JP4225924B2 - 自動継代培養装置及びこれを用いた継代培養方法 - Google Patents
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Description
細胞には浮遊系細胞と付着系細胞の2種類が存在し、付着系細胞の継代培養においては、PBS(Phosphate Buffered Salts)を用いて細胞を洗浄する作業、トリプシンを用いて培養容器から細胞を剥離する作業、トリプシンと細胞とを分離する作業、培養した細胞を複数の培養容器に分配する作業等、多数の作業が行なわれる。
又、自動的に継代培養を行なうことが出来る培養装置が提案されているが、該培養装置は、浮遊系細胞を継代培養の対象とするものである(特許文献5)。
又、付着系細胞の継代培養においては、多数の作業を行なわねばならず、付着系細胞の継代培養は初心者にとって困難である問題があった。
そこで本発明の目的は、培養容器内に雑菌が混入することを完全に防止することが出来、然も、初心者であっても容易に付着系細胞の継代培養を行なうことが出来る自動継代培養装置及びこれを用いた継代培養方法を提供することである。
続いて、前記1或いは複数のバルブ手段を閉止して、洗浄液供給機構により前記1或いは複数の培養容器に洗浄液を供給する。供給された洗浄液は培養容器に溜まり、該容器内の細胞はその洗浄液によって洗浄されることになる。その後、前記1或いは複数のバルブ手段を開放する。これによって、前記1或いは複数の培養容器内の洗浄液は、バルブ手段を通過して処理容器に流入し、更にフィルタ手段を通過して排水口から外部へ排出される。一方、付着系細胞は、培養容器内に付着しているため、該容器内に残存することになる。
続いて、前記1或いは複数のバルブ手段の内、少なくとも1つのバルブ手段を開放した状態で、前記洗浄液供給機構により少なくとも1つの培養容器に洗浄液を供給する。培養容器に供給された洗浄液は、前記少なくとも1つのバルブ手段を通過して処理容器に流入し、該容器内の細胞はその洗浄液によって洗浄されることになる。その後、洗浄液は、フィルタ手段を通過して排水口から外部へ排出される。
次に、培地を処理容器に供給する。例えば、前記処理容器には、前記フィルタ手段の出口側に第2の培地供給機構が接続されており、該培地供給機構により処理容器に培地が供給される。又、少なくとも1つのバルブ手段を開放して、培養容器に接続された培地供給機構により少なくとも1つの培地容器に培地を供給し、該培地を処理容器に流入させることも可能である。
最後に、前記1或いは複数のバルブ手段よりも多くのバルブ手段を開放して、処理容器内の細胞及び培地を前記1或いは複数の培養容器よりも多くの培養容器に分配する。この様にして、1回の継代が終了する。
又、継代培養に必要な全ての処理が密閉系内で行なわれるので、培養容器内に雑菌が混入することはない。
図1は、本発明に係る自動継代培養装置の系統図を表わしており、該自動継代培養装置においては、3つのプラスチック製の培養容器(1a)(1b)(1c)が配置され、これらの容器には夫々、溶液供給用配管(10a)(10b)(10c)が接続されている。第1の溶液供給用配管(10a)の途中に、第3の溶液供給用配管(10c)の終端が接続され、該溶液供給用配管(10c)の途中に、第2の溶液供給用配管(10b)の終端が接続されている。
第1の溶液供給用配管(10a)の終端には、3本の配管(11a)(11b)(11c)が接続されており、これらの配管の終端には夫々、細胞を培養するための栄養分を含む培地が収容された培地供給タンク(2)、細胞を洗浄するための洗浄液であるPBSが収容されたPBS供給タンク(3)、及び培養容器に付着した細胞を該容器から剥離するための剥離液であるトリプシンが収容されたトリプシン供給タンク(4)が接続されている。
又、培地供給タンク(2)、PBS供給タンク(3)及びトリプシン供給タンク(4)に接続された上述の3つの配管(11a)(11b)(11c)の途中には夫々、培地供給用バルブ(31a)、PBS供給用バルブ(31b)及びトリプシン供給用バルブ(31c)が取り付けられている。
培地供給用バルブ(31a)及び第1溶液供給用バルブ(30a)を開放すると共に溶液供給用ポンプ(20)を駆動することによって、培地供給用タンク(2)内の培地が第1の培養容器(1a)に供給され、PBS供給用バルブ(31b)及び第1溶液供給用バルブ(30a)を開放すると共に溶液供給用ポンプ(20)を駆動することによって、PBS供給タンク(3)内のPBSが第1の培養容器(1a)に供給される。又、トリプシン供給用バルブ(31c)及び第1溶液供給用バルブ(30a)を開放すると共に溶液供給用ポンプ(20)を駆動することによって、トリプシン供給用タンク(4)内のトリプシンが第1の培養容器(1a)に供給される。同様にして、培地供給用タンク(2)内の培地、PBS供給タンク(3)内のPBS及びトリプシン供給タンク(4)内のトリプシンが第2及び第3の培養容器(1b)(1c)に供給される。
第1の流出遮断バルブ(32a)を開放することによって、第1の培養容器(1a)内の溶液が処理容器(5)に供給されると共に、処理容器(5)内の溶液が第1の培養容器(1a)に供給される。同様にして、第2及び第3の培養容器(1b)(1c)内の溶液が処理容器(5)に供給されると共に、処理容器(5)内の溶液が第2及び第3の培養容器(1b)(1c)に供給される。
細胞計数センサ(40a)(40b)(40c)は、接続用配管(12a)(12b)(12c)内を通過する溶液に含まれる細胞の数を計数するためのものであって、例えば光センサによって構成される。
上述の第1流出遮断バルブ(32a)及び排水バルブ(33)を開放すると共に、排水ポンプ(21)を駆動することによって、第1の培養容器(1a)内の溶液が廃液として廃液タンク(6)に収容される。同様にして、第2及び第3の培養容器(1b)(1c)内の溶液が廃液として廃液タンク(6)に収容される。ここで、該溶液に含まれている細胞は、フィルタ(50)に受け止められて、フィルタ(50)の表面に堆積する。
更に、上記処理容器(5)には、フィルタ(50)よりも上方位置に、細胞取出し用配管(15)が接続されており、該配管(15)の途中には、細胞取出し用バルブ(34)が取り付けられている。該バルブ(34)を開放することによって、処理容器(5)内の細胞及び培地が外部に取り出される。
図1に示すバルブ(30a)〜(34)及びポンプ(20)〜(22)には、例えばマイクロコンピュータからなる制御回路(図示省略)が接続されており、該制御回路によって、これらのバルブの開閉及びポンプの駆動が制御されている。
付着系細胞と培地を第1の培養容器(1a)に収容した後、先ず工程P1では、図2及び図4に示す如く、該培養容器(1a)内の細胞の一次培養を行なう。
続いて工程P2では、図10に示す如く、第1流出遮断バルブ(32a)及び排水バルブ(33)を開放すると共に、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、第1培養容器(1a)内の培地が、第1接続用配管(12a)及び第1流出遮断バルブ(32a)を通過して処理容器(5)に流入し、更にフィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(6)に収容されることになる。一方、付着系細胞は、培養容器(1a)内に付着しているため、該容器内に残存することになる。
その後、第1溶液供給用バルブ(30a)及びPBS供給用バルブ(31b)を閉止する一方、第1流出遮断バルブ(32a)及び排水バルブ(33)を開放する。又、溶液供給用ポンプ(20)をオフに設定する一方、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、第1培養容器(1a)内のPBSが、第1接続用配管(12a)及び第1流出遮断バルブ(32a)を通過して処理容器(5)に流入し、更にフィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(6)に収容されることになる。一方、付着系細胞は、培養容器(1a)内に付着しているため、該容器内に残存することになる。
次に、第1溶液供給用バルブ(30a)の開放状態及び溶液供給用ポンプ(20)のオン状態を維持して、トリプシン供給用バルブ(31c)を閉止する一方、培地供給用バルブ(31a)を開放する。これによって、培地供給タンク(2)内の培地が配管(11a)、培地供給用バルブ(31a)、第1溶液供給用配管(10a)、溶液供給用ポンプ(20)及び第1溶液供給用バルブ(30a)を通過して第1培養容器(1a)に供給され、培地によって該容器(1a)内のトリプシンの作用が止められることになる。
その後、第1溶液供給用バルブ(30a)、PBS供給用バルブ(31b)及び第1流出遮断バルブ(32a)を閉止する一方、排水バルブ(33)を開放する。又、溶液供給用ポンプ(20)をオフに設定する一方、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、処理容器(5)内のPBSは、フィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(6)に収容されることになる。
その後、工程P8では、3つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)を閉止すると共に、培地供給用ポンプ(22)をオフに設定して、3つの培養容器(1a)〜(1c)内の細胞の二次培養を行なう。
その後、3つの溶液供給用バルブ(30a)〜(30c)及びPBS供給用バルブ(31b)を閉止する一方、3つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)及び排水バルブ(33)を開放する。又、溶液供給用ポンプ(20)をオフに設定する一方、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、培養容器(1a)〜(1c)内のPBSが、接続用配管(12a)〜(12c)及び流出遮断バルブ(32a)〜(32c)を通過して処理容器(5)に流入し、更にフィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(6)に収容されることになる。一方、付着系細胞は、培養容器(1a)〜(1c)内に付着しているため、該容器内に残存することになる。
次に、3つの溶液供給用バルブ(30a)〜(30c)の開放状態及び溶液供給用ポンプ(20)のオン状態を維持して、トリプシン供給用バルブ(31c)を閉止する一方、培地供給用バルブ(31a)を開放する。これによって、培地供給タンク(2)内の培地が、上述のPBSと同様の経路で3つの培養容器(1a)〜(1c)に供給され、培地によって培養容器(1a)〜(1c)内のトリプシンの作用が止められることになる。
その後、第1溶液供給用バルブ(30a)、PBS供給用バルブ(31b)及び第1流出遮断バルブ(32a)を閉止する一方、排水バルブ(33)を開放する。又、溶液供給用ポンプ(20)をオフに設定する一方、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、処理容器(5)内のPBSは、フィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(6)に収容されることになる。
又、工程P1〜P15の全ての工程が密閉系内で実施されるので、培養容器内に雑菌が混入することはない。
(2) 培地供給タンク
(3) PBS供給タンク
(4) トリプシン供給タンク
(5) 処理容器
(6) 廃液タンク
(7) 培地供給タンク
(20) 溶液供給用ポンプ
(21) 排水ポンプ
(22) 培地供給用ポンプ
(30a)〜(30c) 溶液供給用バルブ
(31a) 培地供給用バルブ
(31b) PBS供給用バルブ
(31c) トリプシン供給用バルブ
(32a)〜(32c) 流出遮断バルブ
(33) 排水バルブ
(34) 細胞取出し用バルブ
(40a)〜(40c) 細胞計数センサ
Claims (6)
- 付着系細胞の継代培養を行なう装置であって、複数の培養容器が配置され、これら複数の培養容器には、これらの培養容器に培地を供給する培地供給機構、これらの培養容器に細胞を洗浄するための洗浄液を供給する洗浄液供給機構、及びこれらの培養容器に該容器から付着系細胞を剥離するための剥離液を供給する剥離液供給機構が接続されると共に、1つの共通の処理容器が接続されており、各培養容器と処理容器との間にはバルブ手段が介在し、処理容器内には、培地、洗浄液及び剥離液が通過可能であって細胞の通過を阻止するためのフィルタ手段が設けられると共に、該処理容器には、フィルタ手段を通過した培地、洗浄液及び剥離液を外部へ排出するための排水口が開設されており、培地供給機構、洗浄液供給機構、剥離液供給機構及びバルブ手段には、これらの機構の動作及びバルブ手段の開閉を制御する制御装置が接続されている自動継代培養装置。
- 前記処理容器の排水口には、排水口から排出された培地、洗浄液及び剥離液を回収する排水機構が接続されており、該排水機構は、前記制御装置によって動作が制御されている請求項1に記載の自動継代培養装置。
- 前記処理容器には、前記フィルタ手段の出口側に、第2の培地供給機構が接続されており、該培地供給機構は、前記制御装置によって動作が制御されている請求項2に記載の自動継代培養装置。
- 前記複数の培養容器に接続された培地供給機構は、培地が供給された培地供給タンクと、前記複数の培養容器と培地供給タンクとの間に介在する培地供給用バルブとを具え、洗浄液供給機構は、洗浄液が供給された洗浄液供給タンクと、前記複数の培養容器と洗浄液供給タンクとの間に介在する洗浄液供給用バルブとを具え、剥離液供給機構は、剥離液が供給された剥離液供給タンクと、前記複数の培養容器と剥離液供給タンクとの間に介在する剥離液供給用バルブとを具え、前記排水機構は、前記処理容器から排出された培地、洗浄液及び剥離液を収容するための廃液タンクと、前記処理容器と廃液タンクとの間に介在する排水バルブとを具え、前記第2の培地供給機構は、培地が供給された第2の培地供給タンクと、前記処理容器と第2の培地供給タンクとの間に介在する第2の培地供給用バルブとを具えている請求項3に記載の自動継代培養装置。
- 付着系細胞の継代培養を行なうべく複数の培養容器が配置され、これら複数の培養容器には、これらの培養容器に培地を供給する培地供給機構、これらの培養容器に細胞を洗浄するための洗浄液を供給する洗浄液供給機構、及びこれらの培養容器に該容器から付着系細胞を剥離するための剥離液を供給する剥離液供給機構が接続されると共に、1つの共通の処理容器が接続されており、処理容器内には、培地、洗浄液及び剥離液が通過可能であって細胞の通過を阻止するためのフィルタ手段が設けられると共に、該処理容器には、フィルタ手段を通過した培地、洗浄液及び剥離液を外部へ排出するための排水口が開設されており、培地供給機構、洗浄液供給機構及び剥離液供給機構には、これらの機構の動作を制御する制御装置が接続されている自動継代培養装置を用いた継代培養方法であって、
前記複数の培養容器の内、一部の1或いは複数の培養容器に付着系細胞及び培地を収容して該細胞を培養する工程と、
前記1或いは複数の培養容器内の培地を処理容器に流入させる工程と、
洗浄液供給機構により洗浄液を前記1或いは複数の培養容器に供給し、該容器内の細胞を洗浄する工程と、
前記1或いは複数の培養容器内の洗浄液を処理容器に流入させる工程と、
剥離液供給機構により剥離液を前記1或いは複数の培養容器に供給し、該容器から細胞を剥離する工程と、
前記1或いは複数の培養容器内の細胞及び剥離液を処理容器に流入させる工程と、
前記洗浄液供給機構により洗浄液を少なくとも1つの培養容器に供給し、処理容器内の細胞を洗浄する工程と、
培地を処理容器に供給する工程と、
処理容器内の細胞及び培地を前記1或いは複数の培養容器よりも多くの培養容器に分配する工程
とを有している継代培養方法。 - 付着系細胞の継代培養を行なうべく複数の培養容器が配置され、これら複数の培養容器には、これらの培養容器に培地を供給する培地供給機構、これらの培養容器に細胞を洗浄するための洗浄液を供給する洗浄液供給機構、及びこれらの培養容器に該容器から付着系細胞を剥離するための剥離液を供給する剥離液供給機構が接続されると共に、1つの共通の処理容器が接続されており、各培養容器と処理容器との間にはバルブ手段が介在し、処理容器内には、培地、洗浄液及び剥離液が通過可能であって細胞の通過を阻止するためのフィルタ手段が設けられると共に、該処理容器には、フィルタ手段を通過した培地、洗浄液及び剥離液を外部へ排出するための排水口が開設されており、培地供給機構、洗浄液供給機構、剥離液供給機構及びバルブ手段には、これらの機構の動作及びバルブ手段の開閉を制御する制御装置が接続されている自動継代培養装置を用いた継代培養方法であって、
前記複数の培養容器の内、一部の1或いは複数の培養容器に付着系細胞及び培地を収容して該細胞を培養する工程と、
前記1或いは複数の培養容器と処理容器との間に介在する1或いは複数のバルブ手段を開放して前記1或いは複数の培養容器内の培地を処理容器に流入させる工程と、
前記1或いは複数のバルブ手段を閉止して洗浄液供給機構により洗浄液を前記1或いは複数の培養容器に供給し、該容器内の細胞を洗浄する工程と、
前記1或いは複数のバルブ手段を開放して前記1或いは複数の培養容器内の洗浄液を処理容器に流入させる工程と、
前記1或いは複数のバルブ手段を閉止して剥離液供給機構により剥離液を前記1或いは複数の培養容器に供給し、該容器から細胞を剥離する工程と、
前記1或いは複数のバルブ手段を開放して前記1或いは複数の培養容器内の細胞及び剥離液を処理容器に流入させる工程と、
前記1或いは複数のバルブ手段の内、少なくとも1つのバルブ手段を開放した状態で、前記洗浄液供給機構により洗浄液を少なくとも1つの培養容器に供給し、処理容器内の細胞を洗浄する工程と、
培地を処理容器に供給する工程と、
前記1或いは複数のバルブ手段よりも多くのバルブ手段を開いて、処理容器内の細胞及び培地を前記1或いは複数の培養容器よりも多くの培養容器に分配する工程
とを有している継代培養方法。
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