JP6322711B2 - 細胞数濃度調整装置およびそれを用いた自動継代培養システム - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養を自動で行う装置に関し、特に継代培養作業を自動で行うことができる装置に関する。

従来、接着依存性細胞の培養をシャーレやフラスコなどの細胞接着された容器内で行う場合、ほとんどの操作が手作業により行われてきた。細胞培養操作は煩雑であり時間がかかるため、多大な人的コストを必要とする。また、培地交換や継代培養操作を行うタイミングなど作業者の経験により行われているため、細胞に与えるダメージの度合いが異なることによる生存率の差異が生じ、作業者による継代培養操作後の細胞の状態に差が生じやすい。そこで、細胞培養を低コストで安定して実施できるよう、細胞培養操作を自動化するための装置が研究開発されている。

例えば、特許文献１には、培養した細胞の回収を自動化し、効率的な継代培養を可能とする細胞培養装置が提案されている。また、特許文献２には、細胞を培養する複数の培養皿と、細胞液を所定の培養皿に選択的に移送させる制御手段とを備えた細胞培養装置を用いて、培養作業におけるコンタミネーションのリスクを低減させることが提案されている。

特開２００８−０７９５５４号公報 特開２００７−１８５１６５号公報

継代培養では、初回に拡大培養した細胞を回収し、適切な細胞数濃度になるよう希釈して再播種する操作が必要となる。安定した継代培養のためには、回収した細胞の希釈は、希釈後の細胞数濃度が一定となるように行うことが望ましい。この点に関し、上記の特許文献１には、細胞培養装置に培養細胞を培地に希釈分散させる希釈機構が設けられている旨が記載されているが、該希釈機構は細胞数を測定した上で希釈するわけではない。培養ごとに細胞の回収量が安定している場合はよいが、例えば再生医療における細胞培養に用いる場合には、細胞を採取した患者などによって細胞の生育度合が異なることが考えられ、希釈後の細胞数濃度が不適切になる可能性がある。そこで、本発明は拡大培養した細胞を、所望の細胞濃度に希釈して再播種する工程を自動で行う装置を提供することを目的とする。

本発明は、取り込んだ細胞懸濁液の単位量あたりの細胞数を測定し、その測定結果に基づいて希釈液を取り込み、所望の細胞数濃度まで希釈する作業を自動で行うことができる装置を提供する。本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）細胞を高濃度で含有する細胞懸濁液を取り込む入口と、細胞を入口の濃度よりも低い所望の濃度で含有する細胞懸濁液を排出する出口とを備え、
入口と出口の間に細胞懸濁液を保持可能な流路を有し、
流路には、内部の細胞懸濁液を流動させるための送液ポンプ、細胞懸濁液の単位量あたりの細胞数濃度に関するデータを採取する細胞数計測器、および流路に提供して細胞懸濁液を希釈する希釈液を保持する希釈液容器が備えられており、
細胞数計測器により得たデータに基づいて少なくとも送液ポンプを制御する制御部をさらに備え、
制御部は、細胞数計測器により得たデータに基づいて細胞数濃度を所望の濃度とするのに必要な希釈液の量を判断し、必要量の希釈液を流路に取り込みかつ細胞懸濁液と希釈液を混合するよう送液ポンプを駆動することを特徴とする、細胞数調整装置。
（２）入口と出口の間に設けられた流路の少なくとも一部が循環流路を形成しており、循環流路には送液ポンプと細胞数計測器とが設けられており、制御部は細胞数計測器から得たデータの変動が予め定めた値の範囲内となるまで送液ポンプを駆動して循環流路を繰り返し流動させることにより細胞懸濁液と希釈液を混合する、（１）に記載の細胞数調整装置。
（３）循環流路にバッファタンクをさらに有する、（２）に記載の細胞数調整装置。
（４）制御部が、送液ポンプを順方向と逆方向の交互に駆動することにより細胞懸濁液と希釈液を混合する、（１）に記載の細胞数調整装置。
（５）細胞数計測器は、細胞懸濁液に照射した光の散乱光または透過光の強度を測定し、光強度値として細胞数濃度に関するデータを採取し、制御部はそのデータを予め求めた細胞数濃度と光強度値の関係に照らして細胞数濃度を算出する、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞数調整装置。
（６）細胞数計測器による細胞数濃度に関するデータの採取を、細胞懸濁液を流動させた状態で断続的または連続的に行う、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞数調整装置。
（７）制御部が、入口からの細胞懸濁液の取り込みを制御する弁と、希釈液の流路への取り込みを制御する弁を制御可能であり、制御部は細胞懸濁液と希釈液の取り込みを交互に繰り返し行うよう、送液ポンプと前記２種の弁とを制御する、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞数調整装置。
（８）拡大培養用の第一の細胞培養装置、細胞数調整装置、および継代培養用の第二の細胞培養装置を含む自動継代培養システムであって、
第一の細胞培養装置は高濃度の細胞懸濁液を排出し、細胞数調整装置は高濃度の細胞懸濁液を所望の細胞数濃度を有する均一の細胞懸濁液へと希釈し、第二の細胞培養装置は希釈された細胞懸濁液を播種して継代培養を行い、
前記細胞数調整装置は、
高濃度の細胞懸濁液を取り込む入口と、細胞を入口の濃度よりも低い所望の濃度で含有する細胞懸濁液を排出する出口とを備え、
入口と出口の間に細胞懸濁液を保持可能な流路を有し、
流路には、細胞懸濁液の単位量あたりの細胞数濃度に関するデータを採取する細胞数計測器、および流路に提供して細胞懸濁液を希釈する希釈液を保持する希釈液容器が備えられており、
細胞数計測器により得たデータに基づいて流路内部の細胞懸濁液の流動を制御する制御部をさらに備え、
制御部は、細胞数計測器により得たデータに基づいて細胞数濃度を所望の濃度とするのに必要な希釈液の量を判断し、必要量の希釈液を流路に取り込みかつ細胞懸濁液と希釈液を混合するよう流路内部の細胞懸濁液の流動を制御する、
前記自動継代培養システム。
（９）制御部が、第一の細胞培養装置または第二の細胞培養装置に備えられた送液ポンプを用いて細胞数調整装置の流路内部の細胞懸濁液の流動を制御する、（８）に記載の自動継代培養システム。
（１０）細胞を高濃度で含有する細胞懸濁液を所望の濃度に希釈するための方法であって、
細胞懸濁液を流動させた状態で、細胞懸濁液に照射した光の散乱光または透過光の強度を断続的または連続的に測定して、光強度値として細胞数濃度に関するデータを採取する工程、
得られたデータを予め求めた細胞数濃度と光強度値の関係に照らして細胞数濃度に変換する工程、および
所望の濃度に希釈するために必要な希釈液の量を算出し、その量の希釈液を細胞懸濁液に添加し混合する工程を含む、前記方法。

本発明によれば、作業者の熟練度に関係なく、拡大培養した細胞を一定濃度で再播種することができ、安定した継代培養操作が可能となる。本発明は、再生医療などの現場において安定した細胞培養を実現するのに寄与する。

本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１４−１４８６３６号の明細書、特許請求の範囲および図面に記載された内容を包含する。

本発明の細胞数調整装置の第１の実施形態を示す概略図である。 細胞懸濁液と希釈液を混合している最中の検出器７による光強度測定の測定値の変動の様子を示すグラフの概略図である。 本発明の細胞数調整装置の第２の実施形態を示す概略図である。 本発明の細胞数調整装置の第３の実施形態を示す概略図である。 第３の実施形態の変形例に係る細胞数調整装置を示す概略図である。 本発明の継代培養システムの全体像を示す概略図である。 継代培養システムの第１の変形例の構成の一部を示す概略図である。 継代培養システムの第２の変形例の構成の一部を示す概略図である。 継代培養システムの第３の変形例の構成の一部を示す概略図である。 継代培養システムの第４の変形例の構成の一部を示す概略図である。 継代培養システムの第５の変形例の構成の一部を示す概略図である。 開放系の細胞培養装置を用いた継代培養システムの全体像を示す概略図である。 細胞懸濁液を供給した細胞数調整装置のフローセルに設けられた検出器で散乱光強度測定を断続的に行った際の値の推移を示すプロット図である。 粒径１０μｍのラテックス粒子の濃度と散乱光強度の関係について求められた検量線である。 Ｃａｃｏ−２細胞の濃度と散乱光強度の関係について求められた検量線である。

（細胞数調整装置：第１の実施形態）
図１は、本発明の細胞数調整装置の第１の実施形態を示す概略図である。第１の実施形態に係る細胞数調整装置１００は、細胞を高濃度で含有する、細胞数濃度（細胞懸濁液の単位量あたりに含まれる細胞の数）が未知の細胞懸濁液を入口１から取り込み、内部で濃度を調整し、入口１の濃度よりも低い所望の濃度で細胞を含有する細胞懸濁液を出口２から排出する機能を有する。入口１と出口２の間は流路３で連通しており、流路内の液体を流動させるための送液ポンプであるペリスタポンプ４が設けられており、制御部１１は少なくともペリスタポンプ４を制御する。流路は必ずしも管径が一様でなくてもよく、例えば少なくとも一部に管径を小さくした狭窄部を設け、集塊状の細胞がそこを通る際にせん断力が働いて細胞が分散されるようにしてもよい。

流路３はその少なくとも一部に弾性素材からなる部分を有し、ペリスタポンプ４は流路３の弾性部分をしごいて流路内部の流体を流動させる。ペリスタポンプは羽根などの駆動部品が流体に直接触れないため、流体を汚染せずに流動させることができ、さらに分散している細胞に与えるダメージも小さいため好ましい。流体を流動させるためのポンプはペリスタポンプに限られないが、ペリスタポンプのように駆動部品が流体に直接触れないものが好ましい。そのようなポンプとしてはダイヤフラムポンプ、シリンジポンプなどが挙げられる。

流路３の一部にはフローセル５が設けられており、細胞懸濁液がここを通過する際に、単位量あたりの細胞数濃度に関するデータとして、光強度が測定される。光源６の光をフローセル５に向けて照射し、その透過光または散乱光、あるいはその両方を検出器７で検出する。この実施形態では、光源６と検出器７が細胞数計測器を構成している。検出器７で検出された透過光または散乱光の強度と細胞数の関係は別途予め求めておき、それと検出器７で検出した光強度とに基づいて細胞数濃度を算出する。透過光または散乱光の強度と細胞数の関係は、例えば培養予定の細胞の濃度既知の細胞懸濁液を数種用意しておき、それぞれについて光強度測定を行い、得られた結果から検量線を作成することにより求めることができる。なお、フローセル５を通過する細胞懸濁液の流量は、入口１から取り込んだ量に基づいて、あるいはフローセル５の容積または断面積とペリスタポンプ４の送液速度に基づいて求めることができる。必要な希釈液量は、細胞数濃度と細胞懸濁液の量に基づいて決定される。

光強度に基づく細胞数濃度測定によれば、細胞懸濁液を流動させた状態で細胞数濃度を算出することができる。細胞懸濁液を流動させた状態で細胞数濃度を算出する場合、検出器７は連続的に絶え間なく光強度を測定していてもよく、あるいは断続的に、すなわち間をあけて、好ましくは一定間隔ごとに測定してもよい。なお、本発明の細胞数調整装置において、細胞数濃度の算出手段は他のものであってもよい。

流路３の一部は分岐して分岐流路８と接続されており、分岐部分には切替え弁９が設けられている。切替え弁９は、分岐流路８と入口１側の流路を切替えることができる。切替え弁にはピンチ弁を使用することが好ましい。ピンチ弁は、弾性素材からなる流路を外側から押しつぶして（ピンチして）流れを制御するものであり、流体に直接触れることがないため、流体も弁自身も汚染せずに流体を制御することができる。切替え弁９は、２つの流路を切替える機能を持ち、２つのピンチ弁を組み合わせても実現できるが、１つのアクチュエータで２つの流路を同時かつ互い違いに開閉制御できるユニバーサル型のものを用いてもよい。制御部１１は、切替え弁に設けられたアクチュエータを制御することにより弁の切替えを制御する。後述する他の切替え弁についても同様である。

分岐流路８の先には希釈液の入った希釈液容器１０が接続されている。制御部１１は、少なくともペリスタポンプ４を、好ましくは併せて切替え弁９も制御し、検出器７の検出結果に応じて取り込んだ細胞懸濁液に希釈液を添加し、さらに細胞懸濁液と添加した希釈液が十分に撹拌され細胞数濃度が均一になるようにする。その制御部１１によるペリスタポンプ４および切替え弁９などの制御について、以下詳細に説明する。

制御部１１は、切替え弁９が分岐流路８を閉塞して入口１側流路を選択している状態でペリスタポンプ４を駆動し、入口１から細胞懸濁液の原液を取り込む。取り込まれた細胞懸濁液はそのままフローセル５まで移送される。細胞懸濁液がフローセル５を通過する際に検出器７による光強度測定を行う。制御部１１は、その測定結果から細胞数濃度を算出し、予め定めてある目標値と比較した上で、取り込んだ原液の量と併せて計算し、必要となる希釈液の量を決定する。

制御部１１は、次に切替え弁９を分岐流路８側を選択している状態に切替え、ペリスタポンプ４を一定時間駆動し、希釈液容器１０から希釈液を流路３内に取り込む。流路３内は、調整前の細胞数濃度が高い細胞懸濁液と希釈液の２液が不均一に存在する状態となる。次に制御部１１は、ペリスタポンプ４の回転向きを正転・逆転に何度か切り替えて流路３内で液を前後に繰り返し移動させることにより２液を混合する。流路３は、その移動のための空間も含め、細胞懸濁液と希釈液とを保持するに十分な空間を有している。なお、２液の混合は、ペリスタポンプ４の回転の向きを切り替えるだけではなく、例えばペリスタポンプの回転速度を変えて流速を変化させることによっても行うことができる。

図２は、細胞懸濁液と希釈液を混合している最中の検出器７による光強度測定の測定値の変動の様子を示すグラフの概略図である。光強度測定の測定値は、最初のうちは流路３内における細胞数濃度が不均一であるため振れ幅が大きいが、ペリスタポンプ４の回転向きの切替えを繰り返し行うにつれ、細胞数濃度が徐々に均一となって振れ幅が小さくなっていき、最終的には目標値、すなわち予め定めた細胞数濃度に対応する光強度の値に収束する。そこで、光強度測定の測定値に時間的変化が所定の値（目標値±Δｘ）の範囲内となった時点、好ましくは変化が無くなった時点で、制御部１１は流路３内の液が均一になったと判断する。仮に収束した値が目標値と異なる場合には、制御部１１が上述した希釈工程を再度繰り返すようにしてもよい。希釈工程により所望の細胞数濃度となった細胞懸濁液は、ペリスタポンプ４を駆動させて出口２から排出される。

上述した希釈工程では、入口１からの細胞懸濁液の取り込みおよび希釈液容器１０からの希釈液の取り込みをそれぞれ１回ずつ行うとしたが、制御部１１は切替え弁９をより短いスパンで切り替えて、細胞懸濁液と希釈液とを少量ずつ複数回に分け、交互に繰り返し取り込むようにしてもよい。そのようにすると、２液がより混合しやすくなり、細胞にかかる負担を低減することができるため好ましい。

取り扱う細胞懸濁液の量に対し流路３などの断面積が小さいと、混合のために前後に繰り返し移動する際などに流路内の移動に時間がかかり、細胞に負担がかかってしまう。したがって、少なくとも細胞懸濁液が通過する流路３、さらに好ましくはフローセル５の断面積は、扱う細胞のサイズや取り込む細胞懸濁液の量を考慮して十分な大きさを有していることが好ましい。例えば、取り込む細胞懸濁液の量が１ｍＬ〜１０００ｍＬの範囲であれば、流路３を構成するチューブとして直径１〜１０ｍｍ程度のものを使用することが好ましく、フローセル５としては１〜１０ｍｍ角のものを使用することが好ましい。

流路３を構成するチューブの材質は、細胞への影響がないか、あるいは極めて少ないものを使用することが好ましい。そのような材質の一例として、医療用シリコンチューブが挙げられる。また、フローセル５はガラス製のものでもよいが、安価な樹脂製のものを用いると、一度細胞を通したものは流路３を含めて使い捨てとするようにしやすくなるためより好ましい。

細胞数濃度を測定する方法として、上述のように、光源６をフローセル５に向けて照射し、その透過光または散乱光、あるいはその両方を検出器７で検出する方法を採用すると、細胞懸濁液を流動させたままの状態で細胞数濃度を測定することができるため特に好ましい。しかしながら、細胞数濃度の測定方法はこれに限定されるものではなく、他の方法を採用してもよい。例えば、流路３中に何らかの観察窓を備え、ＣＣＤカメラ付きの顕微鏡で画像（静止画または動画）を撮影し、画像から細胞数を算出するようにしてもよい。細胞懸濁液を流動させた状態で測定するためにはリアルタイムの処理が求められるが、そのような高速な画像処理が可能であれば、光強度測定に換えて細胞数濃度測定手段として採用することができる。

図１では、分岐流路８につながる切替え弁９、ペリスタポンプ４およびフローセル５がこの順番で流路３に設けられているが、この実施態様においてはこの順番に限定されるものではなく、各機構は任意の位置に設けることができる。

なお、細胞懸濁液は静置すると細胞が沈降してしまうため、本発明の細胞数調整装置は、希釈液を加えて細胞懸濁液を希釈するのみならず、細胞懸濁液を単に撹拌するための装置として用いてもよい。

（細胞数調整装置：第２の実施形態）
図３は、本発明の細胞数調整装置の第２の実施形態を示す概略図である。第２の実施形態に係る細胞数調整装置１０１は、基本構成は第１の実施形態と同様であるが、ペリスタポンプ４通過後の流路を分岐し、その先を通過前の流路に戻し、流路を環状構造とした構成とした点において異なる。ポンプ通過前の流路を３ａ、通過後の流路を３ｂ、分岐した帰還流路を１２とする。帰還流路１２への分岐部には切替え弁１３を設置し、出口２側流路と帰還流路１２の選択を可能にする。希釈液容器１０が接続されている分岐流路８は流路３ａ側に設置する。

第２の実施形態に係る細胞数調整装置１０１による希釈工程は次のように行う。まず、制御部１１は、切替え弁１３は帰還流路１２を閉塞し出口２側流路を選択するように、また切替え弁９は分岐流路８を閉塞し入口１側流路を選択するようにし、その状態でペリスタポンプ４を駆動して入口１から細胞懸濁液の原液を取り込む。光強度測定、希釈液の取り込みは第１の実施形態と同様に行う。

第２の実施形態では、調整前の細胞数濃度が高い細胞懸濁液の原液と希釈液の２液の混合は、流路３ａ、３ｂおよび帰還流路１２を利用して行う。まず制御部１１は切替え弁１３を帰還流路１２を選択するように切替え、その状態でペリスタポンプ４を駆動させる。細胞懸濁液と希釈液は帰還流路１２、流路３ａおよび３ｂから構成される循環流路内を循環しながら撹拌され、細胞数濃度が徐々に均一となる。この際、検出器７では図２に示したものと同様の計測結果が得られる。第２の実施形態によれば、帰還流路１２を設けたことにより、ペリスタポンプ４の回転向きの切替えを行わなくても液の混合が可能となり、光強度測定などによる細胞数濃度測定の安定性の向上、ペリスタポンプ４の負担軽減、制御部１１による制御を単純化できる、および細胞への負担を軽減できるなどの効果が得られる。

帰還流路１２の合流点において、流路３ａのポンプ側の圧力は、入口１側より低圧であるため、帰還流路１２から流入する液はポンプ側に流れ、入口１側に逆流することはない。しかし、必要に応じて、流路３ａの帰還流路１２の合流点より入口１側に逆流防止用のピンチ弁や逆止弁を設けてもよい。

（細胞数調整装置：第３の実施形態）
図４は、本発明の細胞数調整装置の第３の実施形態を示す概略図である。第３の実施形態に係る細胞数調整装置１０２は、基本構成は第２の実施形態と同様であるが、帰還流路１２にバッファタンク１４が設けられている点において相違する。

第２の実施形態のように循環流路構造すると、既に説明したように細胞懸濁液と希釈液の混合において有利であるが、その一方で循環流路の容積内で混合を行わなければならないという制約がある。入口１から取り込む細胞懸濁液の原液は細胞数濃度が未知であるため、希釈液の量がどれだけ必要となるかは事前に判断できず、循環流路内に保持する液の総量は可変的である。循環流路の容積が想定され得る最大の液量に対応できるよう、循環流路長を長くとることも考えられるが、実際の液量が最大液量よりも少ない場合には混合の効率が悪くなると考えられる。図４に示した第３の実施形態では、バッファタンク１４を設けることによりこの問題を解決している。

バッファタンク１４は、帰還流路１２の途中に設けられており、バッファタンクの前後の流路をそれぞれ１２ａ、１２ｂとする。例えば、１２ａはバッファタンクの上部から入り、１２ｂはタンク下部から出るようにバッファタンク１４に接続される。バッファタンク１４は大気開放されていてもよく、その場合には途中にＨＥＰＡフィルタ１５を設けて外部からの菌の混入を防ぐことが好ましい。帰還流路１２ｂの合流点には、切替え弁１６を設け、入口１側の流路とペリスタポンプ側の流路を選択可能とする。切替え弁には、１つのアクチュエータで２つの流路を同時に閉開互い違いに制御できるユニバーサル型のものを用いるのが好ましい。

バッファタンクの目的は取扱い液量を可変にすることであり、必ずしも図示したような構造を有するタンクでなくてもよく、例えば、伸縮素材からなる液体バッグや、折紙構造で折り畳まれ容積を自在に変えられるバッグをバッファタンクとして用いてもよい。そのようなバッグは、空気を逃す構造が組み込まれていてもよく、あるいは空気を逃さずバッグ内に閉じ込める構造としてもよい。バッグの出口を下方に設置することにより、空気を混入させず液体のみを排出するようにすることができる。

第３の実施形態に係る細胞数調整装置１０２による希釈工程は次のように行う。まず、制御部１１は切替え弁１３を出口２側流路を閉塞し帰還流路１２ａ側を選択するように、また切換え弁１６を帰還流路１２ｂを閉塞し入口１側流路を選択するように制御し、その状態でペリスタポンプ４を駆動して入口１から細胞懸濁液の原液を取り込む。取り込まれた液はバッファタンク１４に送られる。この際、細胞懸濁液の原液はフローセルを通過し、光強度測定が行われる。制御部１１は、その測定結果から細胞数濃度を算出し、予め定めてある目標値と比較した上で、取り込んだ原液の量も併せて計算し必要となる希釈液の量を決定し、切替え弁９を切り替えて希釈液容器１０から希釈液を取り込む。

取り込まれた細胞懸濁液の原液と希釈液は、切替え弁１６が帰還流路１２ｂを選択するように切替えた後、バッファタンク１４を含めた帰還流路１２ａ、１２ｂおよび流路３ａ、３ｂから構成される循環流路内を循環することにより混合される。所望の細胞数濃度となった細胞懸濁液は、切替え弁１３を出口２側流路を選択するように切替えた後、ペリスタポンプ４を駆動させて出口２より排出することができる。

循環流路内では、バッファタンク１４で上部から入った液が落下することにより、およびその他の流路で細管を通過することにより混合が行われる。バッファタンク１４の容量および各流路の容量は、バッファタンク１４とその他の流路における攪拌効率、および想定され得る取り扱い液量などの観点から適宜決定できる。一例として、取り扱い液量がおおよそ１２０ｍＬ〜１８０ｍＬの範囲であれば、循環流路の容量を１００ｍＬとし、バッファタンク１４の容量を１００ｍＬとすることが挙げられる。バッファタンク１４を設けると、循環流路内から空気を除くことができるため、細胞数測定が安定するという利点も併せて得られる。

図５は第３の実施形態の変形例に係る細胞数調整装置１０３を示す概略図である。これまで説明した実施形態では、希釈液の取り込みを、細胞懸濁液の取り込みや、細胞懸濁液と希釈液の混合に用いるものと同じペリスタポンプ４で行っていた。懸濁液の取り込みや混合のためにはポンプ流量がある程度大きい方が効率良いが、流量の大きいポンプは希釈液取り込み時の微調整にはあまり適していない。また、ペリスタポンプ４自体も流量のばらつきが大きく、微小量の液の注入にはあまり適していない。そこで、図５に示した変形例に係る細胞数調整装置１０３では、希釈液の添加を新たに設けた微量ポンプ１８により行うよう構成されている。微量ポンプ１８としては、例えばダイヤフラムポンプやシリンジポンプなどを利用することができる。この変形例において、希釈液の添加をバッファタンク１４に注入することにより行うようにすると、第３の実施形態で設けられていた切替え弁９は不要となる。

（細胞数調整装置を利用した継代培養システム）
以下、本発明の細胞数調整装置を使用した継代培養システムについて説明する。本発明の細胞数調整装置は、入口と出口を閉じると、外部から菌の混入がない閉鎖系を形成しているので、閉鎖系の細胞培養装置と接続すると、システム全体を閉鎖系とすることができる。以下、閉鎖系細胞培養装置との接続例を説明する。

図６は本発明の継代培養システムの全体像を示す概略図である。閉鎖系細胞培養装置２００において、培養容器１９は、供給バッグ２０および回収バッグ２１と接続され、一つの閉鎖系を形成している。閉鎖系内で培養を行うことで、外部からの菌の混入がない、安全かつ信頼ある培養を行うことができる。供給バッグ２０は複数あってもよく、それぞれのバッグに接続されている個別流路２２は並列に構成され、かついずれも共通流路２３に繋がっており、個別流路２２上に設置された切替え弁２４でいずれかの供給バッグ２０を選択できるようになっている。ここでは、細胞懸濁液２０ａ、培地２０ｂ、剥離液２０ｃ、滅菌空気２０ｄがそれぞれの供給バッグに入っていることとするが、供給バッグの内容物はこれらに限定されない。なお、滅菌空気は、先に入っている液体を後ろから押し出し、液体を排出するために使用する。供給バッグの代わりに、ＨＥＰＡフィルタを接続し大気開放としてもよい。ＨＥＰＡフィルタにより、菌の混入を防ぐことができる。

回収バッグ２１も同様に複数あってもよく、それぞれの個別流路２５は並列に構成され、かついずれも共通流路２６に繋がっており、個別流路２５上に設置された切替え弁２７で、いずれかの回収バッグ２１を選択できるようになっている。ここでは、廃液２１ａ、細胞懸濁液２１ｂをそれぞれの回収バッグに入れることとするが、回収バッグ２１の内容物はこれらに限定されない。

切替え弁２４、２７でいずれかの供給バッグ２０および回収バッグ２１を選択して、ペリスタポンプ２８を駆動することで、培養に必要な送液を行う。細胞懸濁液２０ａを培養容器１９に播種後、定期的に培地交換を実施し、培養を行う。培養後、剥離液２０ｃにより、細胞を培養容器１９から剥離させ、回収バッグ２１ｂに回収する。

閉鎖系細胞培養装置と細胞数調整装置と接続し、継代を行うには、以下のようにする。最初の拡大培養を行う閉鎖系細胞培養装置２００と、継代後の培養を行う閉鎖系細胞培養装置２１０の２つの培養装置がある。２つの培養装置の基本的な構成は同じである。培養量は後者が多いため、後者には、より大面積の容器を使用してもいいし、複数の培養容器を用意し、並列に接続して図示しない切替え弁で培養容器を切替えながら送液を行ってもよい。

培養装置２００の細胞懸濁液の入った回収バッグ２１ｂと細胞数調整装置１０２の入口１を接続流路３０で、細胞数調整装置１０２の出口２と培養装置２１０の細胞懸濁液を入れる供給バッグ２０ａを接続流路３１で、それぞれ接続する。ここで、細胞数調整装置１０２は、上述の第２の実施形態に係るものであるが、他の実施形態に係るものを用いてもよい。

細胞数調整装置１０２は、回収バッグ２１ｂから原液となる細胞懸濁液を取り込む。細胞の回収量は拡大培養の結果によって一様ではないため、ペリスタポンプ４を長めに駆動し、一旦全量をバッファタンク１４に送るとよい。また、取り込み中も検出器７で光強度測定を行い、液が到達してから液切れが起こるまでの時間を測定し、その時間から取り込んだ液量を算出してもよい。

細胞数調整装置１０２において上述のような工程に従って目標値の細胞数濃度となるように均一に希釈された細胞懸濁液は、培養装置２１０の細胞懸濁液用供給バッグ２０ａに送られる。細胞数調整装置１０２の中に保持された細胞懸濁液の全量を送液してもよく、検出器７で光強度測定を行い、その測定結果に基づいて送液量を算出してもよい。目標値の細胞数濃度に希釈された細胞懸濁液が送液された培養装置２１０は、培養装置２００と同様にして培養を行う。

（継代培養システムの変形例および応用例）
図６を用いて説明したような継代培養システムのように、前段の装置から後段の装置への細胞懸濁液の授受を、前段の装置で操作が完了してから後段の装置に送るようにしているが、時間短縮のため、装置間で細胞懸濁液の授受を直接やり取りするようにしてもよい。この際、１本の流路にペリスタポンプを直列して使用する形とする場合、双方のポンプの送りの速度が同じでなければペリスタポンプ間の流路の内圧に問題が生じるため、双方のポンプの間に緩衝領域を設けるのが好ましい。緩衝領域は、内圧を変えることなく容積を自在に変えることができるものであり、例えば伸縮素材からなる液体バッグや、折紙構造で折り畳まれ容積を自在に変えられる袋体、バッファタンク１４のような大気解放された構造物などが緩衝領域として利用できる。図６に示した構成であれば、培養装置２００の回収バッグ２１ｂと培養装置２１０の供給バッグ２０ａが緩衝領域の役割を果たす。

（継代培養システム：第１の変形例）
図７は継代培養システムの第１の変形例の構成の一部を示す概略図である。この構成では、拡大培養用の細胞培養装置から排出された細胞懸濁液を細胞数調整装置に直接送り込む。細胞培養装置２０１は細胞培養装置２００と基本的な構成は同じであるが細胞懸濁液の回収バッグがなく、接続流路３２で細胞数調整装置１０４と接続されている。細胞数調整装置１０４は、バッファタンク１４がペリスタポンプ４と入口１の間に置かれている構成を有する。入口１側の流路を３ａ１、ポンプ側の流路を３ａ２とし、３ａ１はバッファタンク１４の上部から入り、３ａ２はタンク下部から抜けていく。ペリスタポンプ４通過後の流路３ｂを分岐し、その一方を帰還流路１２とし、バッファタンク１４の上部に戻す。この構成では、帰還流路１２の合流点における切替え弁が不要になる。流路３ｂと帰還流路１２との分岐には切替え弁１３が設けられている。希釈液容器１０に繋がる分岐流路８は、バッファタンク１４とペリスタポンプ４の間に設ける。培養装置２０１から排出された細胞分散液は、細胞培養装置２０１のペリスタポンプ２８により細胞数調整装置１０４のバッファタンク１４まで送られる。細胞数調整装置１０４で細胞数濃度を調整された細胞懸濁液は、細胞数調整装置１０４のペリスタポンプ４通過後の流路に緩衝領域が設けられていないため、流路３１を介して継代培養用の細胞培養装置２１０の細胞懸濁液供給バッグ２０ａに送られる。

（継代培養システム：第２の変形例）
図８は継代培養システムの第２の変形例の構成の一部を示す概略図である。この構成では、継代培養用の細胞培養装置２１１に細胞懸濁液供給バッグが設けられていない。細胞数調整装置１０５は、バッファタンク１４がペリスタポンプ４と出口２の間に設けられた構成を有する。ポンプ側の流路を３ｂ１、出口２側の流路を３ｂ２とする。３ｂ１はバッファタンク１４の上部から入り、３ｂ２はバッファタンク１４の下部から抜けていく。流路３ｂ２を分岐し、その一方を帰還流路１２とし、ペリスタポンプ通過前の流路３ａに戻す。合流点には切替え弁１６を設ける。希釈液容器１０に繋がる分岐流路８は、流路３ａ側に設ける。この構成においては、流路３ｂ２と帰還流路１２の分岐部の切替え弁は不要である。流路３ｂ２から継代培養用の培養装置２１１のペリスタポンプ２８までの間には緩衝領域が存在せず液体の逃げ道はないため、帰還流路１２の分岐部に切替え弁がなくても、ペリスタポンプ４を駆動させた際に逆流が生じない。ただし、この空間の空気量が多い場合、空気が膨張し、その分出口２から帰還流路側への逆流がありうるため、逆流防止用に帰還流路との分岐から出口２の間にピンチ弁や逆流防止用の逆止弁を設置してもよい。なお、拡大培養用の細胞培養装置２００には回収バッグ２１ｂが設けられており、細胞数調整装置１０５との間の緩衝領域として機能する。細胞数調整装置１０５で細胞数濃度を調整された細胞懸濁液は、継代培養用の培養装置２１１のペリスタポンプ２８を駆動させることにより移送され、培養装置２１１にて直接播種される。

（継代培養システム：第３の変形例）
図９は継代培養システムの第３の変形例の構成の一部を示す概略図である。この構成では、拡大培養用の細胞培養装置、細胞数調整装置および継代培養用の細胞培養装置のいずれにも緩衝領域が設けられていない。細胞数調整装置１０６は、入口１と出口２を結ぶ流路３Ａと３Ｂの間にバッファタンク１４が設けられ、ペリスタポンプ４は帰還流路１２の途中に設けられている。帰還流路１２はバッファタンク１４の上部に入るようにし、切替え弁を不要とした。希釈液容器１０に繋がる分岐流路８は、帰還流路１２の途中、ペリスタポンプ４の手前に設ける。この構成では、拡大培養用の細胞培養装置２０１からバッファタンク１４に送り込まれた細胞懸濁液は、ペリスタポンプ４を駆動させることにより循環流路内を循環する。必要に応じて、入口１とバッファタンク１４を繋ぐ流路３Ａ、または流路３Ｂの帰還流路１２への分岐の後かつ出口２の手前の流路に弁を設けてもよい。継代培養用の細胞培養装置２１１への細胞懸濁液の送り込みは、細胞培養装置２１１のペリスタポンプ２８を駆動させることにより行う。

（継代培養システム：第４の変形例）
図１０は継代培養システムの第４の変形例の構成の一部を示す概略図である。ここで用いている細胞数調整装置１０７は、帰還流路を有さず、液を前後に流動させることにより混合を行う。細胞数調整装置１０７は、それ自体はペリスタポンプを持たず、培養装置のペリスタポンプを利用して液を流動させる。拡大培養用の培養装置２０１の切替え弁２７が流路３２を選択している状態で、培養装置２０１のペリスタポンプ２８を駆動し、細胞懸濁液を細胞数調整装置１０７へ送り込む。希釈液の取り込みは、切替え弁９を切替えて分岐流路側を開放する状態とし、ペリスタポンプ２８の回転向きを逆転させて行う。切替え弁９を元に戻し、ペリスタポンプの回転向きを何度か切替えて混合を行う。細胞数濃度を調整した細胞懸濁液は、細胞培養装置２０１のペリスタポンプにより、継代培養用の細胞培養装置２１０の供給バッグ２０ａまで送液される。その後、細胞培養装置２０１側の切替え弁２７を切替え、接続流路３２を閉鎖しておく。

（継代培養システム：第５の変形例）
図１１は継代培養システムの第５の変形例の構成の一部を示す概略図である。この構成では、第４の変形例をさらに変更したものであり、細胞培養装置と細胞数調整装置の間の細胞懸濁液の受け渡しをすべて直接的に行うようにした。細胞数調整装置１０８は、流路３の入口１側と出口２側にそれぞれ分岐流路３４を設け、２つの分岐流路を大気開放された共通流路３６に接続した構造となっている。共通流路３６は切替え弁３５で切替え可能となっており、共通流路にはＨＥＰＡフィルタ３７が接続され、外部からの菌の混入を防いでいる。まず、切替え弁３５を出口２側を解放した状態とし、かつ拡大培養用の細胞培養装置２０１の切替え弁２７を接続流路３２を選択した状態してペリスタポンプ２８を駆動すると、細胞懸濁液が細胞数調整装置１０８へと送られる。検出器７で光強度測定を行い、必要に応じて、切替え弁９を切替えて分岐流路側を開放する状態とし、ペリスタポンプ２８の回転向きを逆転させて希釈液を取り込む。その後、細胞培養装置２０１側の切替え弁２７を切替え、接続流路３２を閉鎖しておく。細胞数濃度を調整した細胞懸濁液は、切替え弁３５を切替えて出口２側の分岐流路３４を閉塞させた状態で、細胞培養装置２１１のペリスタポンプ２８を駆動させることにより、細胞培養装置２１１に送液される。

（継代培養システム：応用例）
ここまで細胞培養装置を閉鎖系のものを用いた継代培養システムを前提として説明したが、本発明の継代培養システムは、閉鎖系のみならず、開放系の細胞培養装置も利用することができる。開放系の細胞培養装置は、一般的な手法の細胞培養と同じく、培養容器のふたを外して培地交換するなど、密閉されてない培養容器で培養を行う装置である。菌の混入のリスクは高まるが、液体ハンドリングの自由度が高いのが利点である。菌の混入のリスクは、装置をクリーンルーム内に装置を設置することで減じることができる。

図１２は、開放系の細胞培養装置を用いた継代培養システムの全体像を示す概略図である。開放系の細胞培養装置３００は、密閉されていない培養容器３８と、同じく密閉されていない供給液容器３９、回収液容器４０を持つ。供給液として、細胞懸濁液３９ａ、培地３９ｂ、剥離液３９ｃがあり、回収液として、排液４０ａ、細胞懸濁液４０ｂがある。これらの液体は、分注機構４１により、吸引、吐出が行われる。培養容器はインキュベータ４２内に設置され、培養に適した環境で培養される。

細胞数調整装置１０２の入口１および出口２にはそれぞれ取り込み流路４３および取り出し流路４４が接続され、それぞれ拡大培養用の細胞培養装置３００の回収液容器４０ｂ、継代培養用の培養装置３１０の供給液容器３９ａ内に延びている。拡大培養用の細胞培養装置３００で培養され、回収された細胞懸濁液は分注機構４１により、回収液容器４０ｂ内に回収される。細胞数調整装置は取り込み流路４３から細胞懸濁液を取り込み、細胞数濃度を調整した後、取り出し流路４４から継代培養用の細胞培養装置３１０の供給液容器３９ａに排出する。

開放系の細胞培養装置を用いた継代培養システムにおいて、細胞数調整装置１０２に換えて細胞数調整装置１０６、１０７または１０８を用いる場合、それらの細胞数調整装置は自吸および自排能力を有しないため、そのままで開放系の培養装置と使用することはできない。別途バッファタンク１４との送排液を可能とする手段が必要となる。開放系の培養装置と接続する場合は、細胞数調整装置１００または１０３を用いるのが好ましい。あるいは細胞培養装置のうち一方が閉鎖系のものであれば、細胞数調整装置１０４または１０５も利用することができる。

１．細胞分散液の調製
−８０℃にて冷凍保存されているＣａｃｏ−２（ヒト大腸がん細胞株）４．６×１０^６ｃｅｌｌｓを１０％ＦＢＳ(Fetal Bovine Serum)を添加したＣａｃｏ−２細胞用培養液９ｍＬに浮遊させたものを、細胞培養装置の底面積７８．５ｃｍ^２の拡大培養容器に全量播種し培養したところ、２日後に８０％コンフルエントとなった。その後、３ｍＬのＰＢＳによる細胞洗浄、２ｍＬの０．２５％トリプシン−１ｍＭ ＥＤＴＡを導入し３７℃で４分間静置することによる細胞剥離、３ｍＬの培養液の導入によるトリプシン活性の停止、剥離された細胞を含む培養液の回収を行った。

回収された細胞を含む培養液５ｍＬを図３に示したものと同等の構成を有する細胞数調整装置に供給した。細胞数調整装置の流路は内径３．１５ｍｍのシリコンチューブからなり、その合計長は５２０ｍｍとした。流路の一部には、細胞が分散した状態となりやすくなるよう、内径０．７ｍｍ×長さ１ｍｍの細管を設けた。また、光強度測定を行うためのフローセルは５ｍｍ角のものを用いた。循環流路を１０回程度循環するようペリスタポンプを駆動させながら検出器により散乱光強度測定（波長７００ｎｍ、測定角度２０°）を断続的に行ったところ、測定値が時間とともに収束する様子が観察された（図１３）。細胞懸濁液の様子を目視で確認したところ、同じ試料を１０回程度手作業でピペッティングして細胞を分散させたものと同等の細胞分散状態であると判断された。

２．散乱光強度測定による細胞数測定
（１）ラテックスビーズによるシミュレーション
粒径１０μｍのラテックス粒子（ポリサイエンス社製）を用いて、散乱光強度測定に基づいた濃度測定が、セルカウンターで得られた値と比較して、実際の濃度をどの程度再現するかを検証した。まず、濃度既知のラテックス粒子懸濁液を数種用意し、それぞれ図３に示したものと同等の構成を有する細胞数調整装置に入れ、フローセルに設けられた検出器で散乱光強度測定を行って検量線を作製した（図１４）。次に、５．０×１０^５個／ｍＬの濃度のラテックス粒子懸濁液を用意し、散乱光強度測定を６回計測し、各測定値を検量線に照らして濃度を算出した。平均濃度は５．２４×１０^５個／ｍＬ、標準偏差は０．００９７×１０^５個／ｍＬ、再現性はＲＳＤ＝０．１９％であった。一方、セルカウンターでの測定は、同じラテックス粒子懸濁液とトリパンブルー色素とをピペッティングで十分混合したものを測定した。６回測定を行ったところ、平均濃度は４．５９×１０^５個／ｍＬ、標準偏差は０．３３６×１０^５個／ｍＬ、再現性はＲＳＤ＝７．３２％であった。

（２）Ｃａｃｏ−２細胞を用いた散乱光強度測定
濃度既知のＣａｃｏ−２細胞懸濁液を数種用意し、上記（１）と同様に散乱光強度測定を行って検量線を作製した（図１５）。

３．細胞数調整および継代培養
濃度未知のＣａｃｏ−２細胞懸濁液を用意し、図３に示したものと同等の構成を有する細胞数調整装置に入れ、フローセルに設けられた検出器で散乱光強度測定を行った。得られた値を上記２（２）で得た検量線に照らしたところ、細胞懸濁液の濃度は１．２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであると判断された。この値と既知のＣａｃｏ−２細胞の増殖曲線に基づき、２日後に底面積７８．５ｃｍ^２の継代培養容器２個に５０％コンフルエントの状態にするために必要の再播種細胞濃度が制御部により計算され、１５ｍＬの希釈液が供給された。希釈液は細胞懸濁液と十分混合され、細胞数調整装置に接続された継代培養用の細胞培養装置に供給された。細胞培養装置では、培養容器２個に各１０ｍＬの濃度調整済みの細胞懸濁液が播種された。

継代された細胞の活性度を確認するために再播種した細胞を２日間培養し、増殖率と生存率を調べた。その結果、２日後の細胞濃度は、３．８×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、細胞生存率は９６〜９７％であった（ｎ＝４）。見た目の細胞占有率は５０％コンフルエントであった。

本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

１…入口、２…出口、３…流路、４…ペリスタポンプ、５…フローセル、６…光源、７…検出器、８…分岐流路、９…切替え弁、１０…希釈液容器、１１…制御部、１２…帰還流路、１３…切替え弁、１４…バッファタンク、１５…ＨＥＰＡフィルタ、１６…切替え弁、１７…希釈液流路、１８…微量ポンプ、１９…培養容器、２０…供給バッグ、２１…回収バッグ、２２…個別流路、２３…共通流路、２４…切替え弁、２５…個別流路、２６…共通流路、２７…切替え弁、２８…ペリスタポンプ、２９…インキュベータ、３０…接続流路、３１…接続流路、３２…接続流路、３３…接続流路、３４…分岐流路、３５…切替え弁、３６…共通流路、３７…ＨＥＰＡフィルタ、３８…培養容器、３９…供給液容器、４０…回収液容器、４１…分注機構、４２…インキュベータ、４３…取り込み流路、４４…取り出し流路、１００〜１０８…細胞数調整装置、２００，２０１…細胞培養装置（拡大培養用）、２１０，２１１…細胞培養装置（継代培養用）、３００…開放系細胞培養装置（拡大培養用）

Claims (9)

1. 細胞を高濃度で含有する細胞懸濁液を取り込む入口と、細胞を入口の濃度よりも低い所望の濃度で含有する細胞懸濁液を排出する出口とを備え、
   入口と出口の間に細胞懸濁液を保持可能な流路を有し、
   流路には、内部の細胞懸濁液を流動させるための送液ポンプ、細胞懸濁液の単位量あたりの細胞数濃度に関するデータを採取する細胞数計測器、および流路に提供して細胞懸濁液を希釈する希釈液を保持する希釈液容器が備えられており、
   細胞数計測器により得たデータに基づいて少なくとも送液ポンプを制御する制御部をさらに備え、
   制御部は、細胞数計測器により得たデータに基づいて細胞数濃度を所望の濃度とするのに必要な希釈液の量を判断し、必要量の希釈液を流路に取り込みかつ細胞懸濁液と希釈液を混合するよう送液ポンプを駆動し、
   入口と出口の間に設けられた流路の少なくとも一部が循環流路を形成しており、循環流路には送液ポンプと細胞数計測器とが設けられており、制御部は細胞数計測器から得たデータの変動が予め定めた値の範囲内となるまで送液ポンプを駆動して循環流路を繰り返し流動させることにより細胞懸濁液と希釈液を混合することを特徴とする、細胞数調整装置。
2. 循環流路にバッファタンクをさらに有する、請求項１に記載の細胞数調整装置。
3. 制御部が、送液ポンプを順方向と逆方向の交互に駆動することにより細胞懸濁液と希釈液を混合する、請求項１に記載の細胞数調整装置。
4. 細胞数計測器は、細胞懸濁液に照射した光の散乱光または透過光の強度を測定し、光強度値として細胞数濃度に関するデータを採取し、制御部はそのデータを予め求めた細胞数濃度と光強度値の関係に照らして細胞数濃度を算出する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞数調整装置。
5. 細胞数計測器による細胞数濃度に関するデータの採取を、細胞懸濁液を流動させた状態で断続的または連続的に行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞数調整装置。
6. 制御部が、入口からの細胞懸濁液の取り込みを制御する弁と、希釈液の流路への取り込みを制御する弁を制御可能であり、制御部は細胞懸濁液と希釈液の取り込みを交互に繰り返し行うよう、送液ポンプと前記２種の弁とを制御する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞数調整装置。
7. 拡大培養用の第一の細胞培養装置、細胞数調整装置、および継代培養用の第二の細胞培養装置を含む自動継代培養システムであって、
   第一の細胞培養装置は高濃度の細胞懸濁液を排出し、細胞数調整装置は高濃度の細胞懸濁液を所望の細胞数濃度を有する均一の細胞懸濁液へと希釈し、第二の細胞培養装置は希釈された細胞懸濁液を播種して継代培養を行い、
   前記細胞数調整装置は、
   高濃度の細胞懸濁液を取り込む入口と、細胞を入口の濃度よりも低い所望の濃度で含有する細胞懸濁液を排出する出口とを備え、
   入口と出口の間に細胞懸濁液を保持可能な流路を有し、
   流路には、細胞懸濁液の単位量あたりの細胞数濃度に関するデータを採取する細胞数計測器、および流路に提供して細胞懸濁液を希釈する希釈液を保持する希釈液容器が備えられており、
   細胞数計測器により得たデータに基づいて流路内部の細胞懸濁液の流動を制御する制御部をさらに備え、
   制御部は、細胞数計測器により得たデータに基づいて細胞数濃度を所望の濃度とするのに必要な希釈液の量を判断し、必要量の希釈液を流路に取り込みかつ細胞懸濁液と希釈液を混合するよう流路内部の細胞懸濁液の流動を制御し、
   入口と出口の間に設けられた流路の少なくとも一部が循環流路を形成しており、循環流路には送液ポンプと細胞数計測器とが設けられており、制御部は細胞数計測器から得たデータの変動が予め定めた値の範囲内となるまで送液ポンプを駆動して循環流路を繰り返し流動させることにより細胞懸濁液と希釈液を混合する、
   前記自動継代培養システム。
8. 制御部が、第一の細胞培養装置または第二の細胞培養装置に備えられた送液ポンプを用いて細胞数調整装置の流路内部の細胞懸濁液の流動を制御する、請求項７に記載の自動継代培養システム。
9. 細胞を高濃度で含有する細胞懸濁液を所望の濃度に希釈するための方法であって、
   細胞懸濁液を流動させた状態で、細胞懸濁液に照射した光の散乱光または透過光の強度を断続的または連続的に測定して、光強度値として細胞数濃度に関するデータを採取する工程、
   得られたデータを予め求めた細胞数濃度と光強度値の関係に照らして細胞数濃度に変換する工程、および
   所望の濃度に希釈するために必要な希釈液の量を算出し、その量の希釈液を細胞懸濁液に添加し混合する工程であって、細胞懸濁液および希釈液が循環流路を循環しながら攪拌される工程を含む、前記方法。

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