JP2014509523A - 多機能バイオリアクターシステム並びに細胞を選別および培養する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、バイオリアクターに関し、さらに具体的には、細胞を成長させ、分離するためのバイオリアクターに関する。バイオリアクターは、少なくとも１つの反応チャンバーと、調節可能な磁場と、多機能細胞補助システムを備えており、さらに、任意要素の保護灌流システムと、任意要素のコンピューターによる制御システムとを備えていてもよい。

Description

本発明は、細胞培養および細胞選別のための多機能バイオリアクターに関する。

本出願は、一般的に、バイオリアクターに関し、さらに具体的には、細胞を成長させ、分離するバイオリアクターに関する。

多くの種類の細胞、特に、造血幹細胞および免疫細胞は、培地中で有効に増殖させ、直接的に分化させ得る前に、元のサンプルから単離することが必要である。この単離手順は、細胞選別または細胞分離とも呼ばれる。以前、細胞選別および細胞培養は、それぞれ別個のシステムで行われており、この場合、まず標的細胞を単離し、次いで、培養容器に移す。この従来法は、用いるのが困難であり、細胞選別から細胞培養までに細胞が混入し、細胞が失われる危険性が高くなり、２つの完全に異なるデバイスおよびシステムが関与していた。新しいデザインを有する本願発明者の今回の発明によって、これら２つの異なる手順を１個の容器（チャンバー）で完了させることができ、そのため、混入および標的細胞の損失の危険性が最小限となり、操作効率が顕著に高まる。

ある種の細胞は、培養物中の剪断応力に非常に弱い。例えば、剪断応力によって、非特異的な分化が起こり、幹細胞培養物中のアポトーシスが増加することがあり、幹細胞の増殖効率および直接的分化を顕著に低減させる。剪断応力が大きくなると、タンパク質発現中に非特的なタンパク質が多く放出され、目的のタンパク質の培養物中での比率が小さくなり、そのため、タンパク質の精製が増大する。静置培養には、最小限の剪断応力はあるが、静置培養中の細胞は、通常は、培養容器の底部に存在し、細胞が高密度状態のとき、栄養が十分に行き渡らない細胞もあり、そのため、大規模な細胞増殖には適していない。ある種のバイオリアクター（例えば、ＮＡＳＡの回転壁式容器（ＲＷＶ）バイオリアクター）は、剪断応力を減らすように設計された。しかし、これらのバイオリアクターは、細胞を連続的に移動させ、攪拌し、および／または機械攪拌することによって、細胞を懸濁状態に維持しなければならない。バイオリアクターの動きを止めると、細胞は底部のどこかに蓄積すると思われるが、均一には分布せず、ほとんどの細胞成長にとって有害である。したがって、これらのバイオリアクターでは剪断応力は小さいが、これらのバイオリアクターを動かしているとき、培養した細胞にこの小さな剪断応力が連続的にかかることになる。本願発明において、バイオリアクターが静置状態であるとき、培養チャンバーの底部または磁気ビーズの表面に細胞を均一に分布させることができる。したがって、本発明は、懸濁状態および静置状態の両方で細胞に最良の成長条件を与える。

ある種のバイオリアクターは、マグネットインペラーによって培地を機械攪拌し、細胞を懸濁状態に保持するように制御された磁気要素（特定的には、ブレードまたはバン）を使用する。この種のバイオリアクターは、特定の細胞の培養要求のために剪断応力をわざと高める。用途の違いに加え、本発明のバイオリアクターは、磁気要素であるブレードまたはケーンを使用せず、本発明のマグネットビーズは、マグネットビーズが磁場の中に存在しない場合には、実際には磁気を帯びておらず、磁場に置かれたときにのみ磁力を得ることができる。本発明のマグネットビーズは、インペラーによって制御されていないが、ビーズの移動に影響を及ぼす磁場強度の変化によって制御される。適切な微細環境（またはニッチと呼ばれる）は、ある種の細胞（例えば、幹細胞）の成長にとって非常に重要である。ある種のデバイスは、ニッチを作成するために固体材料を使用するか、またはニッチを作成するためにゲル状の物質を使用する。これらのデバイスを用い、細胞培養後に、特定の手順を用いて細胞をニッチから洗い出す必要があるか、または、ニッチを形成する材料を酵素で溶融または消化し、標的細胞を放出させなければならない。本願発明において、ビーズ間の空間は、通常は、細胞成長のためのニッチに由来し、磁場強度を変えることによってビーズが持ち上げられれば、細胞を簡単に放出させることができる。他の細胞培養システムは、ウェル状の培養プレート（例えば、一般的な９６ウェル状プレート）、微細チャンバー（Ｈｕｎｇ ２００５）または微細なふるい（Ｚｈａｎｇ ２００９）によってニッチを構築することを試みている。本発明のバイオリアクターは、ビーズの移動によって、成長させるのに培地の流れを増すことが必要な細胞にとって、動的な微細環境が作られるため、ウェル状プレートよりも優れている。さらに、製造するときの課題が減り、使用後に滅菌することが簡単であり、ビーズの大きさを調整することによって、ニッチの大きさを簡単に修正することができるため、微細チャンバーおよび微細なふるいよりも優れている。

多くの細胞培容器（チャンバー）は、例えば、一般的な細胞培養フラスコ、気体透過性の袋、回転壁式容器などのバイオリアクターで使用するために設計されてきた。これらの容器は、細胞を希釈することができ、培地を変えることができるような一般的な灌流システムとともに使用することができる。しかし、これらの容器を用いて培地を変えている間、サイトカイン、タンパク質および細胞成長のための他の高価な物質および細胞産物が培地から同時に除去される。また、一般的な透析プロセスの効率は、十分なほど高くない。本発明で設計された細胞培養チャンバーは、浸透チャンバーと培養チャンバーの両側とのコロイド浸透力の差を利用し、特定の大きさのサイトカイン、ペプチド、タンパク質および他の材料を失うことなく、透析膜を通して迅速に培地を交換することができる。この細胞培養チャンバーの設計によって、新しい灌流手法が与えられ、勾配浸透灌流システムと呼ばれるシステムが与えられる。

ほとんどのバイオリアクターは、接着性細胞または懸濁細胞のいずれかを培養するように設計された。部分的に接着性の細胞の成長を補助するようなバイオリアクターは、まだ報告されていない。本発明のバイオリアクターは、懸濁細胞、接着性細胞および部分的に接着性の細胞を含め、ほとんどのあらゆる細胞に使用することができる。

バイオリアクターの動きを制御するのにコンピューターを用いることが極めて一般的であり、多くのバイオリアクターは、プログラム処理可能である。本発明では、（１）磁場の強度および方向、（２）細胞培養チャンバーをひっくり返す周波数および速度、（３）上の（１）および（２）の結果としてのマグネットビーズの周波数および速度は、あらかじめ選択したプログラムおよび／または検出器から受け取ったデータに応答し、バイオリアクターにフィードバックを送り返すプログラムによって制御されることを強調しておく。

バイオリアクター制御におけるコンピューターの利用と同様に、ある特定の光源（例えば、レーザープロジェクター）を用いるいくつかの細胞密度検出器が、細胞培養中の細胞濃度を監視するために設計されてきた。検出器またはセンサーから得られたデータを用い、培地を変えることが必要な場合に細胞を希釈することが必要かどうかを決定する。本発明のバイオリアクターにおいて、細胞密度検出器は、一般的な光源を使用し、そのデータを特定的に使用して、磁場の強度、細胞培養チャンバーをひっくり返す速度および周波数を調整し、さらに、マグネットビーズの移動速度および周波数を間接的に調整する。

バイオリアクターは、典型的には、培養物内で細胞を成長させるために使用される。しかし、多くの種類の細胞は、培地中で有効に増殖させ、直接的に分化させ得る前に、元のサンプルから単離することが必要である。この単離手順は、細胞選別または細胞分離とも呼ばれる。典型的には、細胞選別および細胞培養は、別個のシステムで行われており、この場合、まず標的細胞を単離し、次いで、培養容器に移す。この従来法は、用いるのが困難であり、細胞選別から細胞培養までに細胞が混入し、細胞が失われる危険性が高くなり、２つの完全に異なるデバイスおよびシステムが関与している。

さらに、多くのバイオリアクターは、バイオリアクターの内容物を混合するために、回転するインペラーなどを使用する。残念なことに、これにより、細胞を破壊しかねない剪断応力が細胞に加わり、システムの効率を低下させ、廃棄産物（例えば、非特異的なタンパク質の発現など）の放出を生じる。さらに、ある種のバイオリアクターでは、細胞培養チャンバーの底部または細胞培養チャンバーの他の位置で細胞が凝集することがある。これらの細胞が培養チャンバー内で凝集することは、効果的な細胞成長の妨げとなる。したがって、細胞に与えられる剪断応力も最小限にしつつ、細胞を成長させ、分離することができる効率的なバイオリアクターの顕著な必要性が存在する。

一実施形態では、細胞を成長させ、分離するためのバイオリアクターシステムは、第１部分および第２部分を有する内側を含む細胞培養チャンバーと、培養チャンバーの内側に配置され、内側の第１部分と内側の第２部分の間を移動することが可能なアジテーターと、細胞培養チャンバーに連結し、内側の第１部分と内側の第２部分の間をアジテーターが移動するように操作可能な制御システムとを備える。

別の実施形態では、細胞を成長させ、分離する方法は、第１部分および第２部分を有する内側を含むチャンバーを与えることと、内側の第１部分と内側の第２部分の間を移動することが可能なアジテーターを内側に配置することと、細胞培地をチャンバーの内側に運ぶことと、標的細胞をチャンバーの内側に移すことと、細胞と培地が混合するように、第１部分と第２部分との間をアジテーターを移動させることと、チャンバーの内側にあるかなりの量の標的細胞を維持しつつ、チャンバーの内側から廃棄物を除去することとを含む。

さらに別の実施形態では、細胞培養チャンバーの内側は、細胞培地容器と流体が行き来できるように連結し、容器から細胞培地を受け取ることができるように作られた第１の区画と、アジテーターが内部に配置された第２の区画と、第１の区画と第２の区画との間に配置され、細胞培地が第１の区画から第２の区画へと選択的に流れることができるように作られた第１の膜と、バッファー容器と流体が行き来できるように連結し、バッファー容器からバッファーを受け取ることができるように作られ、さらに、廃棄物容器との流体が行き来できるように連結し、廃棄物が第３の容器から廃棄物容器に流れることができるように作られた第３の区画と、第２の区画と第３の区画との間に配置され、第２の区画から第３の区画へと培地および廃棄物が選択的に流れることができるように作られた第２の膜とを備える。

以下の記載と合わせて考えた場合に、図面は、保護されることを望む発明の主題の理解を助ける目的で提示されている。

図１は、実例となるバイオリアクターを示す模式図である。 図２ａ〜２ｆは、一連のチャンバー内でのアジテーターの移動を示すバイオリアクターの一連の模式図を示す。 図３は、チャンバーの模式的な等軸測視図である。 図４は、チャンバーの模式的な側面図である。 図は、アジテーターの模式図である。

図１を参照すると、細胞を成長させ、分離するためのバイオリアクターシステム１０が示されている。システム１０は、細胞培養チャンバー１５と、アジテーター２０と、制御システム３０とを備える。

細胞培養チャンバー１５は、細胞培養チャンバー内に配置された細胞培地内で標的細胞を受け入れ、成長させるための内側３５と、第１末端４０と、第２末端４５とを備える。本明細書で使用する場合、「標的細胞」は、チャンバー１５内に配置され、チャンバー１５内で成長する細胞を指す。本開示には、標的細胞を成長させるという内容が与えられているが、このシステムを、化学物質または任意の他の適切な溶液または材料を混合するために使用してもよいことは理解されるだろう。さらに、第１末端４０および第２末端４５は、それぞれチャンバー１５の上部および底部にあるものとして示されているが、末端４０、４５は、互いに任意の適切な配置に（例えば、水平な面に）あってもよく、それも本開示の範囲内にあることが理解されるだろう。以下に記載するように、チャンバー１５は、１つ以上の内側区画を備えていてもよい。それに加え、当業者には明らかであろうが、チャンバー１５は、剛性材料、可撓性材料、剛性材料と可撓性材料の組み合わせ、気体透過性材料または任意の他の適切な材料を含め、任意の適切な材料から作られていてもよい。チャンバー１５は、さらに、チャンバーの内側３５と１つ以上の容器との間を流体が行き来できるための１つ以上の出入口を備えていてもよい。実例となる容器としては、限定されないが、細胞培地容器、廃棄物容器、バッファー容器、ＣＯ_２容器、または任意の他の適切な容器が挙げられる。

ここで図３を参照すると、実例となる代替的なチャンバー１５が示されている。この実施形態では、チャンバー１５は、第１の区画７５と、第２の区画８０と、第３の区画８５とを備えている。第１の区画７５は、培地を第１の区画に加え、および／または第１の区画から取り出すことができるように、第１の区画と１つ以上の容器（例えば、細胞培地容器）との間を流体が行き来できるような連結を与えるための１つ以上の出入口１８ａ、バッファーを第１の区画に加え、および／または第１の区画から取り出すことができるようなバッファー容器、廃棄物を第１の区画７５から取り出し得るような廃棄物容器、ＣＯ_２を第１の区画に加え、および／または第１の区画から取り出すことができるようなＣＯ_２容器、または任意の他の適切な容器を備えていてもよい。第１の区画７５と第２の区画８０は、第１の膜９０によって隔離されている。第１の膜９０は、第１の区画７５から第２の区画８０へと培地を選択的に流すことができるように作られている。膜９０は、貫通部、開口部または任意の他の適切な構造を含んでいてもよく、および／または第１の区画７５から第２の区画８０へと培地を流すことができるように他の様式で半透過性である。一実施形態では、膜９０は、透析膜である。膜９０は、限定されないが、セルロースおよびセロファンを含む任意の適切な材料から作られてもよい。

第２の区画８０は、アジテーターを内部に保持し、アジテーターが、図１に関連してすでに記載したように区画内を移動し得るような構成である。標的細胞は、典型的には、第２の区画８０でも同様に成長し、保持される。第２の区画８０は、１つ以上の容器（例えば、第１の区画７５に関して記載した種類の容器）の間を流体が行き来できるような連結を与えるための１つ以上の出入口１８ｂを備えていてもよい。第２の区画８０と第３の区画８５は、第２の膜９５によって隔離されていてもよい。第２の膜９５は、第２の区画７５から第３の区画８５へと培地および／または廃棄物を選択的に流すことができるように作られている。膜９５は、貫通部、開口部または任意の他の適切な構造を含んでいてもよく、および／または第２の区画８０から第３の区画８５へと培地および／または廃棄物を流すことができるように他の様式で半透過性である。一実施形態では、膜９５は、透析膜である。膜９５は、限定されないが、セルロースおよびセロファンを含む任意の適切な材料から作られてもよい。第３の区画８５は、第３の区画８５と、１つ以上の容器（例えば、第１の区画７５に関して記載した種類の容器）との間を流体が行き来できるような連結を与えるための１つ以上の出入口１８ｃを備えていてもよい。さらに、少なくとも１つの実施形態において、チャンバーの外側の少なくとも一部が、気体透過性材料から作られていてもよい。チャンバーの外側の少なくとも一部が気体透過性材料から作られている場合、システムは、ある場合、ただしすべてが必須ではないが、チャンバーへの直接的な気体注入と、培地のｐＨを維持する構成要素を含まない。第１の区画７５および第３の区画８５は、第２の区画８０に対して任意の適切な位置に配置されていてもよく、本開示は、いかなる様式でも、第１の区画７５と第３の区画８０との間に配置された第２の区画８０に限定されない。さらに、任意の適切な数の区画を使用してもよく、本開示は、３つの区画のみに限定されないことが理解されるだろう。

一実施形態では、比較的少量の大きな分子および／または大きな極性の分子を含む適切な溶液を含む培地が第１の区画７５に与えられ、細胞成長のための適切なコロイド浸透性を有する同じ培地または同様の培地が第２の区画８０に与えられる。適切な培地は、標的細胞を成長させ、または維持するために用いられる任意の培地であってもよい。第１の区画７５および／または第２の区画８０の培地と比較して、もっと大きなコロイド浸透力を作り出し、維持するために、もっと濃度が高い大きな分子および／または大きな極性の分子を含むバッファーが第３の区画８５に与えられる。第３の区画８５のためにもっと大きなコロイド浸透力を作り出し、維持するために用いられる材料としては、限定されないが、ＰＥＧ ８００００、アルブミン、他のタンパク質または任意の他の適切な材料または溶液が挙げられる。膜９０、９５は、同じ透過性を有していてもよく、または異なる透過性を有していてもよく、培地および／または新しい細胞の成長から出た廃棄物が、第１のチャンバー７５および／または第２のチャンバー８０から浸透によって第３のチャンバー８５へと流れてもよい構成になっている。制御システムは、それぞれの区画７５、８０、８５内に一定容積が維持され、一定の浸透力が維持され、第２の区画８０への新しい培地の供給が維持されるように、１つ以上の区画７５、８０、８５からの培地、バッファーおよび／または廃棄物の潅流および排出を制御してもよい。それに加え、任意の適切な検出デバイス、機構または方法による制御システムは、標的細胞の成長に関与する任意の適切なパラメーター、例えば、限定されないが、標的細胞の数の変化、ｐＨ、ＣＯ_２、グルコース、カルシウム、カリウム、ナトリウム、温度、湿度または任意の他の適切な力を監視し、第２のチャンバー内のアジテーターの移動間隔、周波数および／または速度を調節し、および／または培地の量、培地の種類、バッファーの量、バッファーの種類、ＣＯ_２の量を調節し、または、チャンバー内の標的細胞の成長を向上させるか、または促進するように、制御システムの測定に基づく任意の適切な調節を行ってもよい。

ここで図４を参照すると、別の実例となるチャンバー１５が示されている。この実施形態では、チャンバーは、チャンバーの内側３５と廃棄物容器との間を流体が行き来できるような連結を与えるための１つ以上の出入口１００を備えていてもよい。チャンバー１５は、さらに、チャンバーの内側３５と細胞培地容器との間を流体が行き来できるような連結を与えるための１つ以上の出入口１１０を備えていてもよい。さらに、チャンバー１５は、チャンバー内側３５とバッファー容器との間を流体が行き来できるような連結を与えるための１つ以上の出入口１１０を備えていてもよい。さらに、チャンバーは、アジテーターをチャンバー内側３５に受け入れるための１つ以上の出入口１１５をさらに備えていてもよい。一実施形態では、チャンバー１５は、テフロン（登録商標）ＦＥＰから作られている。この具体的な実施形態は、標的細胞がアジテーターに接着するか、または他の様式で接続し、廃棄物がチャンバー内側３５から流され、標的細胞がチャンバー内側３５にとどまる場合に有用であろう。しかし、チャンバー１５は、任意の適切な材料から作られていてもよく、それも本開示の範囲内にあることが理解されるだろう。

アジテーター２０は、チャンバー内側３５の中に配置され、チャンバーの第１末端４０とチャンバーの第２末端４５との間を移動することができる。または、アジテーター２０は、チャンバー内側３５の中で、任意の２つ以上の点の間、または２つ以上の部分の間を移動するような構成であってもよい。実例となる実施形態では、アジテーターは、複数のビーズ２１を含む。ビーズ２１を示す任意の実例となる実施形態が、任意の代替的なアジテーター構造を使用してもよく、それもまた本開示の範囲にあり、任意の具体的な実例となる実施形態が、アジテーターとしてビーズを排他的に使用することに限定されないことが理解されるだろう。一実施形態では、ビーズ２１は、磁着性材料、例えば、シリコーンスチール、Ｆｅ_３Ｏ_４、または任意の他の適切な磁着性材料から作られる。本明細書で使用する場合、磁着性は、アジテーター（例えば、ビーズ）が、磁場にさらされると磁荷を保持するが、磁場からはずれると、または磁場がアジテーター近傍からはずれると、例えば、磁場発生器の電源を切ると、他の方法で磁荷を保持することはないことを意味する。磁着性材料は、典型的には、それぞれのビーズ２１のコアを含む。次いで、磁着性コアを任意の適切な材料でコーティングしてもよい。一実施形態では、磁着性コアをポリスチレンでコーティングするが、磁着性コアを任意の適切な材料でコーティングしてもよく、それも本開示の範囲内にあることが理解されるだろう。例えば、限定されないが、磁着性コアを任意の適切な熱可塑性ポリマーまたは熱硬化性ポリマーでコーティングしてもよい。ビーズ２１は、磁着性材料から作られるものとして示されているが、ビーズが、磁着性または非磁着性の任意の適切な材料から作られてもよく、それも本開示の範囲内にあることが理解されるだろう。さらに、ビーズ２１が、それぞれ、チャンバー１５内で細胞が成長するにつれて、標的細胞がビーズに接着するように任意の適切な材料でコーティングされてもよいことが理解されるだろう。さらに、標的細胞が接着するであろう特定の材料でコーティングされていないビーズも本開示の範囲に入ることが理解されるだろう。ある実施形態では、細胞培地内で浮遊するビーズ２１を含むことが望ましいだろう。したがって、ビーズのコアは、空気だまりまたは気泡、軽い泡またはプラスチックまたはビーズ２１が培地内で浮遊できるような任意の他の適切な材料を含んでいてもよい。

ビーズ２１は、ビーズが積み重なったとき、１つ以上のニッチまたは微細環境がビーズ２１の間にある空隙に形成されるか、または作られてもよいように作成されてもよい。ある実施形態では、これらのニッチは、ニッチ内でのさらなる標的細胞の成長を促進してもよい。一実施形態では、ビーズが実質的に球形の場合、それぞれのビーズ２１の直径は、適切なニッチを作成するために１ｍｍ〜１０ｍｍであってもよい。しかし、ビーズ２１は、ビーズ２１が積み重ねられるとき、１つ以上の適切なニッチが作られてもよいように、任意の適切な大きさおよび／または形状を有していてもよいことが理解されるだろう。さらに、少なくともいくつかのニッチが、チャンバー内側のいくつかのビーズと１つ以上の壁との間に作られてもよいことが理解されるだろう。

代わりとなる実施形態では、図５に示されるように、アジテーター２０ａは、内部に複数の開口部２２を有する平面部材２１ａであってもよい。平面部材２１ａの断面は、アジテーター２０ａがチャンバー内側３５を移動し得るように、チャンバー１５の断面形状と相補的であってもよい。開口部２２は、アジテーター２０ａがチャンバー内側３５の中を動くにつれて、アジテーター２０ａを通って培地が流れることができるものであってもよい。アジテーター２０ａは、磁着性材料または非磁着性材料から作られてもよく、浮遊性または非浮遊性であるように作られてもよく、および／またはビーズ２０に関してすでに記載したようにコーティングされていてもよい。

再び図１を参照すると、制御システム３０は、システム１０の操作を制御するためにコントローラー５５およびコンピューター６０のいずれかまたは両方を備えていてもよい。または、システム１０を手動で動かしてもよい。制御システム３０は、チャンバー１５に脱着可能に接続するような構成である。制御システム３０は、チャンバー１５を受け入れるカセット５０を備えていてもよいが、チャンバー１５は、任意の適切な手段または構造（例えば、クリップ、フック、マグネット、フック−ループアセンブリ、フリクションフィットなど）によって制御システム５０に接続していてもよく、それも本開示の範囲内にあることが理解されるだろう。

制御システム３０は、さらに、光源２と、チャンバー１５の中で細胞の数を検出し、チャンバー１５の中の細胞数の変化などを検出し、その結果を制御システム３０に報告するための細胞検出器９とを備えていてもよい。しかし、細胞の数または細胞の数の変化を監視する当該技術分野で既知の任意の検出器、機構または技術を使用してもよく、それも本開示の範囲内にあることが理解されるだろう。さらに、任意の適切な検出器、機構または方法による制御システム３０は、標的細胞の成長に関与する任意の適切なパラメーター、例えば、限定されないが、標的細胞の数の変化、ｐＨ、ＣＯ_２、グルコース、カルシウム、カリウム、ナトリウム、温度、湿度または任意の他の適切な因子を監視し、チャンバー内のアジテーターの移動周波数および／または速度を調節し、および／または培地の量、培地の種類、バッファーの量、バッファーの種類、ＣＯ_２の量を調節し、または、チャンバー１５内の標的細胞の成長を向上させるか、または促進するような任意の制御システムの測定に基づく任意の適切な調節を行ってもよい。

制御システム３０は、アジテーターがチャンバー１５の内側３５の中を移動するように操作可能である。このことは、さまざまな様式で達成されてもよい。実例となる実施形態では、制御システムは、第１の位置と第２の位置との間をチャンバー１５が回転するように操作可能なモーター６５を備えている。以下に記載するように、第１の位置と第２の位置は、ほぼ１８０°離れているが、第１のおよび第２の位置が、互いに任意の適切な角度関係を有していてもよく、それも本開示の範囲内にあることが理解されるだろう。チャンバー１５は、水平面で回転してもよく、垂直面で回転してもよく、または任意の適切な様式で回転し、ずれるか、すべるか、または他の様式で動き、チャンバー１５の中をアジテーター２０が移動してもよい。

それに加え、制御システム３０は、チャンバー１５内のビーズ２１が動き、標的細胞および培養培地を混合するようにビーズ２１または他のアジテーター２０を励起させるために第１の磁場発生器７０および第２の磁場発生器７２を備えていてもよい。実例となる実施形態では、それぞれの磁場発生器は、電源を入れると磁場が発生し、電源を切ると磁場の発生が止む電磁石である。電源を入れると、それぞれの磁場発生器は、アジテーター２０（例えば、ビーズ２１）を電源が入った磁場発生器の方に引き寄せる。代わりとなる実施形態では、永久磁石を使用してもよく、この場合、制御システム３０は、チャンバー１５の近傍からマグネットをはずすか、または他の方法で、チャンバー１５に入り込んだマグネットからの磁場を遮断するように操作することができる。実例となる実施形態が、チャンバー内でアジテーターを動かすためにチャンバーの回転および電磁石を使用する場合、チャンバーの回転を単独で使用してもよく、または電磁石を単独で使用してもよいことが理解されるだろう。さらに、チャンバー内でアジテーターを動かすための任意の技術を使用してもよく、それも本開示の範囲内にあることが理解されるだろう。

ここで図２ａ〜２ｆを参照すると、システム１０の操作が非限定的な例によって示されている。標的細胞および細胞培地がチャンバー１５の内側３５に運ばれる。この実施形態では、ビーズ２１は、浮遊性であり、チャンバー１５内の細胞培地の上部付近に浮いている。図２ａにおいて、第１の磁場発生器７０の電源が入っており、ビーズ２１は、チャンバー１５の第１末端４０付近に保持されている。次いで、チャンバー１５を図２ｂに示すような位置まで約１８０°回転し、第１の磁場発生器７０は、チャンバーの第１末端４０付近にビーズ２１を維持する。次いで、第１の磁場発生器７０の電源を切ることによって、図２ｃに示すように、ビーズ２１がチャンバー１５の第２末端４５に向かって浮き始める。ビーズ２１が、標的細胞が接着するコーティングを含む実施形態では、片方の末端から他の末端へのビーズ２１の移動によって、新しく成長した標的細胞が集まるだろう。廃棄物をチャンバー１５から流しつつ、および／または新しい培地をチャンバー１５に導入するとき、かなりの量の元々の標的細胞および新しく成長した標的細胞がチャンバー内にとどまるように、標的細胞をビーズ２１に接着させてもよい。または、標的細胞に特異的な磁着性抗体をチャンバー１５の内側に加えることによって、抗体が標的細胞に結合し、磁場がチャンバーに導入されるとき、抗体が結合した標的細胞は、磁着性ビーズ２１および／または磁場発生器に隣接するチャンバー壁に脱着可能に接続するだろう。この実施形態では、結合していない細胞および／または廃棄物がチャンバーから流されつつ、および／またはかなりの量の元々の標的細胞および新しく成長した標的細胞がチャンバー１５内にとどまるように、新しい培地をチャンバーに導入している間、磁場発生器７０、７２のいずれかまたは両方の電源を入れたままでもよい。または、磁気試薬（例えば、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖまたは他の適切な試薬）を使用し、ビーズに、システム１０から流された損傷した細胞または死んだ細胞、健康な標的細胞に接続させてもよい。さらに、アジテーターを使用することなく、磁着性抗体および／または試薬をチャンバー１５中で使用してもよく、それによって、チャンバーが流されるとき、標的細胞または損傷を受けた／死んだ細胞がチャンバーに保持されていてもよいことが理解されるだろう。

再び図を参照すると、ビーズ２１がチャンバーの第２末端４５付近にある場合、第２の磁場発生器７２の電源を入れることによって、ビーズ２１は、チャンバーの第２末端４５付近に保持され（図２ｄ）、チャンバーは、図２ｅに示す位置まで回転する。次いで、第２の磁場発生器７２の電源を切ることによって、図２ｆに示すように、ビーズ２１がチャンバーの第１末端４０に向かって浮くだろう。当業者によって理解されるように、このプロセス中に種々の添加剤、培地、バッファー、ＣＯ_２などをチャンバーに任意の所与の点で選択的に加えてもよく、および／またはすでに記載したような制御システムによって行われる測定に基づいて、新しい細胞成長を促進または向上させるために、廃棄物を選択的に除去してもよい。

代わりとなる実施形態では、チャンバーが回転することによってビーズがチャンバー内を移動するように、さらに磁場をかけることなく、非浮遊性ビーズを使用してもよい。ここで、チャンバーが回転することによる重力および遠心力を使用し、チャンバー１５内の２つ以上の点の間をビーズが動く。さらに別の代替例では、ビーズがチャンバー内の２つ以上の点の間を移動するように、チャンバー１５を回転させることなく、第１の磁場発生器７０および第２の磁場発生器７２の電源を交互に入れてもよい。上の例はビーズ２１をアジテーターとして使用するが、限定されないが、図５のものを含め、適切なデバイスをアジテーターとして使用してもよく、それも本開示の範囲内にあることが理解されるだろう。さらに、チャンバー内でアジテーターを移動させる任意の手段または技術を使用してもよく、それも本開示の範囲内にあることが理解されるだろう。

さらに、チャンバー１５が気体透過性材料から作られるか、またはそれ以外の様式で気体透過性部分を含む場合、システムが、ＣＯ_２インキュベーターまたはＣＯ_２室の中に配置されていてもよいことが理解されるだろう。ＣＯ_２インキュベーターまたはＣＯ_２室がなく、またはチャンバーになんら気体透過性部分がない場合、試薬（例えば、ＨＥＰＥＳ）を使用してもよく、または、ＣＯ_２をＣＯ_２容器からチャンバーに直接注入してもよい。

本発明およびその利点が特定の実例、非限定的な実施形態の観点で開示されてきたが、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更、置き換え、入れ替え、改変を行うことができることを理解すべきである。任意の一実施形態と合わせて記載された任意の特徴を他の実施形態にも適用することができることが理解されるだろう。

Claims (33)

1. 細胞マーカーに基づいて細胞を分離し、細胞および人工組織を成長させるためのバイオリアクターシステムであって、
   第１部分および第２部分を有する内側を含み、細胞マーカーによる細胞分離、細胞成長および人工組織の成長の反応のための空間を与える１つの反応チャンバーと、
   前記チャンバーの内側に配置され、内側の第１部分と内側の第２部分の間を移動することができる、磁着性アジテーターと、
   細胞マーカーによる細胞分離を補助し、チャンバーの特定の内側位置にアジテーターをとどまらせ、または反応チャンバーの反転にともなって内側の第１部分と内側の第２部分の間を移動させるように操作可能な、調節可能な磁場とを少なくとも備える、バイオリアクターシステム。
2. 前記反応チャンバーの内側が、
   細胞培地容器と流体が行き来できるように連結し、この容器から細胞培地を受け入れ、消し去ることができ、低コロイド浸透性溶液を含む、第１の区画（低浸透区域）と、
   第１の区画に隣接し、さらに、細胞、アジテーター、試薬、バッファーおよび培地を受け入れ、消し去るための出入口になるように作られ、その内部にアジテーターが配置されている第２の区画（反応区画）と、
   第１の区画と第２の区画の間に配置され、第１の区画から第２の区画へと細胞培地を選択的に流すことができるように作られた、第１の膜と、
   第２の区画に隣接し、第３の区画が、バッファー容器からバッファーを受け入れることができるようにバッファー容器と流体が行き来できるように連結し、さらに、廃棄物が第３の容器から廃棄物容器へと流れることができるように廃棄物容器と流体が行き来できるように連結するように作られた、第３の区画（高浸透区画）と、
   第２の区画と第３の区画との間に配置され、培地および廃棄物を第２の区画から第３の区画まで選択的に流すことができるように作られた、第２の膜と、
   気体透過性材料で作られた反応チャンバーの側壁の少なくとも一部、ｐＨを維持するための試薬を含む培地の１構成要素（例えば、ＨＥＰＥＳ）、またはチャンバーと接続した気体透過性システム、またはこれら３つの任意の組み合わせと、
   バイオリアクターのカセットおよび任意のホルダーに配置された反応チャンバーの少なくとも一部とを備える、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。
3. 複数のビーズ、または複数の開口部を有する平面部材を備える磁着性アジテーターが、
   （１）全体的に剛性磁着性材料で作られ、裸である（コーティングされていない）か、または細胞の接続および細胞損傷の低減を含む任意の目的のために、不活性で剛性または硬質の材料でコーティングされるか、または
   （２）少なくとも部分的に、磁場の中に置かれると磁性を帯びるが、磁場が消えるか、または反応領域からはずされると、磁性ではなくなるか、または磁性が非常に弱くなるような磁着性材料で作られ、
   （３）ビーズについて、直径が１ミリメートルより大きく、請求項１および２の反応チャンバーの体積より小さい、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。
4. 前記磁着性アジテーターは、接着性の細胞培養物中で細胞を接着させ、成長させるため、また、細胞マーカーによる細胞分離中、磁着性材料で標識された抗体または他の生体分子と結合した細胞を接続するために細胞補助材として機能し、生体分子の反応および結合ならびに磁場によって制御された細胞の捕捉および放出を含む、請求項３に記載のバイオリアクターシステム。
5. 前記磁着性アジテーターを用い、反応チャンバー内の任意の２つの部分の間を移動することによって培地をゆっくりと機械撹拌し、（１）周囲にある磁場の引力、（２）アジテーターが反応チャンバー中の培地よりも密度が小さい場合には浮遊性、または（３）ビーズが反応チャンバー中の培地よりも密度が大きい場合には重力といった機構によって液体成長培地中に細胞を懸濁させたままにする、請求項３に記載のバイオリアクターシステム。
6. 前記磁着性アジテーターを使用し、細胞成長のための「ニッチ」または微細環境を作り出し、ここで、ニッチは、請求項５に述べた機構によってそれぞれを動かした後に磁着性アジテーターが沈殿するにつれて、アジテーターの間に空間を含み、細胞成長を妨害し、幹細胞の非特異的な分化を減らし得る任意の過剰な混み合いまたは集塊を防ぐことができる、請求項１に記載のバイオリアクター。
7. （削除）
8. 前記調節可能な磁場を、
   （１）電流および／または電圧を変えることによって、または電磁石の位置および向き（配向）を変えることによって、磁場を調節する電磁石によって作ることができるか、
   （２）永久磁石の位置および向きを変えることによって磁場を変えるような永久磁石によって作ることができるか、または
   （３）上の（１）および（２）の組み合わせによって作ることができる、請求項１に記載のバイオリアクター。
9. 細胞を分離し、細胞および人口組織を成長させるためのバイオリアクターシステムであって、保護潅流システムを含み、保護潅流システムは、さらに、１つ以上の反応チャンバーと、区画の間に１つ以上の透析膜の壁と、浸透バッファーと、勾配のある浸透性バッファー容器と、浸透によってバッファーを循環させ、廃棄物を集める容器のための関連する動的デバイスとを備え、低浸透性区画から、透析膜を介して反応区画（または請求項２に記載されるような第２の区画）へと新しい培地を流すことができ、一方、廃棄物容器に捨てられる前に、反応区画からの古い培地が、透析膜を通って高浸透区画へと流れる、バイオリアクターシステム。
10. 前記勾配のある浸透性バッファーは、高濃度の大きな分子、例えば、高コロイド浸透力を作り出すために、タンパク質およびＰＥＧ ８０００を含む高コロイド浸透性バッファーを含み、また、大きな分子を少量しか含まないか、まったく含まない低コロイド浸透性バッファーを含む、請求項９に記載のバイオリアクター。
11. あらかじめ選択したプログラムを用い、または反応環境からの検出器およびセンサーによって得られるシグナルまたは情報に基づいて、バイオリアクターの磁場、潅流、反応チャンバーの反転およびアジテーターの移動を自動的に調節することができる、コンピューターによるプログラムおよびフィードバックシステムを含む制御システムをさらに含む、請求項１および９に記載のバイオリアクターシステム。
12. 細胞マーカーによる細胞分離のための細胞を調製することと、バイオリアクター中で標的細胞を単離することと、選択していない細胞および古い培地を廃棄することと、細胞密度および細胞成長条件をリアルタイムで監視することと、細胞成長および直接的分化のための細胞培養条件をリアルタイムで調節し、最適化することと、細胞培養条件を調節して最適化するためのコンピューターによるシステムをプログラムし、適用することと、ニッチを用いるか、または用いずに、培養チャンバー内で細胞を培養することと、バイオリアクター中の細胞を集めることと、を含む、細胞マーカーに基づいて細胞を分離し、細胞および人口組織を成長させる方法。
13. 前記細胞マーカーに基づいて細胞を分離し、細胞を成長させることが、同じ反応チャンバー内で行われ、細胞マーカーによる細胞分離を、細胞培養の前、後および細胞培養中に行うことができる、請求項１２に記載の方法。
14. （削除）
15. （削除）
16. 細胞密度をリアルタイムで監視することは、光学および／または生化学の原理を用いて行うことができる、請求項１２に記載の方法。
17. 細胞を成長させることは、バイオリアクターが細胞を懸濁状態または静置状態で保持するか、または、懸濁状態と静置状態が交互に起きるプログラムで保持する場合、制御システムによって、また、反応チャンバー容器と細胞培養物のアジテーターによる機械撹拌を組み合わせることによって制御され、行われる、請求項１２に記載の方法。
18. 前記細胞が、磁着性アジテーターの移動によって懸濁状態に保たれ、この移動が、重力および／または浮遊性によって補助されつつ、または補助されることなく、調節可能な磁場によって制御される、請求項１７に記載の方法。
19. 調節可能な磁場によって制御された前記磁着性アジテーターを、反応チャンバー内側の任意の２つの部分の間を任意の方向に移動させることができ、この移動が、重力および／または浮遊性によって補助されつつ、または補助されることなく、調節可能な磁場によって制御されるが、垂直軸に沿った移動が好ましい、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ニッチが、磁着性アジテーターが物理的に静止しているとき、磁着性アジテーターの中に形成され、磁着性アジテーターを動かすことによってニッチを調整することができる、請求項１２に記載の方法。
21. 前記制御システムは、プログラム可能であり、バイオリアクターの機能のすべてまたは一部についてプログラムされた、請求項１２に記載の方法。
22. 細胞成長および直接的分化のために細胞培養条件をリアルタイムで調節し、最適化することは、細胞培養条件の検出器、コンピューターまたは同様のデバイスおよび対応するプログラム、フィードバックオペレーション制御システムを含むコンピューターによって制御された複合システムによって行われる、請求項１２に記載の方法。
23. 直接的分化のための細胞培養条件は、限定されないが、あらゆる種類の幹細胞を含め、分化能力を有するすべての細胞のためであり、前記直接的分化は、例えば、肝細胞およびその血管を同時に誘導するなど、２つ以上の誘導方向について、生化学的方法および物理的方法によって同時に誘導することができる、請求項１２に記載の方法。
24. 電流が反転したバイオリアクターが、限定されないが、造血幹細胞、間葉幹細胞、線維芽細胞、ハイブリドーマ細胞、リンパ球、樹状細胞、昆虫細胞、胚幹細胞、種々の組織細胞、癌細胞および細胞株、形質変換された細胞および細胞株を含むすべての細胞について理想的な細胞成長条件を与えることができる、請求項１に記載のバイオリアクター。
25. 個々に使用することができ、または細胞培養、細胞分離およびこれらの技術から利益を受ける任意の分野における他の技術とともに使用することができる、請求項９の保護灌流システムおよび請求項２５のチャンバーの反転および溶液の機械攪拌を組み合わせたバイオリアクターシステムおよびこれらの関連する方法。
26. 細胞を分離し、細胞および人工組織を成長させるためのバイオリアクターシステムであって、請求項７および８において調節可能な磁場によって制御されるか、または請求項１１において制御システムによって制御される、反応チャンバーの反転およびアジテーターの機械攪拌を組み合わせることによって、細胞およびアジテーターを懸濁状態で保持することができる反応チャンバーおよびアジテーターを備える、バイオリアクターシステム。
27. 細胞懸濁のために反応チャンバーの反転と細胞の機械攪拌の組み合わせを適用すると、細胞が、静置培養および動的培養両方について最良の成長条件にあるように、静置培養から始めた後、動的に培養し、反応区画内で細胞を均一に分布させることができる、請求項１および２５に記載のバイオリアクターシステム。
28. 細胞および人工組織を成長させることは、低分子を含む灌流溶液が、低浸透区画から反応区画へ、さらに高浸透区画へと単一方向に膜を介して通り抜けるような保護灌流チャンバー中で行われ、この通り抜けが、コロイドの浸透勾配に対して起こるが、一般的な透析で起こるような異なる区画中の低分子の濃度勾配に沿っている必要はない、請求項９に記載のバイオリアクターシステム。
29. 保護灌流システムを、培地の枯渇および培地の添加のような迅速な培地交換、および細胞、ペプチドおよびタンパク質を失わない細胞の懸濁に使用することができる、請求項９に記載のバイオリアクターシステム。
30. 細胞マーカーに基づいて細胞を分離し、細胞および人工組織を成長させるための請求項９におけるような保護灌流システムおよび請求項１１におけるような制御システムをさらに備える、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。
31. 調節可能な磁場を、細胞マーカーによる細胞分離、細胞成長および人工組織の成長の間に、制御システムによって磁場の強度、方向または位置を変えることによって調節することができる、請求項１に記載のバイオリアクター。
32. 細胞マーカーによる細胞分離が、
    特異的な磁着性抗体または他の生体分子を標的細胞に結合させることと、
    磁着性アジテーターまたはチャンバー壁のいずれかによって、または磁着性アジテーターおよびチャンバー壁の両方によって磁気的に標識された細胞を捕捉し、チャンバー壁が、請求項８の発生器（マグネットまたは電磁石）によって磁場が調節されるように作られていることと、
    非標識細胞を捨てるか、または洗浄することと、
    標的細胞を放出させることと、を含む、請求項１３に記載の方法。
33. 細胞による細胞分離を、チャンバーの反応区画（請求項２に記載するような第２の区画）で行い、細胞の生物学的マーカーに特異的に結合する生体分子を用いた生物学的反応が、懸濁細胞を洗浄することを含む手順によって行われる、請求項３２に記載の方法。

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