CN106520669A - 一种干细胞定向分化培养体系 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种干细胞定向分化培养体系，包括培养基，用于培养干细胞和体细胞；细胞载体，所述细胞载体包含中部的空腔、设置于所述细胞载体外表面的一层PIPAAm膜、贯穿所述细胞载体内外的通孔和插接于所述通孔内的密封塞。本发明具有以下优点和效果：采用在细胞载体上设置通孔，使得细胞载体内壁的体细胞和细胞载体外壁的干细胞在细胞间接触，促进干细胞的分化，同时在细胞载体外壁设置一层PIPAAm膜，使得在分离体细胞和分化后的干细胞时不需要采用生物酶处理，达到了分化后分离方便、干细胞分化率高的效果。

Description

一种干细胞定向分化培养体系
技术领域
本发明涉及生命科学技术领域，特别涉及一种干细胞定向分化培养体系。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化为多种功能细胞，干细胞包括体细胞来源的干细胞和胚胎干细胞，干细胞的分化培养可以采用成熟体细胞与干细胞共培养来诱导干细胞的定向分化。
申请公布号为CN105132367A的中国专利《间充质干细胞的三维共培养诱导方法》公开了一种间充质干细胞的三维共培养诱导方法，包括以下步骤：分别获取间充质干细胞和目的细胞源；将间充质干细胞与含有磁性氧化物包裹于凝胶球A中；将目的细胞源包裹于凝胶球B中；用诱导剂对凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源进行共培养至间充质干细胞转化为目的细胞，然后将凝胶球A和凝胶球B置于磁场中进行分离；其中，磁性氧化物颗粒的直径为1-100nm。
但是上述间充质干细胞的三维培养方法存在以下缺点：在培养过程中间充质干细胞被包裹在凝胶球A中，目标细胞源被包裹在凝胶球B中，间充质干细胞不会直接与目标细胞源接触，目标细胞源仅仅只能通过旁分泌机制来对间充质干细胞进行诱导，不能进行细胞间接触和缝隙连接，而缝隙连接在干细胞分化中是必须的，会影响干细胞分化效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种干细胞定向分化培养体系，具有分化率高的效果。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种干细胞定向分化培养体系，包括培养基，用于培养干细胞和体细胞；细胞载体，所述细胞载体包含中部的空腔、设置于所述细胞载体外表面的一层PIPAAm膜和贯穿所述细胞载体内外的通孔。
通过采用上述技术方案，细胞外微环境在干细胞诱导分化中具有重要作用，在干细胞研究领域，将干细胞和体细胞共培养，能促进干细胞增值和诱导干细胞分化。首先将细胞载体放入培养有干细胞的培养基内，动物细胞具有贴壁生长的特性，干细胞会附着在细胞载体外表面上的PIPAAm膜上。将带有体细胞的培养基放入到细胞载体的空腔内，使得体细胞附着于细胞载体内部的空腔内贴壁生长。然后取下密封塞，使得细胞载体内的体细胞和细胞载体外壁的干细胞接触。
共培养过程中，干细胞通过分泌一些细胞因子通过通孔后作用于干细胞，促进干细胞的分化和增值，即旁分泌机制。除了旁分泌机制，体细胞和干细胞之间还能通过通孔直接接触，实现干细胞和体细胞之间的直接接触和缝隙连接。缝隙连接介导的细胞与细胞间反应是干细胞分化中必需的。当干细胞和体细胞共培养一端时间后，将干细胞和体细胞进行分离，PIPAAm膜是一种用多聚物PIPAAm合成膜，在32摄氏度以下为亲水性，不会与细胞发生粘结，在32摄氏度以上为疏水性，会与细胞发生粘结。干细胞和体细胞共培养是保持温度在32摄氏度以上，干细胞诱导分化后，将培养基内的温度调整到30摄氏度以下，即可将附着在细胞载体外壁上的干细胞剥落，实现干细胞和体细胞的分离。达到了干细胞诱导分化率高、增殖速度快的效果。
本发明的进一步设置为：所述细胞载体由壳聚糖和磷酸钙材料制作而成。
通过采用上述技术方案，壳聚糖是一种带正电荷的碱性多糖聚合物，生物相容性好，兼具无毒和抗菌的作用。同时壳聚糖表面分子带有的亲水性的功能基团，使得在培养过程中便于细胞的粘附。但是壳聚糖无法单独使用，在壳聚糖中加入铃酸钙以提高细胞载体的强度，使得细胞载体具有良好的生物相容性和降解性以及优异的材料与细胞接触面。
本发明的进一步设置为：所述培养基包括胰岛素、β-疏基乙醇、白血病抑制因子和基础培养基，所述基础培养基为RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、高糖DMEM培养基之间的一种。
通过采用上述技术方案，在干细胞增殖时胰岛素样生长因子具有显著的促进作用，但是在实际过程中存在提取十分困难，胰岛素与胰岛素样生长因子不仅结构类似，功能上也一致，通过用胰岛素代替胰岛素样生长因子，来实现对干细胞增殖的促进作用。白血病抑制因子,其为一种具有多种功能的细胞因子,能提高细胞的活性和促进干细胞增值。β-疏基乙醇也能在干细胞分化时促进干细胞的增值，通过向基础培养基添加胰岛素、β-疏基乙醇和白血球抑制因子，再配合体细胞分泌的物质，能起到协同促进干细胞的增殖和分化。
本发明的进一步设置为：所述基础培养基为高糖DMEM培养基。
通过采用上述技术方案，高糖DMEM培养基能在干细胞的增殖过程中提供原料，促进干细胞的分化。
本发明的进一步设置为：所述细胞载体包括上端开口的管体和用于密封所述管体开口的封盖，所述管体竖直放置于所述培养基内。
通过采用上述技术方案，细胞载体设置为上端开口的管体和封盖，向管体内加入体细胞，再用封盖封住开口即可。
本发明的进一步设置为：所述干细胞定向分化培养体系包括多个所述细胞载体。
通过采用上述技术方案，干细胞多为贴壁细胞，最常见的培养为二维静态培养，但是在常规的二维贴壁静态培养体系中，当需要较大规模分化培养时，不仅需要增加培养容器和培养基，也增加了人工。采用在干细胞定向分化培养体系中同时放入多个细胞载体，能够实现在同一培养体系下同时进行分化培养，不需要额外增加培养容器，节省人工。
综上所述，本发明具有以下有益效果：采用在细胞载体上设置通孔，使得细胞载体内壁的体细胞和细胞载体外壁的干细胞在细胞间接触，促进干细胞的分化，同时在细胞载体外壁设置一层PIPAAm膜，使得在分离体细胞和分化后的干细胞时不需要采用生物酶处理，其次，细胞载体内壁具有良好的接触面，供体细胞附着生长，达到了分化后分离方便、干细胞分化率高的效果。
具体实施方式
具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例1：一种干细胞定向分化培养体系，包括培养容器、培养基和多个细胞载体。首先配置培养基，培养基包含β-疏基乙醇、胰岛素、白血病抑制因子和基础培养基，其中β-疏基乙醇浓度为0.1mmol/ml，白血病抑制因子浓度为1.5×103U/ml，胰岛素浓度为10-50ng/ml，基础培养基为高糖型DMEM培养基。
制作细胞载体，将固相的磷酸三钙粉末以及液相的壳聚糖溶液在室温下以0.7g:1mL的比例混合，搅拌均匀呈糊状，置于模具中制作成上端开口的管体和用于插入开口中的封盖。选用一张PIPAAm膜用无毒的胶水粘附固定于细胞载体外壁后，选用灭菌后的针扎穿细胞载体侧壁，形成通孔，并选用适配于通孔的密封塞插入通孔内进行密封。密封塞选用橡胶。
将细胞载体竖直放置于培容器内，加入向培养其和细胞载体内加入培养基，并向培养容器内的培养基中加入干细胞，细胞载体内加入体细胞，在37摄氏度下培养1天，等体细胞附着于细胞载体内壁后，拔下通孔内的密封塞，继续培养2-7天。将培养容器温度降低至30摄氏度，轻微振荡将干细胞从细胞载体上脱落，取出微载体即可。
干细胞定向分化培养体系中的体细胞和干细胞可选自人、兔等哺乳动物。为避免涉及伦理道德，上述体细胞选用大鼠心肌样细胞，干细胞选用骨髓间充质干细胞。商购出生1-3天的Wistar大鼠乳鼠和4-6周的wistar大鼠，从wistar大鼠内分离纯化得到骨髓间充质干细胞。将wistar大鼠乳鼠置于超净台内无菌剪去心室肌部分，剪碎组织至1mm,加入0.125％胰蛋白酶，37摄氏度水浴消化5-6分钟，收集消化后的液体至含10％FBS的DMEM/F12培养，消化液过滤后再37摄氏度下水浴5分钟，重复8次，离心7分钟，接种在生长培养基内孵育2小时，吸出细胞悬液，转入培养瓶内，在含有10％de DMEM/F12培养基内继续培养。吸出一部分细胞以2×104/cm2接种于放有玻片的6孔板中，采用间接免疫荧光鉴定所培养的心肌样细胞。
用荧光染液CM-Di标记大鼠骨髓间充质干细胞，按上述方法与大鼠心肌样细胞共培养后，共培养结束后，用间接免疫荧光方法检测大鼠间充质干细胞是否表达心肌特异性抗原情况，所用抗体为小鼠抗大鼠肌球蛋白(myosin,购自Necmarkers公司)、小鼠抗大鼠肌球蛋白T(Troponin T,购自Necmarkers公司)，操作方法如下：弃去培养液，得到共培养后的干细胞，用PBS冲洗后，4％多聚甲醛室内固定30分钟，滴加3％H2O2，室温放置15分钟，加入50ul小鼠抗大鼠肌球蛋白或小鼠抗大鼠肌球蛋白T，4摄氏度处理12小时；加入100μ LFITC-二抗，室温富孵育40分钟，DAPI染细胞核后PBS清洗，封片后在激光共聚焦显微镜下观察，如细胞同时显示红光及绿光，则说明该细胞为已分化的骨髓间充质干细胞。并将结果记录在以下表1中。
实施例2：一种干细胞定向分化培养体系，与实施例1的不同之处在于，基础培养基为RPMI1640培养基，并对共培养后的干细胞进行检测，将结果记录在以下表1中。
实施例3：一种干细胞定向分化培养体系，与实施例1的不同之处在于，基础培养基为DMEM/F12培养基，并对共培养后的干细胞进行检测，将结果记录在以下表1中。
对比例1：一种干细胞定向分化培养体系，与实施例1的不同之处在于，细胞载体内没有添加体细胞。
对比例2：一种干细胞定向分化培养体系，与实施例1的不同之处在于，细胞载体内添加干细胞。
表1
干细胞是否分化
实施例1 是
实施例2 是
实施例3 是
对比例1 否
对比例2 否

Claims (6)

1.一种干细胞定向分化培养体系，包括
培养基，用于培养干细胞和体细胞；
细胞载体，所述细胞载体包含中部的空腔、设置于所述细胞载体外表面的一层PIPAAm膜、贯穿所述细胞载体内外的通孔和插接于所述通孔内的密封塞。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞定向分化培养体系，其特征在于：所述细胞载体由壳聚糖和磷酸钙材料制作而成。
3.根据权利要求1所述的一种干细胞定向分化培养体系，其特征在于：所述培养基包括胰岛素、β-疏基乙醇、白血病抑制因子和基础培养基，所述基础培养基为RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、高糖DMEM培养基之间的一种。
4.根据权利要求3所述的一种干细胞定向分化培养体系，其特征在于：所述基础培养基为高糖DMEM培养基。
5.根据权利要求1所述的一种干细胞定向分化培养体系，其特征在于：所述细胞载体包括上端开口的管体和用于密封所述管体开口的封盖，所述管体竖直放置于所述培养基内。
6.根据权利要求1所述的一种干细胞定向分化培养体系，其特征在于：所述干细胞定向分化培养体系包括多个所述细胞载体。
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