CN110964691A - 子宫内膜干细胞的定向成脂分化培养 - Google Patents

子宫内膜干细胞的定向成脂分化培养 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种子宫内膜干细胞的定向成脂分化培养方法，其特征在于：使用1‑羟基‑4‑O‑鼠李糖‑2‑萘甲酸甲酯是进行诱导培养。成脂诱导液配方：DMEM低糖培养基+10%FBS+50µg/m L 1‑羟基‑4‑O‑鼠李糖‑2‑萘甲酸甲酯+50µg/m L抗坏血酸。本发明的方法简便易行，成本低，在诱导6天就可以明确诱导为脂肪细胞，诱导效率非常高。

Description

子宫内膜干细胞的定向成脂分化培养
技术领域
本发明涉及一种子宫内膜干细胞的定向分化培养，属于干细胞培养技术领域。
背景技术
人子宫内膜是一个高度再生的组织，女性一生大约要经历子宫内膜400多个周期的脱落和再生。研究发现，子宫内膜这种巨大的再生能力被认为与人类子宫内膜干细胞有直接关系，受到越来越多学者的关注。目前，子宫内膜干细胞分类较为多样化，包括子宫内膜细胞侧群(side population，SP)、子宫内膜间充质干细胞、月经血来源的干细胞等，其中子宫内膜间充质干细胞因其数量较多，生物学特性明显人类子宫内膜是一种高度动态的组织，周期性地经历增殖期、分泌期、月经期，
具有显著的再生能力，能从月经后最初的0.5-1毫米长到5-7毫米。据文献报道，来源于子宫内膜组织的间充质干细胞不仅存在于基底层，经血中也存在。子宫内膜组织可全子宫切除术后标本、诊刮组织等中获取，即使绝经后期女性也可在无禁忌情况下应用雌激素刺激内膜生长来获取。hEMSCs因其显著的增殖能力、容易获取，成为构建组织工程韧带具有吸引力的、新的细胞来源。等受到更多关注。
本发明旨在提供一种子宫内膜干细胞的定向分化培养成脂肪细胞的方法，在组织修复工程上可能具有很大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种子宫内膜干细胞的高效定向分化培养成脂肪细胞的方法，在组织修复工程上可能具有很大的应用潜力。
1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯是最近发现的由珍贵束丝放线菌产生的新代谢产物，其结构如下所示：
Figure BDA0002352060210000021
本发明人发现，1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯可以用于高效诱导子宫内膜干细胞成脂分化。
本发明用到的成脂诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+50μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+50μg/mL抗坏血酸。
本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
一种子宫内膜干细胞的高效定向分化培养成脂肪细胞的方法，其包括：
使用1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯是进行诱导培养，其结构如下：
Figure BDA0002352060210000022
作为优选，本发明用到的成脂诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+50μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+50μg/mL抗坏血酸。
具体步骤如下：
hEMSCs的原代培养：
子宫内膜组织被运送至实验室后，将组织浸于PBS中，用手术刀片轻轻刮除组织表面的凝血块，反复洗涤2-3次至PBS洗涤液清亮基本无血迹。用眼科剪将组织剪成约1mm3大小，肉眼观察呈糊状。将组织转移至50ml离心管中，加入适量的Collagenase Type III和Deoxyribonuclease I置于37℃、5％CO2培养箱消化50-60min，消化过程中每5min摇匀1次，结束后在离心管中加入等量培养基终止消化。将消化后的混合液经70um细胞筛过滤，收集滤液，1000r/min离心4min，弃去上清，将获得的细胞用含20％FBS的DMEM/F12(1:1)培养基重悬后接种于培养瓶中。首次换液时间为培养的4-5d，可去除大部分未贴壁细胞及残留的红细胞，并观察细胞的形态。期间2-3d换液1次，待细胞融合达到80％左右时，按1-1：2比例进行传代。
按照现有技术的方法对hEMSCs进行传代、纯化、冻存及复苏。
复苏后上流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原阳性率，鉴定确认为hEMSCs。
诱导培养
诱导培养步骤如下：
(1)选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
(2)使用成脂诱导液进行诱导培养6-8d，所述成脂诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+50-70μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+50μg/mL抗坏血酸。
诱导培养1d后观察，细胞形态出现由长梭形逐渐缩短变圆或多边形趋势，并在胞浆内出现脂滴样物质，更换诱导培养基后也不会消失。随着诱导时间的延长，脂滴样物质逐渐变大，在诱导6天就可以明确诱导为脂肪细胞，诱导效率非常高。
本发明的优点：
本发明的方法简便易行，成本低，在诱导6天就可以明确诱导为脂肪细胞，诱导效率非常高。
附图说明
图1为诱导分化前，图2为诱导6天油红O染色显示：胞浆内脂滴被染成红色。
具体实施方式
实验于2019年2月至2019年10月在浙江省台州医院完成。下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
实施例1
子宫内膜组织取自浙江省台州医院因子宫肌瘤、宫颈病变行全子宫切除术的患者，均为育龄期女性，术前3个月均未曾服用过激素类药物。组织均取自远离患处，标本包含5mm左右肌层的子宫内膜全层，获取子宫内膜组织后，立即置入无菌转移培养基中，4h内送至实验室进行处理。所有的子宫内膜组织均经过我院病理检查，排除子宫内膜炎性病变、子宫内膜增生症、子宫内膜恶性病变等，处于增殖期或分泌期。
hEMSCs的原代培养：
子宫内膜组织被运送至实验室后，将组织浸于PBS中，用手术刀片轻轻刮除组织表面的凝血块，反复洗涤2-3次至PBS洗涤液清亮基本无血迹。用眼科剪将组织剪成约1mm3大小，肉眼观察呈糊状。将组织转移至50ml离心管中，加入适量的Collagenase Type III和Deoxyribonuclease I置于37℃、5％CO2培养箱消化50-60min，消化过程中每5min摇匀1次，结束后在离心管中加入等量培养基终止消化。将消化后的混合液经70um细胞筛过滤，收集滤液，1000r/min离心4min，弃去上清，将获得的细胞用含20％FBS的DMEM/F12(1:1)培养基重悬后接种于培养瓶中。首次换液时间为培养的4-5d，可去除大部分未贴壁细胞及残留的红细胞，并观察细胞的形态。期间2-3d换液1次，待细胞融合达到80％左右时，按1-1：2比例进行传代。
按照现有技术的方法对hEMSCs进行传代、纯化、冻存及复苏。
复苏后上流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原阳性率，鉴定确认为hEMSCs。
实施例2
诱导培养
诱导培养步骤如下：
(1)选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
(2)使用成脂诱导液进行诱导培养6-8d，所述成脂诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+50μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+50μg/mL抗坏血酸。
诱导培养1d后观察，细胞形态出现由长梭形逐渐缩短变圆或多边形趋势，并在胞浆内出现脂滴样物质，更换诱导培养基后也不会消失。随着诱导时间的延长，脂滴样物质逐渐变大，诱导6d后油红O染色显示：胞浆内脂滴被染成红色，见图1和图2。图1为诱导前，图2为诱导6天后。可见，本发明的诱导培养方法在诱导6天就可以明确诱导为脂肪细胞，诱导效率非常高。
实施例3
诱导培养
诱导培养步骤如下：
(1)选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
(2)使用成脂诱导液进行诱导培养6-8d，所述成脂诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+60μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+50μg/mL抗坏血酸。
诱导培养1d后观察，细胞形态出现由长梭形逐渐缩短变圆或多边形趋势，并在胞浆内出现脂滴样物质，更换诱导培养基后也不会消失。随着诱导时间的延长，脂滴样物质逐渐变大，诱导6d后油红O染色显示：胞浆内脂滴被染成红色。可见，60μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯诱导效率同样非常高。
实施例4
诱导培养
诱导培养步骤如下：
(1)选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
(2)使用成脂诱导液进行诱导培养6-8d，所述成脂诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+70μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+50μg/mL抗坏血酸。
诱导培养1d后观察，细胞形态出现由长梭形逐渐缩短变圆或多边形趋势，并在胞浆内出现脂滴样物质，更换诱导培养基后也不会消失。随着诱导时间的延长，脂滴样物质逐渐变大，诱导6d后油红O染色显示：胞浆内脂滴被染成红色。可见，70μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯诱导效率同样非常高。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种子宫内膜干细胞的定向成脂分化培养方法，其特征在于：
使用1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯是进行诱导培养，其结构如下：
Figure FDA0002352060200000011
2.权利要求1所述的培养方法，其特征在于：
成脂诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+50μg/m L 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+50μg/m L抗坏血酸。
3.权利要求2所述的培养方法，其特征在于步骤如下：
(1)hEMSCs的原代培养：
(2)对hEMSCs进行传代、纯化、冻存及复苏；复苏后上流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原阳性率，鉴定确认为hEMSCs。
(3)诱导培养。
4.权利要求3所述的培养方法，其特征在于：
诱导培养步骤如下：
(1)选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
(2)使用成脂诱导液进行诱导培养6-8d，所述成脂诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+50μg/m L抗坏血酸。
5.权利要求4所述的培养方法，其特征在于：
所述成脂诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+50-70μg/m L 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+50μg/mL抗坏血酸。
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