KR102318710B1 - 세포 배양 장치 및 세포 배양 방법 - Google Patents

세포 배양 장치 및 세포 배양 방법 Download PDF

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Abstract

세포 배양 장치는, 세포를 공급하는 세포 공급부와, 배지를 공급하는 배지 공급부와, 미분화 세포를 분화 유도하기 위한 첨가제를 공급하는 첨가제 공급부와, 처리 대상물을 교반하는 교반부와, 처리 대상물에 포함되는 성분을 분리하는 분리부와, 세포를 배양하는 배양 용기를 가짐과 함께, 세포 공급부, 교반부, 분리부 및 배양 용기를 경유하는 순환 루트를 형성하는 제1 유로와, 배지 공급부와 제1 유로를 접속하는 제2 유로와, 첨가제 공급부와 제1 유로를 접속하는 제3 유로와, 제1 유로, 제2 유로 및 제3 유로를 통한 송액을 제어하는 제어부를 포함한다.

Description

세포 배양 장치 및 세포 배양 방법
개시의 기술은, 세포 배양 장치 및 세포 배양 방법에 관한 것이다.
세포 배양에 관한 처리를 실시하는 세포 배양 장치에 관한 기술로서, 예를 들면 이하의 기술이 알려져 있다.
예를 들면, 일본 공개특허공보 2015-100309호에는, 세포를 자동으로 배양하는 자동 배양 장치와, 배양된 세포의 상태에 관한 정보를 관리하는 세포 관리부를 갖는 자동 배양 시스템과, 자동 배양 장치에서 배양된 세포의 상태를 기억하는 기억부와, 발주자 측에 설치된 외부 컴퓨터를 구비하는 세포 관리 시스템이 기재되어 있다.
국제 공개공보 제2013/187359호에는, 원통 형상의 배양조와, 배양조의 바닥부의 내면의 중앙으로부터 직립하는 지주(支柱)와, 지주의 상부분에 회전 가능하게 장착되는 장착부에 그 상부가 고착되고 지주를 회전 중심으로 하여 회전하는 교반 날개를 구비하는 세포 배양 장치가 기재되어 있다.
일본 공표특허공보 2016-529897호에는, 병진(竝進) 가능한 베드 및 가동 멀티 채널 피펫을 포함하는 로봇 액체 처리 시스템을 이용하여 줄기 세포를 배양하기 위한 오토메이션화된 방법이 기재되어 있다.
배성 줄기 세포(Embryonic Stem cell; ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(induced Pluripotent Stem cell; iPS 세포) 등의 다능성 줄기 세포를, 재생 의료 용도 또는 창약(創藥) 지원 용도에 적용하는 경우, 다능성 줄기 세포로부터 원하는 세포를 제작하는 분화 유도를 행할 필요가 있다. 분화 유도의 수법으로서 다능성 줄기 세포에 화학적 자극 또는 물리적 자극을 주는 수법을 들 수 있다. 또, 생체 내에 있어서 분화 세포는, 외배엽, 중배엽, 내배엽으로 불리는 3개의 배엽 중 어느 것으로부터 발생한다. 이것을 모방하여, 다능성 줄기 세포로부터 분화 세포를 얻는 경우, 제1 단계로서, 배엽으로의 분화 유도를 행한다.
상기와 같은 분화 유도에 필요로 하는 일련의 처리를, 폐쇄계에 있어서 연속적으로 실시함으로써 대량의 분화 세포를 생산하는 것을 가능하게 한 세포 배양 장치에 대하여 지금까지 제안된 예는 없고, 분화 세포의 배양 스케일을 크게 하는 것은 곤란했었다. 또, 사람의 손길이 필요한 배양 수법에 있어서는, 생물학적인 오염의 리스크가 높아짐과 함께, 배양에 의하여 얻어지는 세포의 균질성이 저하될 우려가 있다.
개시의 기술은, 상기한 점을 감안하여 이루어진 것이며, 다능성 줄기 세포의 분화 유도에 필요로 하는 일련의 처리를, 폐쇄계에 있어서 연속적으로 실시 가능하게 하는 것을 목적으로 한다.
개시의 기술에 관한 세포 배양 장치는, 세포를 공급하는 세포 공급부와, 배지를 공급하는 배지 공급부와, 미분화 세포를 분화 유도하기 위한 첨가제를 공급하는 첨가제 공급부와, 처리 대상물을 교반하는 교반부와, 처리 대상물에 포함되는 성분을 분리하는 분리부와, 세포를 배양하는 배양 용기를 가짐과 함께, 상기 세포 공급부, 상기 교반부, 상기 분리부 및 상기 배양 용기를 경유하는 순환 루트를 형성하는 제1 유로와, 상기 배지 공급부와 상기 제1 유로를 접속하는 제2 유로와, 상기 첨가제 공급부와 상기 제1 유로를 접속하는 제3 유로와, 상기 제1 유로, 상기 제2 유로 및 상기 제3 유로를 통한 송액을 제어하는 제어부를 포함한다.
상기 분리부는, 상기 미분화 세포와 사세포(死細胞)를 막분리하는 제1 필터막, 상기 미분화 세포가 분화 세포로 분화되기 전의 중간체와 상기 미분화 세포를 막분리하는 제2 필터막, 및 상기 중간체와 상기 분화 세포를 막분리하는 제3 필터막 중 적어도 1개를 갖고 있어도 된다.
상기 분리부는, 상기 제1 필터막, 상기 제2 필터막, 및 상기 제3 필터막 중 적어도 2개를 포함하는 복수의 필터막을 갖고 있어도 되고, 이 경우, 상기 제어부는, 상기 복수의 필터막 중 어느 것에 상기 세포를 포함하는 세포 현탁액을 선택적으로 통과시키는 제어를 행해도 된다.
상기 제1 필터막, 상기 제2 필터막 및 상기 제3 필터막의 각각의 막면에 마련된 개구의 사이즈는, 서로 달라도 된다.
상기 제어부는, 상기 첨가제와 상기 배지와의 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액을 행한 후에, 상기 세포를 포함하는 세포 현탁액과 상기 혼합물을 합류시켜 상기 교반부에 이송하는 제어를 행하는 것이 바람직하다.
세포 배양 장치는, 상기 제1 유로의 도중의, 상기 세포 공급부와 상기 교반부와의 사이에 마련된 저류 용기를 더 포함하고 있어도 된다. 이 경우, 상기 제어부는, 상기 저류 용기와 상기 교반부와의 사이에서 상기 혼합물을 순환시킴으로써 상기 혼합물에 전단 응력을 가한 후에, 상기 세포 현탁액과 상기 혼합물을 상기 저류 용기 내에 있어서 합류시켜 상기 교반부에 이송하는 제어를 행해도 된다. 또, 상기 제어부는, 배관 중에 상기 혼합물을 흐르게 함으로써 상기 혼합물에 전단 응력을 가한 후에, 상기 세포 현탁액과 상기 혼합물을 상기 저류 용기 내에 있어서 합류시켜 상기 교반부에 이송하는 제어를 행해도 된다.
상기 제어부는, 상기 혼합물의 점도가 소정의 점도가 될 때까지 상기 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액을 연속적으로 행해도 된다.
상기 첨가제 공급부는, Wnt 시그널 활성화제를 포함하는 제1 첨가제를 공급하는 제1 첨가제 공급부와, Wnt 시그널 저해제를 포함하는 제2 첨가제를 공급하는 제2 첨가제 공급부를 포함하고 있어도 된다.
세포 배양 장치는, 상기 배양 용기를 수용하고, 상기 배양 용기의 주위 온도를 일정하게 유지하는 인큐베이터와, 상기 인큐베이터의 내부와 외부와의 온도차에 의하여 상기 제1 유로를 따라 발생하는 온도 구배를 완화하는 온도 구배 완화 기구를 더 포함하고 있어도 된다.
개시의 기술에 관한 세포 배양 방법은, 상기의 세포 배양 장치를 이용하여 세포를 배양하는 세포 배양 방법으로서, 상기 제어부가, 상기 배지 공급부로부터 공급되는 상기 세포, 상기 첨가제 공급부로부터 공급되는 상기 첨가제 및 상기 배지 공급부로부터 공급되는 상기 배지를 포함하는 혼합물을, 상기 교반부 및 상기 분리부를 경유하여 상기 배양 용기에 이송하는 제어를 행하는 것이다.
개시의 기술에 의하면, 다능성 줄기 세포의 분화 유도에 필요로 하는 일련의 처리를, 폐쇄계에 있어서 연속적으로 실시하는 것이 가능해진다.
도 1은 개시의 기술의 실시형태에 관한 세포 배양 장치의 구성을 나타내는 블록도이다.
도 2는 개시의 기술의 실시형태에 관한 세포 배양 장치에 있어서 실시되는, 다능성 줄기 세포의 분화 유도를 위한 처리의 흐름의 일례를 나타내는 플로 차트이다.
도 3은 개시의 기술의 실시형태에 관한 제1 첨가제를 첨가하는 처리를 행하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치의 동작을 나타내는 도이다.
도 4는 개시의 기술의 실시형태에 관한 배지 교환 처리를 행하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치의 동작을 나타내는 도이다.
도 5는 개시의 기술의 실시형태에 관한 제1 첨가제를 재첨가하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치의 동작을 나타내는 도이다.
도 6은 개시의 기술의 실시형태에 관한 배지 교환 처리를 행하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치의 동작을 나타내는 도이다.
도 7은 개시의 기술의 실시형태에 관한 제2 첨가제를 첨가하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치의 동작을 나타내는 도이다.
도 8은 개시의 기술의 실시형태에 관한 배지 교환 처리를 행하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치의 동작을 나타내는 도이다.
도 9는 개시의 기술의 실시형태에 관한 제2 첨가제를 재첨가하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치의 동작을 나타내는 도이다.
도 10은 개시의 기술의 실시형태에 관한 배지 교환 처리를 행하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치의 동작을 나타내는 도이다.
도 11은 개시의 기술의 다른 실시형태에 관한 세포 배양 장치의 구성을 나타내는 블록도이다.
도 12는 개시의 기술의 다른 실시형태에 관한 세포 배양 장치의 부분적인 구성을 나타내는 도이다.
도 13은 개시의 기술의 다른 실시형태에 관한 세포 배양 장치의 구성을 나타내는 블록도이다.
이하, 개시의 기술의 실시형태의 일례를, 도면을 참조하면서 설명한다. 또한, 각 도면에 있어서 동일 또는 등가의 구성 요소 및 부분에는 동일한 참조 부호를 부여하고 있다.
[제1 실시형태]
도 1은, 개시의 기술의 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100)의 구성의 일례를 나타내는 블록도이다. 세포 배양 장치(100)는, 다능성 줄기 세포를 분화 세포로 분화 유도하기 위하여 필요로 하는 복수의 처리를 자동으로 행하여, 원하는 분화 세포를 생산하는 세포 배양 장치이다.
다능성 줄기 세포는, 자기 복제능과, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 중 어느 것으로도 분화할 수 있는 다분화능을 갖는 세포이다. 다능성 줄기 세포로서는, 배성 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배성 생식 세포(Embryonic Germ cell; EG 세포), 배성 암세포(Embryonal Carcinoma cell; EC 세포), 다능성 성체 전구 세포(Multipotent Adult Progenitor cell; MAP 세포), 성체 다능성 줄기 세포(Adult Pluripotent Stem cell; APS 세포), Muse 세포(Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell) 등을 들 수 있다. 분화 세포는, 다능성 줄기 세포가 분화하여, 특정의 형태 및 기능을 갖는 세포이다. 본 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100)를 이용하여 생산되는 분화 세포로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 심근 세포, 신경 세포 등을 들 수 있다.
세포 배양 장치(100)는, 세포 공급부(11), 제1 첨가제 공급부(12), 제2 첨가제 공급부(13) 및 배지 공급부(14)를 구비한다. 또, 세포 배양 장치(100)는, 저류 용기(20), 교반부(30), 점도 측정부(41, 42), 분리부(50), 배양 용기(70) 및 제어부(80)를 구비한다.
세포 공급부(11)는, 세포 배양 장치(100)에 있어서 배양되는 세포를 포함하는 세포 현탁액을, 세포 배양 장치(100)의 유로 내에 공급한다. 세포 공급부(11)의 유출구의 근방에는, 개폐 밸브(V1)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V1)는, 세포 공급부(11)로부터 세포 현탁액을 공급하는 경우에 개방 상태로 제어되고, 그 이외의 경우는 폐쇄 상태로 제어된다.
제1 첨가제 공급부(12)는, 다능성 줄기 세포의 분화 유도에 필요한, Wnt 시그널 활성화제를 포함하는 제1 첨가제를 세포 배양 장치(100)의 유로 내에 공급한다. 제1 첨가제 공급부(12)의 유출구의 근방에는, 개폐 밸브(V2)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V2)는, 제1 첨가제 공급부(12)로부터 제1 첨가제를 공급하는 경우에 개방 상태로 제어되고, 그 이외의 경우는 폐쇄 상태로 제어된다.
제2 첨가제 공급부(13)는, 다능성 줄기 세포의 분화 유도에 필요한, Wnt 시그널 저해제를 포함하는 제2 첨가제를 세포 배양 장치(100)의 유로 내에 공급한다. 제2 첨가제 공급부(13)의 유출구의 근방에는, 개폐 밸브(V3)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V3)는, 제2 첨가제 공급부(13)로부터 제2 첨가제를 공급하는 경우에 개방 상태로 제어되고, 그 이외의 경우는 폐쇄 상태로 제어된다.
배지 공급부(14)는, 세포의 배양에 사용하는 신선한 배지(배양액)를 세포 배양 장치(100)의 유로 내에 공급한다. 배지 공급부(14)의 유출구의 근방에는, 개폐 밸브(V4)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V4)는, 배지 공급부(14)로부터 배지를 공급하는 경우에 개방 상태로 제어되고, 그 이외의 경우는 폐쇄 상태로 제어된다.
저류 용기(20)는, 세포 공급부(11)로부터 공급되는 세포 현탁액, 제1 첨가제 공급부(12)로부터 공급되는 제1 첨가제, 제2 첨가제 공급부(13)로부터 공급되는 제2 첨가제 및 배지 공급부(14)로부터 공급되는 배지를 일차적으로 저류해 두기 위한 용기이다. 저류 용기(20)의 형태는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 유리제 또는 스테인리스제의 용기, 플라스틱제의 백(bag)의 형태를 갖는 용기를 사용하는 것이 가능하다.
교반부(30)는, 유로(F2)를 통하여 유입되는 처리 대상물을 교반 및 혼합하는 처리를 행하는 처리부이다. 교반부(30)는, 구동부를 갖지 않는 스태틱 믹서로서의 구성을 갖고 있는 것이 바람직하고, 예를 들면, 관 형상체와, 관 형상체의 내부에 고정 설치되어, 관 형상체의 내부에 나선 형상의 유로를 형성하는 교반 엘리먼트를 포함하여 구성될 수 있다. 또한, 교반부(30)는, 교반 날개를 회전 구동함으로써 교반 및 혼합을 행하는 것이어도 된다.
분리부(50)는, 유로(F3)를 통하여 유입되는 처리 대상물(세포 현탁액)에 포함되는 성분을 분리하는 처리를 행하는 처리부이다. 분리부(50)는, 제1 필터부(51), 제2 필터부(52), 제3 필터부(53)를 포함하여 구성되어 있다. 제1 필터부(51), 제2 필터부(52), 제3 필터부(53)는, 각각, 세포 현탁액이 통과하는 막면에 형성된 개구의 사이즈가 서로 다른 필터막을 구비하고 있다. 즉, 제1 필터부(51)가 구비하는 필터막의 개구 사이즈가 가장 작고, 제3 필터부(53)가 구비하는 필터막의 개구 사이즈가 가장 크다. 제2 필터부(52)가 구비하는 필터막의 개구 사이즈는, 제1 필터부(51)가 구비하는 필터막의 개구 사이즈보다 크고, 또한 제3 필터부(53)가 구비하는 필터막의 개구 사이즈보다 작다. 제1 필터부(51), 제2 필터부(52), 및 제3 필터부(53)는, 각각, 유로(F3)를 통하여 유입되는 처리 대상물(세포 현탁액)에 대하여 필터막에 의한 막분리 처리를 행한다.
제1 필터부(51)는, 다능성 줄기 세포가 분화를 개시하기 전의 배양의 초기 단계에 있어서 사용된다. 제1 필터부(51)는, 생존해 있는 미분화 세포와 사세포를 막분리하는 데에 적합한 개구 사이즈의 필터막을 갖는다. 다능성 줄기 세포에 있어서, 생존해 있는 미분화 세포는, 복수의 세포의 응집체인 세포 덩어리를 형성하고, 사세포는 세포 덩어리로부터 이탈하여 단일 세포가 된다. 따라서, 막분리 처리에 의하여 생존해 있는 미분화 세포와 사세포를 분리하는 것이 가능하다. 제1 필터부(51)는, 생존해 있는 미분화 세포(세포 덩어리)와 사세포를 포함하는 세포 현탁액 중으로부터 사세포를 제거하고, 미분화 세포를 남길 목적으로 사용된다.
제2 필터부(52)는, 다능성 줄기 세포가 심근 세포 등의 분화 세포로 분화하기 전의 중간체(외배엽, 중배엽, 내배엽)로 분화한 단계에서 사용된다. 제2 필터부(52)는, 중간체로 분화하지 않는 미분화 세포와 중간체를 막분리하는 데에 적합한 개구 사이즈의 필터막을 갖는다. 중간체의 사이즈는, 미분화 세포의 사이즈보다 크기 때문에, 막분리 처리에 의하여 미분화 세포와 중간체를 분리하는 것이 가능하다. 제2 필터부(52)는, 미분화 세포와 중간체를 포함하는 세포 현탁액 중으로부터 미분화 세포를 제거하고, 중간체를 남길 목적으로 사용된다.
제3 필터부(53)는, 다능성 줄기 세포가 심근 세포 등의 분화 세포로 분화한 단계에서 사용된다. 제3 필터부(53)는, 분화 세포로 이행하지 않는 중간체와, 분화 세포를 막분리하는 데에 적합한 개구 사이즈의 필터막을 갖는다. 심근 세포 등의 분화 세포의 사이즈는, 외배엽, 중배엽, 내배엽 등의 중간체의 사이즈보다 크기 때문에, 막분리 처리에 의하여 분화 세포와 중간체를 분리하는 것이 가능하다. 제3 필터부(53)는, 분화 세포와 중간체를 포함하는 세포 현탁액 중으로부터 중간체를 제거하고, 분화 세포를 남길 목적으로 사용된다.
제1 필터부(51), 제2 필터부(52), 및 제3 필터부(53)는, 각각, 처리 대상물(세포 현탁액)이 필터막의 막면을 따라 흐르는 탄젠셜 플로 필터의 구성을 갖고 있어도 된다. 또, 제1 필터부(51), 제2 필터부(52), 및 제3 필터부(53)는, 각각, 처리 대상물(세포 현탁액)의 흐름 방향이, 필터막의 막면에 대하여 교차하는 방향이 되는 데드 엔드 플로 필터의 구성을 갖고 있어도 된다.
제1 필터부(51), 제2 필터부(52), 및 제3 필터부(53)에는, 각각 회수 용기(61, 62 및 63)가 접속되어 있다. 제1 필터부(51), 제2 필터부(52), 및 제3 필터부(53)에 있어서, 필터막을 투과한 여과액은, 각각, 회수 용기(61, 62 및 63)에 회수된다.
본 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100)에 있어서, 제1 필터부(51), 제2 필터부(52), 및 제3 필터부(53)는, 배양 기간 중에 있어서의 소정의 타이밍에 선택적으로 사용된다. 즉, 유로(F3)를 통하여 분리부(50)에 유입되는 처리 대상물(세포 현탁액)은, 제1 필터부(51), 제2 필터부(52), 및 제3 필터부(53) 중 어느 것의 필터막을 통과한다.
제1 필터부(51), 제2 필터부(52), 및 제3 필터부(53)의 유입구의 근방에는, 각각, 개폐 밸브(V8, V9 및 V10)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V8)는, 제1 필터부(51)에 의한 막분리 처리를 행하는 경우에 개방 상태로 제어되고, 그 이외의 경우는, 폐쇄 상태로 제어된다. 개폐 밸브(V9)는, 제2 필터부(52)에 의한 막분리 처리를 행하는 경우에 개방 상태로 제어되고, 그 이외의 경우는, 폐쇄 상태로 제어된다. 개폐 밸브(V10)는, 제3 필터부(53)에 의한 막분리 처리를 행하는 경우에 개방 상태로 제어되고, 그 이외의 경우는, 폐쇄 상태로 제어된다.
여기에서, 분화 유도를 위한 세포 배양에 있어서 발생하는, 사세포(싱글 셀)(~20μm), 미분화 세포의 일례인 iPS 세포의 응집체(50~150μm), 중간체의 일례인 중배엽의 응집체(500~600μm) 및 분화 세포의 일례인 심근 세포의 응집체(200~300μm)를, 제1 필터부(51), 제2 필터부(52), 및 제3 필터부(53)에 있어서 막분리하는 경우에 있어서의, 각 필터부의 필터막의 바람직한 개구 사이즈 및 막분리 후의 이송처를, 하기의 표 1에 예시한다.
[표 1]
Figure 112019072015661-pct00001
또한, 제1 필터부(51)의 필터막의 보다 바람직한 개구 사이즈는 30μm이며, 제2 필터부(52)의 필터막의 보다 바람직한 개구 사이즈는 170μm이고, 제3 필터부(53)의 필터막의 보다 바람직한 개구 사이즈는 400μm이다.
배양 용기(70)는, 세포를 배양하기 위한 용기이다. 배양 용기(70)의 형태는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 유리제 또는 스테인리스제의 용기나 플라스틱제의 백의 형태를 갖는 용기를 사용하는 것이 가능하다. 배양 용기(70)는, 예를 들면, 온도 30℃~40℃(바람직하게는 37℃)이고, 또한 CO2 농도 2%~10%(바람직하게는 5%)로 제어되고, 또한 밀폐된 인큐베이터(71) 내에 수용되어 있다.
점도 측정부(41)는, 세포 공급부(11)에 수용되는 세포 현탁액의 점도를 측정하고, 측정 결과를 제어부(80)에 통지한다. 마찬가지로, 점도 측정부(42)는, 저류 용기(20)에 수용되는 액체의 점도를 측정하고, 측정 결과를 제어부(80)에 통지한다.
본 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100)는, 세포 공급부(11), 저류 용기(20), 교반부(30), 분리부(50) 및 배양 용기(70)를 이 순서로 경유하는 순환 루트를 형성하는 순환 유로(F0)를 갖는다. 순환 유로(F0)는, 유로(F1, F2, F3, F4 및 F5)를 포함하여 구성되어 있다. 유로(F1)는, 세포 공급부(11)의 유출구와 저류 용기(20)의 유입구를 접속하는 유로이다. 유로(F2)는, 저류 용기(20)의 유출구와 교반부(30)의 유입구를 접속하는 유로이다. 유로(F3)는, 교반부(30)의 유출구와 분리부(50)의 유입구를 접속하는 유로이다. 유로(F4)는, 분리부(50)의 유출구와 배양 용기(70)의 유입구를 접속하는 유로이다. 유로(F5)는, 배양 용기(70)의 유출구와 세포 공급부(11)의 유입구를 접속하는 유로이다. 또한, 순환 유로(F0)는, 개시의 기술에 있어서의 제1 유로의 일례이다.
제1 첨가제 공급부(12)는, 유로(F11)를 통하여 순환 유로(F0)(유로(F1))에 접속되고, 제2 첨가제 공급부(13)는, 유로(F12)를 통하여 순환 유로(F0)(유로(F1))에 접속되어 있다. 배지 공급부(14)는, 유로(F13)를 통하여 순환 유로(F0)(유로(F1))에 접속되어 있다. 또한, 유로(F13)는, 개시의 기술에 있어서의 제2 유로의 일례이다. 유로(F11 및 F12)는, 개시의 기술에 있어서의 제3 유로의 일례이다.
저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에 마련된 유로(F2)에는 개폐 밸브(V5 및 V6)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V5 및 V6)는, 각각, 저류 용기(20)로부터 교반부(30)를 향하여 송액을 행하는 경우에 개방 상태로 제어되고, 그 이외의 경우에 폐쇄 상태로 제어된다.
또, 교반부(30)와 분리부(50)와의 사이에 마련된 유로(F3)에는 개폐 밸브(V7)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V7)는, 교반부(30)로부터 분리부(50)를 향하여 송액을 행하는 경우에 개방 상태로 제어되고, 그 이외의 경우에 폐쇄 상태로 제어된다.
세포 배양 장치(100)는, 교반부(30)의 유출구와 저류 용기(20)의 유입구를 직결하는 유로(F20)를 갖는다. 즉, 유로(F20)의 일단은, 유로(F1)에 접속되고, 유로(F20)의 타단은, 유로(F3)에 접속되어 있다. 유로(F20)에는, 개폐 밸브(V13 및 V14)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V13 및 V14)는, 교반부(30)로부터 저류 용기(20)를 향하여 송액을 행하는 경우에 개방 상태로 제어되고, 그 이외의 경우에 폐쇄 상태로 제어된다.
세포 배양 장치(100)는, 유로(F1~F5, F11~F12 및 F20)를 통한 송액을 행하는 복수의 펌프(도시하지 않음)를 구비하고 있다. 또한, 세포 공급부(11), 제1 첨가제 공급부(12), 제2 첨가제 공급부(13), 배지 공급부(14), 저류 용기(20), 교반부(30), 분리부(50), 배양 용기(70)의 각각의 내부의 압력을 조정함으로써, 이들 각 요소 간에 있어서의 송액을 행해도 된다.
제어부(80)는, 개폐 밸브(V1~V14)의 개폐 제어 및 펌프(도시하지 않음)의 구동 제어를 행함으로써, 유로(F1~F5, F11~F12 및 F20)를 통한 송액의 제어를 행한다.
본 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100)에 있어서 실시되는 다능성 줄기 세포의 분화 유도를 위한 처리는, 다능성 줄기 세포를 Wnt 시그널 활성화제를 포함하는 배지 중에서 배양하는 제1 공정과, 제1 공정에서 얻어진 세포를 Wnt 시그널 저해제를 포함하는 배지 중에서 배양하는 제2 공정을 포함한다. 또한, 상기의 제1 공정 및 제2 공정을 포함하는 분화 유도의 방법의 상세는, 예를 들면, 국제 공개공보 제2013/111875호에 기재되어 있다.
도 2는, 세포 배양 장치(100)에 있어서 실시되는, 다능성 줄기 세포의 분화 유도를 위한 처리의 흐름의 일례를 나타내는 플로 차트이다.
스텝 S1에 있어서, Wnt 시그널 활성화제를 포함하는 제1 첨가제를 첨가한 배지 중에서 세포를 배양한다.
제1 첨가제를 첨가한 배지 중에서의 배양의 개시부터 소정 시간이 경과한 후, 스텝 S2에 있어서 배지 교환을 행한다. 또한, 배양을 개시한 후 최초로 행해지는 배지 교환 처리를 배지 교환 [1]로 한다. 배양 개시부터 배지 교환 [1]이 완료될 때까지의 기간은, 예를 들면 0.5일~2일 정도이다.
스텝 S3에 있어서, Wnt 시그널 활성화제를 포함하는 제1 첨가제를 배지 중에 재첨가한다.
제1 첨가제를 재첨가하고 나서 소정 시간이 경과한 후, 스텝 S4에 있어서 배지 교환을 행한다. 또한, 제1 첨가제를 재첨가한 후에 행해지는 배지 교환 처리를 배지 교환 [2]로 한다.
스텝 S5에 있어서, 제1 첨가제의 재첨가 및 배지 교환 [2]를 포함하는 일련의 처리를 1단위로 하는 처리 사이클의 사이클수가, 소정의 사이클수에 도달했는지 아닌지를 판정한다. 처리 사이클수가, 소정의 사이클수에 도달할 때까지, 제1 첨가제의 재첨가 및 배지 교환 [2]를 포함하는 일련의 처리가 반복하여 행해진다. 제1 첨가제의 재첨가 및 배지 교환 [2]를 포함하는 일련의 처리의 1사이클 기간은, 예를 들면 1일~5일 정도이다.
스텝 S6에 있어서, Wnt 시그널 저해제를 포함하는 제2 첨가제를 첨가한 배지 중에서 세포를 배양한다.
제2 첨가제를 첨가하고 나서 소정 시간이 경과한 후, 스텝 S7에 있어서 배지 교환을 행한다. 또한, 제2 첨가제를 첨가한 후 최초로 행해지는 배지 교환 처리를 배지 교환 [3]으로 한다. 제2 첨가제를 첨가한 후 배지 교환 [2]가 완료될 때까지의 기간은, 예를 들면 0.5일~2일 정도이다.
스텝 S8에 있어서, Wnt 시그널 저해제를 포함하는 제2 첨가제를 배지 중에 재첨가한다.
제2 첨가제를 재첨가하고 나서 소정 시간이 경과한 후, 스텝 S9에 있어서 배지 교환을 행한다. 또한, 제2 첨가제를 재첨가한 후에 행해지는 배지 교환 처리를 배지 교환 [4]로 한다.
스텝 S10에 있어서, 제2 첨가제의 재첨가 및 배지 교환 [4]를 포함하는 일련의 처리를 1단위로 하는 처리 사이클의 사이클수가, 소정의 사이클수에 도달했는지 아닌지를 판정한다. 처리 사이클수가, 소정의 사이클수에 도달할 때까지, 제2 첨가제의 재첨가 및 배지 교환 [4]를 포함하는 일련의 처리가 반복하여 행해진다. 제2 첨가제의 재첨가 및 배지 교환 [4]를 포함하는 일련의 처리의 1사이클 기간은, 예를 들면 1일~5일 정도이다.
이하에, 상기의 각 스텝에 대응하는 세포 배양 장치(100)의 동작에 대하여 설명한다. 또한, 설명의 번잡함을 회피하는 관점에서, 이하의 설명에서는, 개폐 밸브(V1~V14)의 개폐 제어에 관하여, 이들 개폐 밸브(V1~V14)를 개방 상태로 제어하는 경우에 대해서만 언급한다. 개폐 밸브(V1~V14)를 개방 상태로 제어한 후, 적절히 폐쇄 상태로 제어하는 것으로 한다.
<제1 첨가제의 첨가>
도 3은, 도 2에 나타내는 스텝 S1에 있어서 실시되는 처리, 즉, 제1 첨가제를 첨가하는 처리를 행하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치(100)의 동작을 나타내는 도이다. 도 3에 있어서, 처리 대상물(세포 현탁액, 배지, 첨가제 및 이들의 혼합물)의 각 처리부로의 공급 순서가 나타나 있다. 또한, 세포 공급부(11)에는, 세포 배양 장치(100)를 이용하여 분화 유도를 행하는 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 현탁액이 수용되어 있는 것으로 한다. 또, 세포 공급부(11)에 수용된 세포 현탁액의 점도가 점도 측정부(41)에 의하여 측정되고, 측정 결과가 제어부(80)에 통지되어 있는 것으로 한다.
스텝 A1에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V2 및 V4)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, Wnt 시그널 활성화제를 포함하는 제1 첨가제가, 제1 첨가제 공급부(12)로부터 저류 용기(20)에 공급됨과 함께, 신선한 배지가, 배지 공급부(14)로부터 저류 용기(20)에 공급된다. 이로써, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 저류 용기(20)에 수용된다. 저류 용기(20)에 수용된 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 점도 측정부(42)에 의하여 측정되고, 측정 결과가 제어부(80)에 통지된다.
여기에서, 저류 용기(20)에 수용되어 있는 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 세포 공급부(11)에 수용되어 있는 세포 현탁액의 점도보다 높은 것이 상정된다. 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물 및 세포 현탁액은, 이후에 혼합되게 되지만, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물과 세포 현탁액과의 점도차가 크면 양호한 혼합 상태가 얻어지지 않는 경우가 있다. 따라서, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도를, 세포 현탁액의 점도와 동등하게 한 후, 양자를 혼합하는 것이 바람직하다. 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 요변성(thixotropy)을 갖고 있으며, 전단 응력을 가함으로써 점도를 저하시키는 것이 가능하다. 따라서, 제어부(80)는, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액을 행한 후에, 세포 현탁액과 상기 혼합물을 합류시켜 교반부(30)에 이송하는 제어를 행한다. 구체적으로는, 제어부(80)는, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물을 순환시킴으로써 상기의 혼합물에 전단 응력을 가한다.
즉, 스텝 A2에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 저류 용기(20)에 수용되어 있는 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 교반부(30)에 있어서 교반됨으로써, 전단 응력이 가해지고, 점도가 저하된다.
이어서, 스텝 A3에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V13 및 V14)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 교반부(30)를 통과한 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 유로(F20)를 경유하여 저류 용기(20)에 되돌려진다. 저류 용기(20)에 수용된 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 점도 측정부(42)에 의하여 측정되고, 측정 결과가 제어부(80)에 통지된다. 제어부(80)는, 점도 측정부(42)로부터 통지되는 혼합물의 점도와, 점도 측정부(41)로부터 통지되는 세포 현탁액의 점도와의 차분값이 소정값 이하가 될 때까지, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 상기의 혼합물을 순환시키는 송액을 연속하여 행한다. 또한, 제어부(80)는, 점도 측정부(41)로부터 통지되는 세포 현탁액의 점도와는 관계 없이 점도 측정부(42)로부터 통지되는 혼합물의 점도의 값이 소정값 이하가 될 때까지, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 상기의 혼합물을 순환시키는 송액을 연속하여 행해도 된다. 또, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 상기의 혼합물을 순환시키는 송액을, 미리 정해진 사이클수에 도달할 때까지 연속하여 행해도 된다.
제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액이 완료되면, 스텝 A4에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V1)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 공급부(11)에 수용되어 있는 세포 현탁액이, 유로(F1)를 경유하여 저류 용기(20)에 이송되고, 점도 조정이 이루어진 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물과 합류한다.
스텝 A5에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 저류 용기(20)로부터 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 교반부(30)에 있어서 교반, 혼합된다. 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하여 점도 조정을 실시해 둠으로써, 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 있어서 양호한 혼합 상태를 얻을 수 있다.
스텝 A6에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V7 및 V8)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 교반부(30)로부터 유로(F3)를 경유하여 분리부(50)의 제1 필터부(51)에 공급된다. 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 제1 필터부(51)에 있어서 막분리 처리가 실시되어, 생존해 있는 세포와 사세포가 분리된다. 제1 필터부(51)의 필터막을 투과한 사세포를 포함하는 여과액은 회수 용기(61)에 회수된다.
스텝 A7에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V11)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 사세포가 제거된 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 제1 필터부(51)로부터 유로(F4)를 경유하여 배양 용기(70)에 공급된다. 다능성 줄기 세포가 Wnt 시그널 활성화제를 포함하는 제1 첨가제가 첨가된 배지와 함께 배양 용기(70)에 수용됨으로써, 분화 유도를 위한 배양이 개시된다.
<배지 교환 [1]>
도 4는, 도 2에 나타내는 스텝 S2에 있어서 실시되는 처리, 즉, 배지 교환 [1]을 행하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치(100)의 동작을 나타내는 도이다. 도 4에 있어서, 처리 대상물(세포 현탁액, 배지, 첨가제 및 이들의 혼합물)의 각 처리부로의 공급 순서가 나타나 있다.
스텝 B1에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V12)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액이, 배양 용기(70)로부터 유로(F5)를 경유하여 세포 공급부(11)에 이송된다.
스텝 B2에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V1 및 V4)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액이, 세포 공급부(11)로부터 유로(F1)를 경유하여 저류 용기(20)에 이송됨과 함께, 신선한 배지가, 배지 공급부(14)로부터 저류 용기(20)에 공급된다.
스텝 B3에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액이, 저류 용기(20)로부터 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액은, 교반부(30)에 있어서 교반, 혼합된다.
스텝 B4에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V7 및 V8)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액이, 교반부(30)로부터 유로(F3)를 경유하여 분리부(50)의 제1 필터부(51)에 공급된다. 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액은, 제1 필터부(51)에 있어서 막분리 처리가 실시되어, 사용이 완료된 배지 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 일부가, 사세포와 함께 제거된다. 제1 필터부(51)의 필터막을 투과한 사세포를 포함하는 여과액은 회수 용기(61)에 회수된다.
스텝 B5에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V11)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 막분리 처리가 완료된 세포 현탁액이, 제1 필터부(51)로부터 유로(F4)를 경유하여 배양 용기(70)에 공급되어, 배지 교환 처리가 완료된다.
<제1 첨가제의 재첨가>
도 5는, 도 2에 나타내는 스텝 S3에 있어서 실시되는 처리, 즉, 제1 첨가제를 재첨가하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치(100)의 동작을 나타내는 도이다. 도 5에 있어서, 처리 대상물(세포 현탁액, 배지, 첨가제 및 이들의 혼합물)의 각 처리부로의 공급 순서가 나타나 있다.
스텝 C1에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V2 및 V4)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, Wnt 시그널 활성화제를 포함하는 제1 첨가제가, 제1 첨가제 공급부(12)로부터 저류 용기(20)에 공급됨과 함께, 신선한 배지가, 배지 공급부(14)로부터 저류 용기(20)에 공급된다. 이로써, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 저류 용기(20)에 수용된다. 저류 용기(20)에 수용된 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 점도 측정부(42)에 의하여 측정되고, 측정 결과가 제어부(80)에 통지된다.
여기에서, 저류 용기(20)에 수용되어 있는 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 배양 용기(70)에 수용되어 있는 세포 현탁액의 점도보다 높은 것이 상정된다. 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물 및 세포 현탁액은, 이후에 혼합되게 되지만, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물과 세포 현탁액과의 점도차가 크면 양호한 혼합 상태가 얻어지지 않는 경우가 있다. 따라서, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도를, 세포 현탁액의 점도와 동등하게 한 후, 양자를 혼합하는 것이 바람직하다. 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 요변성을 갖고 있으며, 전단 응력을 가함으로써 점도를 저하시키는 것이 가능하다. 따라서, 제어부(80)는, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액을 행한 후에, 세포 현탁액과 상기 혼합물을 합류시켜 교반부(30)에 이송하는 제어를 행한다. 구체적으로는, 제어부(80)는, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물을 순환시킴으로써 상기의 혼합물에 전단 응력을 가한다.
즉, 스텝 C2에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 저류 용기(20)에 수용되어 있는 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 교반부(30)에 있어서 교반됨으로써, 전단 응력이 가해지고, 점도가 저하된다.
이어서, 스텝 C3에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V13 및 V14)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 교반부(30)를 통과한 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 유로(F20)를 경유하여 저류 용기(20)에 되돌려진다. 저류 용기(20)에 수용된 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 점도 측정부(42)에 의하여 측정되고, 측정 결과가 제어부(80)에 통지된다. 제어부(80)는, 점도 측정부(42)로부터 통지되는 혼합물의 점도의 값이 소정값 이하가 될 때까지, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 상기의 혼합물을 순환시키는 송액을 연속하여 행한다. 또한, 제어부(80)는, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 상기의 혼합물을 순환시키는 송액을, 미리 정해진 사이클수에 도달할 때까지 연속하여 행해도 된다.
제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액이 완료되면, 스텝 C4에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V12)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써 세포 현탁액이, 배양 용기(70)로부터 유로(F5)를 경유하여 세포 공급부(11)에 이송된다.
스텝 C5에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V1)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 공급부(11)에 수용되어 있는 세포 현탁액이, 유로(F1)를 경유하여 저류 용기(20)에 이송되고, 점도 조정이 이루어진 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물과 합류한다.
스텝 C6에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 저류 용기(20)로부터 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 교반부(30)에 있어서 교반, 혼합된다. 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하여 점도 조정을 실시해 둠으로써, 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 있어서 양호한 혼합 상태를 얻을 수 있다.
스텝 C7에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V7 및 V9)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 교반부(30)로부터 유로(F3)를 경유하여 분리부(50)의 제2 필터부(52)에 공급된다. 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 제2 필터부(52)에 있어서 막분리 처리가 실시되어, 중간체(외배엽, 중배엽, 내배엽)로 분화하지 않는 미분화 세포 및 사세포와 중간체가 분리된다. 제2 필터부(52)의 필터막을 투과한 미분화 세포 및 사세포를 포함하는 여과액은 회수 용기(62)에 회수된다.
스텝 C8에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V11)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 미분화 세포 및 사세포가 제거되고, 중간체가 남겨진 세포 현탁액, 제1 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 제2 필터부(52)로부터 유로(F4)를 경유하여 배양 용기(70)에 공급된다.
<배지 교환 [2]>
도 6은, 도 2에 나타내는 스텝 S4에 있어서 실시되는 처리, 즉, 배지 교환 [2]를 행하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치(100)의 동작을 나타내는 도이다. 도 6에 있어서, 처리 대상물(세포 현탁액, 배지, 첨가제 및 이들의 혼합물)의 각 처리부로의 공급 순서가 나타나 있다.
스텝 D1에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V12)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액이, 배양 용기(70)로부터 유로(F5)를 경유하여 세포 공급부(11)에 이송된다.
스텝 D2에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V1 및 V4)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액이, 세포 공급부(11)로부터 유로(F1)를 경유하여 저류 용기(20)에 이송됨과 함께, 신선한 배지가, 배지 공급부(14)로부터 저류 용기(20)에 공급된다.
스텝 D3에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액이, 저류 용기(20)로부터 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액은, 교반부(30)에 있어서 교반, 혼합된다.
스텝 D4에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V7 및 V9)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액이, 교반부(30)로부터 유로(F3)를 경유하여 분리부(50)의 제2 필터부(52)에 공급된다. 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액은, 제2 필터부(52)에 있어서 막분리 처리가 실시되어, 사용이 완료된 배지 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 일부가, 사세포 및 미분화 세포와 함께 제거된다. 제2 필터부(52)의 필터막을 투과한 사세포 및 미분화 세포를 포함하는 여과액은 회수 용기(62)에 회수된다.
스텝 D5에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V11)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 막분리 처리가 완료된 세포 현탁액이, 제2 필터부(52)로부터 유로(F4)를 경유하여 배양 용기(70)에 공급되어, 배지 교환 처리가 완료된다.
<제2 첨가제의 첨가>
도 7은, 도 2에 나타내는 스텝 S6에 있어서 실시되는 처리, 즉, 제2 첨가제를 첨가하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치(100)의 동작을 나타내는 도이다. 도 7에 있어서, 처리 대상물(세포 현탁액, 배지, 첨가제 및 이들의 혼합물)의 각 처리부로의 공급 순서가 나타나 있다.
스텝 E1에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V3 및 V4)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, Wnt 시그널 저해제를 포함하는 제2 첨가제가, 제2 첨가제 공급부(13)로부터 저류 용기(20)에 공급됨과 함께, 신선한 배지가, 배지 공급부(14)로부터 저류 용기(20)에 공급된다. 이로써, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 저류 용기(20)에 수용된다. 저류 용기(20)에 수용된 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 점도 측정부(42)에 의하여 측정되고, 측정 결과가 제어부(80)에 통지된다.
여기에서, 저류 용기(20)에 수용되어 있는 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 배양 용기(70)에 수용되어 있는 세포 현탁액의 점도보다 높은 것이 상정된다. 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물 및 세포 현탁액은, 이후에 혼합되게 되지만, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물과 세포 현탁액과의 점도차가 크면 양호한 혼합 상태가 얻어지지 않는 경우가 있다. 따라서, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도를, 세포 현탁액의 점도와 동등하게 한 후, 양자를 혼합하는 것이 바람직하다. 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 요변성을 갖고 있으며, 전단 응력을 가함으로써 점도를 저하시키는 것이 가능하다. 따라서, 제어부(80)는, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액을 행한 후에, 세포 현탁액과 상기 혼합물을 합류시켜 교반부(30)에 이송하는 제어를 행한다. 구체적으로는, 제어부(80)는, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물을 순환시킴으로써 상기의 혼합물에 전단 응력을 가한다.
즉, 스텝 E2에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 저류 용기(20)에 수용되어 있는 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 교반부(30)에 있어서 교반됨으로써, 전단 응력이 가해지고, 점도가 저하된다.
이어서, 스텝 E3에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V13 및 V14)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 교반부(30)를 통과한 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 유로(F20)를 경유하여 저류 용기(20)에 되돌려진다. 저류 용기(20)에 수용된 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 점도 측정부(42)에 의하여 측정되고, 측정 결과가 제어부(80)에 통지된다. 제어부(80)는, 점도 측정부(42)로부터 통지되는 혼합물의 점도의 값이 소정값 이하가 될 때까지, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 상기의 혼합물을 순환시키는 송액을 연속하여 행한다. 또한, 제어부(80)는, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 상기의 혼합물을 순환시키는 송액을, 미리 정해진 사이클수에 도달할 때까지 연속하여 행해도 된다.
제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액이 완료되면, 스텝 E4에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V12)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써 세포 현탁액이, 배양 용기(70)로부터 유로(F5)를 경유하여 세포 공급부(11)에 이송된다.
스텝 E5에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V1)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 공급부(11)에 수용되어 있는 세포 현탁액이, 유로(F1)를 경유하여 저류 용기(20)에 이송되고, 점도 조정이 이루어진 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물과 합류한다.
스텝 E6에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 저류 용기(20)로부터 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 교반부(30)에 있어서 교반, 혼합된다. 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하여 점도 조정을 실시해 둠으로써, 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 있어서 양호한 혼합 상태를 얻을 수 있다.
스텝 E7에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V7 및 V9)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 교반부(30)로부터 유로(F3)를 경유하여 분리부(50)의 제2 필터부(52)에 공급된다. 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 제2 필터부(52)에 있어서 막분리 처리가 실시되어, 중간체(외배엽, 중배엽, 내배엽)로 분화하지 않는 미분화 세포 및 사세포와 중간체가 분리된다. 제2 필터부(52)의 필터막을 투과한 미분화 세포 및 사세포를 포함하는 여과액은 회수 용기(62)에 회수된다.
스텝 E8에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V11)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 미분화 세포 및 사세포가 제거되고, 중간체가 남겨진 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 제2 필터부(52)로부터 유로(F4)를 경유하여 배양 용기(70)에 공급된다.
<배지 교환 [3]>
도 8은, 도 2에 나타내는 스텝 S7에 있어서 실시되는 처리, 즉, 배지 교환 [3]을 행하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치(100)의 동작을 나타내는 도이다. 도 8에 있어서, 처리 대상물(세포 현탁액, 배지, 첨가제 및 이들의 혼합물)의 각 처리부로의 공급 순서가 나타나 있다.
스텝 G1에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V12)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액이, 배양 용기(70)로부터 유로(F5)를 경유하여 세포 공급부(11)에 이송된다.
스텝 G2에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V1 및 V4)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액이, 세포 공급부(11)로부터 유로(F1)를 경유하여 저류 용기(20)에 이송됨과 함께, 신선한 배지가, 배지 공급부(14)로부터 저류 용기(20)에 공급된다.
스텝 G3에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액이, 저류 용기(20)로부터 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액은, 교반부(30)에 있어서 교반, 혼합된다.
스텝 G4에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V7 및 V9)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액이, 교반부(30)로부터 유로(F3)를 경유하여 분리부(50)의 제2 필터부(52)에 공급된다. 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액은, 제2 필터부(52)에 있어서 막분리 처리가 실시되어, 사용이 완료된 배지 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 일부가, 사세포 및 미분화 세포와 함께 제거된다. 제2 필터부(52)의 필터막을 투과한 사세포 및 미분화 세포를 포함하는 여과액은 회수 용기(62)에 회수된다.
스텝 G5에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V11)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 막분리 처리가 완료된 세포 현탁액이, 제2 필터부(52)로부터 유로(F4)를 경유하여 배양 용기(70)에 공급되어, 배지 교환 처리가 완료된다.
<제2 첨가제의 재첨가>
도 9는, 도 2에 나타내는 스텝 S8에 있어서 실시되는 처리, 즉, 제2 첨가제를 재첨가하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치(100)의 동작을 나타내는 도이다. 도 9에 있어서, 처리 대상물(세포 현탁액, 배지, 첨가제 및 이들의 혼합물)의 각 처리부로의 공급 순서가 나타나 있다.
스텝 H1에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V3 및 V4)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, Wnt 시그널 저해제를 포함하는 제2 첨가제가, 제2 첨가제 공급부(13)로부터 저류 용기(20)에 공급됨과 함께, 신선한 배지가, 배지 공급부(14)로부터 저류 용기(20)에 공급된다. 이로써, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 저류 용기(20)에 수용된다. 저류 용기(20)에 수용된 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 점도 측정부(42)에 의하여 측정되고, 측정 결과가 제어부(80)에 통지된다.
여기에서, 저류 용기(20)에 수용되어 있는 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 배양 용기(70)에 수용되어 있는 세포 현탁액의 점도보다 높은 것이 상정된다. 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물 및 세포 현탁액은, 이후에 혼합되게 되지만, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물과 세포 현탁액과의 점도차가 크면 양호한 혼합 상태가 얻어지지 않는 경우가 있다. 따라서, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도를, 세포 현탁액의 점도와 동등하게 한 후, 양자를 혼합하는 것이 바람직하다. 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 요변성을 갖고 있으며, 전단 응력을 가함으로써 점도를 저하시키는 것이 가능하다. 따라서, 제어부(80)는, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액을 행한 후에, 세포 현탁액과 상기 혼합물을 합류시켜 교반부(30)에 이송하는 제어를 행한다. 구체적으로는, 제어부(80)는, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물을 순환시킴으로써 상기의 혼합물에 전단 응력을 가한다.
즉, 스텝 H2에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 저류 용기(20)에 수용되어 있는 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 교반부(30)에 있어서 교반됨으로써, 전단 응력이 가해지고, 점도가 저하된다.
이어서, 스텝 H3에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V13 및 V14)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 교반부(30)를 통과한 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 유로(F20)를 경유하여 저류 용기(20)에 되돌려진다. 저류 용기(20)에 수용된 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 점도 측정부(42)에 의하여 측정되고, 측정 결과가 제어부(80)에 통지된다. 제어부(80)는, 점도 측정부(42)로부터 통지되는 혼합물의 점도의 값이 소정값 이하가 될 때까지, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 상기의 혼합물을 순환시키는 송액을 연속하여 행한다. 또한, 제어부(80)는, 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 상기의 혼합물을 순환시키는 송액을, 미리 정해진 사이클수에 도달할 때까지 연속하여 행해도 된다.
제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액이 완료되면, 스텝 H4에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V12)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써 세포 현탁액이, 배양 용기(70)로부터 유로(F5)를 경유하여 세포 공급부(11)에 이송된다.
스텝 H5에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V1)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 공급부(11)에 수용되어 있는 세포 현탁액이, 유로(F1)를 경유하여 저류 용기(20)에 이송되고, 점도 조정이 이루어진 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물과 합류한다.
스텝 H6에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 저류 용기(20)로부터 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 교반부(30)에 있어서 교반, 혼합된다. 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하여 점도 조정을 실시해 둠으로써, 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 있어서 양호한 혼합 상태를 얻을 수 있다.
스텝 H7에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V7 및 V10)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 교반부(30)로부터 유로(F3)를 경유하여 분리부(50)의 제3 필터부(53)에 공급된다. 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 제3 필터부(53)에 있어서 막분리 처리가 실시되어, 분화 세포로 이행하지 않는 중간체(외배엽, 중배엽, 내배엽), 중간체로 분화하지 않는 미분화 세포 및 사세포와, 분화 세포가 분리된다. 제3 필터부(53)의 필터막을 투과한 중간체, 미분화 세포 및 사세포를 포함하는 여과액은 회수 용기(63)에 회수된다.
스텝 H8에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V11)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 중간체, 미분화 세포 및 사세포가 제거되고, 분화 세포가 남겨진 세포 현탁액, 제2 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 제3 필터부(53)로부터 유로(F4)를 경유하여 배양 용기(70)에 공급된다.
<배지 교환 [4]>
도 10은, 도 2에 나타내는 스텝 S9에 있어서 실시되는 처리, 즉, 배지 교환 [4]를 행하는 경우에 있어서의 세포 배양 장치(100)의 동작을 나타내는 도이다. 도 10에 있어서, 처리 대상물(세포 현탁액, 배지, 첨가제 및 이들의 혼합물)의 각 처리부로의 공급 순서가 나타나 있다.
스텝 I1에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V12)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액이, 배양 용기(70)로부터 유로(F5)를 경유하여 세포 공급부(11)에 이송된다.
스텝 I2에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V1 및 V4)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액이, 세포 공급부(11)로부터 유로(F1)를 경유하여 저류 용기(20)에 이송됨과 함께, 신선한 배지가, 배지 공급부(14)로부터 저류 용기(20)에 공급된다.
스텝 I3에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액이, 저류 용기(20)로부터 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액은, 교반부(30)에 있어서 교반, 혼합된다.
스텝 I4에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V7 및 V10)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액이, 교반부(30)로부터 유로(F3)를 경유하여 분리부(50)의 제3 필터부(53)에 공급된다. 신선한 배지가 추가된 세포 현탁액은, 제3 필터부(53)에 있어서 막분리 처리가 실시되어, 사용이 완료된 배지 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 일부가, 중간체(외배엽, 중배엽, 내배엽), 미분화 세포 및 사세포와 함께 제거된다. 제3 필터부(53)의 필터막을 투과한 중간체, 미분화 세포, 사세포는 회수 용기(62)에 회수된다.
스텝 I5에 있어서, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V11)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 막분리 처리가 완료된 세포 현탁액이, 제3 필터부(53)로부터 유로(F4)를 경유하여 배양 용기(70)에 공급되어, 배지 교환 처리가 완료된다.
이상과 같이, 세포 배양 장치(100)는, 순환 루트를 형성하는 환 형상 유로(F0)의 도중에 마련된 처리부(교반부(30) 및 분리부(50)), 배양 용기(70), 세포 공급부(11)를 갖는다. 또, 순환 루트를 형성하는 환 형상 유로(F0)에는, 분화 유도에 필요한 첨가제를 공급하는 제1 첨가제 공급부(12) 및 제2 첨가제 공급부(13)와, 신선한 배지를 공급하는 배지 공급부(14)가 접속되어 있다. 또, 세포 배양 장치(100)는, 세포 배양 장치(100)에 마련된 각 유로를 통한 송액을 제어하는 제어부(80)를 갖는다. 상기의 구성을 갖는 세포 배양 장치(100)에 의하면, 다능성 줄기 세포의 분화 유도에 필요로 하는 일련의 처리를, 폐쇄계에 있어서 연속적으로 실시하는 것이 가능해진다.
또, 본 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100)에 의하면, 분리부(50)가, 제1 필터부(51), 제2 필터부(52) 및 제3 필터부(53)를 포함하여 구성되고, 이들 필터부는, 각각, 개구의 사이즈가 서로 다른 필터막을 구비한다. 제1 필터부(51), 제2 필터부(52) 및 제3 필터부(53)는, 배양 기간 중에 있어서의 소정의 타이밍에 선택적으로 사용된다. 이로써, 배양 기간 중에 발생하는, 사세포, 미분화 세포, 중간체 및 분화 세포를, 적절히 분리하는 것이 가능해진다.
또, 본 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100)에 의하면, 첨가제를 첨가 또는 재첨가하는 경우, 제어부(80)는, 첨가제와 신선한 배지와의 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액을 행한 후에, 세포 현탁액과 상기의 혼합물을 합류시켜 교반부(30)에 이송하는 제어를 행한다. 즉, 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도를, 세포 현탁액의 점도에 근접시킨 후에, 상기의 혼합물과 세포 현탁액과의 혼합을 행한다. 이로써, 세포 현탁액, 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물을 혼합하는 경우에, 양호한 혼합 상태를 얻을 수 있다.
또한, 본 실시형태에서는, 분리부(50)가, 제1 필터부(51), 제2 필터부(52) 및 제3 필터부(53)의 3종류의 필터부를 갖는 경우를 예시했지만, 이 양태에 한정되는 것은 아니다. 분리부(50)는, 제1 필터부(51), 제2 필터부(52) 및 제3 필터부(53) 중 적어도 1개를 포함하고 있으면 된다.
또, 본 실시형태에서는, 분리부(50)에 의한 분리 수단으로서, 막분리 처리를 행하는 필터부를 예시했지만, 이 양태에 한정되는 것은 아니다. 분리부(50)에 의한 분리 수단으로서, 막분리 수단 대신에, 또는 막분리 수단과 병용하여, 원심 분리 수단, 가진(加振) 분리 수단, 전해 분리 수단 및 자기 분리 수단을 이용하는 것도 가능하다.
또, 본 실시형태에서는, 세포 배양 장치(100)가 저류 용기(20)를 구비하는 경우를 예시했지만, 저류 용기(20)를 생략하는 것도 가능하다. 저류 용기(20)를 생략하는 경우, 유로를 형성하는 배관에 저류 용기로서의 기능을 담당하게 하도록 해도 된다.
[제2 실시형태]
도 11은, 개시의 기술의 제2 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100A)의 구성을 나타내는 블록도이다. 상기의 제1 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100)에 있어서는, 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하기 위하여, 상기의 혼합물을 저류 용기(20)와 교반부(30)와의 사이에서 순환시키는 경우를 예시했다. 제2 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100A)에 있어서는, 첨가제와 신선한 배지와의 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액 경로가, 제1 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100)와 다르다.
제2 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100A)는, 첨가제와 신선한 배지와의 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액 경로로서, 저류 용기(20)의 유출구와 유입구를 접속하는 유로(F21)를 갖는다. 제어부(80)는, 유로(F21)를 구성하는 배관 중에 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물을 흐르게 함으로써 상기의 혼합물에 전단 응력을 가한 후에, 세포 현탁액과 상기의 혼합물을 저류 용기(20) 내에 있어서 합류시켜 교반부(30)에 이송한다.
구체적으로는, 제어부(80)는, 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이 저류 용기(20)에 수용되어 있는 상태에 있어서, 개폐 밸브(V5, V13 및 V14)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 저류 용기(20)에 수용되어 있는 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이 저류 용기(20)로부터 유출되어, 유로(F21)를 경유하여 저류 용기(20)에 되돌아온다. 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 유로(F21)에 흐르는 동안, 유로(F21)를 구성하는 배관 내의 벽면과의 마찰에 의하여, 상기의 혼합물에 전단 응력이 가해지고, 상기의 혼합물의 점도가 저하된다.
저류 용기(20)에 수용된 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물의 점도는, 점도 측정부(42)에 의하여 측정되고, 측정 결과가 제어부(80)에 통지된다. 제어부(80)는, 점도 측정부(42)로부터 통지되는 혼합물의 점도와, 점도 측정부(41)로부터 통지되는 세포 현탁액의 점도와의 차분값이 소정값 이하가 될 때까지, 상기의 혼합물을 유로(F21)를 통하여 순환시키는 송액을 연속하여 행한다. 또한, 제어부(80)는, 점도 측정부(42)로부터 통지되는 혼합물의 점도의 값이 소정값 이하가 될 때까지, 상기의 혼합물을 유로(F21)를 통하여 순환시키는 송액을 연속하여 행해도 된다. 또, 상기의 혼합물을 유로(F21)를 통하여 순환시키는 송액을, 미리 정해진 사이클수에 도달할 때까지 연속하여 행해도 된다.
첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액이 완료되면, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5, V13 및 V14)를 폐쇄 상태로 제어하고, 개폐 밸브(V1)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 공급부(11)에 수용되어 있는 세포 현탁액이, 유로(F1)를 경유하여 저류 용기(20)에 이송되고, 점도 조정이 이루어진 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물과 합류한다.
그 후, 제어부(80)는, 개폐 밸브(V5 및 V6)를 개방 상태로 제어함과 함께 소정의 펌프를 구동한다. 이로써, 세포 현탁액, 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물이, 저류 용기(20)로부터 유로(F2)를 경유하여 교반부(30)에 이송된다. 세포 현탁액, 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물은, 교반부(30)에 있어서 교반, 혼합된다. 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하여 점도 조정을 실시해 둠으로써, 세포 현탁액, 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 있어서 양호한 혼합 상태를 얻을 수 있다.
또한, 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 수법으로서, 저류 용기(20)를 플라스틱 필름 등의 유연한 재료로 구성하고, 첨가제 및 신선한 배지를 포함하는 혼합물을 수용한 저류 용기(20)에 외부로부터 힘을 가하는 방법을 이용하는 것도 가능하다.
[제3 실시형태]
개시의 기술의 실시형태에 관한 세포 배양 장치에 있어서, 인큐베이터(71)의 내부의 온도 T1는, 예를 들면 37℃로 일정하게 유지되고 있으며, 인큐베이터(71)의 외부의 온도 T2는, 실온(예를 들면 25℃)이다. 따라서, 인큐베이터(71)의 내부에 수용된 배양 용기(70)에 세포 현탁액을 유입시키는 경우, 및 인큐베이터(71)의 외부에 세포 현탁액을 유출시키는 경우에, 세포는, 12℃의 온도차에 의한 열충격을 받는다. 이 열충격에 의하여, 세포는 데미지를 받을 우려가 있다.
도 12는, 개시의 기술의 제3 실시형태에 관한 세포 배양 장치의 부분적인 구성을 나타내는 도이다. 제3 실시형태에 관한 세포 배양 장치는, 배양 용기(70)를 수용하는 인큐베이터(71)의 내부와 외부와의 온도 구배를 완화하는 온도 구배 완화 기구(91 및 92)를 구비하고 있다.
온도 구배 완화 기구(91)는, 복수의 가열 유닛(91a, 91b, 91c 및 91d)을 포함하여 구성되어 있다. 가열 유닛(91a, 91b, 91c 및 91d)은, 인큐베이터(71) 내에 수용된 배양 용기(70)에 유입하는 세포 현탁액이 통과하는 유로(F4)에 마련되어 있다. 가열 유닛(91a, 91b, 91c 및 91d)은, 각각, 독립적으로 가열 온도의 설정을 행하는 것이 가능하고, 서로 다른 온도로 유로(F4)를 흐르는 세포 현탁액을 가열한다. 가열 유닛(91a, 91b, 91c 및 91d)의 설정 온도를 각각, T1a, T1b, T1c 및 T1d로 하면, T2(25℃)<T1d<T1c<T1b<T1a<T1(37℃)이 되도록, 각 가열 유닛의 온도 설정이 이루어진다. 이로써, 유로(F4)를 흐르는 세포 현탁액의 온도는, 완만하게 인큐베이터(71)의 내부의 온도 T1(37℃)을 향하여 상승한다. 즉, 온도 구배 완화 기구(91)에 의하여 인큐베이터(71)의 내외의 온도차에 의한 세포 현탁액의 시간당 온도 변화인 온도 구배가 완화된다. 온도 구배는 예를 들면 0.1(℃/s) 이하인 것이 바람직하다. 또한, 본 실시형태에서는, 4개의 가열 유닛(91a, 91b, 91c 및 91d)에 의하여 온도 구배 완화 기구(91)를 구성하는 경우를 예시했지만, 원하는 온도 구배를 실현할 수 있도록, 가열 유닛의 수는 적절히 증감하는 것이 가능하다.
한편, 온도 구배 완화 기구(92)는, 복수의 냉각 유닛(92a, 92b, 92c 및 92d)을 포함하여 구성되어 있다. 냉각 유닛(92a, 92b, 92c 및 92d)은, 인큐베이터(71) 내에 수용된 배양 용기(70)로부터 유출되는 세포 현탁액이 통과하는 유로(F5)에 마련되어 있다. 냉각 유닛(92a, 92b, 92c 및 92d)은, 서로 독립적으로 냉각 온도의 설정을 행하는 것이 가능하고, 서로 다른 온도로 유로(F5)를 흐르는 세포 현탁액을 냉각한다. 냉각 유닛(92a, 92b, 92c 및 92d)의 설정 온도를 각각, T2a, T2b, T2c 및 T2d로 하면, T2(25℃)<T2d<T2c<T2b<T2a<T1(37℃)이 되도록, 각 냉각 유닛의 온도 설정이 이루어진다. 이로써, 유로(F5)를 흐르는 세포 현탁액의 온도는, 완만하게 인큐베이터(71)의 외부의 온도 T2(25℃)를 향하여 하강한다. 즉, 온도 구배 완화 기구(92)에 의하여 인큐베이터(71)의 내외의 온도차에 의한 세포 현탁액의 시간당 온도 변화인 온도 구배가 완화된다. 온도 구배는, 예를 들면 0.1(℃/s) 이하인 것이 바람직하다. 또한, 본 실시형태에서는, 4개의 냉각 유닛(92a, 92b, 92c 및 92d)에 의하여 온도 구배 완화 기구(92)를 구성하는 경우를 예시했지만, 원하는 온도 구배를 실현할 수 있도록, 냉각 유닛의 수는 적절히 증감하는 것이 가능하다.
이상과 같이, 개시의 기술의 제3 실시형태에 관한 세포 배양 장치에 의하면, 온도 구배 완화 기구(91 및 92)에 의하여 인큐베이터(71)의 내외의 온도차에 의한 세포 현탁액의 온도 변화의 온도 구배가 완화된다. 이로써, 인큐베이터(71)의 내외의 온도차에 의하여 세포가 받는 데미지를 경감 또는 해소하는 것이 가능해진다.
[제4 실시형태]
도 13은, 개시의 기술의 제4 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100B)의 구성을 나타내는 도이다. 제4 실시형태에 관한 세포 배양 장치(100B)는, 세포 상태 측정부(90)를 더 갖는다. 세포 상태 측정부(90)는, 배양 용기(70) 내에 수용되어 있는 세포를 촬상하는 카메라를 구비하고, 촬상에 의하여 얻어지는 화상을 제어부(80)에 공급한다.
제어부(80)는, 세포 상태 측정부(90)로부터 공급되는 화상으로부터 배양 용기(70) 내에 수용되어 있는 세포의 상태를 검출한다. 제어부(80)는, 화상으로부터 검출한 세포의 상태에 근거하여, 도 2에 나타내는 각 처리 스텝으로의 이행 가부(可否)를 판정한다.
이와 같이, 배양 용기(70) 내에 수용되어 있는 세포의 화상에 근거하여 각 처리 스텝으로의 이행 가부를 판정함으로써, 분화 유도에 필요로 하는 각 처리를 적절한 타이밍에 실시할 수 있으며, 분화 세포의 생산성을 높일 수 있다.
또한, 2017년 1월 20일에 출원된 일본 특허 출원 2017-008911의 개시는, 그 전체가 참조에 의하여 본 명세서에 원용된다. 또, 본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격이 참조에 의하여 원용되는 것이 구체적이고, 또한 개개에 기재된 경우와 동일한 정도로, 본 명세서 중에 참조에 의하여 원용된다.

Claims (11)

  1. 세포를 공급하는 세포 공급부와,
    배지를 공급하는 배지 공급부와,
    미분화 세포를 분화 유도하기 위한 첨가제를 공급하는 첨가제 공급부와,
    처리 대상물을 교반하는 교반부와,
    처리 대상물에 포함되는 성분을 분리하는 분리부와,
    상기 세포를 배양하는 배양 용기를 가짐과 함께,
    상기 세포 공급부, 상기 교반부, 상기 분리부 및 상기 배양 용기를 경유하는 순환 루트를 형성하는 제1 유로와,
    상기 배지 공급부와 상기 제1 유로를 접속하는 제2 유로와,
    상기 첨가제 공급부와 상기 제1 유로를 접속하는 제3 유로와,
    상기 제1 유로, 상기 제2 유로 및 상기 제3 유로를 통한 송액을 제어하는 제어부를 포함하는 세포 배양 장치.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 분리부는,
    상기 미분화 세포와 사세포를 막분리하는 제1 필터막, 상기 미분화 세포가 분화 세포로 분화되기 전의 중간체와 상기 미분화 세포를 막분리하는 제2 필터막, 및 상기 중간체와 상기 분화 세포를 막분리하는 제3 필터막 중 적어도 1개를 갖는, 세포 배양 장치.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 분리부는, 상기 제1 필터막, 상기 제2 필터막, 및 상기 제3 필터막 중 적어도 2개를 포함하는 복수의 필터막을 갖고,
    상기 제어부는, 상기 복수의 필터막 중 어느 것에 상기 세포를 포함하는 세포 현탁액을 선택적으로 통과시키는 제어를 행하는, 세포 배양 장치.
  4. 청구항 2 또는 청구항 3에 있어서,
    상기 제1 필터막, 상기 제2 필터막 및 상기 제3 필터막의 각각의 막면에 마련된 개구의 사이즈가 서로 다른, 세포 배양 장치.
  5. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제어부는, 상기 첨가제와 상기 배지와의 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액을 행한 후에, 상기 세포를 포함하는 세포 현탁액과 상기 혼합물을 합류시켜 상기 교반부에 이송하는 제어를 행하는, 세포 배양 장치.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 제1 유로의 도중의, 상기 세포 공급부와 상기 교반부와의 사이에 마련된 저류 용기를 더 포함하고,
    상기 제어부는, 상기 저류 용기와 상기 교반부와의 사이에서 상기 혼합물을 순환시킴으로써 상기 혼합물에 전단 응력을 가한 후에, 상기 세포 현탁액과 상기 혼합물을 상기 저류 용기 내에 있어서 합류시켜 상기 교반부에 이송하는 제어를 행하는, 세포 배양 장치.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 제1 유로의 도중의, 상기 세포 공급부와 상기 교반부와의 사이에 마련된 저류 용기를 더 포함하고,
    상기 제어부는, 배관 중에 상기 혼합물을 흐르게 함으로써 상기 혼합물에 전단 응력을 가한 후에, 상기 세포 현탁액과 상기 혼합물을 상기 저류 용기 내에 있어서 합류시켜 상기 교반부에 이송하는 제어를 행하는, 세포 배양 장치.
  8. 청구항 5에 있어서,
    상기 제어부는, 상기 혼합물의 점도가 소정의 점도가 될 때까지 상기 혼합물에 전단 응력을 가하기 위한 송액을 연속적으로 행하는, 세포 배양 장치.
  9. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 첨가제 공급부는,
    Wnt 시그널 활성화제를 포함하는 제1 첨가제를 공급하는 제1 첨가제 공급부와,
    Wnt 시그널 저해제를 포함하는 제2 첨가제를 공급하는 제2 첨가제 공급부를 포함하는, 세포 배양 장치.
  10. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 용기를 수용하고, 상기 배양 용기의 주위 온도를 일정하게 유지하는 인큐베이터와,
    상기 인큐베이터의 내부와 외부와의 온도차에 의하여 상기 제1 유로를 따라 발생하는 온도 구배를 완화하는 온도 구배 완화 기구를 더 포함하는, 세포 배양 장치.
  11. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 기재된 세포 배양 장치를 이용하여 상기 세포를 배양하는 세포 배양 방법으로서,
    상기 제어부가, 상기 세포 공급부로부터 공급되는 상기 세포, 상기 첨가제 공급부로부터 공급되는 상기 첨가제 및 상기 배지 공급부로부터 공급되는 상기 배지를 포함하는 혼합물을, 상기 교반부 및 상기 분리부를 경유하여 상기 배양 용기에 이송하는 제어를 행하는, 세포 배양 방법.
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