CN110168067A - 细胞培养装置及细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种细胞培养装置，本发明的细胞培养装置具有：细胞供给部，供给细胞；培养基供给部，供给培养基；添加剂供给部，供给用于将未分化细胞进行分化诱导的添加剂；搅拌部，搅拌处理对象物；分离部，分离包含在处理对象物中的成分；及培养容器，培养细胞，并且包括：第1流路，形成经过细胞供给部、搅拌部、分离部及培养容器的循环路径；第2流路，连接培养基供给部和第1流路；第3流路，连接添加剂供给部和第1流路；及控制部，控制经由第1流路、第2流路及第3流路的液体输送。

Description

细胞培养装置及细胞培养方法
技术领域
所公开的技术涉及一种细胞培养装置及细胞培养方法。
背景技术
作为与实施关于细胞培养的处理的细胞培养装置有关的技术，例如已知有以下技术。
例如在日本特开2015-100309号公报中记载有一种细胞管理系统，其具备：自动培养系统，具有自动地培养细胞的自动培养装置和管理与被培养的细胞的状态有关的信息的细胞管理部；存储部，存储通过自动培养装置而被培养的细胞的状态；及外部计算机，设置在订购者处。
国际公开第2013/187359号中记载有一种细胞培养装置，其具备：圆筒形状的培养槽；支柱，从培养槽的底部的内表面的中央直立；及搅拌叶片，其上部被固定在能够旋转地安装于支柱的上部分的安装部，并以支柱作为旋转中心进行旋转。
日本特表2016-529897号公报中记载有一种使用机器人液体处理系统用于培养干细胞的自动化方法，所述机器人液体处理系统包括能够并进的板及可移动多通道移液管。
发明内容
发明要解决的技术课题
在将胚胎干细胞(Embryonic Stem cell；ES细胞)、人工多能干细胞(inducedPluripotent Stem cell；iPS细胞)等多能干细胞应用于再生医疗用途或药物开发支援用途的情况下，需要进行由多能干细胞来制作所希望的细胞的分化诱导。作为分化诱导的方法，可以举出对多能干细胞赋予化学刺激或物理刺激的方法。并且，在活体内，分化细胞从被称作外胚层、中胚层、内胚层的三个胚层中的任一个中生成。针对这一点，在从多能干细胞得到分化细胞的情况下，作为第一阶段，进行对胚层的分化诱导。
关于通过在封闭系统中连续地实施如上所述的分化诱导中所需要的一系列的处理而能够生产大量的分化细胞的细胞培养装置，至今还没有所提出的例子，而且难以增大分化细胞的培养规模。并且，在人手介入的培养方法中，生物学污染的风险提高，并且通过培养而得到的细胞的均质性可能会降低。
所公开的技术是鉴于上述问题点而完成的，其目的在于设为在封闭系统中能够连续地实施多能干细胞的分化诱导中所需要的一系列的处理。
用于解决技术课题的手段
所公开的技术所涉及的细胞培养装置具有：细胞供给部，供给细胞；培养基供给部，供给培养基；添加剂供给部，供给用于将未分化细胞进行分化诱导的添加剂；搅拌部，搅拌处理对象物；分离部，分离包含在处理对象物中的成分；及培养容器，培养细胞，并且包括：第1流路，形成经过上述细胞供给部、上述搅拌部、上述分离部及上述培养容器的循环路径；第2流路，连接上述培养基供给部和上述第1流路；第3流路，连接上述添加剂供给部和上述第1流路；及控制部，控制经由上述第1流路、上述第2流路及上述第3流路的液体输送。
上述分离部可以具有以下滤膜中的至少一个：第1滤膜，将所述未分化细胞和死细胞进行膜分离；第2滤膜，将所述未分化细胞分化为分化细胞之前的中间体和所述未分化细胞进行膜分离；及第3滤膜，将所述中间体和所述分化细胞进行膜分离。
上述分离部可以具有包括上述第1滤膜、上述第2滤膜及上述第3滤膜中的至少两个的多个滤膜，该情况下，上述控制部可以进行如下控制：使包含上述细胞的细胞悬浮液选择性地通过上述多个滤膜的任一个。
在上述第1滤膜、上述第2滤膜及上述第3滤膜的各膜面上设置的开口的尺寸可以彼此不同。
上述控制部优选进行如下控制：在进行了用于对上述添加剂与所述培养基的混合物施加剪切应力的液体输送之后，使包含上述细胞的细胞悬浮液和上述混合物合流并转移到上述搅拌部。
细胞培养装置还可以包括储存容器，该储存容器设置在上述第1流路的中途的、上述细胞供给部与上述搅拌部之间。该情况下，上述控制部可以进行如下控制：在通过使上述混合物在上述储存容器与上述搅拌部之间进行循环而对上述混合物施加剪切应力之后，使上述细胞悬浮液和上述混合物在上述储存容器内合流并转移到上述搅拌部。并且，上述控制部可以进行如下控制：在通过使上述混合物在配管中流过而对上述混合物施加剪切应力之后，使上述细胞悬浮液和上述混合物在上述储存容器内合流并转移到上述搅拌部。
上述控制部可以连续地进行用于对上述混合物施加剪切应力的液体输送，直至上述混合物的粘度成为规定的粘度。
上述添加剂供给部可以包括：第1添加剂供给部，供给包含Wnt信号活化剂的第1添加剂；及第2添加剂供给部，供给包含Wnt信号抑制剂的第2添加剂。
细胞培养装置还可以包括：培养箱，容纳上述培养容器，并将上述培养容器的周围温度保持为恒定；及温度梯度减缓机构，减缓根据上述培养箱的内部与外部的温度差沿上述第1流路生成的温度梯度。
所公开的技术所涉及的细胞培养方法使用上述细胞培养装置来培养细胞，其中，上述控制部进行如下控制：通过上述搅拌部及上述分离部将混合物转移到上述培养容器，上述混合物包含：从上述培养基供给部供给的上述细胞；从上述添加剂供给部供给的上述添加剂；及从上述培养基供给部供给的上述培养基。
发明效果
根据所公开的技术，能够在封闭系统中连续地实施在多能干细胞的分化诱导中需要的一系列的处理。
附图说明
图1是表示所公开的技术的实施方式所涉及的细胞培养装置的结构的框图。
图2是表示在所公开的技术的实施方式所涉及的细胞培养装置中实施的、用于多能干细胞的分化诱导的处理的流程的一例的流程图。
图3是表示在进行添加所公开的技术的实施方式所涉及的第1添加剂的处理的情况下的细胞培养装置的动作的图。
图4是表示在进行所公开的技术的实施方式所涉及的培养基更换处理的情况下的细胞培养装置的动作的图。
图5是表示在重新添加所公开的技术的实施方式所涉及的第1添加剂的情况下的细胞培养装置的动作的图。
图6是表示在进行所公开的技术的实施方式所涉及的培养基更换处理的情况下的细胞培养装置的动作的图。
图7是表示在添加所公开的技术的实施方式所涉及的第2添加剂的情况下的细胞培养装置的动作的图。
图8是表示在进行所公开的技术的实施方式所涉及的培养基更换处理的情况下的细胞培养装置的动作的图。
图9是表示在重新添加所公开的技术的实施方式所涉及的第2添加剂的情况下的细胞培养装置的动作的图。
图10是表示在进行所公开的技术的实施方式所涉及的培养基更换处理的情况下的细胞培养装置的动作的图。
图11是表示所公开的技术的其他实施方式所涉及的细胞培养装置的结构的框图。
图12是表示所公开的技术的其他实施方式所涉及的细胞培养装置的局部结构的图。
图13是表示所公开的技术的其他实施方式所涉及的细胞培养装置的结构的框图。
具体实施方式
以下，参考附图对所公开的技术的实施方式的一例进行说明。另外，各附图中对相同或等同的构成要件及部分标注相同的参照符号。
[第1实施方式]
图1是表示所公开的技术的实施方式所涉及的细胞培养装置100的结构的一例的框图。细胞培养装置100是自动地进行为了将多能干细胞分化诱导为分化细胞而需要的多个处理，并生产所希望的分化细胞的细胞培养装置。
多能干细胞是具有自复制能力和在外胚层、中胚层及内胚层中的任一个中也能够进行分化的多分化能力的细胞。作为多能干细胞，可以举出胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎生殖细胞(Embryonic Germ cell；EG细胞)、胚胎癌细胞(EmbryonalCarcinoma cell；EC细胞)、多能成体祖细胞(Multipotent Adult Progenitor cell；MAP细胞)、成体多能干细胞(Adult Pluripotent Stem cell；APS细胞)、Muse细胞(Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell：多系分化持续应激细胞)等。分化细胞是多能干细胞进行分化并具有特定的形式及功能的细胞。作为使用本实施方式所涉及的细胞培养装置100而生产的分化细胞，并无特别的限定，例如可举出心肌细胞、神经细胞等。
细胞培养装置100具备细胞供给部11、第1添加剂供给部12、第2添加剂供给部13及培养基供给部14。并且，细胞培养装置100具备储存容器20、搅拌部30、粘度测定部41、42、分离部50、培养容器70及控制部80。
细胞供给部11将细胞悬浮液供给到细胞培养装置100的流路内，所述细胞悬浮液包含在细胞培养装置100中培养的细胞。在细胞供给部11的流出口的附近设置有开闭阀V1。在从细胞供给部11供给细胞悬浮液的情况下，开闭阀V1被控制成开启状态，在除此以外的情况下，被控制成关闭状态。
第1添加剂供给部12将多能干细胞的分化诱导中所需要的、包含Wnt信号活化剂的第1添加剂供给到细胞培养装置100的流路内。在第1添加剂供给部12的流出口的附近设置有开闭阀V2。在从第1添加剂供给部12供给第1添加剂的情况下，开闭阀V2被控制成开启状态，在除此以外的情况下，被控制成关闭状态。
第2添加剂供给部13将多能干细胞的分化诱导中所需要的、包含Wnt信号抑制剂的第2添加剂供给到细胞培养装置100的流路内。在第2添加剂供给部13的流出口的附近设置有开闭阀V3。在从第2添加剂供给部13供给第2添加剂的情况下，开闭阀V3被控制成开启状态，在除此以外的情况下，被控制成关闭状态。
培养基供给部14将在细胞培养中使用的新鲜的培养基(培养液)供给到细胞培养装置100的流路内。在培养基供给部14的流出口的附近设置有开闭阀V4。在从培养基供给部14供给培养基的情况下，开闭阀V4被控制成开启状态，在除此以外的情况下，被控制成关闭状态。
储存容器20是用于临时储存从细胞供给部11供给的细胞悬浮液、从第1添加剂供给部12供给的第1添加剂、从第2添加剂供给部13供给的第2添加剂及从培养基供给部14供给的培养基的容器。储存容器20的方式并无特别的限定，例如能够使用玻璃制或不锈钢制的容器、塑料制的具有袋子样式的容器。
搅拌部30是进行如下处理的处理部，即，搅拌及混合经由流路F2流入的处理对象物。搅拌部30优选具有作为不具有驱动部的静态混合器的结构，例如可以包括管状体和搅拌元件而构成，该搅拌元件固定设置于管状体的内部，并在管状体的内部形成螺旋状的流路。另外，搅拌部30可以通过旋转驱动搅拌叶片而进行搅拌及混合。
分离部50是进行如下处理的处理部，即，分离经由流路F3流入的处理对象物(细胞悬浮液)中所包含的成分。分离部50包括第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53而构成。第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53分别具备在细胞悬浮液所通过的膜面形成的开口的尺寸彼此不同的滤膜。即，第1过滤器部51具备的滤膜的开口尺寸最小，第3过滤器部53具备的滤膜的开口尺寸最大。第2过滤器部52所具备的滤膜的开口尺寸大于第1过滤器部51具备的滤膜的开口尺寸，而且小于第3过滤器部53具备的滤膜的开口尺寸。第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53分别对经由流路F3流入的处理对象物(细胞悬浮液)进行基于滤膜的膜分离处理。
第1过滤器部51在多能干细胞开始分化之前的培养的初始阶段被使用。第1过滤器部51具有适合于将存活的未分化细胞和死细胞进行膜分离的开口尺寸的滤膜。在多能干细胞中，存活的未分化细胞形成多个细胞的凝聚体即细胞块，死细胞从细胞块脱离而成为单一细胞。从而，通过膜分离处理而能够分离存活的未分化细胞和死细胞。第1过滤器部51从包含存活的未分化细胞(细胞块)和死细胞的细胞悬浮液中去除死细胞，以残留未分化细胞的目的而被使用。
第2过滤器部52在多能干细胞分化成中间体(外胚层、中胚层、内胚层)的阶段被使用，所述中间体是所述多能干细胞分化为心肌细胞等分化细胞之前的中间体。第2过滤器部52具有适合于将未分化为中间体的未分化细胞和中间体进行膜分离的开口尺寸的滤膜。中间体的尺寸大于未分化细胞的尺寸，因此能够通过膜分离处理而分离未分化细胞和中间体。第2过滤器部52从包含未分化细胞和中间体的细胞悬浮液中去除未分化细胞，以残留中间体的目的而被使用。
第3过滤器部53在多能干细胞分化成心肌细胞等分化细胞的阶段被使用。第3过滤器部53具有适合于将未转移到分化细胞的中间体和分化细胞进行膜分离的开口尺寸的滤膜。心肌细胞等分化细胞的尺寸大于外胚层、中胚层、内胚层等中间体的尺寸，因此能够通过膜分离处理而分离分化细胞和中间体。第3过滤器部53从包含分化细胞和中间体的细胞悬浮液中去除中间体，以残留分化细胞的目的而被使用。
第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53分别可以具有处理对象物(细胞悬浮液)沿滤膜的膜面流动的切向流过滤器的结构。并且，第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53分别可以具有处理对象物(细胞悬浮液)的流动方向相对于滤膜的膜面成为交差的方向的死端过滤器(dead-end flow filter)的结构。
在第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53上分别连接有回收容器61、62及63。在第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53中，透过滤膜的滤液分别回收到回收容器61、62及63。
在本实施方式所涉及的细胞培养装置100中，第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53在培养期间中的规定的时刻被选择性地使用。即，经由流路F3流入到分离部50的处理对象物(细胞悬浮液)通过第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53中的任一个过滤器部的滤膜。
在第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53的流入口的附近分别设置有开闭阀V8、V9及V10。在通过第1过滤器部51进行膜分离处理的情况下，开闭阀V8被控制成开启状态，在除此以外的情况下，被控制成关闭状态。在通过第2过滤器部52进行膜分离处理的情况下，开闭阀V9被控制成开启状态，在除此以外的情况下，被控制成关闭状态。在通过第3过滤器部53进行膜分离处理的情况下，开闭阀V10被控制成开启状态，在除此以外的情况下，被控制成关闭状态。
在此，将用于分化诱导的细胞培养中所生成的死细胞(单细胞)(～20μm)、未分化细胞的一例即iPS细胞的凝聚体(50～150μm)、中间体的一例即中胚层的凝聚体(500～600μm)及分化细胞的一例即心肌细胞的凝聚体(200～300μm)，在第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53中进行膜分离的情况下的各过滤器部的滤膜的优选的开口尺寸及膜分离后的转移目的地，在下述表1中例示出。
[表1]
另外，第1过滤器部51的滤膜的更优选的开口尺寸为30μm，第2过滤器部52的滤膜的更优选的开口尺寸为170μm，第3过滤器部53的滤膜的更优选的开口尺寸为400μm。
培养容器70为用于培养细胞的容器。培养容器70的方式并无特别的限定，例如能够使用玻璃制或不锈钢制的容器或塑料制的具有袋子样式的容器。培养容器70例如被控制成温度为30℃～40℃(优选37℃)且CO2浓度为2％～10％(优选5％)，而且容纳于被封闭的培养箱71内。
粘度测定部41测定容纳于细胞供给部11中的细胞悬浮液的粘度，并将测定结果通知到控制部80。同样地，粘度测定部42测定容纳于储存容器20中的液体的粘度，并将测定结果通知到控制部80。
本实施方式所涉及的细胞培养装置100具有循环流路F0，该循环流路F0形成依次经过细胞供给部11、储存容器20、搅拌部30、分离部50及培养容器70的循环路径。循环流路F0包括流路F1、F2、F3、F4及F5而构成。流路F1是连接细胞供给部11的流出口与储存容器20的流入口的流路。流路F2是连接储存容器20的流出口与搅拌部30的流入口的流路。流路F3是连接搅拌部30的流出口与分离部50的流入口的流路。流路F4是连接分离部50的流出口与培养容器70的流入口的流路。流路F5是连接培养容器70的流出口与细胞供给部11的流入口的流路。另外，循环流路F0是所公开的技术中的第1流路的一例。
第1添加剂供给部12经由流路F11连接于循环流路F0(流路F1)，第2添加剂供给部13经由流路F12连接于循环流路F0(流路F1)。培养基供给部14经由流路F13连接于循环流路F0(流路F1)。另外，流路F13是所公开的技术中的第2流路的一例。流路F11及F12是所公开的技术中的第3流路的一例。
在储存容器20与搅拌部30之间设置的流路F2上设置有开闭阀V5及V6。在从储存容器20朝向搅拌部30进行液体输送的情况下，开闭阀V5及V6分别被控制成开启状态，在除此以外的情况下，被控制成关闭状态。
并且，在搅拌部30与分离部50之间设置的流路F3上设置有开闭阀V7。在从搅拌部30朝向分离部50进行液体输送的情况下，开闭阀V7被控制成开启状态，在除此以外的情况下，被控制成关闭状态。
细胞培养装置100是直接连结搅拌部30的流出口与储存容器20的流入口的流路F20。即，流路F20的一端连接于流路F1，流路F20的另一端连接于流路F3。在流路F20上设置有开闭阀V13及V14。在从搅拌部30朝向储存容器20进行液体输送的情况下，开闭阀V13及V14被控制成开启状态，在除此以外的情况下，被控制成关闭状态。
细胞培养装置100具备多个泵(未图示)，该多个泵进行经由流路F1～F5、F11～F12及F20的液体输送。另外，可以调整细胞供给部11、第1添加剂供给部12、第2添加剂供给部13、培养基供给部14、储存容器20、搅拌部30、分离部50、培养容器70各自的内部压力，由此进行这些各要件之间的液体输送。
控制部80进行开闭阀V1～V14的开闭控制及泵(未图示)的驱动控制，由此进行经由流路F1～F5、F11～F12及F20的液体输送的控制。
在本实施方式所涉及的细胞培养装置100中实施的用于多能干细胞的分化诱导的处理包括：第1工序，在包含Wnt信号活化剂的培养基中培养多能干细胞；及第2工序，在包含Wnt信号抑制剂的培养基中培养在第1工序中得到的细胞。另外，包括上述第1工序及第2工序的分化诱导方法的详细内容，例如记载于国际公开第2013/111875号中。
图2是表示在细胞培养装置100中实施的、用于多能干细胞的分化诱导的处理的流程的一例的流程图。
在步骤S1中，在添加了包含Wnt信号活化剂的第1添加剂的培养基中培养细胞。
在添加了第1添加剂的培养基中的培养开始后经过规定时间之后，在步骤S2中进行培养基更换。另外，将开始培养之后首先进行的培养基更换处理设为培养基更换[1]。从开始培养到完成培养基更换[1]为止的期间，例如为0.5天～2天左右。
在步骤S3中，将包含Wnt信号活化剂的第1添加剂重新添加到培养基中。
在重新添加第1添加剂后经过规定时间之后，在步骤S4中进行培养基更换。另外，将重新添加第1添加剂后进行的培养基更换处理设为培养基更换[2]。
在步骤S5中，判定将包括第1添加剂的重新添加及培养基更换[2]的一系列的处理设为1个单位的处理循环的循环次数是否达到规定的循环次数。直至处理循环次数达到规定的循环次数为止，反复进行包括第1添加剂的重新添加及培养基更换[2]的一系列的处理。包括第1添加剂的重新添加及培养基更换[2]的一系列的处理的1个循环期间，例如为1天～5天左右。
在步骤S6中，在添加了包含Wnt信号抑制剂的第2添加剂的培养基中培养细胞。
在添加第2添加剂后经过规定时间之后，在步骤S7中进行培养基更换。另外，将添加第2添加剂后首先进行的培养基更换处理设为培养基更换[3]。从添加第2添加剂到完成培养基更换[2]为止的期间，例如为0.5天～2天左右。
在步骤S8中，将包含Wnt信号抑制剂的第2添加剂重新添加到培养基中。
在重新添加第2添加剂后经过规定时间之后，在步骤S9中进行培养基更换。另外，将重新添加第2添加剂后进行的培养基更换处理设为培养基更换[4]。
在步骤S10中，判定将包括第2添加剂的重新添加及培养基更换[4]的一系列的处理设为1个单位的处理循环的循环次数是否达到规定的循环次数。直至处理循环次数达到规定的循环次数为止，反复进行包括第2添加剂的重新添加及培养基更换[4]的一系列的处理。包括第2添加剂的重新添加及培养基更换[4]的一系列的处理的1个循环期间，例如为1天～5天左右。
以下，对与上述各步骤对应的细胞培养装置100的动作进行说明。另外，从避免说明的复杂性的观点考虑，以下说明中，关于开闭阀V1～V14的开闭控制，仅提及关于将这些开闭阀V1～V14控制成开启状态的情况。设为将开闭阀V1～V14控制成开启状态之后，适当地控制成关闭状态。
＜第1添加剂的添加＞
图3是表示在图2所示的步骤S1中实施的处理，即，进行添加第1添加剂的处理的情况下的细胞培养装置100的动作的图。图3中示出处理对象物(细胞悬浮液、培养基、添加剂及它们的混合物)对各处理部的供给顺序。另外，在细胞供给部11中包含使用细胞培养装置100进行分化诱导的多能干细胞的细胞悬浮液。并且，容纳在细胞供给部11中的细胞悬浮液的粘度通过粘度测定部41而被测定，测定结果通知到控制部80。
在步骤A1中，控制部80将开闭阀V2及V4控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含Wnt信号活化剂的第1添加剂从第1添加剂供给部12供给到储存容器20的同时，新鲜的培养基从培养基供给部14供给到储存容器20。由此包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物容纳于储存容器20中。容纳于储存容器20中的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度通过粘度测定部42而被测定，测定结果通知到控制部80。
在此，预计容纳在储存容器20中的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度高于容纳在细胞供给部11中的细胞悬浮液的粘度。包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物及细胞悬浮液之后被混合，但若包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物与细胞悬浮液的粘度差大，则有时无法得到良好的混合状态。从而在使包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度与细胞悬浮液的粘度相等之后，优选将两者进行混合。包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物具有触变性，通过施加剪切应力能够使粘度降低。因此控制部80在进行用于对包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送之后，进行使细胞悬浮液和上述混合物合流并转移到搅拌部30的控制。具体而言，控制部80使包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环，由此对上述混合物施加剪切应力。
即，在步骤A2中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此容纳在储存容器20中的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物经过流路F2并转移到搅拌部30。包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物在搅拌部30中被搅拌，由此被施加剪切应力且粘度降低。
接着，在步骤A3中，控制部80将开闭阀V13及V14控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此通过了搅拌部30的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物经过流路F20返回到储存容器20。容纳在储存容器20中的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度通过粘度测定部42而被测定，测定结果通知到控制部80。控制部80连续地进行使上述混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环的液体输送，直至从粘度测定部42通知的混合物的粘度与从粘度测定部41通知的细胞悬浮液的粘度的差值成为规定值以下。另外，控制部80可以连续地进行使上述混合物在储存容器20与搅拌部30之间的循环的液体输送，直至从粘度测定部42通知的混合物的粘度值成为规定值以下，而不管从粘度测定部41通知的细胞悬浮液的粘度如何。并且，可以连续地进行使上述混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环的液体输送，直至达到预先确定的循环次数。
若完成用于对包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送，则在步骤A4中，控制部80将开闭阀V1控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此容纳在细胞供给部11的细胞悬浮液经过流路F1转移到储存容器20，并与被调整粘度的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物合流。
在步骤A5中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液和包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物从储存容器20经过流路F2转移到搅拌部30。细胞悬浮液和包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物在搅拌部30中被搅拌并混合。对包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力而实施粘度调整，由此在细胞悬浮液和包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物中能够获得良好的混合状态。
在步骤A6中，控制部80将开闭阀V7及V8控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液和包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物从搅拌部30经过流路F3供给到分离部50的第1过滤器部51。细胞悬浮液和包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物在第1过滤器部51中被实施膜分离处理，存活的细胞与死细胞被分离。包含透过第1过滤器部51的滤膜的死细胞的滤液回收到回收容器61。
在步骤A7中，控制部80将开闭阀V11控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此被去除死细胞的细胞悬浮液和包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物从第1过滤器部51经过流路F4供给到培养容器70。多能干细胞与被添加了包含Wnt信号活化剂的第1添加剂的培养基一同容纳于培养容器70中，由此开始用于分化诱导的培养。
＜培养基更换[1]＞
图4是表示在图2所示的步骤S2中实施的处理，即，进行培养基更换[1]的情况下的细胞培养装置100的动作的图。图4中示出处理对象物(细胞悬浮液、培养基、添加剂及它们的混合物)对各处理部的供给顺序。
在步骤B1中，控制部80将开闭阀V12控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含使用完的培养基的细胞悬浮液从培养容器70经过流路F5转移到细胞供给部11。
在步骤B2中，控制部80将开闭阀V1及V4控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含使用完的培养基的细胞悬浮液从细胞供给部11经过流路F1转移到储存容器20，并且新鲜的培养基从培养基供给部14供给到储存容器20。
在步骤B3中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液从储存容器20经过流路F2转移到搅拌部30。被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液在搅拌部30中被搅拌并混合。
在步骤B4中，控制部80将开闭阀V7及V8控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液从搅拌部30经过流路F3供给到分离部50的第1过滤器部51。被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液在第1过滤器部51中被实施膜分离处理，包含使用完的培养基及新鲜的培养基的混合物的一部分与死细胞一同被去除。包含透过第1过滤器部51的滤膜的死细胞的滤液回收到回收容器61。
在步骤B5中，控制部80将开闭阀V11控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此完成膜分离处理的细胞悬浮液从第1过滤器部51经过流路F4供给到培养容器70，完成培养基更换处理。
＜第1添加剂的重新添加＞
图5是表示在图2所示的步骤S3中实施的处理，即，重新添加第1添加剂的情况下的细胞培养装置100的动作的图。图5中示出处理对象物(细胞悬浮液、培养基、添加剂及它们的混合物)对各处理部的供给顺序。
在步骤C1中，控制部80将开闭阀V2及V4控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含Wnt信号活化剂的第1添加剂从第1添加剂供给部12供给到储存容器20，并且新鲜的培养基从培养基供给部14供给到储存容器20。由此包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物容纳于储存容器20中。容纳在储存容器20中的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度通过粘度测定部42而被测定，测定结果通知到控制部80。
在此，预计容纳在储存容器20中的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度高于容纳在培养容器70中的细胞悬浮液的粘度。包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物及细胞悬浮液之后被混合，但若包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物与细胞悬浮液的粘度差大，则有时无法获得良好的混合状态。从而在使包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度与细胞悬浮液的粘度相等之后，优选将两者进行混合。包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物具有触变性，通过施加剪切应力能够使粘度降低。因此控制部80在进行了用于对包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送之后，进行使细胞悬浮液和上述混合物合流并转移到搅拌部30的控制。具体而言，控制部80使包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环，由此对上述混合物施加剪切应力。
即，在步骤C2中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此容纳在储存容器20中的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物经过流路F2转移到搅拌部30。包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物在搅拌部30中被搅拌，由此被施加剪切应力且粘度降低。
接着，在步骤C3中，控制部80将开闭阀V13及V14控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此通过了搅拌部30的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物经过流路F20返回到储存容器20。容纳在储存容器20中的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度通过粘度测定部42而被测定，测定结果通知到控制部80。控制部80连续地进行使上述混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环的液体输送，直至从粘度测定部42通知的混合物的粘度值成为规定值以下。另外，控制部80连续地进行使上述混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环的液体输送，直至达到预先确定的循环次数。
若完成用于对包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送，则在步骤C4中，控制部80将开闭阀V12控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液从培养容器70经过流路F5转移到细胞供给部11。
在步骤C5中，控制部80将开闭阀V1控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此容纳在细胞供给部11中的细胞悬浮液经过流路F1转移到储存容器20，并与被调整粘度的包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物合流。
在步骤C6中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液和包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物从储存容器20经过流路F2转移到搅拌部30。细胞悬浮液和包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物在搅拌部30中被搅拌并混合。对包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力而实施粘度调整，由此在细胞悬浮液和包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物中能够获得良好的混合状态。
在步骤C7中，控制部80将开闭阀V7及V9控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液和包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物从搅拌部30经过流路F3供给到分离部50的第2过滤器部52。细胞悬浮液和包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物在第2过滤器部52中被实施膜分离处理，未分化为中间体(外胚层、中胚层、内胚层)的未分化细胞及死细胞与中间体被分离。包含透过第2过滤器部52的滤膜的未分化细胞及死细胞的滤液回收到回收容器62。
在步骤C8中，控制部80将开闭阀V11控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此未分化细胞及死细胞被去除且残留有中间体的细胞悬浮液、包含第1添加剂及新鲜的培养基的混合物，从第2过滤器部52经过流路F4供给到培养容器70。
＜培养基更换[2]＞
图6是表示在图2所示的步骤S4中实施的处理，即，进行培养基更换[2]的情况下的细胞培养装置100的动作的图。图6中示出处理对象物(细胞悬浮液、培养基、添加剂及它们的混合物)对各处理部的供给顺序。
在步骤D1中，控制部80将开闭阀V12控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含使用完的培养基的细胞悬浮液从培养容器70经过流路F5转移到细胞供给部11。
在步骤D2中，控制部80将开闭阀V1及V4控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含使用完的培养基的细胞悬浮液从细胞供给部11经过流路F1转移到储存容器20，并且新鲜的培养基从培养基供给部14供给到储存容器20。
在步骤D3中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液从储存容器20经过流路F2转移到搅拌部30。被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液在搅拌部30中被搅拌并混合。
在步骤D4中，控制部80将开闭阀V7及V9控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液从搅拌部30经过流路F3供给到分离部50的第2过滤器部52。被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液在第2过滤器部52中被实施膜分离处理，包含使用完的培养基及新鲜的培养基的混合物的一部分和死细胞及未分化细胞一同被去除。包含透过第2过滤器部52的滤膜的死细胞及未分化细胞的滤液回收到回收容器62。
在步骤D5中，控制部80将开闭阀V11控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此完成膜分离处理的细胞悬浮液从第2过滤器部52经过流路F4供给到培养容器70，完成培养基更换处理。
＜第2添加剂的添加＞
图7是表示在图2所示的步骤S6中实施的处理，即，添加第2添加剂的情况下的细胞培养装置100的动作的图。图7中示出处理对象物(细胞悬浮液、培养基、添加剂及它们的混合物)对各处理部的供给顺序。
在步骤E1中，控制部80将开闭阀V3及V4控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含Wnt信号抑制剂的第2添加剂从第2添加剂供给部13供给到储存容器20，并且新鲜的培养基从培养基供给部14供给到储存容器20。由此包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物容纳于储存容器20中。容纳在储存容器20中的包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度通过粘度测定部42而被测定，测定结果通知到控制部80。
在此，预计容纳在储存容器20中的包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度高于容纳在培养容器70中的细胞悬浮液的粘度。包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物及细胞悬浮液之后被混合，但若包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物与细胞悬浮液的粘度差大，则有时无法获得良好的混合状态。从而在使包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度与细胞悬浮液的粘度相等之后，优选将两者进行混合。包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物具有触变性，通过施加剪切应力能够使粘度降低。因此控制部80在进行了用于对包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送之后，进行使细胞悬浮液与上述混合物合流并转移到搅拌部30的控制。具体而言，控制部80使包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环，由此对上述混合物施加剪切应力。
即，在步骤E2中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此容纳在储存容器20中的包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物经过流路F2转移到搅拌部30。包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物在搅拌部30中被搅拌，由此被施加剪切应力且粘度降低。
接着，在步骤E3中，控制部80将开闭阀V13及V14控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此通过了搅拌部30的包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物经过流路F20返回到储存容器20。容纳在储存容器20中的包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度通过粘度测定部42而被测定，测定结果通知到控制部80。控制部80连续地进行使上述混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环的液体输送，直至从粘度测定部42通知的混合物的粘度值成为规定值以下。另外，控制部80可以连续地进行使上述混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环的液体输送，直至达到预先确定的循环次数。
若完成用于对包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送，则在步骤E4中，控制部80将开闭阀V12控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液从培养容器70经过流路F5并转移到细胞供给部11。
在步骤E5中，控制部80将开闭阀V1控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此容纳在细胞供给部11中的细胞悬浮液经过流路F1转移到储存容器20，并与包含被调整粘度的第2添加剂及新鲜的培养基的混合物合流。
在步骤E6中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液和包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物从储存容器20经过流路F2转移到搅拌部30。细胞悬浮液和包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物在搅拌部30中被搅拌并混合。对包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力而实施粘度调整，由此在细胞悬浮液和包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物中能够获得良好的混合状态。
在步骤E7中，控制部80将开闭阀V7及V9控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液和包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物从搅拌部30经过流路F3供给到分离部50的第2过滤器部52。细胞悬浮液和包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物在第2过滤器部52中被实施膜分离处理，未分化为中间体(外胚层、中胚层、内胚层)的未分化细胞及死细胞与中间体被分离。包含透过第2过滤器部52的滤膜的未分化细胞及死细胞的滤液回收到回收容器62。
在步骤E8中，控制部80将开闭阀V11控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此未分化细胞及死细胞被去除且残留有中间体的细胞悬浮液、包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物从第2过滤器部52经过流路F4供给到培养容器70。
＜培养基更换[3]＞
图8是表示在图2所示的步骤S7中实施的处理，即，进行培养基更换[3]的情况下的细胞培养装置100的动作的图。图8中示出处理对象物(细胞悬浮液、培养基、添加剂及它们的混合物)对各处理部的供给顺序。
在步骤G1中，控制部80将开闭阀V12控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含使用完的培养基的细胞悬浮液从培养容器70经过流路F5转移到细胞供给部11。
在步骤G2中，控制部80将开闭阀V1及V4控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含使用完的培养基的细胞悬浮液从细胞供给部11经过流路F1转移到储存容器20，并且新鲜的培养基从培养基供给部14供给到储存容器20。
在步骤G3中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液从储存容器20经过流路F2转移到搅拌部30。被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液在搅拌部30中被搅拌并混合。
在步骤G4中，控制部80将开闭阀V7及V9控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液从搅拌部30经过流路F3供给到分离部50的第2过滤器部52。被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液在第2过滤器部52中被实施膜分离处理，包含使用完的培养基及新鲜的培养基的混合物的一部分和死细胞及未分化细胞一同被去除。包含透过第2过滤器部52的滤膜的死细胞及未分化细胞的滤液回收到回收容器62。
在步骤G5中，控制部80将开闭阀V11控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此完成膜分离处理的细胞悬浮液从第2过滤器部52经过流路F4供给到培养容器70，完成培养基更换处理。
＜第2添加剂的重新添加＞
图9是表示在图2所示的步骤S8中实施的处理，即，重新添加第2添加剂的情况下的细胞培养装置100的动作的图。图9中示出处理对象物(细胞悬浮液、培养基、添加剂及它们的混合物)对各处理部的供给顺序。
在步骤H1中，控制部80将开闭阀V3及V4控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含Wnt信号抑制剂的第2添加剂从第2添加剂供给部13供给到储存容器20，并新鲜的培养基从培养基供给部14供给到储存容器20。由此包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物容纳于储存容器20中。容纳在储存容器20中的包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度通过粘度测定部42而被测定，测定结果通知到控制部80。
在此，预计容纳在储存容器20中的包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度高于容纳在培养容器70中的细胞悬浮液的粘度。包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物及细胞悬浮液之后被混合，但若包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物与细胞悬浮液的粘度差大，则有时无法获得良好的混合状态。从而，在使包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度与细胞悬浮液的粘度相等之后，优选将两者进行混合。包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物具有触变性，通过施加剪切应力而能够使粘度降低。因此控制部80在进行了用于对包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送之后，进行使细胞悬浮液与上述混合物合流并转移到搅拌部30的控制。具体而言，控制部80使包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环，由此对上述混合物施加剪切应力。
即，在步骤H2中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此容纳在储存容器20中的包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物经过流路F2转移到搅拌部30。包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物在搅拌部30中被搅拌，由此被施加剪切应力且粘度降低。
接着，在步骤H3中，控制部80将开闭阀V13及V14控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此通过了搅拌部30的包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物经过流路F20返回到储存容器20。容纳在储存容器20中的包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度通过粘度测定部42而被测定，测定结果通知到控制部80。控制部80连续地进行使上述混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环的液体输送，直至从粘度测定部42通知的混合物的粘度值成为规定值以下。另外，控制部80可以连续地进行使上述混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环的液体输送，直至达到预先确定的循环次数。
若完成用于对包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送，则在步骤H4中，控制部80将开闭阀V12控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液从培养容器70经过流路F5转移到细胞供给部11。
在步骤H5中，控制部80将开闭阀V1控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此容纳在细胞供给部11中的细胞悬浮液经过流路F1转移到储存容器20，并与被调整粘度的包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物合流。
在步骤H6中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液和包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物从储存容器20经过流路F2转移到搅拌部30。细胞悬浮液和包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物在搅拌部30中被搅拌并混合。对包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力而实施粘度调整，由此在细胞悬浮液和包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物中能够获得良好的混合状态。
在步骤H7中，控制部80将开闭阀V7及V10控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液和包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物从搅拌部30经过流路F3供给到分离部50的第3过滤器部53。细胞悬浮液和包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物在第3过滤器部53中被实施膜分离处理，未转移到分化细胞的中间体(外胚层、中胚层、内胚层)、未分化为中间体的未分化细胞及死细胞与分化细胞被分离。包含透过第3过滤器部53的滤膜的中间体、未分化细胞及死细胞的滤液回收到回收容器63。
在步骤H8中，控制部80将开闭阀V11控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此中间体、未分化细胞及死细胞被去除且残留有分化细胞的细胞悬浮液、包含第2添加剂及新鲜的培养基的混合物从第3过滤器部53经过流路F4供给到培养容器70。
＜培养基更换[4]＞
图10是表示在图2所示的步骤S9中实施的处理，即，进行培养基更换[4]的情况下的细胞培养装置100的动作的图。图10中示出处理对象物(细胞悬浮液、培养基、添加剂及它们的混合物)对各处理部的供给顺序。
在在步骤I1中，控制部80将开闭阀V12控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含使用完的培养基的细胞悬浮液从培养容器70经过流路F5转移到细胞供给部11。
在步骤I2中，控制部80将开闭阀V1及V4控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此包含使用完的培养基的细胞悬浮液从细胞供给部11经过流路F1转移到储存容器20，并且新鲜的培养基从培养基供给部14供给到储存容器20。
在步骤I3中，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液从储存容器20经过流路F2转移到搅拌部30。被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液在搅拌部30中被搅拌并混合。
在步骤I4中，控制部80将开闭阀V7及V10控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液从搅拌部30经过流路F3供给到分离部50的第3过滤器部53。被追加了新鲜的培养基的细胞悬浮液在第3过滤器部53中被实施膜分离处理，包含使用完的培养基及新鲜的培养基的混合物的一部分与中间体(外胚层、中胚层、内胚层)、未分化细胞及死细胞一同被去除。透过第3过滤器部53的滤膜的中间体、未分化细胞、死细胞被回收到回收容器62。
在步骤I5中，控制部80将开闭阀V11控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此完成膜分离处理的细胞悬浮液从第3过滤器部53经过流路F4供给到培养容器70，完成培养基更换处理。
如上所述，细胞培养装置100具有在形成循环路径的环状流路F0的中途设置的处理部(搅拌部30及分离部50)、培养容器70及细胞供给部11。并且，在形成循环路径的环状流路F0上，连接有供给在分化诱导中需要的添加剂的第1添加剂供给部12及第2添加剂供给部13和供给新鲜的培养基的培养基供给部14。并且，细胞培养装置100具有对经由设置在细胞培养装置100中的各流路的液体输送进行控制的控制部80。根据具有上述结构的细胞培养装置100，在封闭系统中能够连续地实施在多能干细胞的分化诱导中需要的一系列的处理。
并且，根据本实施方式所涉及的细胞培养装置100，分离部50包括第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53而构成，这些过滤器部分别具备开口的尺寸彼此不同的滤膜。第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53在培养期间中的规定的时刻被选择性地使用。由此能够适当地分离在培养期间中生成的死细胞、未分化细胞、中间体及分化细胞。
并且，根据本实施方式所涉及的细胞培养装置100，在添加或重新添加添加剂的情况下，控制部80在进行了用于对添加剂与新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送之后，进行使细胞悬浮液与上述混合物合流并转移到搅拌部30的控制。即，在使包含添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度接近于细胞悬浮液的粘度之后，进行上述混合物与细胞悬浮液的混合。由此在混合细胞悬浮液和包含添加剂及新鲜的培养基的混合物的情况下，能够获得良好的混合状态。
另外，在本实施方式中，例示出分离部50具有第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53三种过滤器部的情况，但并不限定于该方式。分离部50只要包含第1过滤器部51、第2过滤器部52及第3过滤器部53中的至少1个即可。
并且，在本实施方式中，作为基于分离部50的分离构件，例示出进行膜分离处理的过滤器部，但并不限定于该方式。作为基于分离部50的分离构件，也能够使用离心分离构件、激振分离构件、电解分离构件及磁分离构件，以代替膜分离构件或者与膜分离构件并用。
并且，在本实施方式中，例示出细胞培养装置100具备储存容器20的情况，但也能够省略储存容器20。在省略储存容器20的情况下，可以使形成流路的配管作为储存容器而发挥功能。
[第2实施方式]
图11是表示所公开的技术的第2实施方式所涉及的细胞培养装置100A的结构的框图。在上述第1实施方式所涉及的细胞培养装置100中，例示出使上述混合物在储存容器20与搅拌部30之间循环以对包含添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的情况。在第2实施方式所涉及的细胞培养装置100A中，用于对添加剂与新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送路径不同于第1实施方式所涉及的细胞培养装置100。
第2实施方式所涉及的细胞培养装置100A具有连接储存容器20的流出口和流入口的流路F21，作为用于对添加剂与新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送路径。控制部80通过使包含添加剂及新鲜的培养基的混合物在构成流路F21的配管中流动而对上述混合物施加剪切应力之后，使细胞悬浮液和上述混合物在储存容器20内合流并转移到搅拌部30。
具体而言，在包含添加剂及新鲜的培养基的混合物容纳在储存容器20中的状态下，控制部80将开闭阀V5、V13及V14控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此容纳在储存容器20中的包含添加剂及新鲜的培养基的混合物从储存容器20流出，并经流路F21返回到储存容器20。包含添加剂及新鲜的培养基的混合物在流入流路F21的期间，通过与构成流路F21的配管内的壁面的摩擦而对上述混合物施加剪切应力，上述混合物的粘度降低。
容纳在储存容器20中的包含添加剂及新鲜的培养基的混合物的粘度通过粘度测定部42而被测定，测定结果通知到控制部80。控制部80连续地进行使上述混合物经由流路F21循环的液体输送，直至从粘度测定部42通知的混合物的粘度与从粘度测定部41通知的细胞悬浮液的粘度的差值成为规定值以下。另外，控制部80可以连续地进行使上述混合物经由流路F21循环的液体输送，直至从粘度测定部42通知的混合物的粘度值成为规定值以下。并且，可以连续地进行使上述混合物经由流路F21循环的液体输送，直至达到预先确定的循环次数。
若完成用于对包含添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的液体输送，则控制部80将开闭阀V5、V13及V14控制成关闭状态，将开闭阀V1控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此容纳在细胞供给部11中的细胞悬浮液经过流路F1转移到储存容器20，并与包含被调整粘度的添加剂及新鲜的培养基混合物合流。
之后，控制部80将开闭阀V5及V6控制成开启状态的同时，驱动规定的泵。由此细胞悬浮液和包含添加剂及新鲜的培养基的混合物从储存容器20经过流路F2转移到搅拌部30。细胞悬浮液和包含添加剂及新鲜的培养基的混合物在搅拌部30中被搅拌并混合。对包含添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力而实施粘度调整，由此在细胞悬浮液和包含添加剂及新鲜的培养基的混合物中能够获得良好的混合状态。
另外，作为用于对包含添加剂及新鲜的培养基的混合物施加剪切应力的方法，也能够使用如下方法：由塑料薄膜等柔软的材料构成储存容器20，从外部对容纳了包含添加剂及新鲜的培养基的混合物的储存容器20施加力。
[第3实施方式]
在所公开的技术的实施方式所涉及的细胞培养装置中，培养箱71内部的温度T1例如恒定地保持为37℃，培养箱71外部的温度T2为室温(例如25℃)。从而在使细胞悬浮液流入容纳在培养箱71的内部的培养容器70的情况下，以及在使细胞悬浮液流出到培养箱71的外部的情况下，细胞受到由12℃的温度差引起的热冲击。通过该热冲击，细胞可能会受到损伤。
图12是表示所公开的技术的第3实施方式所涉及的细胞培养装置的局部结构的图。第3实施方式所涉及的细胞培养装置具备减缓容纳培养容器70的培养箱71的内部与外部的温度梯度的温度梯度减缓机构91及92。
温度梯度减缓机构91包括多个加热单元91a、91b、91c及91d而构成。加热单元91a、91b、91c及91d设置在流路F4中，流入到容纳在培养箱71内的培养容器70中的细胞悬浮液通过该流路F4。加热单元91a、91b、91c及91d分别能够独立地进行加热温度的设定，以彼此不同的温度来加热流过流路F4的细胞悬浮液。若将加热单元91a、91b、91c及91d的设定温度分别设为T1a、T1b、T1c及T1d，则进行各加热单元的温度设定，以成为T2(25℃)＜T1d＜T1c＜T1b＜T1a＜T1(37℃)。由此流过流路F4的细胞悬浮液的温度缓慢地朝向培养箱71的内部的温度T1(37℃)上升。即，通过温度梯度减缓机构91而减缓由培养箱71内外部的温度差引起的细胞悬浮液的每小时的温度变化即温度梯度。温度梯度例如优选为0.1(℃/s)以下。另外，在本实施方式中，例示出通过4个加热单元91a、91b、91c及91d构成温度梯度减缓机构91的情况，但也能够适当地增减加热单元的数量，以能够实现所希望的温度梯度。
另一方面，温度梯度减缓机构92包括多个冷却单元92a、92b、92c及92d而构成。冷却单元92a、92b、92c及92d设置在流路F5中，从容纳在培养箱71内的培养容器70流出的细胞悬浮液通过该流路F5。冷却单元92a、92b、92c及92d能够彼此独立地进行冷却温度的设定，以彼此不同的温度来冷却流过流路F5的细胞悬浮液。若将冷却单元92a、92b、92c及92d的设定温度分别设为T2a、T2b、T2c及T2d，则进行各冷却单元的温度设定，以成为T2(25℃)＜T2d＜T2c＜T2b＜T2a＜T1(37℃)。由此流过流路F5的细胞悬浮液的温度缓慢地朝向培养箱71的外部的温度T2(25℃)下降。即，通过温度梯度减缓机构92而减缓由培养箱71的内外部的温度差引起的细胞悬浮液的每小时的温度变化即温度梯度。温度梯度例如优选为0.1(℃/s)以下。另外，在本实施方式中，例示出通过4个冷却单元92a、92b、92c及92d构成温度梯度减缓机构92的情况，但也能够适当地增减冷却单元的数量，以能够实现所希望的温度梯度。
如上所述，根据所公开的技术的第3实施方式所涉及的细胞培养装置，通过温度梯度减缓机构91及92而减缓由培养箱71的内外部的温度差引起的细胞悬浮液的温度变化的温度梯度。由此能够减轻或消除细胞因培养箱71的内外部的温度差而受到的损伤。
[第4实施方式]
图13是表示所公开的技术的第4实施方式所涉及的细胞培养装置100B的结构的图。第4实施方式所涉及的细胞培养装置100B还具有细胞状态测定部90。细胞状态测定部90具备拍摄容纳在培养容器70内的细胞的相机，并将通过拍摄而得到的图像供给到控制部80。
控制部80从细胞状态测定部90供给的图像检测出容纳在培养容器70内的细胞的状态。控制部80根据从图像检测出的细胞的状态判定是否转移到图2所示的各处理步骤。
如此，通过根据容纳在培养容器70内的细胞的图像判定是否转移到各处理步骤，能够在适当的时刻实施分化诱导中所需要的各处理，并能够提高分化细胞的生产率。
另外，2017年1月20日申请的日本专利申请2017-008911的公开其全部内容通过参考而援用于本说明书中。并且，本说明书中所记载之所有文献、专利申请及技术标准，以与具体且分别记载通过参考而援用各文献、专利申请及技术标准之情况相同之程度，通过参考而援用于本说明书中。

Claims (11)

1.一种细胞培养装置，其具有：
细胞供给部，供给细胞；
培养基供给部，供给培养基；
添加剂供给部，供给用于将未分化细胞进行分化诱导的添加剂；
搅拌部，搅拌处理对象物；
分离部，分离包含在处理对象物中的成分；及
培养容器，培养所述细胞，
并且包括：
第1流路，形成经过所述细胞供给部、所述搅拌部、所述分离部及所述培养容器的循环路径；
第2流路，连接所述培养基供给部和所述第1流路；
第3流路，连接所述添加剂供给部和所述第1流路；及
控制部，控制经由所述第1流路、所述第2流路及所述第3流路的液体输送。
2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，
所述分离部具有以下滤膜中的至少一个；第1滤膜，将所述未分化细胞和死细胞进行膜分离；第2滤膜，将所述未分化细胞分化为分化细胞之前的中间体和所述未分化细胞进行膜分离；及第3滤膜，将所述中间体和所述分化细胞进行膜分离。
3.根据权利要求2所述的细胞培养装置，其中，
所述分离部具有包括所述第1滤膜、所述第2滤膜及所述第3滤膜中的至少两个的多个滤膜，
所述控制部进行如下控制：使包含所述细胞的细胞悬浮液选择性地通过所述多个滤膜中的任一个。
4.根据权利要求2或3所述的细胞培养装置，其中，
在所述第1滤膜、所述第2滤膜及所述第3滤膜的各膜面上设置的开口的尺寸彼此不同。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞培养装置，其中，
所述控制部进行如下控制：在进行了用于对所述添加剂与所述培养基的混合物施加剪切应力的液体输送之后，使包含所述细胞的细胞悬浮液和所述混合物合流并转移到所述搅拌部。
6.根据权利要求5所述的细胞培养装置，其还包括：
储存容器，设置在第1流路的中途的、所述细胞供给部与所述搅拌部之间，
所述控制部进行如下控制：通过使所述混合物在所述储存容器与所述搅拌部之间进行循环而对所述混合物施加剪切应力之后，使所述细胞悬浮液和所述混合物在所述储存容器内合流并转移到所述搅拌部。
7.根据权利要求5所述的细胞培养装置，其还包括：
储存容器，设置在第1流路的中途的、所述细胞供给部与所述搅拌部之间，
所述控制部进行如下控制：通过使所述混合物在配管中流过而对所述混合物施加剪切应力之后，使所述细胞悬浮液和所述混合物在所述储存容器内合流并转移到所述搅拌部。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的细胞培养装置，其中，
所述控制部连续地进行用于对所述混合物施加剪切应力的液体输送，直至所述混合物的粘度成为规定的粘度。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的细胞培养装置，其中，
所述添加剂供给部包括：
第1添加剂供给部，供给包含Wnt信号活化剂的第1添加剂；及
第2添加剂供给部，供给包含Wnt信号抑制剂的第2添加剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞培养装置，其还包括：
培养箱，容纳所述培养容器，并将所述培养容器的周围温度保持为恒定；及
温度梯度减缓机构，减缓根据所述培养箱的内部与外部的温度差沿所述第1流路生成的温度梯度。
11.一种细胞培养方法，其使用权利要求1至10中任一项所述的细胞培养装置来培养所述细胞，其中，
所述控制部进行如下控制：通过所述搅拌部及所述分离部将混合物转移到所述培养容器，所述混合物包含：从所述培养基供给部供给的所述细胞；从所述添加剂供给部供给的所述添加剂；及从所述培养基供给部供给的所述培养基。
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