CN103642682B - 一种高效生物反应器及薯蓣皂苷高效生物水解方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物反应器技术领域，具体公开了一种高效生物反应器及薯蓣皂苷高效生物水解方法。本发明的高效生物反应器的发酵罐内填充或悬浮有磁珠，在进气管道上设置有负离子发生器，负离子发生器、氧电极和pH计与一个总控制器相连，由该总控制器根据氧电极和pH计输出的数据来调节负离子发生器的通气工作，在循环管道上包裹有磁化器。本发明将生物反应器的固定化培养和磁场技术科学结合起来，可以显著地提高细胞的反应活力，并应用在薯蓣皂苷生物水解反应中，与传统的酸水解反应相比，本发明的水解方法无污染、低成本、低能耗。

Description

一种高效生物反应器及薯蓣皂苷高效生物水解方法

技术领域

本发明涉及生物反应器技术领域，具体涉及一种高效生物反应器及薯蓣皂苷高效生物水解方法或其他生物医药如青霉菌发酵生产青霉素、青蒿细胞发酵生产青蒿素等等。 

背景技术

生物反应器是在一个可以控制培养条件的容器中培养生活细胞或组织或生命体生产人类需要的生物活性物质或组织或个体的培养设备的总称。在酒类、生物医药、食品生产、环境治理等方面有着广泛的应用。目前人类所应用的生物反应器的控制条件有：培养基配方、溶氧率、酸碱度、渗透势、温度、光照等。近些年研究发现磁场对生物细胞的生长代谢有显著的促进作用，磁场被认为对细胞生长和次生代谢具有显著的调节作用，但是在生物技术上如何科学地利用磁场来促进培养细胞的生长代谢仍然是个未解的技术难题，尤其是在大型生物反应器中，使用简单的外加磁场必然导致反应器内的培养细胞受磁不均匀；尽管可以通过搅拌来实现培养细胞接受外加磁场作用，但是，对于固定化培养的生物反应器则无法实现这一要求，如何将磁场和固定化培养科学结合起来，也是生物技术中的一个难题；同时在生物反应器中，固定化细胞培养并最大限度地增加反应面积可以提高反应效率，如何增加反应面积也是一个技术难题，本发明提供了该项技术。负离子气体一方面可以提高细胞活力，另一方面可以提高溶液的pH值。目前还没有将这些新发现科学地用于生物反应器的设备和技术。本发明将固定化材料与永磁体结合在一起，解决了固定化生物反应器中磁场利用的问题，大大提高了固定化生物反应器的工作效率，也为相关科学研究提供了新的研究工具。 

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于提供了一种高效生物反应器。 

本发明的第二个目的在于提供了一种利用上述生物反应器对薯蓣皂苷进行高效生物水解的方法。 

为了实现第一个目的，本发明采取了如下技术方案： 

一种高效生物反应器，包括发酵罐、进气系统、发酵罐外的循环管道、发酵罐顶部的出气管道、发酵罐底部的出入口管道、发酵罐顶部的出气口和底部的出入口，所述出气口在出气管道的上端，所述出入口在出入口管道的下端，所述进气系统包括进气管道、高压气泵、进气口无菌过滤器和进气口阀门，进气管道、出入口管道、循环管道三者相连通，所述循环管道上开设有取样口，取样口上设有取样口阀门，底部的出入口上设有出入口阀门； 

所述循环管道中设置有氧电极和pH计，用以监测循环管道中发酵液或培养液的溶氧率和pH值； 

其特征在于：所述循环管道的两端分别与发酵罐顶部的出气管道和底部的出入口管道连通，发酵罐内的发酵液通过循环管道循环； 

所述发酵罐内设置有磁珠，所述发酵罐的底部或/和顶部为可以分离的漏斗形结构，便于填充和取出磁珠。 

在所述进气管道上设置有负离子发生器，高压气泵、进气口无菌过滤器、负离子发生器、进气口阀门沿着进气管道的进气方向依次设置，进气系统通入的气体可以是自然空气，也可以是人工高纯度氧气，也可以是人工氮气，具体使用什么气体根据不同的培养要求而定。 

所述负离子发生器可通过向循环管道中循环的发酵液中通入负离子氧气以促进好氧细胞的生长代谢和调节发酵液酸碱度，防止发酵液酸化，或通入其他组分的负离子气体来调节发酵液的酸碱度； 

所述负离子发生器、氧电极和pH计与一个总控制器相连，由该总控制器根据氧电极和pH计输出的数据来调节负离子发生器的通气工作。 

所述总控制器为一个微型电子计算机模块，可以接受pH计和氧电极发出的检测电信号，并根据设置的信号范围控制高压气泵和负离子发生器的电源，从而控制发酵液的pH值和溶氧率在设置的范围内。如果发酵液的pH值低于设置的范围，总控制器就会自动开启负离子发生器的电源，该负离子发生器开始工作将通入发酵罐的空气负离子化，负离子空气进入发酵罐可以升高pH值，当发酵液的pH值超过设置的范围时，总控制器断开负离子发生器的电源；如果发酵液的 溶氧率低于设置的范围，总控制器自动开启高压气泵，发酵液的溶氧率开始上升，当发酵液的溶氧率超过设置的范围时，总控制器自动减弱高压气泵的电源电流或电压，高压气泵鼓气速度下降，发酵液的溶氧率也慢慢下降，如此自动循环控制。 

所述高效生物反应器还包括一个与出入口相连通的气体加热装置，该气体加热装置可拆卸，该气体加热装置包括空气加热器和鼓风机； 

通过出入口可以向发酵罐内通入高温气体或者有机溶剂或者消毒剂。 

进一步，所述磁珠自下而上填充在发酵罐内或者所述磁珠悬浮于发酵罐内的液体中； 

所述循环管道上包裹有磁化器，该磁化器是可调整磁场强度的永磁体或可调整磁场强度的电磁铁，可调整的磁场强度范围在10-1000mT。该磁化器通过对循环管道中发酵液的水分子进行磁化以提高发酵液的营养成分的溶解度防止沉淀，磁化的发酵液还可以促进细胞生长和代谢活力。 

更进一步，所述磁珠有两种，第一种为实心磁珠，第二种为中空磁珠，实心磁珠主要用于固定化细胞培养，中空磁珠主要用于气升式悬浮培养； 

所述实心磁珠为双层结构，包括球心和第一外包层，所述球心为天然磁铁或人造永磁体； 

所述中空磁珠为三层结构，从里到外依次包括真空球心，磁芯和第二外包层，所述磁芯为包裹在真空球心外的天然磁铁或人造永磁体； 

所述第一外包层和第二外包层的材质均为耐有机溶剂且对生物细胞生长和代谢没有抑制作用的惰性材料，例如玻璃或陶瓷或不锈钢或聚四氟乙烯等等； 

所述第一外包层和第二外包层的表面是光滑的或者是带有突出结构的粗糙表面，所述突出结构可以为规则的，也可也为不规则的； 

表面光滑的磁珠用于贴壁性强的细菌、植物或者动物细胞培养，表面粗糙的磁珠用于贴壁性弱的真菌、细菌或动植物细胞培养。 

所述磁珠外径一般为0.1-20厘米，或所述磁珠外径可以根据发酵罐的大小和培养要求来定制所需直径的磁珠。 

所述磁珠的表面磁场强度一般为1-500mT或500mT以上，还可以根据培养要求定制磁珠。 

所述磁珠可以在整个发酵罐内紧密堆积，由于微生物和单细胞具有贴壁生长特性，因此细胞或菌丝包裹磁珠生长，发酵液在磁珠之间的缝隙间循环流动，向细胞或菌丝提供养分，发酵液也可以通过发酵罐外的循环管道循环。 

为了实现第二个目的，本发明采用如下技术方案： 

一种利用上述高效生物反应器进行薯蓣皂苷高效生物水解方法，其特征在于步骤如下： 

在发酵罐内填充磁珠，然后打开底部的出入口阀门通入200-300℃高温空气对发酵罐进行消毒，然后再从底部的出入口注入以鼠李糖为碳源的培养液，并接种薯蓣皂苷水解菌株(Penicillium dioscin，CCTCC No:M206001)，然后开启循环管道中的循环泵，培养7-10天后，薯蓣皂苷水解菌紧贴磁珠生长并包满磁珠，关闭循环泵，然后打开出入口阀门放出培养液，再通过底部的出入口注入混悬有薯蓣皂苷的无糖Czapeks培养液，室温设置在28-30℃，溶氧率设置在25-28mg/kg，酸碱度设置在pH6.0-7.0，开启循环泵、高压气泵、负离子发生器及进气口阀门，开始水解反应，薯蓣皂苷被水解菌水解为薯蓣皂苷元，被水解的薯蓣皂苷元附着在磁珠表面的菌丝体上，在水解反应期间，每隔5-12小时从取样口取样以检测发酵液中的薯蓣皂苷含量，当发酵液中的薯蓣皂苷含量不再下降时，表明薯蓣皂苷水解菌已经衰退，此时停止水解发酵；然后从底部的出入口放出发酵液，再将气体加热装置与底部的出入口连通，向发酵罐通入热空气对磁珠上的附着物进行加热干燥，干燥彻底后，再通过底部的出入口向发酵罐泵入石油醚，提取水解产生的薯蓣皂苷元，然后回收石油醚，得到薯蓣皂苷元粗提物，然后再将底部的出入口与气体加热装置连接，泵入高温空气使罐内温度达到200-300℃，对发酵罐内的磁珠及附着在磁珠上的菌丝进行高温烘干杀菌，然后再通入培养液并接种薯蓣皂苷水解菌种，如上所述进行薯蓣皂苷生物水解反应，一般反复循环3-5次后磁珠上长满了厚厚一层菌丝并阻塞了发酵液流动时即可取出磁珠，磁珠取出后超声波清洗后可以反复使用。 

或者，在烘干磁珠后，直接将烘干的磁珠取出来在容器里加石油醚提取薯蓣皂苷元。 

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果： 

1、将磁场与固定化载体结合起来形成磁珠载体，大大提高了生物反应效率。 

2、利用磁化器磁化培养液和发酵液，提高菌株活力。 

3、利用负离子调节培养液和发酵液酸碱度，提供负离子氧气，提高薯蓣皂苷水解菌的水解活力。 

4、本发明将生物反应器的固定化培养和磁场技术科学结合起来，可以显著地提高细胞的反应活力，并应用在薯蓣皂苷生物水解反应中，与传统的酸水解反应相比，本发明的水解方法无污染、低成本、低能耗。 

附图说明

图1为本发明的一种高效生物反应器的结构示意图。 

图中，1-发酵罐；2-磁珠；3-筛板；4-出气口阀门；5-出气口无菌过滤器；6-取样口阀门；7-循环泵；8-出入口阀门；9-空气加热器；10-鼓风机；11-高压气泵；12-进气口无菌过滤器；13-负离子发生器；14-进气口阀门；15-循环管道；16-磁化器；17-氧电极；18-pH计，21-出气口，22-取样口，23-出入口，24-进气管道，25-出入口管道，26-出气管道。 

图2为本发明的一种高效生物反应器中磁珠的一种结构示意图。 

19-实心磁珠；19-1：第一外包层；19-2：球心。 

图3为本发明的一种高效生物反应器中磁珠的另一种结构示意图。 

20-中空磁珠；20-1：第二外包层；20-2：磁芯；20-3：真空球心。 

具体实施方式

下面结合附图对本发明的装置和方法作进一步详细说明。 

实施例1： 

一种高效生物反应器，包括发酵罐1、进气系统、发酵罐外的循环管道15、发酵罐1顶部的出气管道26、发酵罐1底部的出入口管道25、发酵罐1顶部的出气口21和底部的出入口23，所述出气口21在出气管道的上端，所述出入口23在出入口管道25的下端，所述进气系统包括进气管道24、高压气泵11、进气口无菌过滤器12和进气口阀门14，进气管道24、出入口管道25、循环管道15三者相连通，所述循环管道15上开设有取样口22，取样口22上设有取样口阀门6，底部的出入口23上设有出入口阀门8； 

所述循环管道15中设置有氧电极17和pH计18，用以监测循环管道15中发酵液或培养液的溶氧率和pH值； 

所述循环管道15的两端分别与发酵罐顶部的出气管道26和底部的出入口管道25连通，发酵罐1内的发酵液通过循环管道15循环； 

所述发酵罐1内设置有磁珠2，所述发酵罐1的底部或/和顶部为可以分离的漏斗形结构，便于填充和取出磁珠2。 

在所述进气管道24上设置有负离子发生器13，高压气泵11、进气口无菌过滤器12、负离子发生器13、进气口阀门14沿着进气管道24的进气方向依次设置，进气系统通入的气体可以是自然空气，也可以是人工高纯度氧气，也可以是人工氮气，具体使用什么气体根据不同的培养要求而定。 

所述负离子发生器13可通过向循环管道15中循环的发酵液中通入负离子氧气以促进好氧细胞的生长代谢和调节发酵液酸碱度，防止发酵液酸化，或通入其他组分的负离子气体来调节发酵液的酸碱度； 

所述负离子发生器13、氧电极17和pH计18与一个总控制器相连，由该总控制器根据氧电极17和pH计18输出的数据来调节负离子发生器13的通气工作。 

所述总控制器为一个微型电子计算机模块，可以接受pH计18和氧电极17发出的检测电信号，并根据设置的信号范围控制高压气泵11和负离子发生器13的电源，从而控制发酵液的pH值和溶氧率在设置的范围内。如果发酵液的pH值低于设置的范围，总控制器就会自动开启负离子发生器13的电源，该负离子发生器13开始工作将通入发酵罐的空气负离子化，负离子空气进入发酵罐1可以升高pH值，当发酵液的pH值超过设置的范围时，总控制器断开负离子发生器13的电源；如果发酵液的溶氧率低于设置的范围，总控制器自动开启高压气泵11，发酵液的溶氧率开始上升，当发酵液的溶氧率超过设置的范围时，总控制器自动减弱高压气泵11的电源电流，高压气泵11鼓气速度下降，发酵液的溶氧率也慢慢下降，如此自动循环控制。 

所述高效生物反应器还包括一个与出入口23相连通的气体加热装置，该气体加热装置可拆卸，该气体加热装置包括空气加热器9和鼓风机10； 

通过出入口23可以向发酵罐1内通入高温气体或者有机溶剂或者消毒剂。 

进一步，所述磁珠2自下而上填充在发酵罐内或者所述磁珠悬浮于发酵罐内 的液体中； 

所述循环管道15上包裹有磁化器16，该磁化器是在10-1000mT范围内可调整磁场强度的永磁体或可调整磁场强度的电磁铁，磁化器16通过对循环管道15中发酵液的水分子进行磁化以提高发酵液的营养成分的溶解度防止沉淀，磁化的发酵液还可以促进细胞生长和代谢活力。 

更进一步，所述磁珠2有两种，第一种为实心磁珠19，第二种为中空磁珠20，实心磁珠19主要用于固定化细胞培养，中空磁珠20主要用于气升式悬浮培养； 

所述实心磁珠为双层结构，包括球心19-2和第一外包层19-1，所述球心为天然磁铁或人造永磁体； 

所述中空磁珠20为三层结构，从里到外依次包括真空球心20-3，磁芯20-2和第二外包层20-1，所述磁芯20-2为包裹在真空球心20-3外的天然磁铁或人造永磁体； 

所述第一外包层19-1和第二外包层20-1的材质均为耐有机溶剂且对生物细胞生长和代谢没有抑制作用的惰性材料，例如玻璃或陶瓷或不锈钢或聚四氟乙烯等等； 

所述第一外包层19-1和第二外包层20-1的表面是光滑的或者是带有突出结构的粗糙表面，所述突出结构可以为规则的，也可也为不规则的； 

表面光滑的磁珠2用于贴壁性强的细菌、植物或者动物细胞培养，表面粗糙的磁珠2用于贴壁性弱的真菌、细菌或动植物细胞培养。 

所述磁珠2外径一般为0.1-20厘米，或所述磁珠2外径可以根据发酵罐1的大小和培养要求来定制所需直径的磁珠。 

所述磁珠2的表面磁场强度为1-500毫特斯拉或500毫特斯拉以上，还可以根据培养要求定制表面磁场强度相同的磁珠，在发酵罐内形成均一磁场，或定制表面磁场强度不同的磁珠，在发酵罐里形成不均一磁场。 

所述磁珠2可以在整个发酵罐1内紧密堆积，由于微生物和单细胞具有贴壁生长特性，因此细胞或菌丝包裹磁珠生长，发酵液在磁珠之间的缝隙间循环流动，向细胞或菌丝提供养分，发酵液也可以通过发酵罐外的循环管道循环。 

实施例2： 

在实施例1的高效生物反应器的基础上将结构具体化，进行薯蓣皂苷生物水解试验： 

在容积为5升的发酵罐1内填充磁珠2至罐高1/2，本实验所用的磁珠2为外包层为聚四氟乙烯的表面粗糙的实心磁珠19，该实心磁珠19的第一外包层19-1表面均匀分布刺状突起，突起的长度0.5厘米，磁珠外径1.0cm，实心磁珠19表面磁场强度为120mT，然后将出入口23与气体加热装置的空气加热器9连接，开启空气加热器9和鼓风机10向罐内鼓入300℃热空气，如此消毒2小时，然后注入以鼠李糖为糖源的LB培养液，并接种薯蓣皂苷水解菌株(Penicillium dioscin，CCTCC No:M206001)一级液体菌种100毫升，然后开启循环泵7，按常规方法培养10天后，薯蓣皂苷水解菌紧贴磁珠生长并包满磁珠，然后放出培养液，再注入混悬有薯蓣皂苷的无糖Czapeks培养液，培养液中混悬薯蓣皂苷含量为50mg/ml，温度设置在28-30℃，溶氧率设置在28mg/kg，酸碱度设置在pH6.5，开启循环泵7、高压气泵11、负离子发生器13及进气口阀门14，开始水解反应，薯蓣皂苷被水解菌水解为薯蓣皂苷元，被水解的薯蓣皂苷元附着在磁珠2表面的菌丝体上，在水解反应期间，每隔12小时取样检测发酵液中的薯蓣皂苷含量；5天后发酵液中的薯蓣皂苷含量达到8mg/ml后不再下降，表明薯蓣皂苷水解菌已经衰退，此时停止水解发酵，放出发酵液，然后接通发酵罐1底部的气体加热装置，通过出入口23向发酵罐1通入热空气对磁珠2上的附着物进行加热干燥，干燥彻底后，向发酵罐1通入石油醚，提取水解产生的薯蓣皂苷元，然后回收石油醚，得到薯蓣皂苷元粗提物，磁珠2取出后超声波清洗后可以反复使用。 

也可以在水解发酵完毕和烘干磁珠后，将烘干的磁珠取出来放在容器里直接用石油醚提取薯蓣皂苷元。 

以不带任何珠子和不带永磁体的四氟乙烯珠进行如上同样条件的水解发酵，作为对照，最后提取得到的薯蓣皂苷元产率如下表： 

本说明书中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。 

Claims (4)

1.一种高效生物反应器，包括发酵罐、进气系统、发酵罐外的循环管道、发酵罐顶部的出气管道、发酵罐底部的出入口管道、发酵罐顶部的出气口和底部的出入口，所述出气口在出气管道的上端，所述出入口在出入口管道的下端，所述进气系统包括进气管道、高压气泵、进气口无菌过滤器和进气口阀门，进气管道、出入口管道、循环管道三者相连通，所述循环管道上开设有取样口，取样口上设有取样口阀门，底部的出入口上设有出入口阀门；

所述循环管道中设置有氧电极和pH计；

其特征在于：所述循环管道的两端分别与发酵罐顶部的出气管道和底部的出入口管道连通； 

所述发酵罐内设置有磁珠，所述发酵罐的底部或/和顶部为可以分离的漏斗形结构；

在所述进气管道上设置有负离子发生器，高压气泵、进气口无菌过滤器、负离子发生器、进气口阀门沿着进气管道的进气方向依次设置；

所述循环管道上包裹有磁化器，该磁化器是可调整磁场强度的永磁体或可调整磁场强度的电磁铁；

所述磁珠自下而上填充在发酵罐内或者所述磁珠悬浮于发酵罐内的液体中；

所述磁珠有两种，第一种为实心磁珠，第二种为中空磁珠；

所述实心磁珠为双层结构，包括球心和第一外包层，所述球心为天然磁铁或人造永磁体；所述第一外包层材质为耐有机溶剂且对生物细胞生长和代谢没有抑制作用的惰性材料，所述第一外包层的表面是光滑的或者是带有突出结构的粗糙表面；

所述中空磁珠为三层结构，从里到外依次包括真空球心，磁芯和第二外包层，所述磁芯为包裹在真空球心外的天然磁铁或人造永磁体；所述第二外包层材质为耐有机溶剂且对生物细胞生长和代谢没有抑制作用的惰性材料，所述第二外包层的表面是光滑的或者是带有突出结构的粗糙表面；

所述磁珠外径为0.1-20厘米；

所述磁珠的表面磁场强度为1-500mT或500mT以上。

2.根据权利要求1所述的高效生物反应器，其特征在于：所述负离子发生器、氧电极和pH计与一个总控制器相连，由该总控制器根据氧电极和pH计输出的数据来调节负离子发生器的通气工作。

3.根据权利要求1所述的高效生物反应器，其特征在于：所述高效生物反应器还包括一个与出入口相连通的气体加热装置，该气体加热装置可拆卸，该气体加热装置包括空气加热器和鼓风机。

4.权利要求1-3中任一所述的高效生物反应器在薯蓣皂苷生物水解中的应用，其过程如下：

在容积为5升的发酵罐内填充磁珠至罐高1/2，磁珠为外包层为聚四氟乙烯的表面粗糙的实心磁珠，该实心磁珠的第一外包层表面均匀分布刺状突起，突起的长度0.5厘米，磁珠外径1.0cm，实心磁珠表面磁场强度为120 mT，然后将出入口与气体加热装置的空气加热器连接，开启空气加热器和鼓风机向罐内鼓入300℃热空气，如此消毒2小时，然后注入以鼠李糖为糖源的LB培养液，并接种薯蓣皂苷水解菌株Penicillium dioscin，CCTCC No: M206001一级液体菌种100毫升，然后开启循环泵，按常规方法培养10天后，薯蓣皂苷水解菌紧贴磁珠生长并包满磁珠，然后放出培养液，再注入混悬有薯蓣皂苷的无糖Czapeks培养液，培养液中混悬薯蓣皂苷含量为50mg/ml，温度设置在28-30℃，溶氧率设置在28mg/kg，酸碱度设置在pH6.5，开启循环泵、高压气泵、负离子发生器及进气口阀门，开始水解反应，薯蓣皂苷被水解菌水解为薯蓣皂苷元，被水解的薯蓣皂苷元附着在磁珠表面的菌丝体上，在水解反应期间，每隔12小时取样检测发酵液中的薯蓣皂苷含量；5天后发酵液中的薯蓣皂苷含量达到8mg/ml后不再下降，表明薯蓣皂苷水解菌已经衰退，此时停止水解发酵，放出发酵液，然后接通发酵罐底部的气体加热装置，通过出入口向发酵罐通入热空气对磁珠上的附着物进行加热干燥，干燥彻底后，向发酵罐通入石油醚，提取水解产生的薯蓣皂苷元，然后回收石油醚，得到薯蓣皂苷元粗提物，磁珠取出后超声波清洗后可以反复使用；

或者在水解发酵完毕和烘干磁珠后，将烘干的磁珠取出来放在容器里直接用石油醚提取薯蓣皂苷元。