CN111057678A - 子宫内膜干细胞的定向成软骨分化培养 - Google Patents
子宫内膜干细胞的定向成软骨分化培养 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种子宫内膜干细胞的定向成软骨分化培养方法，其特征在于：使用(2Z,5E)‑7‑羟基‑3,7‑二甲基‑2,6‑辛二烯‑1‑O‑[α‑L‑鼠李糖基(1→6)]‑β‑D‑葡萄糖苷进行诱导培养，本发明人发现，(2Z,5E)‑7‑羟基‑3,7‑二甲基‑2,6‑辛二烯‑1‑O‑[α‑L‑鼠李糖基(1→6)]‑β‑D‑葡萄糖苷可以用于高效诱导子宫内膜干细胞成软骨分化诱导得到软骨细胞，诱导8天即可分化为软骨细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种子宫内膜干细胞的定向分化培养，属于干细胞培养技术领域。
背景技术
人子宫内膜是一个高度再生的组织，女性一生大约要经历子宫内膜400 多个周期的脱落和再生。研究发现，子宫内膜这种巨大的再生能力被认为与人类子宫内膜干细胞有直接关系，受到越来越多学者的关注。目前，子宫内膜干细胞分类较为多样化，包括子宫内膜细胞侧群( side population，SP) 、子宫内膜间充质干细胞、月经血来源的干细胞等，其中子宫内膜间充质干细胞因其数量较多，生物学特性明显人类子宫内膜是一种高度动态的组织，周期性地经历增殖期、分泌期、月经期，
具有显著的再生能力，能从月经后最初的 0.5- 1 毫米长到 5- 7 毫米。据文献报道，来源于子宫内膜组织的间充质干细胞不仅存在于基底层，经血中也存在。子宫内膜组织可全子宫切除术后标本、诊刮组织等中获取，即使绝经后期女性也可在无禁忌情况下应用雌激素刺激内膜生长来获取。hEMSCs 因其显著的增殖能力、容易获取，成为构建组织工程韧带具有吸引力的、新的细胞来源。等受到更多关注。
本发明旨在提供一种子宫内膜干细胞的定向分化培养成软骨细胞的方法，在软骨组织修复工程上可能具有很大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种子宫内膜干细胞的高效定向分化培养成软骨细胞的方法，在组织修复工程上可能具有很大的应用潜力。
豨莶为菊科（Asteraceae）豨莶属Siegesbeckia L.一年生草本植物，别名风湿草，肥猪草、黄花草、珠草等，为常用中药，始载于唐代《新修本草》。近期有人从中分离得到一个新化合物：(2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷，其结构式如下：
本发明人发现，(2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷可以用于高效诱导子宫内膜干细胞成软骨分化诱导得到软骨细胞，诱导8天即可分化为软骨细胞。
本发明用到的成软骨诱导液配方：DMEM 低糖培养基+10%FBS+10-20µg/m L (2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷+50µg/mL 抗坏血酸。
本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
一种子宫内膜干细胞的高效定向分化培养成软骨细胞的方法，其包括：
使用(2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷进行诱导培养，(2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷结构如下：
作为优选，本发明用到的成软骨诱导液配方：DMEM 低糖培养基+10%FBS+10-20µg/m L (2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷+50µg/m L 抗坏血酸。
具体步骤如下：
hEMSCs 的原代培养：
子宫内膜组织被运送至实验室后，将组织浸于PBS中，用手术刀片轻轻刮除组织表面的凝血块，反复洗涤 2-3 次至PBS洗涤液清亮基本无血迹。用眼科剪将组织剪成约1mm3 大小，肉眼观察呈糊状。将组织转移至 50ml 离心管中，加入适量的Collagenase Type III和 Deoxyribonuclease I 置于 37℃、5%CO2培养箱消化50-60min，消化过程中每5min 摇匀1次，结束后在离心管中加入等量培养基终止消化。将消化后的混合液经70um细胞筛过滤，收集滤液，1000r/min 离心4min，弃去上清，将获得的细胞用含20%FBS的DMEM/F12(1:1)培养基重悬后接种于培养瓶中。首次换液时间为培养的 4-5d，可去除大部分未贴壁细胞及残留的红细胞，并观察细胞的形态。期间 2-3d换液 1次，待细胞融合达到80%左右时，按1-1： 2 比例进行传代。
按照现有技术的方法对hEMSCs 进行传代、纯化、冻存及复苏。
复苏后上流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原阳性率，鉴定确认为hEMSCs。
诱导培养
诱导培养步骤如下：
（1）选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
（2）使用成软骨诱导液进行诱导培养10d，成软骨诱导液配方：DMEM 低糖培养基+10%FBS+10-20µg/m L (2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷+50µg/m L 抗坏血酸。
诱导培养 2d 后观察，细胞开始出现聚团现象，诱导8d 后，阿利新蓝染色显示：细胞呈蓝色，表明诱导后大量的糖胺聚糖被分泌在细胞基质中。
本发明的优点：
本发明人发现，(2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷可以用于高效诱导子宫内膜干细胞成软骨分化诱导得到软骨细胞，诱导8天即可分化为软骨细胞。
附图说明
图1为诱导分化前，图2为诱导8d后，阿利新蓝染色显示：细胞呈蓝色，表明诱导后大量的糖胺聚糖被分泌在细胞基质中。
具体实施方式
实验于2019年2月至2019年10月在浙江省台州医院完成。下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
实施例1
子宫内膜组织取自浙江省台州医院因子宫肌瘤、宫颈病变行全子宫切除术的患者，均为育龄期女性，术前 3 个月均未曾服用过激素类药物。组织均取自远离患处，标本包含5mm左右肌层的子宫内膜全层，获取子宫内膜组织后，立即置入无菌转移培养基中，4h 内送至实验室进行处理。所有的子宫内膜组织均经过我院病理检查，排除子宫内膜炎性病变、子宫内膜增生症、子宫内膜恶性病变等，处于增殖期或分泌期。
hEMSCs 的原代培养：
子宫内膜组织被运送至实验室后，将组织浸于PBS中，用手术刀片轻轻刮除组织表面的凝血块，反复洗涤 2-3 次至PBS洗涤液清亮基本无血迹。用眼科剪将组织剪成约1mm3 大小，肉眼观察呈糊状。将组织转移至 50ml 离心管中，加入适量的Collagenase Type III和 Deoxyribonuclease I 置于 37℃、5%CO2培养箱消化50-60min，消化过程中每5min 摇匀1次，结束后在离心管中加入等量培养基终止消化。将消化后的混合液经70um细胞筛过滤，收集滤液，1000r/min 离心4min，弃去上清，将获得的细胞用含20%FBS的DMEM/F12(1:1)培养基重悬后接种于培养瓶中。首次换液时间为培养的 4-5d，可去除大部分未贴壁细胞及残留的红细胞，并观察细胞的形态。期间 2-3d换液 1次，待细胞融合达到80%左右时，按1-1： 2 比例进行传代。
按照现有技术的方法对hEMSCs 进行传代、纯化、冻存及复苏。
复苏后上流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原阳性率，鉴定确认为hEMSCs。
实施例2
诱导培养
诱导培养步骤如下：
（1）选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
（2）使用成软骨诱导液进行诱导培养10d，成软骨诱导液配方：DMEM 低糖培养基+10%FBS+10µg/m L (2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷+50µg/m L 抗坏血酸。
诱导培养 2d 后观察，细胞开始出现聚团现象，诱导8d 后，阿利新蓝染色显示：细胞呈蓝色，表明诱导后大量的糖胺聚糖被分泌在细胞基质中。参见图1和图2.
实施例3
诱导培养
诱导培养步骤如下：
（1）选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
（2）使用成软骨诱导液进行诱导培养10d，，成软骨诱导液配方： DMEM 低糖培养基+10%FBS+15µg/m L (2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷+50µg/m L 抗坏血酸。。
诱导培养 2d 后观察，细胞开始出现聚团现象，诱导8d 后，阿利新蓝染色显示：细胞呈蓝色，表明诱导后大量的糖胺聚糖被分泌在细胞基质中。
实施例4
诱导培养
诱导培养步骤如下：
（1）选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
（2）使用成软骨诱导液进行诱导培养10d，成软骨诱导液配方：DMEM 低糖培养基+10%FBS+20µg/m L (2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷+50µg/m L 抗坏血酸。
诱导培养 2d 后观察，细胞开始出现聚团现象，诱导8d 后，阿利新蓝染色显示：细胞呈蓝色，表明诱导后大量的糖胺聚糖被分泌在细胞基质中。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种子宫内膜干细胞的定向成软骨分化培养方法，其特征在于：
使用(2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷进行诱导培养，(2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷甲酯结构如下：
2.权利要求1所述的培养方法，其特征在于：
成软骨诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+10-20μg/mL(2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷+50μg/mL抗坏血酸。
3.权利要求2所述的培养方法，其特征在于步骤如下：
(1)hEMSCs的原代培养：
(2)对hEMSCs进行传代、纯化、冻存及复苏；复苏后上流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原阳性率，鉴定确认为hEMSCs。
(3)诱导培养。
4.权利要求3所述的培养方法，其特征在于：
诱导培养步骤如下：
(1)选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
(2)使用成软骨诱导液进行诱导培养6-8d，所述成软骨诱导液配方：成软骨诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+(2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷+50μg/mL抗坏血酸。
5.权利要求4所述的培养方法，其特征在于：
成软骨诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+10-20μg/mL(2Z,5E)-7-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷+50μg/mL抗坏血酸。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180092506A (ko) * | 2017-02-09 | 2018-08-20 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 및 분화시키는 방법 |
| CN109852582A (zh) * | 2017-11-30 | 2019-06-07 | 北京世纪劲得生物技术有限公司 | 一种子宫内膜干细胞的分离培养方法及其专用培养基 |
| CN109908180A (zh) * | 2018-04-04 | 2019-06-21 | 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 | 用于治疗子宫内膜损伤的子宫内膜干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂及其制备方法与给药方法 |
| CN110079496A (zh) * | 2018-01-25 | 2019-08-02 | 左凤琼 | 一种低氧培养经血来源子宫内膜干细胞的方法 |
-
2020
- 2020-03-06 CN CN202010000033.1A patent/CN111057678A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180092506A (ko) * | 2017-02-09 | 2018-08-20 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 및 분화시키는 방법 |
| CN109852582A (zh) * | 2017-11-30 | 2019-06-07 | 北京世纪劲得生物技术有限公司 | 一种子宫内膜干细胞的分离培养方法及其专用培养基 |
| CN110079496A (zh) * | 2018-01-25 | 2019-08-02 | 左凤琼 | 一种低氧培养经血来源子宫内膜干细胞的方法 |
| CN109908180A (zh) * | 2018-04-04 | 2019-06-21 | 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 | 用于治疗子宫内膜损伤的子宫内膜干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂及其制备方法与给药方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 刘娟等: "单萜苷类化合物及其药理活性研究进展 ", 《现代药物与临床》 * |
| 张倩媚等: "子宫内膜干细胞体外诱导及定性分化的研究 ", 《山西医药杂志》 * |
| 梁笃等: "关节康中药血清促进去分化软骨细胞再分化的实验研究 ", 《新中医》 * |
| 许世兵等: "经血源子宫内膜干细胞复合3D打印PLGA支架体外培养的相容性研究 ", 《浙江中医药大学学报》 * |
| 陈杨等: "不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 ", 《四川大学学报(医学版)》 * |
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