CN107189975B - 一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法。不需要打开细胞反应器就能够对细胞进行收集，并且能够减小对细胞和滤膜的伤害，从而提高细胞的培养和收集效率。一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法，包括：在细胞扩增完成后，改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，在营养液腔和细胞生长腔之间产生压差，通过压差对扩增后的细胞进行扰动，和/或，转动细胞反应器，利用重力和离心力对扩增后的细胞进行扰动，以使得所述扩增后的细胞分散和脱落；将脱落后的细胞在营养液的驱动下排出得以收集。本发明用于细胞的收集。

Description

一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法。

背景技术

细胞扩增培养是将细胞在适宜的条件下进行养育，以达到细胞数倍增的一种生物工程方式。在现有技术中，通过滤膜将细胞反应器分隔为营养液腔和细胞生长腔，将细胞接种于细胞生长腔中进行扩增培养已成为细胞培养的主流，由于滤膜的作用，营养液腔内的营养液可不断渗透至细胞生长腔为细胞提供营养，进而使得营养液腔内的营养液可与细胞生长腔内的细胞代谢物进行交换，模拟体内细胞代谢环境，可保持细胞生存环境的稳定与优化。

但是，采用该细胞反应器对细胞进行扩增培养完成之后，通常采用机械或者酶解的方法对细胞进行收集。比如，可将细胞反应器打开，将细胞从细胞生长腔的腔壁上刮除，或者，在细胞生长腔内加入消化酶对细胞进行消化，以对细胞进行收集。在此过程中，机械刮除和酶解的方式都会对细胞和滤膜造成不同程度的伤害，达不到细胞培养和收集的最好效果。

发明内容

本发明的实施例提供一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法。不需要打开细胞反应器就能够对细胞进行收集，并且能够减小对细胞和滤膜的伤害，从而提高细胞的培养和收集效率。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

本发明实施例提供一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法，包括：

在细胞扩增完成后，改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，在营养液腔和细胞生长腔之间产生压差，通过压差对扩增后的细胞进行扰动，和/或，转动细胞反应器，利用重力和离心力对扩增后的细胞进行扰动，以使得所述扩增后的细胞分散和脱落；

将脱落后的细胞在营养液的驱动下排出得以收集。

可选的，改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，在营养液腔和细胞生长腔之间产生压差具体包括：

将营养液输送泵以脉冲的形式输送营养液，以使得营养液腔和细胞生长腔之间的压差正负交替变化。

可选的，改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，在营养液腔和细胞生长腔之间产生压差具体包括：

交替向压力扩展箱内充入气体和排出气体，以使得营养液腔和细胞生长腔之间的压差正负交替变化。

可选的，当所述细胞为贴壁细胞时，改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，在营养液腔和细胞生长腔之间产生压差，通过压差对扩增后的细胞进行扰动，和/或，转动细胞反应器，对扩增后的细胞进行扰动，所述方法还包括：对所述扩增后的细胞进行消化。

可选的，所述压差为20-80kPa。

可选的，所述压差正负交替变化的频度为2-5次/分钟。

可选的，转动细胞反应器具体包括：

控制所述细胞反应器的两端绕所述细胞反应器的中心在竖直平面内往复转动。

可选的，所述往复转动的角度大于0度小于等于180度，所述往复转动的次数为3-10次。

可选的，所述往复转动的速度为2-10转/分钟。

本发明实施例提供的一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法，由于在通过细胞反应器对细胞进行扩增时，细胞反应器内通过滤膜分隔为细胞生长腔和营养液腔，细胞接种于细胞生长腔内，营养液腔中的营养液渗透该滤膜为细胞提供营养，在此过程中，细胞在狭窄的腔室内扩增之后，大量细胞会聚集在一起，并且还有的细胞附着于细胞生长腔的壁面上，在细胞扩增完成后，改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，在营养液腔和细胞生长腔之间产生压差，通过压差对扩增后的细胞进行扰动，和/或，转动细胞反应器，利用重力和离心力，对扩增后的细胞进行扰动，以使得细胞分散并脱落，而后，通过营养液的驱动将细胞排出并收集，不需要打开细胞反应器就能够对细胞进行收集，并且，通过营养液对细胞进行扰动，与机械刮除和酶解相比，能够减小对细胞和滤膜的伤害，从而能够提高细胞的培养和收集效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法的流程示意图；

图2为本发明实施例提供的一种封闭式细胞扩增系统的结构示意图；

图3为本发明实施例提供的一种转动细胞反应器的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本发明实施例提供一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法，参见图1与图2，包括：

步骤1)在细胞扩增完成后，改变营养液腔11和/或细胞生长腔12的压力，在营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差，通过压差对扩增后的细胞进行扰动，和/或，转动细胞反应器1，利用重力和离心力对扩增后的细胞进行扰动，以使得所述扩增后的细胞分散和脱落；

步骤2)将脱落后的细胞在营养液的驱动下排出得以收集。

本发明实施例提供的一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法，由于在通过细胞反应器1对细胞进行扩增时，细胞反应器1内通过滤膜2分隔为细胞生长腔12和营养液腔11，细胞接种于细胞生长腔12内，营养液腔11中的营养液渗透该滤膜2为细胞提供营养，在此过程中，细胞在狭窄的腔室内扩增之后，大量细胞会聚集在一起，并且还有的细胞附着于细胞生长腔12的壁面上，在细胞扩增完成后，改变营养液腔11和/或细胞生长腔12的压力，在营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差，通过压差对扩增后的细胞进行扰动，和/或，转动细胞反应器1，对扩增后的细胞进行扰动，以使得细胞分散并脱落，而后，通过营养液的驱动将细胞排出并收集，不需要打开细胞反应器1就能够对细胞进行收集，并且，通过营养液对细胞进行扰动，与机械刮除和酶解相比，能够减小对细胞和滤膜的伤害，从而能够提高细胞的培养和收集效率。

需要说明的是，本发明实施例的细胞收集方法中的细胞反应器1，可适用于绝大多数细胞的培养，尤其适用于悬浮细胞和贴壁细胞的培养。其中，悬浮细胞在培养时可直接注入到细胞培养器1内进行培养，贴壁细胞在培养前需要对细胞反应器1内的细胞生长腔12的壁面进行处理，以便于细胞贴壁生长，例如，将具有附着功能的蛋白铺在细胞生长腔12壁面后，再进行贴壁细胞的培养。在扩增完成后，对细胞进行收集时，通过对所述细胞进行扰动，以使得细胞从细胞生长腔12的壁面脱落，对于悬浮细胞而言，随着细胞的扩增，大量细胞聚集成细胞团，并有部分细胞粘附在细胞生长腔12的腔壁上，通过轻轻扰动就能够使细胞从壁面脱落，并将细胞团打散；而对于贴壁细胞而言，由于贴壁细胞在培养前在细胞生长腔12的壁面铺设有蛋白，因此，优选的，当所述细胞为贴壁细胞时，在对扩增后的细胞进行扰动之前，所述方法还包括：对所述扩增后的细胞进行消化。这样，便于细胞快速脱落，提高收集效率。

当然，这时对扩增后的细胞进行消化仅仅是细胞脱落的辅助手段，因此，可以适当降低消化酶的浓度以及反应时间，从而仍然能够达到减小对细胞和滤膜的伤害的目的。

对所述扩增后的细胞进行消化的具体操作不做限定，可以将细胞生长腔内的营养液排空，再向其中注入胰蛋白酶，静置一段时间，以对所述细胞进行消化。

其中，所述压差可以是营养液腔11的压力减细胞生长腔12的压力，也可以为细胞生长腔12的压力减营养液腔11的压力，在实际应用中，通过在营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差，就能够使营养液对细胞生长腔12内的细胞进行扰动，从而能够使细胞分散和脱落。

其中，改变营养液腔11和/或细胞生长腔12的压力，使得营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差的具体操作不做限定，在细胞扩增系统中，营养液腔11与营养液输送泵3连通，营养液腔11或细胞生长腔12连通有压力扩展箱4，通过营养液输送泵3向营养液腔11输送营养液，当营养液腔11的压力大于细胞生长腔12的压力时，营养液通过滤膜2进入细胞生长腔12与细胞代谢物发生交换，而压力扩展箱4不论与营养液腔11连通还是和细胞生长腔12连通，都能够使营养液腔11和细胞生长腔12之间的压力逐渐趋于平衡，因此，在实际应用中，可以通过调节所述营养液输送泵3的流速突然增大或者突然减小，在营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差，具体的，当营养液输送泵3的流速突然增大时，营养液腔11和细胞生长腔12之间产生一个正向压差，这时，营养液腔11内的营养液以一定的渗透速度进入细胞生长腔12中，能够对细胞进行扰动，在压力扩展箱4的作用下，细胞生长腔12和营养液腔11之间的压力趋于平衡。而相应地，还可以通过向压力扩展箱4内充入气体或者排出气体，来突然增大或减小压力扩展箱4内的压力，这样，也能够在营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差，对细胞进行扰动，同样地，在此过程中，由于压力扩展箱4的平衡作用，同样能够使营养液腔11和细胞生长腔12之间的压力趋于平衡。

当然，在营养液输送泵3输送营养液的通路中，在营养液腔11的出口处还可以设置有阀门a，这时，可以在营养液输送泵3工作时适当关闭所述阀门a，使营养液腔11内的压力增大，进而实现调节营养液腔11内与细胞生长腔12内的压差。

本发明的又一实施例中，改变营养液腔11和/或细胞生长腔12的压力，使得营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差具体包括：将营养液输送泵3以脉冲的形式输送营养液，以使得营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化。

在本发明实施例中，通过将营养液输送泵3以脉冲的形式输送营养液，使得营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化，能够避免不断增大营养液腔11或者细胞生长腔12的压力而使得系统过压的情况发生，保证系统稳定运行，同时，还能够持续对细胞进行扰动。

其中，脉冲是指一个物理量在短持续时间内突变后迅速回到其初始状态的过程。在这里，将营养液输送泵3以脉冲的形式输送营养液是指，营养液输送泵3的输送速度以脉冲的形式变化，这样，营养液输送泵3的输送速度忽高忽低，使得营养液输送泵3的输送速度突然增大时，营养液腔11和细胞生长腔12之间就会产生正向压差，而后，营养液输送泵3的输送速度突然降低时，营养液腔11和细胞生长腔12之间产生负向压差，这样，通过使营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化，能够使营养液不断冲击细胞，使细胞在足够的压力作用下发生分散和脱落。

其中，在将营养液输送泵3以脉冲的形式输送营养液时，可以根据所需要达到的压差以及细胞生长腔12的压力来调节所述营养液输送泵3的输送速度。在此过程中，对所述脉冲的波形不做限定，只要能够使营养液以脉冲的形式不断对细胞进行冲击，从而使细胞发生分散和脱落即可。

优选的，所述脉冲的波形为矩形波，这样，控制营养液输送泵3以第一速度和第二速度交替输送营养液，使得所述营养液输送泵3的速度为矩形波的波峰时，营养液腔11的压力大于细胞生长腔12的压力，接着，营养液输送泵的速度迅速转换到矩形波的波谷，细胞生长腔12的压力大于营养液腔11的压力，这样压差不断正负交替变化，能够使营养液不断对细胞产生冲击力，使细胞分散和脱落。

本发明的又一实施例中，改变营养液腔11和/或细胞生长腔12的压力，使得营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差，以对细胞进行扰动；具体包括：交替向压力扩展箱4内充入气体和排出气体，以使得所述营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化。

在本发明实施例中，通过改变压力扩展箱4内的压力，使营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化，同样能够避免不断增大营养液腔11或者细胞生长腔12的压力而使得系统过压的情况发生，保证系统稳定运行。同时，也能够持续对细胞进行扰动，从而能够使营养液不断冲击细胞，使细胞在足够的压力作用下发生分散和脱落。

在实际应用中，通过在压力扩展箱4上设置阀门b，当向所述压力扩展箱4内充入气体或者排出气体时可以通过开启所述阀门b来实现。

其中，需要说明的是，由于压力扩展箱4可以与营养液腔11或者细胞生长腔12连通，因此，具体的，当压力扩展箱4与营养液腔11连通时，向压力扩展箱4内充入气体，能够增大营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差，反之，则减小营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差，当压力扩展箱4与细胞生长腔12连通时，向压力扩展箱4内充入气体，能够减小营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差，反之，则增大营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差。

在此过程中，同样可以根据所需要达到的压差以及细胞生长腔12或者营养液腔11的压力来调节充入或者排出气体的气体量，以使得营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化。

如果同时对营养液输送泵3的流速和压力扩展箱4内的压力进行调节，以使得营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化，则操作较为复杂，不利于控制，但仍可作为一选项。

本发明的一实施例中，所述压差为20-80kPa。通过实验发现，控制营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差在该范围内，能够最大程度上对细胞进行扰动，使细胞分散和脱落，同时，还能够避免压差过大造成系统运行不稳定，当然，系统还可以设置过压保护，以避免压差过大。

在实际应用中，还可以在所述营养液腔11和细胞生长腔12上分别设置压力传感器，对所述营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差进行实时检测，便于对营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差进行调节。

其中，在营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化时，所述压差正负交替变化的数值可以为该范围内的任意值，示例性的，当营养液输送泵3以第一速度输送营养液时，营养液腔与细胞生长腔之间的压差可以为20kPa，而后，营养液输送泵3以第二速度输送营养液，这时，营养液腔与细胞生长腔之间的压差可以为-20--80kPa中的任意值，这与第一速度和第二速度的大小有关；再示例性的，当向所述压力扩展箱4内充入气体时，营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差可以为-80kPa，而后，从所述压力扩展箱4内排出气体时，营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差可以为20-80kPa中的任意值，这与所充入和排出的气体量有关。

本发明的又一实施例中，所述压差正负交替变化的频度为2-5次/分钟。所述压差正负交替变化的频度是指在一定的时间段内压差正负交替变化的频繁程度，通过实验发现，将压差正负交替变化的频度控制在该范围内，能够对细胞进行很好的扰动，使细胞得以充分分散和脱落。

本发明的一实施例中，参见图3，转动细胞反应器1具体包括：控制所述细胞反应器1的两端绕所述细胞反应器1的中心在竖直平面内往复转动。

往复转动是指细胞反应器1顺时针转动一定的角度之后，逆时针转回到初始状态的过程，或者，细胞反应器1逆时针转动一定的角度之后，顺时针转回到初始状态的过程。

在本发明实施例中，通过控制所述细胞反应器1的两端绕所述细胞反应器1的中心在竖直平面内往复转动，能够在对细胞进行充分扰动的同时，最大程度上减小细胞反应器1的转动空间，避免转动空间过大而对周边的仪器造成干扰，另外，由于细胞反应器1上还连通有营养液输送管道、细胞输送管道等各种管道，因此，采用往复转动的形式，能够防止细胞反应器1不断转动导致管道缠绕。

本发明的一实施例中，所述往复转动的角度大于0度小于等于180度，所述往复转动的次数为3-10次。所述往复转动的角度是指细胞反应器1从初始位置转动到一定的位置进行回转时的角度。如图3所示，为往复转动的角度为90度的示意图，实线表示细胞反应器1的初始位置，虚线表示转动90度时的位置。通过控制往复转动的角度和次数，能够对细胞进行充分扰动，还能够最大程度上减少管道缠绕。

本发明的又一实施例中，所述往复转动的速度为2-10转/分钟。其中，1转是360度，在这里，往复转动的速度为2-10转/分钟，也就是说，所述细胞反应器的两端不断绕所述细胞反应器1的中心往复转动，1分钟转动的角度为720度-3600度，这里的角度是指往复转动的角度与转动次数之间的乘积。通过控制往复转动的速度，能够防止速度过大造成细胞破裂，速度过小对细胞扰动不到位的情况发生。

以上仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种封闭式细胞扩增系统的细胞收集方法，其特征在于，所述封闭式细胞扩增系统包括细胞反应器，所述细胞反应器包括营养液腔和细胞生长腔；所述细胞收集方法包括：

在细胞扩增完成后，改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，在营养液腔和细胞生长腔之间产生压差，通过压差对扩增后的细胞进行扰动，和/或，控制所述细胞反应器的两端绕所述细胞反应器的中心在竖直平面内往复转动，利用重力和离心力对扩增后的细胞进行扰动，以使得所述扩增后的细胞分散和脱落；

将脱落后的细胞在营养液的驱动下排出得以收集；

其中，所述压差为20-80kPa，所述压差正负交替变化的频度为2-5次/分钟；

所述往复转动的角度大于0度小于等于180度，所述往复转动的次数为3-10次，所述往复转动的速度为2-10转/分钟。

2.根据权利要求1所述的细胞收集方法，其特征在于，

改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，在营养液腔和细胞生长腔之间产生压差具体包括：

将营养液输送泵以脉冲的形式输送营养液，以使得营养液腔和细胞生长腔之间的压差正负交替变化。

3.根据权利要求1所述的细胞收集方法，其特征在于，

改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，在营养液腔和细胞生长腔之间产生压差具体包括：

交替向压力扩展箱内充入气体和排出气体，以使得营养液腔和细胞生长腔之间的压差正负交替变化。

4.根据权利要求1所述的细胞收集方法，其特征在于，

当所述细胞为贴壁细胞时，改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，在营养液腔和细胞生长腔之间产生压差，通过压差对扩增后的细胞进行扰动，和/或，控制所述细胞反应器的两端绕所述细胞反应器的中心在竖直平面内往复转动，利用重力和离心力对扩增后的细胞进行扰动之前，所述方法还包括：对所述扩增后的细胞进行消化。

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