CN104877954A - 一种干细胞壁龛及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种干细胞壁龛及其制备方法与应用，属于组织工程领域。该干细胞壁龛的制备方法包括以下步骤：周围支持细胞转染自杀基因；将转染自杀基因的周围支持细胞和凝胶混悬接种在培养容器中；在诱导因素的作用下促进周围支持细胞分泌细胞外基质；待周围支持细胞分泌的细胞外基质相互连接形成三维支架后，启动自杀基因，去除周围支持细胞，得到特异性的干细胞壁龛。本发明获得的干细胞壁龛可以维持干细胞良好的干性，不存在免疫排斥反应，具有良好的生物相容性和降解性，且降解产物对人体无害。

Description

一种干细胞壁龛及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于组织工程领域，具体地说是涉及一种干细胞壁龛及其制备方法与应用。

背景技术

干细胞移植技术是通过对特定的干细胞进行筛选、增殖，再通过一定的方式移植到病变位置进行细胞治疗的方法。与器官移植相比存在的优势：①由于干细胞移植技术是利用体外培养的方式使细胞扩增到想要的数量，因此不存在数量不足的限制；②来源于自体的细胞移植后不存在免疫排斥反应，避免了术后长期使用免疫抑制药物。因此，干细胞移植技术临床应用前景巨大。

目前，干细胞治疗方式包括：血管内注射，组织内注射，细胞片法。主要以两种形式进行干细胞移植，一是以细胞悬浮液的状态移植，这种方法是直接注射一定量的干细胞悬液，但血液的循环和病变部位的炎症环境严重制约着到达病变部位的细胞数量及细胞的存活率，造成细胞的浪费。另一种是以干细胞片的形式植入体内。干细胞片能够比较好的解决掉细胞浪费的问题。然而，在利用干细胞片移植过程中需要用到干细胞的支持材料，不同的材料对干细胞的生物学功能有不同的作用。目前针对干细胞片移植技术中采用的生物材料主要包括以下研究：1.合成高分子生物材料，在普通的高分子材料中添加具有细胞亲和性的物质，例如胶原和明胶等，并进一步对其进行生物改性，使其满足细胞的生长条件，达到生物材料的基本要求。这种材料的优点是①干细胞在上面能够生长和增殖，保证了细胞在移植前的活力；②大部分用于干细胞治疗过程中的合成高分子材料都能够降解，减少了材料作为异物在体内存在的时间。但合成高分子材料还存在着一些缺点：材料降解后的产物是否对机体有影响还待进一步的实验证明，对于一些难培养的干细胞，是否能够很好的保持移植前干细胞的干性还需进一步的研究。2.利用温敏材料制备无载体细胞片。利用温敏材料制备无载体细胞片为细胞治疗提供了一个很好的方向，但应用在干细胞治疗中还是存在一定的问题。在温敏材料上培养干细胞，并不能保证干细胞的干性，例如利用温敏法培养骨髓间充质干细胞，在移植前已经分化，并不能达到干细胞治疗的效果。3.天然基质材料。目前常用的天然材料主要包括脱细胞基质材料和天然生物膜材料。与合成高分子材料相比，天然基质材料有很大的优势：成分更接近细胞周围的环境，细胞毒性更小，组织相容性更好。但目前存在的脱细胞基质在进行脱细胞处理时使得天然基质中丢失了很多成分，破坏了细胞外基质天然的结构，在进行干细胞培养过程中不能保证干细胞的微环境。目前还未出现一种细胞支架适用于各种类干细胞使得干细胞维持干性，保持未分化状态，这就给干细胞的移植带来很多的不便。寻找一种适用于各类干细胞移植的细胞支架是目前干细胞移植技术发展的关键。

作为转运干细胞的载体要能够充分模拟干细胞体内生长的微环境，保证干细胞的干性。干细胞壁龛与干细胞的生物学功能有着密切的关系。干细胞壁龛包含了干细胞周围的一切微环境(细胞外基质、细胞与细胞之间的信息交流、粘附因子等)。干细胞壁龛能使干细胞处于G0期，对干细胞起到保护作用，使干细胞与周围的分化因子分离，保持干细胞的干性。研究表明干细胞壁龛通过其不对称的结构调节干细胞的分裂增殖、分化及凋亡情况。其中细胞外基质在干细胞壁龛中发挥着重要作用。细胞外基质不仅仅对细胞的静态性质(支持、保护、连接、抗压等物理学作用)产生影响，而且在细胞的动态生长过程中产生重要的作用：1.影响细胞的存活、增殖与死亡。在正常的真核细胞中，大多数细胞必须粘附与特定的细胞外基质上才能维持细胞活性，并且不同的细胞增殖所需的细胞外基质不同。例如，上皮细胞一旦脱离细胞外基质便会凋亡，且其在层粘连蛋白上增殖加快，在纤粘连蛋白上增殖减慢；而纤粘连蛋白和层粘连蛋白对成纤维细胞增殖的影响与上皮细胞相反；2.决定细胞的形状。研究表明，不同的细胞分泌的细胞外基质成分组成不尽相同，导致介导的细胞骨架也不相同，从而使细胞在不同的细胞外基质上变现出不同的形状。例如，上皮细胞粘附于基膜上时可表现出极性，脱离基膜时多呈现球形；3.控制细胞的分化。细胞外基质中的粘附分子和整合素共同调控着干细胞对细胞外基质的粘附，进而控制干细胞的分化：在皮肤中，整合素β-1与基质中糖蛋白结合调节干细胞分化。细胞外基质中还存在着许多细胞因子，共同影响着干细胞的分化状态：在神经系统中，丝裂原样生长因子与神经干细胞的增殖和分化都有重要的作用。研究表明，由同一干细胞分裂得到的两个干细胞，两者接触的细胞外基质不同导致分化程度、分化结果不同；4.参与细胞的迁移。胞外、胞内信号分子在调节细胞骨架动力装置时会产生驱动力，肌动蛋白细胞骨架介导黏附时会产生锚定力，驱动力和锚定力之间的相互协调决定了细胞的迁移速度和方向。脑内整合素与细胞外基质蛋白Reelin相互作用促进神经细胞的迁移。以上说明细胞外基质作为干细胞壁龛的组成确实对干细胞的生物学功能有着很大的作用。

是否可利用制备的干细胞壁龛作为转运干细胞的特异性支架？干细胞干性的维持的具体机制目前还不明确，但现有研究证明干细胞的干性的维持与干细胞壁龛有着重要关系。干细胞壁龛包含了干细胞周围的一切环境，利用干细胞周围支持细胞分泌的细胞外基质制备三维支架，可以最大程度地模拟干细胞的微环境，很好地保证干细胞的特异性微环境，满足干细胞的生长条件，维持细胞干性。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种干细胞壁龛的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的干细胞壁龛。

本发明的再一目的在于提供上述干细胞壁龛的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种干细胞壁龛的制备方法，包含以下步骤：

(1)周围支持细胞转染自杀基因；

(2)将转染自杀基因的周围支持细胞和凝胶混悬接种在培养容器中；

(3)在诱导因素的作用下促进周围支持细胞分泌细胞外基质；

(4)待周围支持细胞分泌的细胞外基质相互连接形成三维支架后，启动自杀基因，去除周围支持细胞，得到特异性的干细胞壁龛。

所述的周围支持细胞是指存在于干细胞周围，可以分泌细胞外基质，对干细胞起到支持和保护及信息交流，维持干细胞生物学功能的细胞；

所述的转染的方法优选为病毒或非病毒的转染方法；

所述的病毒转染方法优选为利用逆转录病毒载体，腺病毒载体，单纯疱疹病毒载体，EB病毒载体，细小病毒载体和痘病毒载体介导的转染方法中一种或一种以上；

所述的非病毒转染方法优选为阳离子聚合物转染法，磷酸钙共沉淀转染法，人工脂质体法，DEAE(二乙氨乙基)葡聚糖介导转染法，直接注射法，电穿孔法，激光辐射法，磁性微粒法和基因枪法中的一种或一种以上；

所述的自杀基因优选为胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、大肠杆菌谷氨酸丙酮酸转氨酶基因、细胞色素P450基因、硝基还原酶基因、羧肽酶基因、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸酶基因、白喉毒素基因和FAS基因中的一种或一种以上；

所述的凝胶优选为纳米多肽凝胶、纤维蛋白胶、基质胶、胶原胶和天然生物凝胶中的至少一种；

所述的诱导因素优选包含物理因素、化学因素，也包括预先对周围支持细胞转染控制细胞外基质表达的基因中的一种或一种以上；

所述的物理因素优选包括剪切力、压力、高糖环境的一种或一种以上；

所述的化学因素优选包括维生素C、转化生长因子β(TGFβ)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(ECG)、胰岛素样生长因子(IGFl)、白介素1(IL-1)、IL-4、IL-6、IL-8、促有丝分裂蛋白激酶、3-磷脂酰肌醇激酶、灶状粘附激酶、蛋白激酶C、粘连蛋白、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和壳聚糖中的一种或一种以上；

所述的控制细胞外基质表达的基因优选包括与结构蛋白表达相关的基因、与功能蛋白表达相关的基因、与蛋白聚糖表达相关的基因的一种或一种以上；

所述的启动自杀基因的方法优选为添加无毒的或低毒的药物前体，药物前体能与周围支持细胞携带的自杀基因编码的酶类特异性作用而导致周围支持细胞凋亡；

所述的药物前体优选包括无环鸟苷、更昔洛韦、5-氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷、6-甲氧基阿糖核苷、(E)-5-(2-溴乙烯基)-2-脱氧尿苷、羧肽酶、异环磷酰胺、N-芳香基谷氨酸盐类前药、6-巯基嘌呤和阿糖胞苷中的一种或一种以上。

一种干细胞壁龛，通过上述制备方法制备得到。

所述的干细胞壁龛在组织工程领域中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)维持干细胞良好的干性：干细胞干性的维持的具体机制目前还不明确，但现有研究证明干细胞的干性的维持与干细胞壁龛有着重要关系。干细胞壁龛包含了干细胞周围的一切环境，利用干细胞的周围支持细胞分泌得到的细胞外基质制备干细胞壁龛可以最大程度地模拟干细胞的微环境，为干细胞干性的维持起到重要作用。而干细胞的干性在干细胞治疗中起到关键作用，体外维持干细胞干性的技术的申报和实施蕴含了极大的社会效应和经济效益，具有广阔的研究前景和良好的产业化预期。

(2)不存在免疫排斥反应：细胞外基质是通过自体干细胞的周围支持细胞体外促进细胞外基质的分泌得到，不存在外加物质，进行移植后对病人不会产生免疫排斥反应，手术后不需进行免疫抑制，有助于病人的恢复。

(3)具有良好的生物相容性和降解性，且降解产物对人体无害。由于本发明中的载体是采用自体细胞分泌的物质，在进行移植后，能够很好地与周围组织相融合，并通过新陈代谢降解，且讲解产物均为人体正常情况下的降解产物，不会对人体产生危害。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1用于转运大鼠心脏干细胞的支架的制备

1.周围支持细胞转染自杀基因

以大鼠的心脏成纤维细胞、Cajal样间质细胞和成熟的心肌细胞作为周围支持细胞，利用脂质体转染法，把胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase，CD)基因分别转染入大鼠心脏成纤维细胞、Cajal样间质细胞和成熟的心肌细胞中，筛选出稳定表达CD基因的大鼠心脏成纤维细胞、Cajal样间质细胞和成熟的心肌细胞，扩增后备用。

2.在培养容器底部种植培养已转染自杀基因的周围支持细胞

将1×10⁶个的带有CD基因的大鼠心脏成纤维细胞、Cajal样间质细胞和成熟的心肌细胞和200μL纳米多肽凝胶混悬接种在3cm直径侵袭小室(Transwell)的上表面。

3.在诱导因素的作用下促进周围支持细胞分泌细胞外基质

在周围支持细胞的正常培养液中加入含50μg/mL维生素C，制成促进周围支持细胞分泌细胞外基质的培养液。在步骤2中的侵袭小室中加入3mL该培养液，37℃、5％CO₂培养箱中培养，促进大鼠心脏成纤维细胞、Cajal样间质细胞和成熟的心肌细胞分泌细胞外基质，以获得足量的细胞外基质。

4.待周围支持细胞分泌的细胞外基质相互连接形成三维支架后，启动自杀基因，去除凋亡细胞，得到特异性的干细胞壁龛。

按照浓度为10～20μmol/L一次性添加针对CD自杀基因的特定的药物前体5-氟胞嘧啶3mL，作用12h。5-氟胞嘧啶与大鼠心脏成纤维细胞、Cajal样间质细胞和成熟的心肌细胞中的CD自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的5-氟胞嘧啶代谢为5-氟尿嘧啶，产生细胞毒性，诱导位于底部的大鼠心脏成纤维细胞、Cajal样间质细胞和成熟的心肌细胞凋亡。去除培养液，再加入3mL PBS进行清洗，去除凋亡的细胞，获得细胞外基质和纳米多肽凝胶的混合物，即特异性的干细胞壁龛。

5.将等量的目的干细胞接种在铺有细胞外基质的培养皿和普通皿中，对比两种方法干细胞的未分化率

利用组织块贴壁法分离得到3周龄大鼠心脏干细胞原代，培养5天后利用流式细胞仪分选出Sca-1，c-Kit阳性的心脏干细胞。在显微镜的观察下用显微注射的方法将心脏干细胞一粒一粒地种植在大鼠心脏成纤维细胞、Cajal样间质细胞和成熟的心肌细胞分泌的细胞外基质三维支架中，并设置对照组：将等量的心脏干细胞直接接种在普通培养皿中培养。

一周后，取上述培养的两组细胞，用胰酶消化后制备成单细胞悬液。用PBS洗2次后计数，取5×10⁵个细胞重悬于100μL PBS中，避光条件下加入Sca-1，c-Kit抗体和同型对照，4℃避光孵育30min，PBS洗1次，用500μL PBS重悬，流式细胞仪检测分析。结果显示，实验组中心脏干细胞标记物Sca-1和c-Kit的表达比对照组分别高30％和25％。

实施例2用于转运大鼠骨髓造血干细胞的支架的制备

1.周围支持细胞转染控制细胞外基质表达的基因

以大鼠的成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞和成骨细胞作为周围支持细胞，采用磷酸钙共沉淀转染法将碱性成纤维细胞生长因子基因分别转染到大鼠的成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞和成骨细胞中。分别筛选出高表达碱性成纤维细胞生长因子的大鼠的成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞和成骨细胞，扩增后备用。

2.周围支持细胞转染自杀基因

采用人工脂质体转染法，把胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(TK基因)分别转染入步骤1中扩增得到的大鼠成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞和成骨细胞中。筛选稳定表达TK基因的大鼠成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞和成骨细胞，扩增后备用。

3.在培养容器底部种植培养已转染自杀基因的周围支持细胞

将5×10⁶个带有TK基因的大鼠成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、成骨细胞和800μL纳米多肽凝胶混悬接种在10cm直径培养皿表面。

4.待周围支持细胞分泌的细胞外基质相互连接形成三维支架后，启动自杀基因，去除凋亡细胞，得到特异性的干细胞壁龛。

待周围支持细胞分泌的细胞外基质相互连接形成三维支架后，按照20μmol/L浓度分两次添加针对TK自杀基因的特定的药物前体更昔洛韦，每次添加8～10mL，作用24h。更昔洛韦与TK自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的更昔洛韦代谢为三磷酸化产物GCT-TP，产生细胞毒性，诱导位于底部的周围支持细胞凋亡，获得细胞外基质和纳米多肽凝胶的混合物，即特异性的干细胞壁龛。

5.将等量的目的干细胞接种在铺有细胞外基质的培养皿和普通皿中，对比两种方法干细胞的未分化率

利用密度梯度离心法分离得到大鼠骨髓造血干细胞，用Lineage和Sca-1磁珠分选得到Lin^-、Sca-1⁺的骨髓造血干细胞。在显微镜的观察下用显微注射的方法将10⁶个的骨髓造血干细胞一粒一粒地种植在周围支持细胞产生的细胞外基质三维支架中进行培养，并设置对照组：将等量的骨髓造血干细胞直接接种在普通培养皿中培养。

五天后，取上述培养的两组细胞，用胰酶消化后制备成单细胞悬液。用PBS洗2次后计数，取5×10⁵个细胞重悬于100μL PBS中，避光条件下加入Sca-1、Lineage抗体和同型对照，4℃避光孵育30min，PBS洗1次，用500μL PBS重悬，流式细胞仪检测分析。结果显示，实验组中表达骨髓造血干细胞标记物Sca-1和Lineage的细胞百分率比对照组分别高30.5％和40％左右。

实施例3用于转运小鼠小肠干细胞的支架的制备

1.周围支持细胞转染自杀基因

以小鼠的肠内分泌细胞、潘氏细胞、杯状细胞和吸附绒毛细胞作为周围支持细胞，采用磷酸钙共沉淀法，把细胞色素P450基因分别转染到小鼠的肠内分泌细胞、潘氏细胞、杯状细胞和吸附绒毛细胞中。筛选稳定表达细胞色素P450基因的小鼠的肠内分泌细胞、潘氏细胞、杯状细胞和吸附绒毛细胞，扩增后备用。

2.在培养容器底部种植培养已转染自杀基因的周围支持细胞

将1×10⁶个的带有细胞色素P450基因的小鼠的肠内分泌细胞、潘氏细胞、杯状细胞、吸附绒毛细胞和200μL纳米多肽凝胶混悬接种在3cm直径侵袭小室(Transwell)的上表面。

3.在诱导因素的作用下促进周围支持细胞分泌细胞外基质

在周围支持细胞的正常培养液中加入100μg/mL结缔组织生长因子(CTGF)，制成促进周围支持细胞分泌细胞外基质的培养液。在步骤2中的侵袭小室中加入3mL该培养液，37℃、5％CO2培养箱中培养，促进小鼠的肠内分泌细胞、潘氏细胞、杯状细胞、吸附绒毛细胞分泌细胞外基质，以获得足量的细胞外基质。

4.待周围支持细胞分泌的细胞外基质相互连接形成三维支架后，启动自杀基因，去除凋亡细胞，得到特异性的干细胞壁龛。

按照5～20μg/mL的浓度一次性添加针对细胞色素P450自杀基因的特定的药物前体环磷酰胺3～5mL，作用10h。环磷酰胺与小鼠的肠内分泌细胞、潘氏细胞、杯状细胞和吸附绒毛细胞中的自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的环磷酰胺代谢为有细胞毒性的4-OHCPA(4-羟基环磷酰胺)，诱导位于底部的周围支持细胞凋亡，获得细胞外基质和纳米多肽凝胶的混合物，即特异性的干细胞壁龛。

5.将等量的目的干细胞接种在铺有细胞外基质的培养皿和普通皿中，对比两种方法干细胞的未分化率

利用组织块消化法分离得到小鼠小肠干细胞原代，利用流式细胞仪分选出Bmi1^-、Hopx^-和Lgr5表型的小肠干细胞，在显微镜的观察下用显微注射的方法将小鼠小肠干细胞一粒一粒地种植在小鼠的肠内分泌细胞、潘氏细胞、杯状细胞和吸附绒毛细胞产生细胞外基质三维支架中进行培养，并设置对照组：将等量的小鼠小肠干细胞直接接种在普通培养皿中培养。

一周后，取上述培养的两组细胞，用胰酶消化后制备成单细胞悬液。用PBS洗2次后计数，取5×10⁵个细胞重悬于100μL PBS中，避光条件下加入Bmi1、Hopx和Lgr5抗体和同型对照，4℃避光孵育30min，PBS洗1次，用500μLPBS重悬，流式细胞仪检测分析。结果显示，实验组中表达小肠干细胞标记物Bmi1^-、Hopx^-和Lgr5的细胞百分率为55.13％+2.10％，47.66％+1.61％，60.27％+1.43％；而对照组中表达小肠干细胞标记物Bmi1^-、Hopx^-和Lgr5的细胞百分率为25.26％+0.18％，19.31％+1.01％，20.53％+0.84％，实验组明显比对照组的未分化率高。

实施例4用于转运人表皮干细胞的支架的制备

1.周围支持细胞转染自杀基因

以人的毛囊基底层细胞和表皮细胞作为周围支持细胞。人的毛囊基底层细胞转染自杀基因：采用腺病毒转染的方法将胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase，CD)基因导入人的毛囊基底层细胞中；人的表皮细胞转染自杀基因：利用磷酸钙共沉淀的方法将细胞色素P450基因导入人的表皮细胞。筛选稳定表达CD基因的人毛囊基底层细胞和稳定表达细胞色素P450基因的人表皮细胞，扩增后备用。

2.在培养容器底部种植培养已转染自杀基因的周围支持细胞

将3×10⁶个的带有CD基因的人毛囊基底层细胞和带有细胞色素P450基因的人表皮细胞与400μL纳米多肽凝胶混悬接种在6cm直径培养皿上。

3.在诱导因素的作用下促进周围支持细胞分泌细胞外基质

在周围支持细胞的正常培养液中加入含50μg/mL维生素C，制成促进周围支持细胞分泌细胞外基质的培养液。在步骤2中的培养皿中加入8mL该培养液，37℃、5％CO₂培养箱中培养，促进人毛囊基底层细胞和表皮细胞分泌细胞外基质，以获得足量的细胞外基质。

4.待周围支持细胞分泌的细胞外基质相互连接形成三维支架后，启动自杀基因，去除凋亡细胞，得到特异性的干细胞壁龛。

一次性添加浓度为20μmol/L的针对CD自杀基因的特定的药物前体5-氟胞嘧啶5mL和浓度为5～50μmol/L的针对细胞色素P450基因的特定的药物前体环磷酰胺5mL，静置作用12小时。5-氟胞嘧啶能与该人毛囊基底层细胞中的CD自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的5-氟胞嘧啶代谢为5-氟尿嘧啶，产生细胞毒性，最终导致人的毛囊基底层细胞全部凋亡；环磷酰胺与人表皮细胞中的自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的环磷酰胺代谢为有细胞毒性的4-OHCPA，诱导位于底部的表皮细胞凋亡，获得细胞外基质和纳米多肽凝胶的混合物，即特异性的干细胞壁龛。

5.将等量的目的干细胞接种在铺有细胞外基质的培养皿和普通皿中，对比两种方法干细胞的未分化率

利用0.25％胰蛋白酶对无菌条件下取的幼儿包皮环切术后的包皮消化4～6h，揭下表皮，经0.05％胰蛋白酶于37℃下消化20min后终止消化，再经过离心和重悬制备人表皮干细胞原代，培养3天后，用流式细胞仪分选出CK19和P63阳性的人表皮干细胞。在显微镜的观察下用显微注射的方法将4×10⁴个人表皮干细胞一粒一粒地种植在人毛囊基底层细胞和表皮细胞分泌的细胞外基质三维支架中进行培养，并设置对照组：将等量的人表皮干细胞直接接种在普通培养皿中培养。

一周后，取上述培养的两组细胞，用胰酶消化后制备成单细胞悬液。用PBS洗2次后计数，取5×10⁵个细胞重悬于100μL PBS中，避光条件下加入CK19、P63抗体和同型对照，4℃避光孵育30min，PBS洗1次，用500μL PBS重悬，流式细胞仪检测分析。结果显示，实验组中表达表皮干细胞标记物CK19和P63的细胞百分率为50.21％+5.12％，对照组中表达表皮干细胞CK19和P63的细胞百分率为2.10％+0.14％，实验组比对照组人表皮干细胞分为分化率提高45％以上。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种干细胞壁龛的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)周围支持细胞转染自杀基因；

(2)将转染自杀基因的周围支持细胞和凝胶混悬接种在培养容器中；

(3)在诱导因素的作用下促进周围支持细胞分泌细胞外基质；

(4)待周围支持细胞分泌的细胞外基质相互连接形成三维支架后，启动自杀基因，去除周围支持细胞，得到特异性的干细胞壁龛。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述的周围支持细胞是指存在于干细胞周围，分泌细胞外基质，对干细胞起到支持和保护及信息交流，维持干细胞生物学功能的细胞；

所述的转染的方法为病毒或非病毒的转染方法。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

所述的病毒转染方法为利用逆转录病毒载体，腺病毒载体，单纯疱疹病毒载体，EB病毒载体，细小病毒载体和痘病毒载体介导的转染方法中一种或一种以上；

所述的非病毒转染方法为阳离子聚合物转染法，磷酸钙共沉淀转染法，人工脂质体法，DEAE葡聚糖介导转染法，直接注射法，电穿孔法，激光辐射法，磁性微粒法和基因枪法中的一种或一种以上。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述的自杀基因为胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、大肠杆菌谷氨酸丙酮酸转氨酶基因、细胞色素P450基因、硝基还原酶基因、羧肽酶基因、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸酶基因、白喉毒素基因和FAS基因中的一种或一种以上；

所述的凝胶为纳米多肽凝胶、纤维蛋白胶、基质胶、胶原胶和天然生物凝胶中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述的诱导因素包含物理因素、化学因素，也包括预先对周围支持细胞转染控制细胞外基质表达的基因中的一种或一种以上。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：

所述的物理因素包括剪切力、压力、高糖环境的一种或一种以上；

所述的化学因素包括维生素C、转化生长因子β、血小板衍生生长因子表皮生长因子、胰岛素样生长因子、IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、促有丝分裂蛋白激酶、3-磷脂酰肌醇激酶、灶状粘附激酶、蛋白激酶C、粘连蛋白、结缔组织生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和壳聚糖中的一种或一种以上；

所述的控制细胞外基质表达的基因包括与结构蛋白表达相关的基因、与功能蛋白表达相关的基因、与蛋白聚糖表达相关的基因的一种或一种以上。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述的启动自杀基因的方法为添加无毒的或低毒的药物前体与周围支持细胞携带的自杀基因编码的酶类特异性作用而导致周围支持细胞凋亡。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述的药物前体包括无环鸟苷、更昔洛韦、5-氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷、6-甲氧基阿糖核苷、(E)-5-(2-溴乙烯基)-2-脱氧尿苷、羧肽酶、异环磷酰胺、N-芳香基谷氨酸盐类前药、6-巯基嘌呤和阿糖胞苷中的一种或一种以上。

9.一种干细胞壁龛，通过权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到。

10.权利要求9所述的干细胞壁龛在组织工程领域中的应用。