JP7030849B2 - 細胞培養装置及び細胞培養方法 - Google Patents

Description

開示の技術は、細胞培養装置及び細胞培養方法に関する。

細胞培養装置に関する技術として、以下の技術が知られている。例えば特開２００５－１９８６２６号公報には、付着系細胞の継代培養を行なう装置であって、複数の培養容器が配置され、これらの培養容器に、１つの共通の処理容器が接続されており、各培養容器と処理容器との間にはバルブ手段が介在し、処理容器内には、培地、洗浄液及び剥離液が通過可能であって細胞の通過を阻止するためのフィルタ手段が設けられると共に、該処理容器には、フィルタ手段を通過した培地、洗浄液及び剥離液を外部へ排出するための排水口が開設された装置が記載されている。

また、特開２０１６－１３１５３８号公報には、細胞を培養するための培養容器と、培養容器で培養される細胞を貯留するための貯留容器、細胞塊を分割する分割処理を行う分割処理部と、を含む細胞培養装置が記載されている。

細胞培養において必要とされる処理の少なくとも一部を自動化した細胞培養装置は、例えば、細胞懸濁液を収容する培養容器と、培養容器に収容された細胞懸濁液または細胞懸濁液に含まれる細胞に対して所定の処理を施す処理部と、培養容器から処理部への細胞懸濁液の移送を制御する移送制御部と、を含んで構成され得る。上記のような構成を有する細胞培養装置を用いて、例えば１０^１０個以上の細胞を培養する大量培養を行う場合、細胞懸濁液を、複数の培養容器に小分けした状態でインキュベータ内に収容して培養する方法が考えられる。複数の培養容器に分割収容された細胞懸濁液は、処理部の処理能力に応じた所定量が培養容器から抜き出され、処理部に順次移送される。処理部は、培養容器から段階的に移送される細胞懸濁液を移送された順に処理する。

上記の細胞培養装置を用いて製造された細胞は、例えば、所定量ずつ回収容器に収容され、製品として出荷されることが想定される。例えば、製造された細胞を、再生医療の用途で用いる場合、回収容器間で細胞の品質が均一であることが要求される。しかしながら、細胞懸濁液を複数の培養容器に小分けして細胞の培養を行うと、例えば、インキュベータ内の僅かな温度差等に起因して、細胞の品質が培養容器間で異なってしまうおそれがある。更に、上記の構成の細胞培養装置によれば、処理部における細胞懸濁液の累積処理量または細胞の累積処理数の増加に伴って、処理部における処理状態が変化するおそれがある。例えば、処理部が、細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す、濾過膜を備えた濾過装置を含む場合、濾過装置における細胞懸濁液の累積処理量の増加に伴って、死細胞等のデブリスが濾過膜に堆積し、濾過膜の濾過性能が変化するおそれがある。処理部における処理状態が変化すると、処理後の細胞の品質が変化するおそれがある。すなわち、処理部において先に処理された細胞と、後に処理された細胞とで品質が異なるおそれがある。

開示の技術は、細胞懸濁液を複数の培養容器に小分けして細胞の培養を行う場合における、培養状態の培養容器間での差を吸収することを目的とする。

開示の技術に係る細胞培養装置は、細胞懸濁液を分割収容する複数の培養容器と、複数の培養容器の各々に収容された細胞懸濁液及び複数の培養容器に収容された細胞懸濁液に含まれる細胞の少なくとも一方に対して、処理単位に対応する分量毎に処理を施す処理部と、処理部において処理された、複数の処理単位の各々に対応する細胞懸濁液を混合する混合部と、混合部において混合された細胞懸濁液を撹拌する撹拌部と、処理部、混合部及び撹拌部への細胞懸濁液の移送を制御する移送制御部と、を含む。開示の技術に係る細胞培養装置によれば、細胞懸濁液を複数の培養容器に小分けして細胞の培養を行う場合における、培養状態の培養容器間での差を吸収することが可能となる。

開示の技術に係る細胞培養装置は、混合部において混合される細胞懸濁液の温度を制御する温度制御部を更に含んでいてもよい。この態様によれば、細胞懸濁液が長時間に亘り細胞の培養に適さない温度環境下に晒されることを防止することができるので、細胞の生存率を高めることができる。

開示の技術に係る細胞培養装置において、混合部と撹拌部とが一体的に構成されていてもよい。この態様によれば、装置の小型化を実現することができる。また、混合部と撹拌部との間で、細胞懸濁液の移送を行うことを要しないので、細胞懸濁液の移送に伴う細胞へのダメージを小さくすることができる。

開示の技術に係る細胞培養装置において、混合部は、処理部において処理された、複数の処理単位の全てに対応する細胞懸濁液を混合することが好ましい。この態様によれば、処理部における処理状態の経時的な変動に伴う細胞の品質のばらつきを抑制する効果が促進される。

開示の技術に係る細胞培養装置は、撹拌部において撹拌された細胞懸濁液を回収する複数の回収容器を更に含んでいてもよい。この場合、移送制御部は、複数の回収容器の各々への細胞懸濁液の移送を更に制御する。この態様によれば、回収容器間において細胞の品質が略均一である状態が提供される。

開示の技術に係る細胞培養装置において、移送制御部は、撹拌部において撹拌された細胞懸濁液を、複数の培養容器の各々に移送する制御を更に行ってもよい。この態様によれば、複数の細胞培養容器を再利用して細胞の培養を継続することが可能となる。

開示の技術に係る細胞培養装置において、混合部は、処理部において処理された細胞懸濁液または処理部において処理された細胞を含む細胞懸濁液を、処理部における処理単位毎に貯留する複数の貯留部と、複数の貯留部の各々から所定量ずつ抜き出された細胞懸濁液を合流させる合流部と、を含んでいてもよい。この態様によれば、撹拌部は、複数の培養容器に収容された細胞懸濁液の全量を収容可能な容積を有することを要しないので、撹拌部の容積を小さくすることができる。

開示の技術に係る細胞培養装置において、処理部において処理された、複数の処理単位の全てに対応する細胞懸濁液が、複数の貯留部のいずれかに貯留されることが好ましい。この態様によれば、処理部における処理状態の経時的な変動に伴う細胞の品質のばらつきを抑制する効果が促進される。

開示の技術に係る細胞培養方法は、上記の細胞培養装置を用いた細胞培養方法であって、処理部において、細胞懸濁液及び細胞懸濁液に含まれる細胞の少なくとも一方に対して、処理単位に相当する分量毎に処理を施し、混合部において、処理された、複数の処理単位の各々に対応する細胞懸濁液を混合し、撹拌部において、混合された細胞懸濁液を撹拌することを含む。開示の技術に係る他の細胞培養方法は、細胞懸濁液を分割収容する複数の培養容器に分割収容された細胞懸濁液を、前記複数の培養容器の少なくとも一部の複数の培養容器の各々から、処理単位に対応する分量だけ抜き出し、細胞懸濁液及び細胞懸濁液に含まれる細胞の少なくとも一方に対して、処理単位に対応する分量毎に処理を施し、処理された、複数の処理単位の各々に対応する細胞懸濁液を混合し、混合された細胞懸濁液を撹拌することを含み、前記処理は、濾過膜を用いた膜分離処理、細胞懸濁液に新鮮な培地を供給する培地添加処理及び細胞懸濁液に含まれる細胞の凝集体を分割する分割処理のうちの少なくとも１つを含み、前記細胞懸濁液の移送を、細胞培養装置が備える移送制御部が行う、というものである。開示の技術に係る細胞培養方法によれば、細胞懸濁液を複数の培養容器に小分けして細胞の培養を行う場合における、培養状態の培養容器間での差を吸収することが可能となる。

開示の技術によれば、処理部における処理状態の経時的な変動に伴う細胞の品質のばらつきを抑制することが可能となる。

開示の技術の第１の実施形態に係る細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る処理部の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る処理部の構成の他の例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る移送制御部の動作シーケンスの一例を示すフローチャートである。 開示の技術の実施形態に係る混合部において、各処理単位に対応する細胞懸濁液が収容されている様子の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る撹拌部に、各処理単位に対応する細胞懸濁液が移送されている様子の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る複数の回収容器に対して細胞懸濁液が一括処理により収容されている様子の一例を示す図である。 開示の技術の第２の実施形態に係る細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の第３の実施形態に係る細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の第４の実施形態に係る細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の第４の実施形態に係る混合部の構成の一例を示す図である。 開示の技術の第４の実施形態に係る移送制御部の動作シーケンスの一例を示すフローチャートである。

以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与し、重複する説明は適宜省略する。

［第１の実施形態］
図１は、開示の技術の第１の実施形態に係る細胞培養装置１の構成の一例を示す図である。細胞培養装置１は、複数の培養容器１０、処理部２０、混合部３０、温度制御部４０、撹拌部５０、複数の回収容器６０及び移送制御部７０を含んで構成されている。

複数の培養容器１０は、培養の対象とされる細胞を含む細胞懸濁液を分割収容する容器である。複数の培養容器１０は、それぞれ、ガス透過性を有するフィルムからなるバッグの形態を有していてもよい。複数の培養容器１０の総容積は、例えば、１０^１０個以上の細胞を培地とともに収容可能な容積とされている。１０^１０個以上の細胞を含む大量の細胞懸濁液を、複数の培養容器１０に分割収容することで、個々の培養容器１０の容積を小さくすることができる。これにより、個々の培養容器１０において、培養容器１０の表面を透過して培養容器１０の内部に導入される酸素の、各細胞への供給状態を良好に保つことが可能となる。

複数の培養容器１０は、インキュベータ１１の内部に収容されている。インキュベータ１１の内部の温度は、培養容器１０に収容された細胞の培養に適した温度（例えば３７℃）に保持されている。

複数の培養容器１０の各々は、個別流路Ｆ１及び流路Ｆ２を介して処理部２０に接続されている。個別流路Ｆ１の各々にはバルブＶ１が設けられている。個別流路の各々は、流路Ｆ２に接続されており、流路Ｆ２上にはポンプＰ１が設けられている。ポンプＰ１は、培養容器１０の各々に収容された細胞懸濁液を処理部２０に移送する場合に駆動される。

処理部２０は、培養容器１０の各々に収容された細胞懸濁液及び培養容器１０の各々に収容された細胞懸濁液に含まれる細胞の少なくとも一方に対して、所定の処理単位毎に所定の処理を施す。すなわち、処理部２０は、複数の培養容器１０の各々に収容された細胞懸濁液の全量を一括で処理するのではなく、処理部２０の処理能力に応じた処理量を１処理単位として処理を行う。処理部２０において実施される処理は、特に限定されないが、例えば、細胞懸濁液の膜分離処理を含んでいてもよく、また、複数の細胞が凝集した凝集体（スフェア）を細胞数がより少ない小規模な凝集体に分割する分割処理を含んでいてもよい。

処理部２０は、流路Ｆ３を介して混合部３０に接続されている。流路Ｆ３上には、ポンプＰ２が設けられている。ポンプＰ２は、処理部２０において処理された細胞懸濁液を混合部３０に移送する場合に駆動される。

混合部３０は、複数の培養容器１０の各々に収容された細胞懸濁液の全量を収容可能な容積を有する容器の形態を有し、処理部２０において処理された、複数の処理単位の各々に対応する細胞懸濁液を混合する。すなわち、処理部２０において処理が完了した細胞懸濁液は、処理単位毎に混合部３０に順次移送され、混合部３０において、複数の処理単位の各々に対応する細胞懸濁液が混合された状態とされる。

温度制御部４０は、混合部３０において混合される細胞懸濁液の温度を、細胞の培養に適した温度（例えば３７℃）に制御する。温度制御部４０は、例えば、混合部３０内の雰囲気温度を制御するヒータ及びクーラを含んで構成されていてもよい。温度制御部４０は、例えば、混合部３０に収容された細胞懸濁液の温度を検出する温度センサ（図示せず）からの温度検出信号に基づいて細胞懸濁液の温度を制御してもよい。

混合部３０は、流路Ｆ４を介して撹拌部５０に接続されている。流路Ｆ４上には、ポンプＰ３が設けられている。ポンプＰ３は、混合部３０において混合された細胞懸濁液を撹拌部５０に移送する場合に駆動される。

撹拌部５０は、混合部３０において混合された細胞懸濁液を撹拌する。すなわち、撹拌部５０は、複数の処理単位の各々に対応する細胞懸濁液が混在した混合物を撹拌する。撹拌部５０は、混合部３０で混合された細胞を回収容器６０に送液する際、細胞懸濁液に含まれる細胞や細胞凝集体の密度、細胞凝集体のサイズ分布を均一化し、回収容器６０間での細胞の品質を均一化する目的で処理される。撹拌部５０における撹拌方式は、特に限定されないが、例えば、撹拌翼を使用する方式、サイフォン方式及び上下動撹拌方式などを適用することができる。

複数の回収容器６０は、撹拌部５０において撹拌された細胞懸濁液を分割収容する容器である。回収容器６０の形態は、培養容器１０と同じであってもよい。複数の回収容器６０の総容量は、複数の培養容器１０の総容量と同等以上とされていてもよい。また、複数の回収容器６０の総容量は、複数の培養容器１０の総容量よりも少なくてもよい。回収容器６０の各々は、培養容器１０を収容するインキュベータ１１の内部に収容されている。なお、回収容器６０の各々は、細胞懸濁液を冷凍保存するための冷凍庫の内部に収容されていてもよい。

回収容器６０の各々は、個別流路Ｆ６及び流路Ｆ５を介して撹拌部５０に接続されている。個別流路Ｆ６の各々にはバルブＶ２が設けられている。個別流路Ｆ６の各々は、流路Ｆ５に接続されており、流路Ｆ５上にはポンプＰ４が設けられている。ポンプＰ４は、撹拌部５０において撹拌された細胞懸濁液を回収容器６０に移送する場合に駆動される。

移送制御部７０は、培養容器１０から処理部２０への細胞懸濁液の移送、処理部２０から混合部３０への細胞懸濁液の移送、混合部３０から撹拌部５０への細胞懸濁液の移送、及び撹拌部５０から回収容器６０への細胞懸濁液の移送をそれぞれ制御する。移送制御部７０は、バルブＶ１、Ｖ２の開閉制御及びポンプＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４の駆動制御を行うことで、細胞懸濁液の移送を制御する。

図２は、処理部２０の構成の一例を示す図である。なお、図２において、細胞懸濁液の送液を行うポンプ等の送液手段、細胞懸濁液が通過する経路を規制するバルブ等の経路規制手段については図示を省略している。処理部２０は、一例として、濾過装置２１、分割装置２２及び培地添加装置２３を含んで構成されている。

濾過装置２１は、濾過膜（図示せず）を備えており、流路Ｆ２を介して供給される細胞懸濁液に対して膜分離処理（濃縮処理）を施す。膜分離処理（濃縮処理）は、細胞懸濁液に含まれる細胞と、使用済みの培地及び死細胞等を含むデブリスとを濾過膜によって分離する処理である。濾過装置２１を通過することにより濃縮された細胞懸濁液は、流路Ｆ１１に排出される。

バイパス流路Ｆ１２は、一端が流路Ｆ２に接続され、他端が流路Ｆ１１に接続されている。バイパス流路Ｆ１２は、流路Ｆ２を介して処理部２０に流入する細胞懸濁液を、濾過装置２１を介さずに分割装置２２に移送する場合に使用される。また、流路Ｆ１１に排出された細胞懸濁液に対して濾過装置２１による膜分離処理を再度行う場合にもバイパス流路Ｆ１２を使用することが可能である。

培地添加装置２３は、濾過装置２１による膜分離処理（濃縮処理）によって濃縮された細胞懸濁液に、新鮮な培地を供給する。濾過装置２１及び培地添加装置２３の連携により、使用済みの培地を新鮮な培地に置換する培地交換を行うことが可能である。

分割装置２２は、細胞懸濁液に含まれる複数の細胞が凝集した凝集体（スフェア）を、細胞数がより少ない小規模な凝集体に分割する分割処理を行う。分割装置２２は、繊維状部材を編み込むことで形成された複数の網目を有するメッシュを備えている。メッシュの網目サイズよりも大きい細胞塊は、メッシュを通過することで、メッシュの網目サイズに応じた大きさの細胞塊に分割される。

例えば、多能性幹細胞の培養においては、細胞を培養することによって生じる細胞の凝集体のサイズが過大となると、凝集体同士が接着融合し、細胞が分化を開始したり、凝集体の中心部の細胞が壊死したりするといった問題が生じる。従って、凝集体のサイズが過大となることを防止するために、培養期間中の適切な時期に、凝集体を分割（解砕）する分割処理が必要となる。分割装置２２を通過することにより分割された細胞塊は、流路Ｆ３に排出される。

バイパス流路Ｆ１３は、一端が流路Ｆ１１に接続され、他端が流路Ｆ３に接続されている。バイパス流路Ｆ１３は、例えば、濾過装置２１による膜分離処理が施された細胞懸濁液を、分割装置２２を介さずに混合部３０に移送する場合に使用される。また、バイパス流路Ｆ１２及びＦ１３は、分割装置２２による分割処理を実施した後に濾過装置２１による膜分離処理を実施する場合に使用することも可能である。

図３は、処理部２０の構成の他の例を示す図である。図３に示すように、処理部２０は、複数の濾過装置２１及び複数の分割装置２２、及び分配装置２４、２５を含んで構成されていてもよい。

分配装置２４は、流路Ｆ２を介して処理部２０に流入した細胞懸濁液を、複数の濾過装置２１の各々に分配する。複数の濾過装置２１は、それぞれ、分配装置２４により分配された細胞懸濁液に対して膜分離処理（濃縮処理）を施す。分配装置２４及び複数の濾過装置２１の連携により膜分離処理（濃縮処理）を並列化することができ、これにより膜分離処理（濃縮処理）の処理時間を短縮することが可能となる。

分配装置２５は、濾過装置２１から排出された細胞懸濁液またはバイパス流路Ｆ１２を介して供給される細胞懸濁液を複数の分割装置２２の各々に分配する。複数の分割装置２２は、それぞれ、分配装置２５により分配された細胞懸濁液に含まれる細胞に対して分割処理を施す。分配装置２５及び複数の分割装置２２の連携により、分割処理を並列化することができ、これにより分割処理の処理時間を短縮することが可能となる。

以下において、細胞培養装置１の動作を図４を参照しつつ説明する。図４は、移送制御部７０の動作シーケンスの一例を示すフローチャートである。なお、初期状態において、培養対象とされる細胞を含む細胞懸濁液は、インキュベータ１１内に配置された複数の培養容器１０の各々に収容されているものとする。

ステップＳ１において、移送制御部７０は、バルブＶ１のいずれかを選択的に開状態に制御するとともにポンプＰ１を駆動させる。すなわち、移送制御部７０は、複数の培養容器１０の各々に収容された細胞懸濁液のうち、処理部２０における１処理単位に対応する分量の細胞懸濁液を、培養容器１０のいずれかから抜き出す。このとき、全ての培養容器１０の各々から細胞懸濁液の一部を抜き出してもよいし、少なくとも１つの一部の培養容器１０から細胞懸濁液の一部または全部を抜き出してもよい。培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液は、処理部２０に移送され、処理部２０において所定の処理が施される。

ステップＳ２において、移送制御部７０は、処理部２０において処理が完了したか否かを判定する。移送制御部７０は、例えば、細胞懸濁液を処理部２０に移送してから所定時間が経過したことをもって処理部２０において処理が完了したものと判定してもよい。また、処理部２０から処理完了を通知する信号が供給される場合には、上記の信号に基づいて処理部２０において処理が完了したものと判定してもよい。移送制御部７０は、処理部２０において処理が完了したものと判定すると、処理をステップＳ３に移行する。

ステップＳ３において、移送制御部７０は、ポンプＰ２を駆動させることにより、処理部２０において処理が施された一処理単位に対応する分量の細胞懸濁液を混合部３０に移送する。

ステップＳ４において、移送制御部７０は、培養容器１０のいずれかに細胞懸濁液が残留しているか否かを判定する。移送制御部７０は、例えば、培養容器１０から抜き出した細胞懸濁液の累積量が、初期状態において培養容器１０の各々に収容されていた細胞懸濁液の総量に達したか否かを判定することで、培養容器１０における細胞懸濁液の残留の有無を判定してもよい。また、培養容器１０に収容されている細胞懸濁液の重量を示す情報がリアルタイムに提供される場合には、上記の情報に基づいて培養容器１０における細胞懸濁液の残留の有無を判定してもよい。

移送制御部７０は、培養容器１０のいずれかに細胞懸濁液が残留しているものと判定した場合、処理をステップＳ１に戻す。すなわち、移送制御部７０は、処理部２０における１処理単位に対応する分量の細胞懸濁液を、培養容器１０から抜き出し、処理部２０に移送し、処理部２０における処理の完了後、混合部３０に移送する処理を、全ての培養容器１０において残留する細胞懸濁液がなくなるまで繰り返し実施する。

混合部３０には、図５Ａに示すように、処理部２０において処理が施された、各処理単位（処理単位１、処理単位２、・・・、処理単位ｎ）に対応する細胞懸濁液が収容される。すなわち、混合部３０において、各処理単位に対応する細胞懸濁液が混在した状態が形成される。ここで、「処理単位１」は、処理部２０において１番目に処理された細胞懸濁液に対応し、「処理単位２」は、処理部２０において２番目に処理された細胞懸濁液に対応し、「処理単位ｎ」は、処理部２０においてｎ番目（最後）に処理された細胞懸濁液に対応する。本実施形態において、混合部３０は、処理部２０において処理された、複数の処理単位の全てに対応する細胞懸濁液を混合する。なお、混合部３０への細胞懸濁液の注入は、混合部３０を構成する容器の底部から行うことが好ましい。混合部３０への細胞懸濁液の注入に伴って必要となる混合部３０からの空気の排出は、混合部３０を構成する容器の上部に設けられた配管（図示せず）を介して行われる。上記配管には無菌コネクタが設けられていることが好ましく、上記配管を通過する空気の流れ方向は常に一方向であることが好ましい。

混合部３０において混合される細胞懸濁液の温度は、温度制御部４０によって細胞の培養に適した温度（例えば３７℃）に制御される。すなわち、混合部３０に収容された細胞懸濁液の温度環境は、インキュベータ１１内の温度環境と同じであってもよい。従って、混合部３０に収容される細胞懸濁液は、ｎ番目（最後）に処理された細胞懸濁液が混合部３０に収容されるまでの間、培養に適した好ましい温度環境下で待機する。

移送制御部７０は、培養容器１０のいずれにも細胞懸濁液が残留していないものと判定した場合、処理をステップＳ５に移行する。ステップＳ５において、移送制御部７０は、ポンプＰ３を駆動させることにより、細胞懸濁液を混合部３０から撹拌部５０に移送する。撹拌部５０には、図５Ｂに示すように、各処理単位（処理単位１、処理単位２、・・・、処理単位ｎ）に対応する細胞懸濁液が移送される。撹拌部５０は、各処理単位に対応する細胞懸濁液を混合した混合物を撹拌する。本実施形態において、撹拌部５０は、処理部２０において処理された、複数の処理単位の全てに対応する細胞懸濁液を撹拌する。

ステップＳ６において、移送制御部７０は、撹拌部５０において撹拌処理が完了したか否かを判定する。移送制御部７０は、例えば、細胞懸濁液を撹拌部５０に移送してから所定時間が経過したことをもって撹拌部５０において撹拌処理が完了したものと判定してもよい。また、撹拌部５０から撹拌完了を通知する信号が供給される場合には、上記の信号に基づいて撹拌部５０において撹拌処理が完了したものと判定してもよい。移送制御部７０は、撹拌部５０において撹拌処理が完了したものと判定すると、処理をステップＳ７に移行する。なお、撹拌部５０に設けられた観察装置により、撹拌部５０における撹拌処理により細胞懸濁液に含まれる細胞の単位面積あたりの数が均一化されたかどうかを判定してもよい。

ステップＳ７において、移送制御部７０は、バルブＶ２のいずれかを選択的に開状態に制御するとともにポンプＰ４を駆動させる。これにより、撹拌部５０において撹拌された細胞懸濁液が、複数の回収容器６０に収容される。このとき、複数の回収容器６０に対して細胞懸濁液を一括で収容してもよいし、順次収容してもよい。複数の回収容器６０に対して細胞懸濁液を順次収容する場合、個々の回収容器６０の各々に重量センサを設け、重量センサの出力に基づいてバルブＶ２の開閉タイミングを決定してもよい。図５Ｃには、複数の回収容器６０に対して細胞懸濁液が収容されている様子が例示されている。なお、複数の回収容器６０の各々に収容された細胞懸濁液に含まれる細胞を、インキュベータ１１内部において継続して培養してもよい。培養容器１０とは別の回収容器６０を新たな培養容器として用いて培養を継続することで、元の培養容器１０を再利用する場合と比較して、細胞が細菌などによって汚染されるリスクを低減することができる。細胞懸濁液が、複数の回収容器６０の各々に収容されると、移送制御部７０による細胞懸濁液の移送制御が終了する。

細胞培養装置１を用いて、例えば１０^１０個以上の細胞を培養する大量培養を行った場合には、処理部２０における細胞懸濁液の累積処理量または細胞の累積処理数の増加に伴って、処理部２０における処理状態の変化が顕著となるおそれがある。例えば、処理部２０が濾過装置２１を含む場合、細胞懸濁液の累積処理量の増加に伴って、死細胞等のデブリスが濾過膜に堆積し、濾過膜の濾過性能が変化するおそれがある。また、処理部２０が分割装置２２を含む場合、細胞の累積処理数の増加に伴って、細胞の凝集体がメッシュに堆積し、メッシュの膜面差圧が変化するおそれがある。これにより、分割処理後における細胞の凝集体のサイズが変化するおそれがある。

このように、細胞培養装置１を用いて大量培養を行うと、処理部２０における処理状態の経時的な変動が顕著となり、処理部２０において先に処理された細胞と、後に処理された細胞とで品質が異なるおそれがある。一方、細胞培養装置１を用いて製造された細胞を、例えば、再生医療の用途で用いる場合、回収容器６０間で細胞の品質が均一であることが要求される。

細胞培養装置１によれば、処理部２０において処理された、複数の処理単位の各々に対応する細胞懸濁液が混合部３０において混合され、混合された細胞懸濁液が撹拌部５０において撹拌された後、複数の回収容器６０の各々に収容される。これにより複数の処理単位（処理単位１、処理単位２、・・・、処理単位ｎ）の各々に対応した細胞懸濁液が、略均等に分散した状態で複数の回収容器６０の各々に収容される。従って、回収容器６０間での細胞の品質差を抑制することができる。すなわち、開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置１によれば、処理部２０における処理状態の経時的な変動を吸収し、回収容器６０間での細胞の品質の均一性を向上させることが可能となる。

ここで、大量の細胞懸濁液の全量を、処理部において一括処理する場合について考える。この場合、処理部における処理時間が膨大となり、細胞懸濁液が長時間に亘り、細胞の培養に適さない温度環境下に晒され、細胞の生存率が低下したり、細胞の品質が低下したりするおそれがある。そこで処理部において処理が施されている間、細胞懸濁液の温度を、インキュベータ内の温度（培養温度）と同程度の温度に保持する対応が考えられる。しかしながら、例えば、膜分離処理（濃縮処理）中においては、細胞懸濁液の濃度が高い状態となり、この状態において、細胞懸濁液の温度が、培養温度と同程度の温度に保持されると、細胞が活性化される。細胞が活性化されると、細胞による栄養及び酸素の消費が促進され、栄養及び酸素が枯渇状態となり、細胞が死滅するおそれがある。開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置１によれば、温度制御部４０は、混合部３０において混合される細胞懸濁液の温度を制御するので、細胞の活性化を促進させることなく、細胞懸濁液が長時間に亘り細胞の培養に適さない温度環境下に晒されることを防止することができる。これにより、細胞の生存率を高めることができる。

また、大量の細胞懸濁液の全量を、単一の培養容器に収容して培養を行う場合、培養容器の容積が大きくなる。従って、この場合、培養容器の表面を透過して培養容器の内部に導入される酸素の、各細胞への供給状態を良好に保つことが困難となる。開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置１によれば、細胞懸濁液は、複数の培養容器１０に分割収容されるので、個々の培養容器１０の容積を小さくすることができる。これにより、個々の培養容器１０において、培養容器１０の表面を透過して培養容器１０の内部に導入される酸素の、各細胞への供給状態を良好に保つことが可能となる。

なお、本実施形態では、細胞懸濁を移送する手段として流路Ｆ２～Ｆ５上にそれぞれ配置されたポンプＰ１～Ｐ４を用いて、細胞懸濁液を移送する場合を例示したが、この態様に限定されない。例えば、培養容器１０の各々、処理部２０、混合部３０及び撹拌部５０にそれぞれ付随して設けられた、細胞懸濁液の液面を加圧する加圧機構を用いて細胞懸濁液の移送を行ってもよい。

［第２の実施形態］
図６は、開示の技術の第２の実施形態に係る細胞培養装置１Ａの構成の一例を示す図である。細胞培養装置１Ａは、混合部３０と撹拌部５０とが一体的に構成されている点が、第１の実施形態に係る細胞培養装置１（図１参照）と異なる。すなわち、混合部３０は、撹拌部５０において撹拌処理を行う処理容器として構成されている。

温度制御部４０は、撹拌部５０の処理容器として機能する混合部３０に収容された細胞懸濁液の温度を、細胞の培養に適した温度（例えば３７℃）に制御する。

開示の技術の第２の実施形態に係る細胞培養装置１Ａによれば、混合部３０と撹拌部５０とが一体的に構成されているので、装置の小型化を実現することができる。また、混合部３０と撹拌部５０との間で、細胞懸濁液の移送を行うことを要しないので、細胞懸濁液の移送に伴う細胞へのダメージを小さくすることできる。

［第３の実施形態］
図７は、開示の技術の第３の実施形態に係る細胞培養装置１Ｂの構成の一例を示す図である。細胞培養装置１Ｂは、撹拌部５０において撹拌された細胞懸濁液を、培養容器１０に戻すための流路Ｆ７を備えている点が、第１の実施形態に係る細胞培養装置１（図１参照）と異なる。流路Ｆ７の一端は、流路Ｆ５に接続され、流路Ｆ７の他端は、流路Ｆ２に接続されている。

細胞培養装置１Ｂにおいて、移送制御部７０は、図４に示すフローチャートのステップＳ７において、バルブＶ１を開状態に制御するとともにポンプＰ４を駆動させる。これにより、撹拌部５０において撹拌された細胞懸濁液が、複数の培養容器１０に収容される。このとき、複数の培養容器１０に対して細胞懸濁液を一括で収容してもよいし、順次収容してもよい。複数の培養容器１０の各々に収容された細胞懸濁液に含まれる細胞を継続して培養してもよい。培養容器１０を再利用して培養を継続することで、新たな培養容器を利用する場合と比較してコストを抑えることが可能となる。

［第４の実施形態］
図８は、開示の技術の第４の実施形態に係る細胞培養装置１Ｃの構成の一例を示す図である。細胞培養装置１Ｃは、混合部３０Ｃを備える。

図９は、混合部３０Ｃの構成の一例を示す図である。混合部３０Ｃは、処理部２０において処理された細胞懸濁液を、処理部２０における処理単位毎に貯留する複数の貯留部３１＿１、３１＿２、・・・、３１＿ｎを備える。貯留部３１＿１には、処理部２０において１番目に処理された「処理単位１」に対応する細胞懸濁液が貯留される。貯留部３１＿２には、処理部２０において２番目に処理された「処理単位２」に対応する細胞懸濁液が貯留される。貯留部３１＿ｎには、処理部２０においてｎ番目（最後）に処理された「処理単位ｎ」に対応する細胞懸濁液が貯留される。すなわち、複数の処理単位の全てに対応する細胞懸濁液が、貯留部３１＿１～３１＿ｎのいずれかに貯留される。温度制御部４０は、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々に貯留される細胞懸濁液の温度を、細胞の培養に適した温度（例えば３７℃）に制御する。

混合部３０Ｃは、更に、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々から所定量ずつ抜き出される細胞懸濁液を合流させる合流部３２を備える。

貯留部３１＿１～３１＿ｎへの細胞懸濁液の振り分けは、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々の流入口の近傍に設けられたバルブＶ１１の開閉制御により行われる。貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々から合流部３２への細胞懸濁液の移送は、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々の流出口の近傍に設けられたバルブＶ１２の開閉制御により行われる。バルブＶ１１及びＶ１２の開閉制御は、移送制御部７０によって行われる。

図１０は、本実施形態に係る移送制御部７０の動作シーケンスの一例を示すフローチャートである。なお、初期状態において、培養対象とされる細胞を含む細胞懸濁液は、インキュベータ１１内に配置された複数の培養容器１０の各々に収容されているものとする。

ステップＳ１１において、移送制御部７０は、バルブＶ１のいずれかを選択的に開状態に制御するとともにポンプＰ１を駆動させる。すなわち、移送制御部７０は、複数の培養容器１０の各々に収容された細胞懸濁液のうち、処理部２０における１処理単位に対応する分量の細胞懸濁液を、培養容器１０のいずれかから抜き出す。このとき、全ての培養容器１０から細胞懸濁液を抜き出してもよいし、少なくとも１つの一部の培養容器１０から細胞懸濁液を抜き出してもよい。培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液は、処理部２０に移送され、処理部２０において所定の処理が施される。

ステップＳ１２において、移送制御部７０は、処理部２０において処理が完了したか否かを判定する。移送制御部７０は、例えば、細胞懸濁液を処理部２０に移送してから所定時間が経過したことをもって処理部２０において処理が完了したものと判定してもよい。また、処理部２０から処理完了を通知する信号が供給される場合には、上記の信号に基づいて処理部２０において処理が完了したものと判定してもよい。移送制御部７０は、処理部２０において処理が完了したものと判定すると、処理をステップＳ１３に移行する。

ステップＳ１３において、移送制御部７０は、バルブＶ１１のいずれかを選択的に開状態に制御するとともにポンプＰ２を駆動させる。これにより、処理部２０において処理が施された１処理単位に対応する分量の細胞懸濁液を、貯留部３１＿１～３１＿ｎのうち対応する貯留部に移送する。

ステップＳ１４において、移送制御部７０は、培養容器１０のいずれかに細胞懸濁液が残留しているか否かを判定する。移送制御部７０は、例えば、培養容器１０から抜き出した細胞懸濁液の累積量が、初期状態において培養容器１０の各々に収容されていた細胞懸濁液の総量に達したか否かを判定することで、培養容器１０における細胞懸濁液の残留の有無を判定してもよい。また、培養容器１０に収容されている細胞懸濁液の重量を示す情報がリアルタイムに提供される場合には、上記の情報に基づいて培養容器１０における細胞懸濁液の残留の有無を判定してもよい。

移送制御部７０は、培養容器１０のいずれかに細胞懸濁液が残留しているものと判定した場合、処理をステップＳ１１に戻す。すなわち、移送制御部７０は、処理部２０における１処理単位に対応する分量の細胞懸濁液を、培養容器１０から抜き出し、処理部２０に移送し、処理部２０における処理の完了後、貯留部３１＿１～３１＿ｎのいずれかに移送する処理を、培養容器１０に残留する細胞懸濁液がなくなるまで繰り返し実施する。処理部２０において処理が施された細胞懸濁液は、処理単位毎に別々の貯留部に貯留される。移送制御部７０は、培養容器１０のいずれにも細胞懸濁液が残留していないものと判定すると、処理をステップＳ１５に移行する。

ステップＳ１５において、移送制御部７０は、バルブＶ１２の全てを開状態とするとともにポンプＰ２を駆動することにより、所定量の細胞懸濁液を、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々から合流部３２に移送する。貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々に貯留された細胞懸濁液の一部が、合流部３２に移送される。各処理単位（処理単位１、処理単位２、・・・、処理単位ｎ）に対応する細胞懸濁液が、合流部３２において合流することで、混合される。

ステップＳ１６において、移送制御部７０は、ポンプＰ３を駆動させることにより、細胞懸濁液を混合部３０Ｃから撹拌部５０に移送する。撹拌部５０には、各処理単位（処理単位１、処理単位２、・・・、処理単位ｎ）に対応する細胞懸濁液が移送される。撹拌部５０は、各処理単位に対応する細胞懸濁液を混合したものを撹拌する。

ステップＳ１７において、移送制御部７０は、撹拌部５０において撹拌処理が完了したか否かを判定する。移送制御部７０は、例えば、細胞懸濁液を撹拌部５０に移送してから所定時間が経過したことをもって撹拌部５０において撹拌処理が完了したものと判定してもよい。また、撹拌部５０から撹拌完了を通知する信号が供給される場合には、上記の信号に基づいて撹拌部５０において撹拌処理が完了したものと判定してもよい。移送制御部７０は、撹拌部５０において撹拌処理が完了したものと判定すると、処理をステップＳ１８に移行する。

ステップＳ１８において、移送制御部７０は、バルブＶ２を開状態に制御するとともにポンプＰ４を駆動させる。これにより、撹拌部５０において撹拌された細胞懸濁液が、１つまたは複数の回収容器６０に収容される。

ステップＳ１９において、移送制御部７０は、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々に細胞懸濁液が残留しているか否かを判定する。移送制御部７０は、例えば、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々から抜き出した細胞懸濁液の累積量に基づいて、貯留部３１＿１～３１＿ｎにおける細胞懸濁液の残留の有無を判定してもよい。また、貯留部３１＿１～３１＿ｎに貯留されている細胞懸濁液の重量を示す情報がリアルタイムに提供される場合には、上記の情報に基づいて貯留部３１＿１～３１＿ｎにおける細胞懸濁液の残留の有無を判定してもよい。

移送制御部７０は、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々に細胞懸濁液が残留しているものと判定した場合、処理をステップＳ１５に戻す。すなわち、移送制御部７０は、所定量の細胞懸濁液を、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々から抜き出し、合流部３２を介して撹拌部５０に移送し、撹拌部５０における撹拌処理の完了後、回収容器６０に移送する処理を、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々に残留する細胞懸濁液がなくなるまで繰り返し実施する。移送制御部７０は、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々に細胞懸濁液が残留していないものと判定すると、移送制御部７０による細胞懸濁液の移送制御が終了する。

本実施形態に係る細胞培養装置１Ｃによれば、混合部３０Ｃから撹拌部５０への細胞懸濁液の移送は、段階的に行われる。従って、撹拌部５０は、複数の培養容器１０に収容された細胞懸濁液の全量を収容可能な容積を有することを要しない。従って、撹拌部５０の容積を小さくすることができる。

また、本実施形態に係る細胞培養装置１Ｃによれば、貯留部３１＿１～３１＿ｎの各々に貯留された細胞懸濁液が、合流部３２において合流して混合されるので、撹拌部５０が細胞懸濁液の全量を収容可能な容積を有していない場合でも、複数の処理単位（処理単位１、処理単位２、・・・、処理単位ｎ）の各々に対応した細胞懸濁液が、略均等に分散した状態で、複数の回収容器６０の各々に収容される。従って、回収容器６０間での細胞の品質差を抑制することができる。

なお、細胞培養装置１Ｃにおいて、図６に示す細胞培養装置１Ａの例に倣って、撹拌部５０と混合部３０Ｃとを一体的に構成してもよい。また、細胞培養装置１Ｃにおいて、図７に示す細胞培養装置１Ｂの例に倣って、撹拌部５０において撹拌された細胞懸濁液、複数の培養容器１０の各々に収容してもよい。

なお、２０１８年１月１５日に出願された日本国特許出願２０１８－００４２２２の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。また、本明細書に記載された全ての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (10)

1. 細胞懸濁液を分割収容する複数の培養容器と、
   前記複数の培養容器の各々に収容された細胞懸濁液及び前記複数の培養容器に収容された細胞懸濁液に含まれる細胞の少なくとも一方に対して、処理単位に対応する分量毎に処理を施す処理部と、
   前記処理部において処理された、複数の処理単位の各々に対応する細胞懸濁液を混合する混合部と、
   前記混合部において混合された細胞懸濁液を撹拌する撹拌部と、
   前記処理部、前記混合部及び前記撹拌部への細胞懸濁液の移送を制御する移送制御部と、
   を含む細胞培養装置。
2. 前記混合部において混合される細胞懸濁液の温度を制御する温度制御部を更に含む請求項１に記載の細胞培養装置。
3. 前記混合部と前記撹拌部とが一体的に構成されている
   請求項１または請求項２に記載の細胞培養装置。
4. 前記混合部は、前記処理部において処理された、前記複数の処理単位の全てに対応する細胞懸濁液を混合する
   請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
5. 前記撹拌部において撹拌された細胞懸濁液を回収する複数の回収容器を更に含み、
   前記移送制御部は、前記複数の回収容器の各々への細胞懸濁液の移送を更に制御する
   請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
6. 前記移送制御部は、前記撹拌部において撹拌された細胞懸濁液を、前記複数の培養容器の各々に移送する制御を更に行う
   請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
7. 前記混合部は、
   前記処理部において処理された細胞懸濁液または前記処理部において処理された細胞を含む細胞懸濁液を、前記処理部における処理単位毎に貯留する複数の貯留部と、
   前記複数の貯留部の各々から所定量ずつ抜き出された細胞懸濁液を合流させる合流部と、
   を含む
   請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
8. 前記処理部において処理された、前記複数の処理単位の全てに対応する細胞懸濁液が、前記複数の貯留部のいずれかに貯留される
   請求項７に記載の細胞培養装置。
9. 請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の細胞培養装置を用いた細胞培養方法であって、
   前記処理部において、細胞懸濁液及び細胞懸濁液に含まれる細胞の少なくとも一方に対して、処理単位に対応する分量毎に処理を施し、
   前記混合部において、処理された、複数の処理単位の各々に対応する細胞懸濁液を混合し、
   前記撹拌部において、混合された細胞懸濁液を撹拌する、
   細胞培養方法。
10. 細胞懸濁液を分割収容する複数の培養容器に分割収容された細胞懸濁液を、前記複数の培養容器の少なくとも一部の複数の培養容器の各々から、処理単位に対応する分量だけ抜き出し、
    細胞懸濁液及び細胞懸濁液に含まれる細胞の少なくとも一方に対して、処理単位に対応する分量毎に処理を施し、
    処理された、複数の処理単位の各々に対応する細胞懸濁液を混合し、
    混合された細胞懸濁液を撹拌することを含み、
    前記処理は、濾過膜を用いた膜分離処理、細胞懸濁液に新鮮な培地を供給する培地添加処理及び細胞懸濁液に含まれる細胞の凝集体を分割する分割処理のうちの少なくとも１つを含み、
    前記細胞懸濁液の移送を、細胞培養装置が備える移送制御部が行う
    細胞培養方法。

Images