화상편"의 평균 명도와, "광원 방향의 복수 화상편"의 평균 명도를, 상이한 색으로 조합함으로써, 세포의 생사 판정을 행해도 된다.
이상으로 설명한 특징량 1~특징량 11은, 연결 화상으로부터 얻어지는 특징량의 일례이며, 다른 특징량에 근거해도, 세포의 생사 판정 및 세포의 식별을 행할 수 있다.
특징량 1 및 특징량 11은, 세포의 렌즈 효과에 관한 것이다. 또, 특징량 2~특징량 5는, 세포의 평균 굴절률에 관한 것이다. 또, 특징량 6은, 세포의 직경에 관한 것이다. 또, 특징량 7은, 세포의 비중에 관한 것이다. 또, 특징량 8 및 특징량 9는, 연결 화상 자체의 형태에 관한 것이다. 또한, 특징량 10은, 세포의 평균 굴절률, 세포의 직경 및 세포의 비중 모두에 관한 것이다.
이와 같이, 연결 화상으로부터는, 많은 특징량을 얻을 수 있기 때문에, 연결 화상은, 세포의 생사 판정뿐만 아니라, 세포의 식별에도 유효하다.
목적 세포의 생사 판정에 이용되는 특징량은, 특징량 1~특징량 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상, 즉, 세포의 렌즈 효과에 관한 특징량, 세포의 평균 굴절률에 관한 특징량, 세포의 직경에 관한 특징량, 및 세포의 비중에 관한 특징량으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다.
-생사 판정 공정-
생사 판정 공정에서는, 해석용 연결 화상의 특징량과, 미리 정해진 특징량의 범위에 근거하여, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정을 행한다. 다른 실시형태에 있어서, 목적 세포의 생사 판정은, 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여 행해도 된다.
목적 세포의 생사 판정을 행하는 것은, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지의 판정을 행하는 것, 즉, 세포의 식별을 포함한다.
"미리 정해진 특징량의 범위"란, 세포가 생세포인지 아닌지를 구별하기 위한 임곗값을 의미하고, 특징량이 상기 범위 내인 경우, 세포가 생세포라고 판정할 수 있다. "미리 정해진 특징량의 범위"의 결정 방법은 특별히 한정되지 않고, 세포의 생사 판정이 가능하도록 적절히 결정해도 된다.
다른 실시형태에 있어서, 세포의 생사 판정은, 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여 행해도 된다. 이와 같은 양태는, 기계 학습기에 의하여 세포의 생사 판정을 행하는 경우에 바람직하다.
목적 세포의 생사 판정은, 생사 판정의 관점에서 특징량 1~특징량 3, 및 특징량 11 중 어느 하나 이상을 이용하고, 또한, 세포의 식별의 관점에서 특징량 4~특징량 9 중 어느 하나 이상을 이용하여 행해도 된다.
생사 판정의 정밀도를 보다 향상시키는 관점에서, 세포의 생사 판정은, 특징량 1~특징량 3, 및 특징량 11 중 2개 이상을 조합하여 행해도 된다.
특징량 4~특징량 9 중 어느 하나를 이용하여 행해도 된다. 세포의 식별의 정밀도를 보다 향상시키는 관점에서, 세포의 식별은, 특징량 4~특징량 9 중 2개 이상을 조합하여 행해도 된다.
다른 실시형태에 있어서, 목적 세포의 생사 판정은, 연결 화상의 일치도에 근거하는 특징량 10을 이용하여 행해도 되고, 세포의 생사 판정에 더하여, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지의 판정도 동시에 행해진다.
어느 실시형태에 있어서, 집광점의 개시 위치에 근거하는 특징량 2(또는 특징량 4)에 의하여 세포의 생사 판정을 행하는 경우, 특징량 2가 동일하게 집광점의 개시 위치에 근거하는 특징량 4(또는 특징량 2)로서 기능함으로써, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지의 판정도 행해질 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 집광점의 계속 길이에 근거하는 특징량 3(또는 특징량 4)에 의하여 세포의 생사 판정을 행하는 경우, 특징량 3이 동일하게 집광점의 계속 길이에 근거하는 특징량 4(또는 특징량 3)로서 기능함으로써, 생사 판정의 대상인 세포가 목적 세포인지 아닌지의 판정도 행해질 수 있다.
(기계 학습기)
목적 세포의 생사 판정은, 기계 학습기를 이용하여 행해도 된다. 기계 학습기는, 뉴럴 네트워크, 서포트 벡터 머신 및 부스팅 중 어느 하나의 수법에 의하여 구축된 것이어도 된다. 기계 학습기는, 뉴럴 네트워크에 의하여 구축되고, 심층 학습을 행한 것인 것이 바람직하다.
도 16에 나타내는 바와 같이, 학습 페이즈에 있어서, 기계 학습기는, 교사 데이터가 부여되어 학습한다. 교사 데이터는, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량(이하, "학습용 특징량"이라고 부르는 경우가 있다)과, 학습용 특징량에 대응하는 생세포인지 아닌지의 판정 결과(이하, 정답 생사 판정 결과"라고 부르는 경우가 있다)의 조합이다.
학습 페이즈에 있어서, 기계 학습기에는, 학습용 특징량이 입력된다. 기계 학습기는, 학습용 특징량에 대하여 학습용 생사 판정 결과를 출력한다. 이 학습용 생사 판정 결과 및 정답 생사 판정 결과에 근거하여, 손실 함수를 이용한 기계 학습기의 손실 연산이 이루어진다. 그리고, 손실 연산의 결과에 따라 기계 학습기의 각종 계수의 갱신 설정이 이루어지고, 갱신 설정에 따라 기계 학습기가 갱신된다.
기계 학습기의 학습 페이즈에 있어서는, 학습용 특징량의 기계 학습기로의 입력, 기계 학습기로부터의 학습용 생사 판정 결과의 출력, 손실 연산, 갱신 설정, 및 기계 학습기의 갱신과 같은 상기 일련의 처리가, 교사 데이터가 교환되면서 반복하여 행해진다. 상기 일련의 처리의 반복은, 정답 생사 판정 결과에 대한 학습용 생사 판정 결과의 예측 정밀도가, 미리 정해진 설정 레벨까지 도달한 경우에 종료된다. 이렇게 하여 예측 정밀도가 설정 레벨까지 도달한 기계 학습기가, 운용 페이즈에서 이용되고, 해석용 연결 화상의 특징량의 입력에 대하여, 생사 판정 결과를 출력한다.
생사 판정 공정에 있어서, 세포 현탁액 중의 복수의 세포에 대하여 생사 판정을 행하기 때문에, 세포 현탁액 중의 복수의 세포에 대하여 해석용 연결 화상을 작성한다. 그리고, 이들 해석용 연결 화상의 특징량과, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 목적 세포의 생사 판정을 행해도 된다.
또, 예를 들면, 목적 세포와 다른 물질(예를 들면, 다른 세포, 적혈구, 유적 등)을 포함하는 세포 현탁액을 이용하여, 목적 세포 및 다른 물질의 해석용 연결 화상을 작성한다. 그리고, 이들 해석용 연결 화상의 특징량과, 목적 세포의 이미 알려진 참조용 연결 화상의 특징량 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 목적 세포의 식별과 동시에, 목적 세포의 생사 판정을 행해도 된다.
생사 판정 공정의 생사 판정 플로의 일례에 대하여, 도 17에 나타나는 플로도를 들어 설명한다. 도 17에 나타나는 생사 판정 플로는, 특징량 4~특징량 7을 이용하여 목적 세포의 식별을 행하고, 또한, 특징량 4 및 특징량 5를 이용하여 생사 판정을 행하는 예이다.
도 17에 나타나는 생사 판정 플로는, 특징량 4~특징량 6을 이용하여 목적 세포의 식별을 행하고, 또한, 특징량 4 및 특징량 5를 이용하여 생사 판정을 행하는 예이다.
-스텝 S10-
복수의 해석용 연결 화상 중에서, 하나의 해석용 연결 화상을 선정한다(S10).
-스텝 S12-
해석용 연결 화상의 특징량 6(직경의 크기)이, 미리 정해진 특징량 6의 범위 내인지 아닌지 판정한다(S12). 해석용 연결 화상의 특징량 6이 상기 범위 내인 경우에는, 목적 세포일 수 있다고 하고 다음의 스텝(S14)으로 진행된다.
해석용 연결 화상의 특징량 6이 상기 범위 내가 아닌 경우에는, 목적 세포가 아니라고 판정한다(S22).
-스텝 S14-
해석용 연결 화상의 특징량 7(포커싱면의 위치)이, 미리 정해진 특징량 7의 범위 내인지 아닌지 판정한다(S14). 해석용 연결 화상의 특징량 7이 상기 범위 내인 경우에는, 목적 세포일 수 있다고 하고 다음의 스텝(S16)으로 진행된다.
해석용 연결 화상의 특징량 7이 상기 범위 내가 아닌 경우에는, 목적 세포가 아니라고 판정한다(S22).
-스텝 S16-
해석용 연결 화상의 특징량 4(집광점의 개시 위치)가, 미리 정해진 특징량 4의 범위 내인지 아닌지 판정한다(S16). 해석용 연결 화상의 특징량 4가 상기 범위 내인 경우에는, 목적 세포의 생세포(이하, "목적 생세포"라고 부르는 경우가 있다)일 수 있다고 하고 다음의 스텝(S18)으로 진행된다.
해석용 연결 화상의 특징량 4가 상기 범위 내가 아닌 경우에는, 목적 세포의 생세포가 아니라고 판정한다(S22).
-스텝 S18-
해석용 연결 화상의 특징량 5(집광점의 계속 길이)가, 미리 정해진 특징량 5의 범위 내인지 아닌지 판정한다(S18). 해석용 연결 화상의 특징량 5가 상기 범위 내인 경우에는, 목적 세포의 생세포라고 판정한다(S20).
해석용 연결 화상의 특징량 5가 상기 범위 내가 아닌 경우에는, 목적 세포의 생세포가 아니라고 판정한다(S22).
-스텝 S20, 스텝 S22-
목적 세포의 생세포라고 판정된 경우(S20)에는, 다음의 스텝(S24)으로 진행되고, 목적 세포가 아니라고 판정된 경우(S22)에는, 다음의 스텝(S26)으로 진행된다.
-스텝 S24-
목적 세포의 생세포라고 판정된 연결 화상의 수를 카운트하고, 다음의 스텝(S28)으로 진행된다.
-스텝 S26-
목적 세포의 생세포가 아니라고 판정된 연결 화상의 수를 카운트하고, 다음의 스텝(S28)으로 진행된다.
-스텝 S28-
생사가 미판정인 해석용 연결 화상이 있는 경우에는, 스텝 S10으로 되돌아가, 모든 해석용 연결 화상에 대하여 생사 판정을 행한 경우에는, 생사 판정 플로를 종료한다.
-생세포 농도 결정 공정-
생세포 농도 결정 공정에서는, 생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 결정한다.
본 개시에 있어서, 목적 세포의 생세포 농도는, 단위 체적 당의 생세포의 수[개/ml]를 의미한다.
목적 세포의 생세포 농도는, 예를 들면, 이하와 같이 하여 구할 수 있다.
세포 현탁액을 유지 용기에 수용하고, 무작위로 선택한 시야에 대하여, 유지 용기의 바닥부로부터 세포 현탁액의 액면까지의 사이에 존재하는 모든 목적 세포(목적 세포 이외의 다른 물질(예를 들면, 다른 세포, 적혈구, 유적 등)도 포함할 수 있다)의 해석용 연결 화상을 작성하여 생사 판정을 행하고, 생세포라고 판정된 해석용 연결 화상의 수를 목적 생세포의 수로 한다. 목적 세포의 생세포의 수를, 측정하는데 제공한 세포 현탁액의 체적(즉, 상기 시야의 면적과 세포 현탁액의 높이(유지 용기의 바닥면으로부터 액면까지의 높이)의 곱)으로 나눔으로써, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 구할 수 있다.
(양태 2의 생세포 농도 측정 공정)
양태 2의 생세포 농도 측정 공정은,
디지털 홀로그래픽 현미경으로 목적 세포를 촬상하고, 목적 세포의 위상 이미지를 취득하는 공정(이하, "위상 이미지 취득 공정"이라고 부르는 경우가 있다),
상기 위상 이미지의 위상량 분포와, 미리 정해진 위상량 분포에 근거하여, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정을 행하는 공정(이하, "생사 판정 공정"이라고 부르는 경우가 있다), 및
생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 결정하는 공정(이하, "생세포 농도 결정 공정"이라고 부르는 경우가 있다)을 포함한다.
-위상 이미지 취득 공정-
위상 이미지 취득 공정에서는, 디지털 홀로그래픽 현미경으로 목적 세포를 촬상하고, 목적 세포의 위상 이미지를 취득한다.
목적 세포를 통과한 광과 참조광으로 생성되는 간섭 패턴에 의하여, 목적 세포의 위상 이미지를 얻을 수 있다.
디지털 홀로그래픽 현미경은 특별히 한정되지 않고, 공지의 것을 이용해도 된다.
-생사 판정 공정-
위상 이미지 취득 공정에서는, 목적 세포의 위상 이미지의 위상량 분포와, 미리 정해진 위상량 분포에 근거하여, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정을 행한다.
생세포는, 세포 내부에 굴절률 분포를 갖지만, 사세포는, 생세포와 비교하여, 굴절률 분포가 작다. 따라서, 디지털 홀로그래픽 현미경에 의하여 얻어진 목적 세포의 위상 이미지는, 생세포에 특유의 위상량 분포를 갖는다.
"위상량 분포"는, 세포 내부의 굴절률 분포에 관한 정보, 및 세포의 크기에 관한 정보를 갖는다.
"미리 정해진 위상량 분포의 범위"란, 세포가 목적 세포의 생세포인지 아닌지를 구별하기 위한 임곗값을 의미하고, 위상량 분포가 상기 범위 내인 경우, 세포가 목적 세포의 생세포라고 판정할 수 있다. "미리 정해진 위상량 분포의 범위"의 결정 방법은 특별히 한정되지 않고, 목적 세포의 생사 판정이 가능하도록 적절히 결정해도 된다.
또, 예를 들면, 촬상한 위상 이미지의 위상량 분포와, 목적 세포의 이미 알려진 위상량 분포 및 생세포인지 아닌지의 판정 결과에 근거하여, 목적 세포의 생사 판정을 행해도 된다.
-생세포 농도 결정 공정-
생세포 농도 결정 공정에서는, 생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 생세포 농도를 결정한다. 상세는, 양태 1의 생세포 농도 측정 공정에 있어서 상술한 것과 동일하다.
[액량 결정 공정]
액량 결정 공정에서는, 생세포 농도와 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 세포 현탁액의 액량 및 파종하는 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조제하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정한다.
세포 현탁액의 액량 및 희석액의 액량은, 희석된 세포 현탁액의 생세포 농도가 원하는 값이 되도록 적절히 결정해도 된다.
[희석 공정]
희석 공정에서는, 상기 결정한 액량의 세포 현탁액과 상기 결정한 액량의 희석액을 혼합한다. 혼합하는 수단은 특별히 한정되지 않고, 적절히 선택해도 된다.
이상과 같이 하여, 본 개시에 관한 생세포 농도 조정 방법에 의하여, 목적 세포의 생세포 농도를 신속히 조정할 수 있다.
[세포 생존율 결정 공정]
생세포 농도 조정 방법은, 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포의 생사 판정의 결과에 근거하여, 세포 현탁액 중의 목적 세포의 세포 생존율을 결정하는 공정(이하, "세포 생존율 결정 공정"이라고 부르는 경우가 있다)을 포함해도 된다.
세포 생존율은, 생세포의 수를 전체 세포 수(생세포의 수와 사세포의 수의 합)로 나누어 얻어지는 값이다.
양태 1의 생세포 농도 측정 공정을 행한 경우, 세포 생존율은, 생세포라고 판정된 해석용 연결 화상의 수(예를 들면, 도 17의 스텝 S24)를 생세포의 수로 하고, 해석용 연결 화상의 총 수(예를 들면, 도 17의 스텝 S24 및 S26)를 전체 세포 수로 하여 산출할 수 있다.
양태 2의 생세포 농도 측정 공정을 행한 경우, 세포 생존율은, 생세포라고 판정된 세포의 수, 및 생사 판정을 행한 세포의 총 수(전체 세포 수)로부터 산출할 수 있다.
계대 배양 및 확대 배양에서는, 세포 현탁액에 포함되는 세포종은 목적 세포의 1종류뿐이기 때문에, 이 경우에 얻어지는 세포 생존율은, 전체 목적 세포에 포함되는 목적 생세포의 비율이 된다.
2021년 4월 28일에 출원된 일본 특허출원 2021-076027호의 개시는, 그 전체가 참조에 의하여 본 명세서에 원용된다. 본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허출원, 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허출원, 및 기술 규격이 참조에 의하여 원용되는 것이 구체적이고 또한 개개에 기재된 경우와 동일한 정도로, 본 명세서에 참조에 의하여 원용된다.

Claims (17)

  1. 세포 현탁액을 유지하는 제1 용기,
    상기 세포 현탁액을 희석하는 희석액을 유지하는 제2 용기,
    세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포에 대하여 개별적으로 생사 판정을 행함으로써, 상기 세포 현탁액 중의 상기 목적 세포의 생세포 농도의 측정을 행하는 생세포 농도 측정 장치,
    상기 생세포 농도 및 상기 세포 현탁액의 액량 데이터를 유지하여 제어하는 제어 장치,
    상기 세포 현탁액과 상기 희석액을 혼합하는 혼합부, 및
    희석된 세포 현탁액을 파종하여 세포 배양을 행하는 배양 용기를 갖고,
    상기 제어 장치는, 상기 생세포 농도와 상기 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 상기 세포 현탁액의 액량 및 상기 파종하는 상기 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조정하는 데 필요한 상기 희석액의 액량을 결정하며, 상기 액량의 상기 세포 현탁액과 상기 액량의 상기 희석액을 상기 혼합부로 송액하고, 상기 희석된 세포 현탁액을 파종하는, 세포 배양 장치.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 생세포 농도 측정 장치가, 상기 제1 용기와 상기 혼합부의 사이의 유로로부터 분기된 유로, 또는 상기 제1 용기와 상기 혼합부의 사이의 상기 유로에 배치된, 세포 배양 장치.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 제1 용기로부터 상기 혼합부에 상기 세포 현탁액이 도달할 때까지의 송액 시간의 적어도 일부의 시간으로, 상기 생세포 농도의 상기 측정을 행하는, 세포 배양 장치.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합부가, 상기 배양 용기를 겸하고 있는, 세포 배양 장치.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합부가, 부유 배양 장치인 상기 배양 용기를 겸하고 있는, 세포 배양 장치.
  6. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합부가, 상기 제2 용기를 겸하는, 세포 배양 장치.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 용기가, 다층 배양 용기인, 세포 배양 장치.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생세포 농도 측정 장치가,
    상기 목적 세포에 광을 조사하는 광원,
    상기 목적 세포를 촬상하는 촬상 장치,
    초점면을 변화시키는 수단,
    상기 광이 조사된 상기 목적 세포의 상기 광이 조사된 측과는 반대의 방향으로부터, 상기 목적 세포의 포커싱면을 포함하는 복수의 초점면에서 촬상된, 상기 목적 세포의 화상을 취득하는 화상 취득부,
    각 상기 화상으로부터, 상기 목적 세포의 중심부 및 외주부를 포함하는 화상편을 취득하는 화상편 취득부,
    상기 초점면의 촬상 방향의 순서로 상기 화상편을 연결하여, 해석용 연결 화상을 작성하는 해석용 연결 화상 작성부,
    상기 해석용 연결 화상으로부터 특징량을 추출하는 특징량 추출부, 및
    상기 해석용 연결 화상의 상기 특징량과, 미리 정해진 특징량의 범위에 근거하여, 상기 세포 현탁액 중의 상기 복수의 상기 목적 세포의 생사 판정을 행하는 생사 판정부, 및
    상기 생사 판정의 결과에 근거하여, 상기 세포 현탁액 중의 상기 목적 세포의 상기 생세포 농도를 결정하는 생세포 농도 결정부를 구비한, 세포 배양 장치.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 초점면을 변화시키는 상기 수단이, 상기 목적 세포를 유지하는 유지 용기를 재치한 스테이지를 이동시켜 상기 목적 세포와 상기 촬상 장치의 사이의 거리를 변화시키는 스테이지 이동 기구인, 세포 배양 장치.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 초점면을 변화시키는 상기 수단이, 상기 촬상 장치를 이동시켜 상기 목적 세포와 상기 촬상 장치의 사이의 거리를 변화시키는 촬상 장치 이동 기구인, 세포 배양 장치.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 초점면을 변화시키는 상기 수단으로서, 상기 촬상 장치가 액체 렌즈를 구비한, 세포 배양 장치.
  12. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생세포 농도 측정 장치가,
    상기 목적 세포를 촬상하는 디지털 홀로그래픽 현미경,
    상기 목적 세포의 위상 이미지를 취득하는 위상 이미지 취득부,
    상기 위상 이미지의 위상량 분포와, 미리 정해진 위상량 분포에 근거하여, 상기 세포 현탁액 중의 복수의 상기 목적 세포의 생사 판정을 행하는 생사 판정부, 및
    상기 생사 판정의 결과에 근거하여, 상기 세포 현탁액 중의 상기 목적 세포의 상기 생세포 농도를 결정하는 생세포 농도 결정부를 구비한, 세포 배양 장치.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생세포 농도 측정 장치가, 상기 생사 판정의 결과에 근거하여, 상기 세포 현탁액 중의 상기 목적 세포의 세포 생존율을 결정하는 세포 생존율 결정부를 구비한, 세포 배양 장치.
  14. 세포 현탁액 중의 복수의 목적 세포에 대하여 개별적으로 생사 판정을 행함으로써, 상기 세포 현탁액 중의 상기 목적 세포의 생세포 농도를 측정하는 공정,
    상기 생세포 농도와 상기 세포 현탁액의 액량 데이터에 근거하여, 파종하는 상기 세포 현탁액의 액량 및 상기 파종하는 상기 세포 현탁액을 미리 정해진 생세포 농도로 조제하는 데 필요한 희석액의 액량을 결정하는 공정, 및
    상기 액량의 상기 세포 현탁액과 상기 액량의 상기 희석액을 혼합하는 공정을 포함하는, 생세포 농도 조정 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 생세포 농도를 측정하는 공정이,
    광이 조사된 상기 목적 세포의 상기 광이 조사된 측과는 반대의 방향으로부터, 상기 목적 세포의 포커싱면을 포함하는 복수의 초점면에서 촬상된, 상기 목적 세포의 화상을 취득하는 공정,
    각 상기 화상으로부터, 상기 목적 세포의 중심부 및 외주부를 포함하는 화상편을 취득하는 공정,
    상기 초점면의 촬상 방향의 순서로 상기 화상편을 연결하여, 해석용 연결 화상을 작성하는 공정,
    상기 해석용 연결 화상으로부터 특징량을 추출하는 공정,
    상기 해석용 연결 화상의 상기 특징량과, 미리 정해진 특징량의 범위에 근거하여, 상기 세포 현탁액 중의 복수의 상기 목적 세포의 생사 판정을 행하는 공정, 및
    상기 생사 판정의 결과에 근거하여, 상기 세포 현탁액 중의 상기 목적 세포의 생세포 농도를 결정하는 공정을 포함하는, 생세포 농도 조정 방법.
  16. 청구항 14에 있어서,
    상기 생세포 농도를 측정하는 공정이,
    디지털 홀로그래픽 현미경으로 상기 목적 세포를 촬상하고, 상기 목적 세포의 위상 이미지를 취득하는 공정,
    상기 위상 이미지의 위상량 분포와, 미리 정해진 위상량 분포에 근거하여, 상기 세포 현탁액 중의 복수의 상기 목적 세포의 생사 판정을 행하는 공정, 및
    상기 생사 판정의 결과에 근거하여, 상기 세포 현탁액 중의 상기 목적 세포의 생세포 농도를 결정하는 공정을 포함하는, 생세포 농도 조정 방법.
  17. 청구항 14 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생사 판정의 결과에 근거하여, 상기 세포 현탁액 중의 상기 목적 세포의 세포 생존율을 결정하는 공정을 포함하는, 생세포 농도 조정 방법.
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