JPS6361144A - 微生物測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物の数、あるいは量を測定する方法に係り
、特に不均一な微生物けん濁液にも好適な測定方法に関
する。

〔従来の技術〕

細菌の増殖状態を調べたり、動物実験やワクチン製造な
どいろいろな目的で菌液を作るとき、菌数・菌量を知る
必要のあることがきわめて多い。

従来このような微生物を測定する方法として、特開昭５
５−１４０１５１号公報に記載のように、抗原抗体反応
を用い蛍光で標識した微生物に紫外線を照射し、発生す
る励起光の光量を電気的に計測することにより微生物を
定量する方法や、同様な例として特開昭５７−１４４９
９５号公報に明らかにされているように蛍光強度測定の
直前に菌体その他の固型物を遠心分離によって除去して
測定するという方法。

さらに特開昭５８−１７５９８号公報において記載され
ている様に細菌をトルエンなどの有機溶剤で処理した後
、ウンベリフェロンの蛍光強度を測定するといった蛍光
を用いた測定従来例が存在する。

又、上記のように特別な蛍光光度計を使用せずに測定す
る方法としては、古くから透過光、散乱光を測定するこ
とにより混濁度を測定し、これから菌の濃度を算出する
方法が公知の方法として広く用いられてきた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記従来技術のうち蛍光マーカなどを用いて蛍光強度測
定をする方法においては、１０８〜１０４ＣＥυ／　ｎ
　Ｑ　　の菌数が測定できると記載される様に、高感度
な測定が期待されるが、特別に遠心分離操作が必要とさ
れ、薬剤感受性試験その他の、培養を続けながら経時的
に増殖を観察する必要のある場合には、そのまま適用で
きないという問題点。

蛍光１１ｍ抗体と微生物を接触させて蛍光標ｍａｔ生物
を得る際、微生物を固定（殺す）せねばならず、測定後
に培養を継続できないという問題点、さらに有機溶剤で
前処理する方法では、トルエンによって菌体膜が破壊さ
れ、菌体内に含まれるエステラーゼが十分にウンベリフ
ェロン誘導体を加水分解することができるため高感度な
菌の測定が可能なわけであるが、菌内体を溶菌して殺し
てしまうため、培養系に再び戻して経時変化を観察でき
ないばかりか、菌濃度既知のサンプルとして他の実験に
共することができないという問題点がある。

一方、吸光光度法による微生物の測定方法では、続けて
培養することができるが検出感度は１０８〜１０７０Ｆ
υ／ｍＱと悪く、これ以上の高濃度の菌浮遊液でないと
検出できないという問題点がある。

細胞浮遊液が希薄な場合には、細胞浮遊液にょる散乱光
の強さは総細胞数に対応する。そこで散乱光による測定
が可能である。ところがこれは被検菌が一定即ち均一な
濁りのサンプルのときという条件のもとに成立する。従
って発育の時期により菌の形・大きさの変化がひどい場
合には、その濁りと菌数とは並行するとは限らない。従
って対数増殖期には散乱光の強さが総画数と対応するの
で精度良く測定できても、例えばブドウ球菌のように条
件によって定常期にはブドウの房状にかたまりを形成し
ていく場合や、抗生物質セファレキシンを細菌に作用さ
せた時のようにフィラメント化を起こし、菌形態が激し
く変化する場合には菌数測定にうまく適用できない場合
があるという問題点がある。

また、これら透過光・散乱光の測光は、装置により上下
方向か水平方向のいずれか一方向となっている。測光方
向は一般的にはセルの形状により規制され、例えば一般
的なガラスあるいは石英の角セルや試験管をそのまま用
いる場合は水平方向。

また、９６穴などのマイクロプレートを用いる場合はお
のずから垂直方向（上下方向）となる、しかしながら菌
の種類により発育の形態をさまざまに異なり、発育の形
態によっては測光方向により測定に不都合が生ずる場合
がある。

即ち、大腸菌のようにホモジニアスな菌の場合は水力方
向・垂直（上下）方向のいずれでも測定が可能である。

ところが先にも述べたようなブドウ球菌や連鎖球菌は増
殖に従い房状のかたまり、あるいは連鎖を形成しそのた
めにセル中で沈降しがちである。この場合水平方向の測
光では光束が上澄を通過し正しい菌数が反映されないと
いう問題点が生ずる。また緑腸菌は菌液表面に菌膜を形
成することが知られているが、垂直（上下）方向の測光
では光束がすべて反射され、測定不可能となる。

本発明の目的は、サンプルの微生物を殺すことなく測定
でき、測定途中で菌の形態が変化してホモジニアスでな
くなった場合でも正しく測定できること、さらに、異な
る発育形態をとるさまざまな菌種についても同一の装置
で誤りなく測定できるようにする微生物測定法を提供す
ることを目的とする。

〔問題を解決するための手段〕

上記目的は、第５図に示すように、水平方向と垂直（上
下）方向の両方向から光を照射し、サンプルである細菌
浮遊液を通過させた後、透過光と散乱光の両方を検知し
、その得られた情報を総合評価し、菌数と対応させるこ
とにより菌数測定することにより達成される。

〔作用〕

サンプルの菌浮遊液に照射された光は菌濃度即ち微生物
の数に応じて、透過光量（吸光度）を変化させたり、散
乱強度を変化させる。今、異なる増殖をする菌の場合と
して、１．均一な分裂をし、ホモジニアスな濁りとなる
もの、２１分裂・増殖するに従い、混濁すると同時に、
菌液表面に菌膜を張るもの、３．ブドウの房状に配列し
たり、連鎖してひも状になり、かたまりを作って大きく
なり沈降するもの、の３つの場合を考える。さらにそれ
ぞれの菌の発育状態として、以下の２つを考える。即ち
、 １０分裂の準備をする誘導期から、２分裂が盛んに行な
われる対数増殖期にかけての状態、この状態は比較的希
薄な菌浮遊液となっている。

２、対数増殖期から、新生菌と死滅していく菌の間に平
衡が保たれ、生菌数が見かけ上一定となる定常期にかけ
ての状態、閉鎖系である培地中で増殖が飽和になった状
態であり菌種固有の発育形態を呈している。菌液は１０
７ＣＦυ／ｍＱ程度から、１ｎｖｉｔｒｏで最大発育可
能な１０９０Ｆυ／ｍＱ程度まで、かなり高濃度な状態
である。

以上、菌の種類３種と、発育状態２種の合計６通りの場
合を想定する。この様な菌浮遊液に第５図に示すように
水平方向と垂直方向から光を照射し、光が菌浮遊液を通
過後、透過光と散乱光を両方ディテクトする。各々の検
知器からの信号が、データにどのように作用するかを次
に説明する。

又、菌液の状態と測光の模式図を第６．７．８図に示す
。

１、ホモジニアスな菌液の場合 １−１　誘導期〜対数期：水平、垂直方向とも散乱光の
み正しいデータとなり、透過光は感度不足の為データは
取れない。

１−２　対数期〜定常期：水平、垂直の両方向で、散乱
光と透過光ともデータとして使える。（第６図） ２、菌膜を張る場合 ２−１　誘導期〜対数期：低濃度菌液のため散乱光のみ
データとなる。菌膜はこの時点では形成していない為、
垂直方向でも正しい値となる。

２−２　対数期〜定常期：菌膜を形成するため、垂直（
上下）方向からの照射では光を通しにくい（第７図）。

このため、散乱。

透過ともに誤ったデータとなる。水平方向からの照射で
は散乱光は正しく検知される。また、この時点では高濃
度菌液となっている為、誘過光も正しく検知される。

３、沈降する菌の場合 ３−１　誘導期〜対数期：低濃度菌液のため透過光は検
知されない、又、未だかたまりを作るほど発育していな
いため、散乱光は垂直・水平の両方向で正しく検知され
る。

３−２　対数期〜定常期：この時点では分裂・増殖が進
み、画境を形成し沈降しやすい。

従２つて、垂直方向は散乱光、透過光とも正しく測定さ
れるが、水平方向の場合は光束は上澄の部分を通ること
があり、正確な菌数を反映しない。（第８図）このため
散乱光・透過光とも誤ったデータとなる。

以上をまとめると第４図のようになる。

このように１つの検知器からのデータだけでは、正しい
データは得られず、正確な菌数測定は行なわれない。４
つの検知器からの４データを全て用いて総合評価するこ
とにより、種々に変化する全増殖過程を、又異なる発育
形態をとる種々の菌種についても同一の装置で誤りなく
測定することができる。

〔実施例〕

以下、本発明の詳細な説明する。

実施例１ 第１図はＰ、ａａｒｕｇｉｎｏｓａ　（緑膿菌）の増殖
をモニタリングした図である。横軸は培地に菌を接種し
てからの培養時間、たて軸はそれぞれ散乱強度（０およ
び・マーク）、吸光度（Δおよびムマーク）である。

細菌を培地に接種すると、まず誘導期に入る。

この時期は接種菌が分裂増殖の準備をする時期であり、
菌は新環境に適応するため酵素、補酵素。

必須物質などを蓄える生理学的増殖が行なわれる。

この誘導期の長さは接種菌の幼老や培地成分によって非
常に異なる。第１図に示した場合では、３時間から４時
間までがこれに相当する。この範囲では、照射の方向お
よび散乱、透過光による顕著な差異は認められない６次
に誘導期を経過した菌は急激に２分裂を始め、一定の割
合で規則正しく２分裂を繰り返す対数増殖期に入る。第
１図では４時間目以降にみられるが、５．５　時間日付
近までは初期なため菌濃度は未だ小さい為散乱光は検知
され増殖が認められるが透過光では認められない、６時
間目あたりから、透過光でも検知できるようになる。と
ころが増殖が十分進むと、緑膿菌は、菌液表面に菌膜を
張る性質がある６図の場合では８時間目付近から菌膜の
形成が始まっている。

このため、垂直方向からの照射では測定値のばらつきが
大きくなり、やがてさらに増殖が進むと散乱光、透過光
ともに誤データを出力する。細菌の状態としては、培地
中の栄養物の減少、老廃物の蓄積やＰＨの変動が進み、
新生菌と死滅していく菌の間に均衡が保たれ生菌数一定
の定常期へと続いていく。

以上のように、接種後比較的早い時間には第１図中ａと
ｂのデータが有効、続いてｃ、ｄも有効となるがやがて
ｂおよびｄは誤データとなり、データとして使えなくな
る。よってａ、ｂ、ｃ、ｄすべての情報を集取し、最終
的には総合評価することが極めて重要であり、これによ
り正しく菌数を測定できる。

実施例２ 第２図はＳ、ａｕｒｅｕｓ　（黄色ブドウ球菌）の増殖
をモニタリングしたものである。この図の場合、誘導期
は２時間程度とみられ、この間における４つの検知器か
らのデータに顕著な差異はない、その後増殖が進むと散
乱光は２．５時間目付近から透過光は３．５時間目付近
から検知可能となる。従って２．５〜３．５時間の範囲
内では水平・垂直両方向からの散乱光がデータとなり、
透過光の方は増菌なしとみなされてしまう。ブドウ球菌
は増殖するに従いブドウの房状に配列してくる。１個の
菌の分裂から始まった菌の集塊がこのような配列を示す
のは、はじめの分裂面と次の分裂面は直交するが、分裂
の際の娘細胞の分離の進行が、隔壁の一端から始まって
他端に及び配列が不規則になってくることによる。ブド
ウの房状に配列した画境は次第に大きくなり、液体培地
の中で沈降しやすくなる。沈降が起こった菌液において
水平方向から光を照射すると、光束は上澄の部分を通過
することになる。この様な状態は第２図中、水平方向、
散乱光の９時間目以降にあられれている。増殖曲線は減
少の傾向を示し、菌数は実際のそれよりも少なく誤測定
される。垂直方向では正しい菌数が検知され、増殖が飽
和状態にあることを示している（０−０及びΔ−Δ）。

以上のように、上記のブドウ球菌や、さらに−方向にし
か分裂しないためにひも状につながる連鎖球菌のように
かたまりを作りやすい菌群の場合には、接種後早い時期
には第２図中ａ、ｂのデータが有効であり、続いてｃ、
ｄも有効となる。やがて十分な増殖がなされると、ａお
よびＣが誤データとなる。実施例１ではａおよびＣが正
しいデータであったが、この場合では逆に誤データとな
っている。これは菌種により有効なデータの種類は異な
ることを示している。

実施例３ 第３図はＩＩＥｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌ　：　　
（大腸菌）の増殖をモニタリングした例である。実施例
１及び２と同様に透過光の検知器からの信号は散乱光に
比べ３時間程度の遅れを見せている。従って比較的早い
期間には方向に関係なく散乱光の検知器からのデータａ
及びｂが有効である。しかじながらさべに時間が経過し
増殖が進むと、大腸菌の場合は均一な濁りの菌液となる
。従って第３図に示すように５〜６時間以降は透過光も
有効となり、しかも水平、垂直の両方向共有効となる。

結局、大腸菌は早い期間はａ、ｂのいずれか、増殖が進
んだ後はａｔ　ｂｔ　ｃ、ｄのいずれも有効なデータと
なる例である。

〔発明の効果〕

本発明によれば、サンプルを損傷させることなく、培養
を継続しながら測定ができる。また、測定途中で均一な
濁りのサンプルでなくなった場合でもそのまま続けて同
一の装置で正確な測定が可能である。さらに種々の未知
の菌種についても同一の装置でカバーでき、正確に測定
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第３図はそれぞれ本発明による微生物測定
法によって得られるデータ、第４図は菌液の状態と測光
によって示されるデータ、第５図は本発明による微生物
測定法を実施する手段の構成図、第６図ないし第８図は
菌液の状態と測光を示す模式図である。 １．２・・・光源、３・・・セル、４・・・菌液（サン
プル）、５．６・・・散乱光用検知器、７，８・・・透
過光用検知器、９・・・微生物、１０・・・菌膜、１１
・・・微生物のかたまり。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、微生物を含む試料液に光を照射し、微生物の数を光
   学的に測定する方法において、垂直方向及び水平方向の
   ２方向から光を照射し、それぞれの透過光と散押光の変
   化を組みあわせて菌数を導くように構成したことを特徴
   とする微生物測定方法。