WO2007052716A1 - 細胞培養装置、細胞培養方法、細胞培養プログラム、及び細胞培養システム - Google Patents

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WO2007052716A1
WO2007052716A1 PCT/JP2006/321901 JP2006321901W WO2007052716A1 WO 2007052716 A1 WO2007052716 A1 WO 2007052716A1 JP 2006321901 W JP2006321901 W JP 2006321901W WO 2007052716 A1 WO2007052716 A1 WO 2007052716A1
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culture
cell
cells
bag
medium
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PCT/JP2006/321901
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Norihiko Hata
Hidemasa Jinguji
Atsutaka Noguchi
Shiho Sato
Kazutoshi Sato
Naoko Ariyoshi
Akihiro Hosoi
Original Assignee
Medinet Co., Ltd.
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • Cell culture device cell culture method, cell culture program, and cell culture system
  • the present invention relates to a cell culture apparatus, a cell culture method, a cell culture program, and a cell culture system that evaluate cell culture conditions and culture cells.
  • Patent Document 1 grasps the proliferation ability of the entire cell population by observing the morphology of each adhesion-dependent cell without attacking and nondestructively with an image.
  • Patent Document 2 a plurality of casters (containers) are arranged in one thermostat (culture chamber).
  • a cell culturing system is disclosed in which cells are cultivated by storing culture containers one by one in a caster. In this culture system, all the canisters in a single thermostatic chamber have the same culture environment. It has been determined.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-218995
  • Patent Document 2 JP-A-2005-73566
  • An object of the present invention has been made in consideration of the above-described circumstances, and a cell culturing apparatus and a cell culturing device capable of realizing appropriate culturing according to the culturing state of the cells while reducing the labor of the operator. It is in providing a cultivation method and a cell culture program.
  • a further object of the present invention is to automatically collect and accumulate cell culture related data related to cell culture, and to monitor and manage cell culture based on the cell culture related data. It is intended to provide a cell culture system, a cell culture method, and a cell culture program.
  • a cell culture device includes a culture container for culturing cells, medium storage means for storing a medium supplied to the culture container, and an image of the cells in the culture container.
  • An image acquisition means for acquiring, and a control means for determining a culture state of the cell from an image of the cell acquired by the image acquisition means and executing a culture operation based on the determination. It is.
  • the culture container according to the invention of claim 1 is characterized in that the culture container has a growth culture container for growing cells and a function of the cells.
  • a culture container for function expression for causing expression, and a fraction of cells in the culture container for function expression.
  • the image acquisition means acquires an image.
  • the cell culture device is the invention according to claim 2, wherein the culture container for function expression is for stimulating an inducer that stimulates cells with an inducer for proliferation.
  • the control means determines the cell growth possibility and the cell growth ability based on the image of the cells in the induction factor stimulation culture vessel, and controls the growth factor from the induction factor stimulation culture vessel. It is characterized by controlling the culture operation such as the timing of transferring the cells to the culture container and the supply of the culture medium from the culture medium storage means to the culture container for proliferation.
  • the cell culture device is the invention according to claim 2, wherein the functional expression culture vessel is a differentiation-inducing culture vessel for differentiating cells and is controlled.
  • the means is characterized in that the differentiation induction operation is controlled based on the image of the cells in the differentiation induction culture vessel.
  • the medium storage means is configured in a cassette structure and connected to a culture vessel. It is characterized by.
  • the cell culture device according to the invention of claim 6 is the invention according to claim 5, wherein the culture container for function expression is configured in a cassette structure, and the culture container for proliferation and the medium reservoir It is characterized by being connected to the means.
  • the cell culture device according to the invention of claim 7 is the invention according to any one of claims 2 to 6, wherein the culture medium storage means, the culture container for function expression and the culture container for proliferation are in a closed system. It is characterized by being configured.
  • the cell culture device according to the invention of claim 8 is the cell culture device according to any of claims 2 to 7, wherein the growth culture container is provided with a liquid reservoir so as to be formed. In the initial stage of culture in the culture vessel, cells and culture medium are stored in the liquid reservoir.
  • the cell culture device according to the invention of claim 9 is the culture according to any one of claims 2 to 8, wherein the cells grown in the culture vessel for proliferation are cultured for functional expression.
  • the cell image is guided into the container and the image of the cell is acquired by the image acquisition means. is there.
  • the cell culture device is the invention according to any one of claims 2 to 9, wherein the medium storage means stores a used medium storage capable of storing a used medium.
  • the container is installed together with a medium storage container capable of storing the medium to be supplied to the culture container, and the used medium in the growth culture container is discharged and stored in the used medium storage container. It is a feature.
  • the culture medium storage means can be equipped with a cell recovery container for recovering cells.
  • the cells concentrated in the culture vessel for proliferation are configured to be collected in the cell collection vessel.
  • a cell culture device according to the invention of claim 12 is characterized in that, in the invention of any one of claims 1 to 11, the cell is a suspension cell. is there.
  • the cell culture device according to the invention of claim 13 is characterized in that, in the invention of any one of claims 1 to 12, the cells are used in immunocell therapy. It is a thing.
  • the image acquisition means acquires an image of the cells in the culture vessel in which the cells are cultured, and from the cell image acquired by the image acquisition means.
  • the culture state of the cell is determined, and based on this determination, the culture operation is performed on the culture vessel.
  • the culture container according to the invention of claim 14 is characterized in that the culture container has a growth culture container for proliferating the cells and a function of the cells.
  • a culture container for function expression for expression, and an image acquisition means acquires an image of cells in the culture container for function expression.
  • the cell culture method according to the invention of claim 16 is the induction of the invention of claim 15, wherein the culture container for function expression stimulates cells with an inducer for proliferation.
  • This is a factor stimulation culture vessel, and based on the image of the cells in the induction factor stimulation culture vessel, the cell growth possibility and the cell growth ability are determined, and the above-described induction factor stimulation culture vessel is used for the growth culture. Timing of cell transfer to the container, medium storage means, etc. A culture operation such as supply of a culture medium to a culture vessel for breeding is performed.
  • the culture container for function expression is a culture container for differentiation induction for differentiating cells.
  • the differentiation induction operation is performed based on the image of the cells in the differentiation-inducing culture vessel.
  • the cell culture method according to the invention of claim 18 is the invention according to any one of claims 15 to 17, in the initial stage of culture in the culture container for proliferation, The cell and the culture medium are stored in the liquid reservoir.
  • the cell culture method according to the invention of claim 19 is the functional culture according to the invention of any one of claims 15 to 18, wherein the cells grown in the growth culture vessel are cultured.
  • the cell is guided into the container, and the image acquisition means acquires the cell image.
  • the cell culture method according to the invention of claim 20 is the invention according to any one of claims 15 to 19, wherein the spent medium in the growth culture container is used as the spent medium of the medium storage means. It is characterized by discharging into a storage container.
  • the cell culture method according to the invention of claim 21 is the cell culture method according to any one of claims 15 to 20, wherein the cells concentrated in the culture vessel for proliferation are recovered by the cell storage means. It collects in a container, It is characterized by the above-mentioned.
  • the cell culture method according to the invention of claim 22 is characterized in that, in the invention of any of claims 14 to 21, the cell is a suspension cell. .
  • the cell culture method according to the invention of claim 23 is characterized in that, in the invention of any one of claims 14 to 22, the cell is used in immune cell therapy. It is.
  • the cell culture program according to the invention of claim 24 is a cell culture program stored in a computer for executing cell culture, and acquires an image of a cell in a culture vessel in which the cell is cultured.
  • a cell culture program according to the invention of claim 25 is a cell culture program stored in a computer for executing cell culture, and a culture container for function expression for causing a cell to express a function.
  • the cell culture device according to the invention of claim 26 is the cell culture device according to any one of claims 1 to 3, wherein the culture vessel is placed on a mounting table. The culture area is changed by raising and lowering a part of the pedestal.
  • the cell culture device according to the invention of claim 27 is a simple fed-batch culture and a perfusion culture according to the invention according to claim 1 of claim 1 to claim 13. One of these can be selected.
  • the cell culture device according to the invention of claim 28 is characterized in that, in the invention of claim 27, one of intermittent perfusion culture and continuous perfusion culture can be selected. Is.
  • the cell culture method according to the invention of claim 29 is the invention according to any one of claims 14 to 16, wherein the culture container is placed on a mounting table, The culture area is changed by moving a part of the table up and down.
  • the cell culture method according to the invention of claim 30 is a simple fed-batch culture and a perfusion culture according to the invention of claim 14 to claim 23, wherein: One of these can be selected.
  • the cell culture method according to the invention of claim 31 is characterized in that, in the invention of claim 30, one of intermittent perfusion culture and continuous perfusion culture can be selected. Is.
  • the cell culture system according to the invention of claim 32 is a cell culture system for culturing cells and monitoring and managing the culture, each of which is provided with a culture vessel for culturing the cells.
  • the management means is installed in a culture chamber together with a thermostat, and in each culture unit of the thermostat An operation control panel having a function of controlling culture, and a monitoring computer that is installed outside the culture room and receives and displays data of the operation control panel.
  • the cell culture-related data includes cells, a medium, a culture vessel, a thermostat, a culture unit, and an operator. At least one of the identification code, the culture environment data in the thermostat and the culture unit, and the image data of the cells in the culture vessel.
  • a remote monitoring computer is connected to the monitoring computer via a public communication line. It is characterized by that.
  • the cell culture system according to the invention of claim 37 is the invention according to any of claims 32 to 36, wherein each of the canisters of the thermostatic chamber constituting the culture unit is a bacterium or the like. It is characterized by being isolated in a state where there is no entry / exit.
  • the cell culture system according to the invention of claim 38 is the invention according to any one of claims 32 to 37, wherein the canister of the thermostatic chamber constituting the culture unit includes A fan is installed to guide the air to the canister, and all the canister fans in one temperature chamber are stopped when the temperature chamber door is opened. It is structured.
  • the cell culture system according to the invention of claim 39 is the invention as set forth in any of claims 32 to 38, wherein the canisters of the thermostat bath constituting the culture unit are each canister in one thermostat bath.
  • the door force is V, and only one of the gaps is opened.
  • the cell culture system according to the invention of claim 40 is characterized in that, in the invention of any of claims 32 to 39, the cell is a suspension cell.
  • the cell culture system according to the invention of claim 41 is characterized in that, in the invention according to any one of claims 32 to 40, the cell is used in immune cell therapy.
  • a cell culturing method according to the invention of claim 42 is a cell culturing method for culturing cells and monitoring and managing the culturing, wherein a plurality of culturing containers for culturing the cells are provided.
  • Cell culture-related data related to cell culture for each culture unit in the thermostat using a thermostat that cultivates cells in an independent culture environment for each culture unit.
  • the cell culture state is collected for each culture unit based on the cell culture related data, and the cell culture operation is managed.
  • the cell culture-related data in the invention of claim 42 includes cells, a medium, a culture vessel, a thermostat, a culture unit, and an operation. It is at least one of the identification code of the person, the culture environment data in the thermostatic chamber and the culture unit, and the image data of the cells in the culture vessel.
  • the cell culture method according to the invention of claim 44 is characterized in that, in the invention of any one of claims 42 or 43, the cell is a suspension cell.
  • the cell culture method according to the invention of claim 45 is characterized in that, in the invention according to any one of claims 42 to 44, the cell is used in immune cell therapy. .
  • the cell culture program according to the invention of claim 46 is a cell culture program stored in a computer for culturing cells and monitoring and managing the culture, and each of the culture containers for culturing the cells. Multiple culture units are placed in isolation from each other. A procedure for collecting and accumulating cell culture-related data related to cell culture for each culture unit of the thermostat for culturing cells in an independent culture environment for each culture unit, and the cell culture-related data. And a procedure for monitoring the cell culture state for each culture unit, and a procedure for managing the cell culture operation for each culture unit based on the cell culture-related data.
  • a plurality of culture containers for culturing cells are sequentially connected, and each culture container cultures cells in a different culture environment, and the above-described culture on the downstream side
  • a feature is that the cultured cells are transferred to a container and cultured.
  • the cell culture device according to the invention of claim 48 is the culture according to the invention of claim 47, wherein the two culture vessels are installed, and one culture vessel expresses the function of the cells. It is a culture container for function expression having an environment, and the other culture container is a culture container for proliferation having a culture environment for growing cells.
  • the culture container for function expression has a culture environment in which a cell is stimulated by an inducing factor for proliferation. It is characterized by being a culture vessel for stimulating induction factors.
  • the cell culture device according to the invention of claim 50 is the differentiation-inducing culture container according to the invention of claim 48, wherein the culture container for function expression has a culture environment for differentiating the proliferated cells. It is characterized by being.
  • a cell culture device according to the invention of claim 51 is characterized in that, in the invention of any one of claims 47 to 50, the cell is a suspension cell.
  • a cell culture device according to the invention of claim 52 is characterized in that, in the invention of any one of claims 47 to 51, the cell is used in immune cell therapy.
  • the cells are cultured in a plurality of culture vessels in different culture environments, and the cells cultured in one culture vessel are placed downstream. It is characterized in that it is transferred to another culture vessel and cultured.
  • the number of the culture containers is two, and an inducing factor is used for growth in one culture container. After the cells are stimulated, the cells are grown in another culture vessel.
  • the number of the culture containers is two, and after the cells are grown in one culture container, It is characterized by differentiating cells in another culture vessel.
  • the cell culture method according to the invention of claim 56 is characterized in that, in the invention of any of claims 53 to 55, the cell is a suspension cell.
  • the cell culture method according to the invention of claim 57 is characterized in that, in the invention of any of claims 53 to 56, the cell is used in immune cell therapy.
  • a cell culture device is a cell culture device comprising a culture container for culturing cells and a mounting table for mounting the culture container, wherein the mounting table Has an ascending / descending portion, and the cultivatable area of the placed culture vessel changes as the ascending / descending portion moves up and down.
  • a cell culture device according to the invention of claim 59 is characterized in that, in the invention of claim 58, the cell is a suspension cell.
  • a cell culture device according to the invention of claim 60 is characterized in that, in the invention of claim 58 or claim 59, the cell is used for immune cell therapy.
  • a cell culture device according to the invention of claim 61 is the culture medium supplied to the culture container in the invention according to any one of claims 58 to 60.
  • a culture medium storage means for storing is connected.
  • the cell culture device according to the invention of claim 62 is characterized in that, in the invention of claim 61, the medium storage means and the culture vessel are configured in a closed system.
  • the culture medium storage means is a used culture medium storage container capable of storing a used culture medium. Is installed together with a medium storage container capable of storing the medium to be supplied to the culture container, and is configured to discharge and store the used medium in the growth culture container into the used medium storage container. To do.
  • the image of the cells in the culture container according to the invention according to any one of claims 58 to 63, V, shift 1 An image photographing means for obtaining the cell culture medium from the cell image obtained by the image obtaining means. And a control means for determining a feeding situation and executing a culture operation based on the determination.
  • the culture container is a growth culture container for growing cells, and causes the cells to exhibit functions.
  • an image acquisition means for acquiring an image of cells in the culture container for function expression.
  • the culture container for function expression stimulates a cell with an inducing factor for proliferation.
  • the control means determines the cell growth possibility and the cell growth ability based on the image of the cells in the induction factor stimulation culture container, and changes the culturable area.
  • Medium storage means force Controlling culture operations such as supply of culture medium to the growth culture vessel.
  • the culture state of the cell is determined from the image of the cell in the culture container, and the culture is performed. Since the culturing operation according to the situation is performed, the culturing state of the cell can be determined in a non-contact state, so that the cell is not damaged. Therefore, it is possible to reduce the labor of a person, and furthermore, it is possible to carry out a culture operation according to the state of cell culture, so that an appropriate culture operation can be realized. By realizing an appropriate culturing operation according to the culturing state of the cells, the culturing operation can be performed in hour units, and the culturing period can be shortened.
  • the medium storage means force S is configured in the S-cassette structure and connected to the culture container (the culture container for function expression, the culture container for proliferation), the culture Since the container can always be maintained in an optimum environment for culturing, damage to the cells in the culture container due to environmental changes can be reduced, and an aseptic operation for supplying the culture medium to the culture container in a clean bench or the like can be omitted.
  • the medium storage means, the culture container for function expression and the culture container for proliferation are configured in a closed system, It is possible to keep the medium storage means, the culture container for function expression and the culture container for proliferation in a sterile state.
  • the cells grown in the growth culture vessel are guided into the function expression culture vessel, and an image of the cells is acquired by the image acquisition means. Therefore, the cells grown in the growth culture vessel can be obtained as an image, and the number of cells and the morphology of the cells can be observed.
  • the cell collection container is subjected to centrifugal separation by recovering the entire amount of the cells concentrated in the growth culture container in the cell collection container of the medium storage means.
  • the cell can be collected by mounting it directly on the machine, and labor saving of the cell collection work can be realized.
  • the operation control panel and the monitoring computer are provided with a cell related to cell culture for each culture unit of the thermostat. Since culture-related data is collected and accumulated, it is possible to accurately grasp the culture history of cells cultured in any culture unit.
  • the operation control panel and monitoring computer are based on cell culture-related data for each culture unit of the thermostat. Since the cell culture state is monitored, the culture state abnormality can be monitored for each culture unit.
  • the management means is installed in the culture chamber together with the thermostat, and an operation control panel having a function of controlling the culture in each culture unit (caster and culture cassette) of the thermostat, and a monitoring room other than the above culture room Installed in the culture unit in the constant temperature bath in the culture room.
  • the culture state of the cells can be monitored, monitored and managed in a monitoring room other than the culture room using a monitoring computer. This management automatically records and stores the history etc. This prevents tampering and recording errors.
  • the canisters of the thermostatic chamber constituting the culture unit are each isolated by the intake filter and the exhaust filter so that cells or Z and bacteria do not enter and exit. Therefore, contamination in which cells in the culture bag and cell inoculation cassette stored in each caster are contaminated with bacteria can be prevented. Since the blower fans of all the casters in one temperature chamber are configured to stop when the main body door of the temperature chamber is opened, each of the temperature chambers in the temperature chamber is opened Since the canister can be kept sealed, an independent culture environment can be secured for each canister, and fluctuations in the culture environment within the canister can be suppressed.
  • one of the caster doors of each caster in one temperature chamber is configured to open, only one or more of the caster doors of each caster is opened simultaneously in one temperature chamber. Therefore, it is possible to prevent a culture bag in the canister from being mixed and a cell inoculation cassette to be carried in and out, and to prevent cross contamination where cells are contaminated with each other.
  • the initial stage of culture in the culture bag Antibody stimulation and cell growth in the same culture bag, and the liquid reservoir in which cells and culture medium are stored can be changed within a predetermined area, so that cells per area during culture can be changed.
  • the density at a density suitable for growth cells can be efficiently grown.
  • FIG. 1 (a) is a configuration diagram showing the first embodiment of the cell culture device according to the present invention
  • FIG. 1 (b) shows the first embodiment of the cell culture system according to the present invention
  • FIG. FIG. 2 is a perspective view showing the thermostat of FIG.
  • FIG. 5 is a layout diagram showing the configuration of one caster in the thermostatic chamber of FIG. 2, a culture cassette housed in the caster, and a powerful culture unit.
  • a cell culture device 10 shown in Fig. 1 (a) is a device that specifically cultures suspension cells used for immune cell therapy, and is equipped with a plurality of (for example, eight) culture units 12. 11, an operation control panel 13 for controlling the operation of the thermostat 11 and the culture unit 12, an image processing computer 14 for processing cell images, an operation control panel 13 and an image processing computer 14 And a monitoring computer 15 for monitoring the thermostatic chamber 11 and the culture unit 12.
  • the operation control panel 13 and the image processing computer 14 function as control means.
  • the cell culture device 10 can also be realized as a cell culture system.
  • the cell culture system 10 is a device that cultivates floating cells used for immune cell therapy, and monitors and manages the culture.
  • the thermostat 11, the operation control panel 13 and the image processing computer 14 are installed in a culture room (clean room) 94 suitable for cell culture, and the monitoring computer 15 is It is installed in a monitoring room 95 other than the culture room 94.
  • the thermostat 11 has a plurality of (for example, eight) culture units 12 arranged so as to be separated from each other, each of which is provided with a culture vessel for cell culture (a culture vessel for growth described later, an induction factor stimulation culture vessel). Is. this In the thermostat 11, the cells in the culture vessel are cultured in an independent culture environment for each culture unit 12.
  • a culture vessel for cell culture a culture vessel for growth described later, an induction factor stimulation culture vessel.
  • the operation control panel 13 controls the operation of the thermostat 11 and the culture unit 12, and monitors and manages cell culture for each culture unit 12 of the thermostat 11.
  • the image processing computer 14 processes an image of cells being cultured for each culture unit 12 in the thermostat 11, and functions as a control means for controlling the culture operation together with the operation control panel 13.
  • the monitoring computer 15 is connected to the operation control panel 13 and the image processing computer 14 to receive, store and display (view) data stored in the operation control panel 13 and the image processing computer 14. It can function as a management means for monitoring and managing cell culture together with the operation control panel 13.
  • the suspension cells peripheral blood mononuclear cells, LAK cells (Lymphokine Activated Killer cells), neural stem cells, ES cells and the like are known. These floating cells are hereinafter simply referred to as cells. These cells are cultured after being stimulated with an inducer suitable for each cell. Each inducer differs from cell to cell, for example, anti-human CD3 antibody in LAK cells, epithelial growth factor such as EGF in neural stem cell inducer, and fiber such as FGF-8b in inducer of ES cells It is a blast growth factor.
  • the cell culture device 10 can also be applied when culturing adhesion-dependent cells other than the suspension cells.
  • the culture unit 12 includes a plurality of (for example, eight) casters 16 (Fig. 2 and Fig. 5) separated from each other in the thermostatic chamber 11 and housed in each caster 16.
  • Culture cassette 17 (FIGS. 2 and 3).
  • the culture cassette 17 includes a culture bag 18 as a growth culture container, a cell inoculation cassette 19 as an induction factor stimulation culture container, and a medium cassette 20 as a medium storage means.
  • the cells in these culture vessels (culture no. 18, cell inoculation cassette 19) are cultured in an independent culture environment for each caster 16.
  • the thermostatic chamber 11 is provided with a multi-stage shelf 23 in a thermostatic chamber body 22 having a body door 21 that can be opened and closed, and one canister 16 is provided on each shelf 23. Be placed.
  • the thermostatic chamber 11 is closed to the environment (temperature, Maintain humidity and C02 concentration) in the environment necessary for culturing the cells.
  • a temperature sensor 24, a C02 sensor 25, a door sensor 26, and a heater 27 are disposed in the thermostatic chamber body 22.
  • Gas cylinder 28 installed outside is connected. Signals from the temperature sensor 24, the C02 sensor 25, and the door sensor 26 are transmitted to the operation control panel 13.
  • This operation control panel 13 controls the heater 27 based on the temperature signal from the temperature sensor 24, and controls the heater 27, and from the gas cylinder 28 to the thermostat body 22 based on the C02 concentration signal from the C02 sensor 25. Control the amount of C02 gas supplied to the inside.
  • the caster 16 has a caster door 31 attached to the caster body 30, and an intake filter 32 and an exhaust filter attached to the caster body 30. 33 is installed, and a blower fan 34 is installed on the intake filter 32 side of the caster body 30.
  • the intake filter 32 and the exhaust filter 33 are filters for removing bacteria, and when the air in the thermostat body 22 and the C02 gas are taken into the caster 16 by the operation of the blower fan 34, the thermostat tank Prevents inflow of bacteria from the body 22 into the caster 16.
  • the operation of the blower fan 34 is controlled by the operation control panel 13, and the operation of the blower fan 34 is performed when a signal indicating that the main body door 21 of the thermostatic chamber 11 is opened is transmitted from the door sensor 26 to the operation control panel 13. Is stopped, and the sealed state of the canister 16 is secured.
  • the function of preventing the inflow of bacteria from the thermostatic chamber body 22 into the caster 16 by the intake filter 32 and the exhaust filter 33, and ensuring the tightness of the caster 16 by stopping the operation of the blower fan 34, is provided for each carrier.
  • the inside of the star 16 is an independent culture environment.
  • the cells in the culture cassette 17 stored in one caster 16 in the thermostatic chamber 11 are isolated from the cells in the other casters 16 and stored in this caster 16. Contamination of cells in culture cassette 17 contaminated with various bacteria is prevented. Also, so-called cross-contamination that is contaminated by other patient's cells is prevented.
  • the caster body 30 is further provided with a door sensor 35, a door lock sensor 36, a temperature sensor 37, a humidity sensor 38, a door lock mechanism 39, a heater 40, and a circulation fan 41.
  • the operation control panel 13 controls the heater 40 based on the temperature signal from the temperature sensor 37. Ma
  • the operation control panel 13 controls the operation of the circulation fan 41 to circulate air and C02 gas in the canister 16.
  • the humidity sensor 38 detects the humidity in the canister 16 and transmits it to the operation control panel 13 to detect the abnormality. In this way, the inside of the canister 16 is maintained in an optimum environment for culturing cells.
  • the operation control panel 13 controls the operation of the door lock mechanism 39 so that two or more caster doors 31 do not open simultaneously in one thermostatic chamber 11. As a result, it is possible to prevent cells and culture media from being mixed and transferred between different casters 16.
  • the lock operation of the door lock mechanism 39 is detected by the door lock sensor 36 and transmitted to the operation control panel 13.
  • the open / close state of the canister door 31 is detected by the door sensor 35 and transmitted to the operation control panel 13.
  • a stage 42 is provided for supporting the culture cassette 17 stored in the caster 16, and a weighing scale 43 is installed on the stage 42.
  • This weighing scale 43 measures the weight of the culture bag 18 of the culture cassette 17 housed in the caster 16, and actually measures the amount of medium supplied from the culture cassette 20 to the culture bag 18. To do.
  • the measured value of the weigh scale 43 is also transmitted to the operation control panel 13.
  • the caster body 30 is provided with an indicator lamp 44. When automatic culture is performed in the caster 16, the indicator light 44 of the caster 16 is lit in red, for example, and the canister 16 for which an operation command is output and the culture cassette 17 is not housed inside.
  • the culture cassette 17 is a large tray 45 equipped with a culture bag 18, a cell inoculation cassette 19, and a medium cassette 20.
  • the culture bag 18 and the cell inoculation cassette 19 are A culture vessel for culturing cells.
  • the cell inoculation cassette 19 is a culture container for function expression for causing the cells to express functions (for example, proliferating the cells, differentiating the cells (described later), etc.).
  • Inducer for It is a culture vessel for stimulating an inducing factor that stimulates cells.
  • the culture bag 18 is a growth culture container for growing cells stimulated by the inducer in the cell inoculation cassette 19.
  • the culture bag 18 is a flexible disposable container for storing the culture solution inoculated with the cells.
  • the culture bag tray shown in Fig. 4 (A) is placed via the mounting table 46 (Fig. 5).
  • the culture bag tray 47 is detachably mounted on the large tray 45 shown in FIG. 3 and FIG.
  • the culture bag 18 is, for example, a nod which also has an oxygen-permeable material strength.
  • a first pump 48, a second pump 49, and a third pump 50 are arranged in the large tray 45.
  • One end side of the culture bag 18 is connected to the seventh connector 57 through the second pump 49 using the tube 63. Further, the other end of the culture bag 18 is connected to the first connector 51 using a tube 60.
  • the first pump 48, second pump 49, and third pump 50 are preferably peristaltic pumps because of the convenience of sterilization tube replacement.
  • one end of the tube 61 is connected to the third connector 53 and the other end is connected to the fifth connector 55.
  • the tube 61 is disposed in a rotary drive unit (not shown) of the first pump 48.
  • One end of the tube 63 is connected to the seventh connector 57 as described above, and the other end is connected to the culture bag 18.
  • the tube 63 is disposed in a rotation drive unit (not shown) of the second pump 49.
  • One end of the tube 62 is connected to the tube 61 by a connector X, and the other end is connected to the tube 63 by a connector Y.
  • the tube 62 is disposed in a non-illustrated rotary drive unit of the third pump 50.
  • the cell inoculation cassette 19 solidifies the inducer on the inside of the bottom surface of the inducer stimulating vessel 65, and puts the medium into the inducer stimulating vessel 65.
  • the medium is inoculated with cells, and this inducing factor stimulating vessel 65 is installed in the cassette frame 66, and is configured in a force set structure.
  • the operation of putting the inducer, medium and cells into the inducer stimulation container 65 is performed in a sterile condition in a clean bench or a safety cabinet (hereinafter referred to as a clean bench or the like in the present embodiment).
  • the mixed solution of the medium and the cells is referred to as a culture solution.
  • the cell inoculation cassette 19 is detachably attached to the large tray 45 as shown in FIG. Is done.
  • the second connector 52 and the fourth connector 54 of the cell inoculation cassette 19 are aseptically coupled to the first connector 51 and the third connector 53 of the large tray 45, respectively. That is, the first connector 51 and the second connector 52 are aseptically coupled by inserting the other needle-like coupling portion into one rubber-like coupling portion, for example. The same applies to the connection between the third connector 53 and the fourth connector 54.
  • the cell inoculation cassette 19 and the culture bag 18 in different culture environments, that is, the cells are stimulated with an inducing factor, and the cells are proliferated.
  • the cell inoculation cassette 19 having a culture environment for expressing the cells and the culture bag 18 having the culture environment for growing cells are connected. Therefore, the cells that have been stimulated by the inducer in the cell inoculation cassette 19 and have started to grow can be transferred to the culture bag 18, and only the growth can be performed in this culture bag 18.
  • the medium cassette 20 has a medium bag 67 as a medium storage container and a used medium bag 68 as a used medium storage container on a medium bag tray 69. Placed into a cassette structure.
  • the culture medium bag 67 stores the culture medium supplied to the culture knob 18 and the cell inoculation cassette 19.
  • the used medium bag 68 stores the used medium (supernatant) discharged from the culture bag 18. Since the culture cassette 20 is configured in the cassette structure, the culture bag 18 is maintained in the canister 16 and the culture cassette 17 in the canister 16 is simply installed in the culture cassette 17 to replace and supply the culture medium. Is possible.
  • the medium cassette 20 is detachably attached to the large tray 45 (Fig. 3).
  • the sixth connector 56 and the eighth connector 58 of the medium cassette 20 are connected to the fifth connector 55 and the seventh connector 57 of the large tray 45, respectively, and the first connector 51 and the second connector 52.
  • the culture medium bag 67 and the cell inoculation cassette 19 are connected.
  • the spent medium bag 68 and the culture bag 18 are connected by coupling the seventh connector 57 and the eighth connector 58.
  • the medium force in the medium bag 67 in the medium cassette 20 is activated by the activation of the first pump 48.
  • a closed system is constructed in which the cells are supplied to the culture bag 18 through the cell inoculation cassette 19 and the used medium in the culture bag 18 is discharged to the used medium bag 68 of the medium cassette 20 when the second pump 49 is activated. The With this closed system configuration, the system (culture bag 18, cell inoculation cassette 19 and medium cassette 20 is maintained in a sterile state.
  • the cell inoculation cassette 19 is replaced with a dummy cassette 70 when there are no more cells inside. This prevents the inducer in the cell inoculation cassette 19 from moving into the culture bag 18. Further, the medium cassette 20 is replaced with a new medium cassette 20 including a medium bag 67 filled with a medium and an empty used medium bag 68 when the medium bag 67 is empty. This exchange is performed by the operator. The dummy cassette 70 simply functions as a flow path for flowing the culture medium.
  • the first pump 48 is activated and the medium in the medium bag 67 of the medium cassette 20 is supplied (fed) to the culture bag 18.
  • the fed-batch culture in which the cells are propagated with the first pump 48 and the second pump 49 are started, and the spent medium in the culture bag 18 is discharged to the spent medium bag 68 of the medium cassette 20 and the medium no.
  • perfusion culture in which cells are grown by supplying the culture medium in the bag 67 to the culture bag 18, shaking culture using a shaking device 80 described later, and stationary culture without shaking.
  • perfusion culture includes intermittent perfusion culture in which spent medium discharge and medium supply are alternately performed, and continuous perfusion culture in which spent medium discharge and medium supply are performed simultaneously.
  • a filter 71 that normally prevents cell migration is disposed between the culture bag 18 and the second pump 49 in the tube 63, and the cells in the culture bag 18 are used as spent medium.
  • the bag 68 is prevented from being discharged.
  • the third pump 50 is activated when, for example, observing cells grown in the culture bag 18 with images. That is, if the filter 71 is not provided in the tube 63, the cells in the culture bag 18 are also transferred to the cell inoculation cassette 19 or the dummy cassette 70 through the tube 63, the tube 62, and the tube 61. The number of the proliferated cells is observed by being guided and imaged by a CCD force sensor 88 described later.
  • the filter 71 is disposed in the tube 63
  • the upstream side of the third pump 50 is connected to the culture bag 18 via the bypass tube 73, and the cells in the culture bag 18 are transferred to the bypass tube. Then, the light is introduced into the cell inoculation cassette 19 or the dummy cassette 70 through the tube 73 and the tube 62, and observed using the CCD camera 88.
  • the spent medium in the culture bag 18 is discharged into the used medium bag 68 of the medium cassette 20 and the cells in the culture bag 18 are concentrated. .
  • the spent medium is discharged by starting the second pump 49, and the volume of the culture solution in the culture bag 18 is reduced to about 1Z2 to about LZ3 by the control of the operation control panel 13 based on the measured value of the weighing scale 43. It is carried out until. Concentration of the cells in the culture bag 18 reduces the number of times of centrifugation by a centrifuge for the purpose of subsequent cell washing and concentration.
  • the used medium bag 68 is replaced with a cell collection bag 72 as a cell collection container that can be attached to a centrifuge.
  • the culture solution (medium and cells) in which the cells are concentrated in the culture bag 18 may be supplied into the cell collection bag 72 by starting the second pump 49. In this case, it is a condition that the tube 71 is not provided with the filter 71.
  • the cells can be collected in the canister 16 that is a closed system space by using a bag that can be attached to the centrifuge, and the work of collecting the cells can be saved.
  • the cell inoculation cassette 19 or the dummy cassette 70 is attached to the large tray 45.
  • a cell inoculation cassette sensor 74 to detect and a medium cassette sensor 75 to detect that the medium cassette 20 is mounted on the large tray 45 are installed.
  • the signals of these sensors 74 and 75 are transmitted to the operation control panel 13.
  • the operation control panel 13 confirms that the cell inoculation cassette 19 or the dummy cassette 70 is mounted on the large tray 45 of the culture cassette 17 and the medium cassette 20 is mounted, and then the first pump 48 and the second pump 49. And start the third pump 50.
  • the culture cassette 17 is housed in the caster 16 and the force by which the culture cassette 17 is supported by the stage 42 of the caster 16
  • a tilt motor 76, a cam mechanism 79, and a positioning sensor 77 are installed at a lower position where the culture bag tray 47 of the culture cassette 17 is arranged.
  • Culture bags on culture bag tray 47 18 The mounting table 46 that directly mounts a part thereof (not shown) is configured so that it can be moved up and down.
  • the tilt motor 76 rotates the cam mechanism 79 to raise and lower the elevating part of the mounting table 46.
  • the position of the lift is detected by the positioning sensor 77 and transmitted to the operation control panel 13.
  • the tilt motor 76 is controlled by the operation control panel 13 and is controlled to lower the elevating part of the mounting table 46 at the initial stage of culture in the culture bag 18. As a result, a liquid reservoir 78 (FIGS. 8 and 9) is formed in the culture nodule 18.
  • the culture solution (medium and cells) from the cell inoculation cassette 19 is stored in the liquid reservoir 78, thereby increasing the cell density per area in the culture bag 18. Therefore, the cells are efficiently proliferated at the initial stage of culture.
  • the tilting motor 76 raises the elevating part of the mounting table 46 via the cam mechanism 79 to keep the culture bag 18 in a horizontal state. As a result, the liquid reservoir 78 is eliminated.
  • a shaking mechanism 91 of a shaking device 80 is installed as a pressing means at an upper position where the culture bag tray 47 of the culture cassette 17 is arranged.
  • the shaking device 80 includes the shaking mechanism 91, the operating motor 81, the cam mechanism 90, and the position determining sensor 82.
  • an operation plate 85 is disposed on the apparatus frame 83 via a guide rod 84 so as to be movable up and down, and a plurality of protrusions 86 protrude from the bottom surface of the operation plate 85. It was established.
  • the actuating plate 85 is alternately moved upward or downward by the actuating motor 81 by the action of the cam mechanism 90 (Fig.
  • the culture bag 18 is repeatedly pressed, that is, the culture bag 18 is repeatedly pressed and released. As a result, the culture solution in the culture bag 18 is agitated, the cells in the culture bag 18 float and move in the culture solution, and the distribution of cells and the concentration of the components in the culture bag 18 are reduced. Cell growth is promoted by homogenization and increased oxygen supply capacity.
  • the position of the operation plate 85 is detected by the positioning sensor 82 and transmitted to the operation control panel 13, and the operation motor 81 is controlled by the operation control panel 13.
  • the cell culture (shaking culture) in the culture bag 18 using the shaking device 80 may be performed before the culture solution in the culture bag 18 is filled to about 1 or 2 times. It may be implemented after being done.
  • an LED 87 for illumination is obtained above the position where the cell inoculation cassette 19 or the dummy cassette 70 of the culture cassette 17 is arranged, and an image is obtained below.
  • a CCD camera 88 is installed as a means.
  • the illumination LED 87 illuminates the cell inoculation cassette 19 or the dummy cassette 70 from above.
  • the CCD camera 88 captures the image of the cells in the cell seed cassette 19 or the dummy cassette 70 with a downward force, and acquires the image.
  • the illumination operation of the LED 87 for illumination and the photographing operation of the CCD camera 88 are controlled by the operation control panel 13 (Fig. 6), and the cells in the cell inoculation cassette 19 or the dummy cassette 70 are controlled every predetermined time (for example, 6 hours).
  • An image is acquired.
  • the cell image at every predetermined time is stored in the image memory circuit 89 of the image processing computer 14.
  • the image processing computer 14 performs image processing, for example, binarization processing or multi-value processing, on a cell image for each predetermined time stored in the image memory circuit 89, thereby obtaining a single cell projection area. And the rate of increase of non-single cells, which are cell aggregates in which single cells aggregate, are calculated as evaluation parameters for cell culture.
  • the average value of the projected area of a single cell was determined by mounting the cell inoculation cassette 19 on the culture cassette 17 and storing the culture force set 17 in the canister 16 to start the culture.
  • the time force is also calculated from the cell image after 24 hours, for example.
  • a force is a non-single cell as described above is based on the fact that the projected area of a single cell at the initial stage of culture is less than 100 ⁇ m 2 , and therefore the non-single case where the projected area is 100 m 2 or more.
  • the rate of increase of non-single cells is calculated by calculating the change in the ratio of non-single cells to total cells from images of cells over time (for example, images after 24, 48, and 72 hours from the start of culture). Is calculated.
  • the image processing computer 14 also calculates the lag time for the average projected area force of a single cell, and estimates the growth start time of the cell.
  • the lag time is the time required for the induction period from inoculation of cells into the inducer stimulating vessel 65 of the cell inoculation cassette 19 until the start of growth.
  • the image processing computer 14 determines the culture status of the cell from the start of cell proliferation, that is, whether or not the cell has a possibility of proliferation by stimulation with an inducer. Then, the image processing computer 14 determines the cell determination result (for example, the cell If there is a possibility that the cells will grow, “YES”, if not, a signal such as “NO”) is transmitted to the operation control panel 13.
  • the operation control panel 13 When the operation control panel 13 receives a signal indicating that the possibility of growth of the cells in the induction factor stimulating container 65 of the cell inoculation cassette 19 is extremely low, the operation control panel 13 displays the state of the cells. It should be noted that cells with too long lag time are cells that are not easily stimulated by an inducing factor, and are judged to have a low possibility of proliferation.
  • the image processing computer 14 calculates the minimum doubling time of the cell from the increasing rate of the non-single cell.
  • the double time is the time required for the number of cells in a certain time to double.
  • the image processing computer 14 determines the culture state of the cell, that is, the proliferation ability of the cell from the minimum doubling time, and transmits it to the operation control panel 13.
  • the operation control panel 13 that receives the signal from the image processing computer 14 then moves the cells from the cell inoculation cassette 19 to the culture bag 18 based on the above-described cell growth ability, and transfers the medium to the culture bag 18. Determine the flow acceleration to be fed. It should be noted that a cell with a minimum fold time that is too long is determined to be a cell with extremely low proliferation ability.
  • the operation control panel 13 and the image processing computer 14 functioning as control means are a CPU that executes computation and control, a storage device (memory) that stores processing programs and data, and data. And an input device such as a keyboard for inputting commands and commands, an input device such as a mouse or touch panel, and an output device such as a monitor. Further, the image processing computer 14 includes an image memory circuit 89 for storing image data of the CCD camera 88 force.
  • images of cells in the cell inoculation cassette 19 taken every predetermined time by the CCD camera 88 are subjected to image processing (for example, binarization processing or multi-value processing).
  • image processing for example, binarization processing or multi-value processing.
  • Cell culture evaluation parameters average projected area of single cell, non-single cell increase acceleration), etc., and cell culture status (cell growth possibility, cell growth) from this cell culture evaluation parameter A program for determining the ability
  • the storage device of the operation control panel 13 includes devices related to the thermostat 11, the carriage 16 and the culture cassette 17 according to the cell culture conditions (for example, the first pump 48, the second pump 49, etc.) Is stored, and a program for executing the culturing operation is stored. Further, the storage device of the operation control panel 13 is based on signals from various sensors of the thermostat 11, the canister 16, and the culture cassette 17, such as controlling the CCD camera 88 every predetermined time to acquire cell images. A device control program for controlling devices related to the thermostatic chamber 11, the canister 16, and the culture cassette 17 is also stored.
  • the recording device of the operation control panel 13 is provided for each caster 16 of the thermostat 11 and for each of these.
  • a program for monitoring the cell culture state and a program for managing the cell culture operation for each of the caster 16 and the culture cassette 17 based on the cell culture-related data are stored.
  • the cell culture-related data are as follows: cells, medium, inducer, culture bag 18, large tray 45, medium bag 67, medium cassette 20, inducer stimulation container 65, cell inoculation cassette 19, cell recovery Back 72, operator's ID, thermostat 11, and each address of caster 16, etc.
  • Identification code that can be read with a barcode reader, thermostat 11, caster 16 and culture cassette, for example 17 sensors (temperature sensor 24, door sensor 35, medium cassette sensor 75, weigh scale 43, etc.) or detected by various devices (first pump 48, second pump 49, blower fan 34, operating motor 81, etc.)
  • Culture environment data indicating the operation state, cell image data acquired by the image processing computer 14 (image data by the CCD camera 88, image data after binarizing the image, and the like) At least one of the evaluation parameters, etc.) that issued calculated from the data.
  • the operation control panel 13 acquires, collects and accumulates cell culture-related data at predetermined times (for example, every minute) for each of the canister 16 and the culture cassette 17 in the thermostatic chamber 11 based on the above program. To do. Thereby, the culture history regarding the cells cultured in the arbitrary canister 16 and the culture cassette 17 in the thermostat 11 is automatically acquired regardless of the operator. Similarly, the operation control panel 13 observes the culture state of the cells based on the culture-related data for each of the caster 16 and the culture cassette 17 in the thermostat 11 and monitors whether there is an abnormality.
  • the operation control panel 13 replaces the culture medium cassette 20 for each of the caster 16 and the culture cassette 17 of the thermostatic chamber 11 (medium replacement operation), the replacement operation to the dummy cassette 70, and the cell recovery bag 72.
  • manage various culture operations such as the replacement operation, and notify the operator, etc. that the operation is encouraged. With this management, history and other information can be automatically recorded and stored, preventing artificial tampering and recording errors.
  • the monitoring computer 15 includes cell culture-related data, culture history data, data on presence / absence of abnormality, data on culture operation for each of the canister 16 and the culture cassette 17 of the thermostat 11 included in the operation control panel 13. Is received from the operation control panel 13 and saved so that it can be displayed (viewed) on the monitor. As a result, the operator observes and monitors the culture of the cells cultured in the thermostatic chamber 11 in the monitoring chamber 95 other than the culture chamber 94 where the thermostatic bath 11 is installed, and manages and manages it. It becomes possible to do. With this management, history and other information can be recorded and stored automatically, preventing human falsification and recording errors.
  • a bar code reader is used to inoculate the inducer stimulating vessel.
  • 65 IDs, IDs assigned to the storage containers for the induction factor and medium, cell samples, and operator IDs are acquired by the operation control panel 13 together with the operation date and time and transmitted to the monitoring computer 15.
  • the inducer stimulation container 65 is mounted on the cell inoculation cassette 19
  • the barcode reader is used with the ID of the induction factor stimulation container 65, the ID of the cell inoculation cassette 19 and the operator ID together with the operation date and time. Is acquired by the operation control panel 13 and transmitted to the monitoring computer 15.
  • the ID of the culture bag 18, the ID of the large tray 45, and the operator ID are acquired by the operation control panel 13 using the bar code reader together with the operation date and time. Sent to the monitoring computer 15.
  • the culture medium bag 67 and the used culture medium bag 68 are mounted on the culture medium cassette 20, the ID of the culture medium back 67, the ID of the culture medium cassette 20 and the operator ID are used together with the operation date and time, and a no code reader is used. Is acquired by the operation control panel 13 and transmitted to the monitoring computer 15.
  • the addresses of the thermostat 11 and the caster 16, the ID of the large tray 45, and the operator is acquired together with the operation date and time by the operation control panel 13 using a bar code reader and transmitted to the monitoring computer 15.
  • the medium cassette 20 is mounted on the large tray 45 stored in the canister 16 of the thermostat 11, the addresses of the thermostat 11 and the canister 16, the ID of the medium cassette 20, and the operator ID are stored.
  • the operation date and time it is acquired by the operation control panel 13 using a bar code reader and transmitted to the monitoring computer 15.
  • the addresses of the thermostat 11 and canister 16 and the cell inoculation cassette 19 are acquired together with the operation date and time by the operation control panel 13 using a barcode reader and transmitted to the monitoring computer 15.
  • the canister Operation and stop status of various devices such as the blower fan 34 and the first pump 48
  • measurement data of various sensors temperature sensor 37, weight scale 43, etc.
  • the image data of cells taken by the CCD camera 88, the processing data obtained by binarizing the image data, and evaluation parameters, along with the date and time and the address of the caster 16, are processed. Obtained from the computer 14 to the operation control panel 13 and transmitted to the monitoring computer 15. At this time, the operation control panel 13 outputs control signals for controlling various devices to the thermostat 11, the caster 16 and the culture cassette 17 as described above.
  • the lock mechanism 39 is activated to release the door lock, and the signal from the cell inoculation cassette sensor 74 or the medium cassette sensor 75 is replaced with the above dummy force set 70, the medium cassette 20 is replaced (medium replacement), the cell Confirm replacement with collection bag 72.
  • Fig. 20 when cells are collected in the cell collection bag 72 after cell culture is completed, the corresponding constant temperature is removed when the medium cassette 20 equipped with the cell collection bag 72 is removed.
  • Address of tank 11 and caster 16, ID of medium cassette 20, ID of cell recovery bag 72 The operator ID is acquired by the operation control panel 13 together with the operation date and time, and is transmitted to the monitoring computer 15. Thereafter, when the cell collection bag 72 is removed from the medium cassette 20 with a clean bench or the like, the ID of the medium cassette 20, the ID of the cell collection bag 72 and the operator ID are acquired in the operation control panel 13 together with the operation date and time. Sent to monitoring computer 15
  • the operation control panel 13 and the image processing computer 14 execute the above-described program to culture the cells.
  • the operation control panel 13 and the image processing converter 14 set and control the culture environment independently for each canister 16 in the thermostatic chamber 11, and the culture cassettes stored in each canister 16. Cells in 17 are cultured.
  • FIG. 8 to FIG. 13 show the induction factor-stimulated intermittent perfusion culture process, in which cells are collected in the culture bag 18.
  • the operator places an empty culture bag 18 on the culture bag tray 47 via the mounting table 46, and places the culture bag tray 47 on the large tray 45.
  • the culture bag 18 is connected to the first pump 48, the second pump 49, and the third pump 50.
  • the operator carries the large tray 45 into the single canister 16 of the thermostatic chamber 11 in which the indicator lamp 44 is lit in green, for example, and supports it on the stage 42. Then, the operator solidifies the inducing factor in the inducing factor stimulating vessel 65 in a clean bench or the like, puts the medium, and inoculates the cells with the cell inoculation cassette 19, as shown in FIG. Mount on the large tray 45 in the caster 16. Subsequently, the operator attaches the medium cassette 20 in which the medium is put into the medium bag 67 in the clean bench or the like to the large tray 45 in the caster 16 (Sl in FIG. 12).
  • the operator outputs an image output from the CCD camera 8 8 in the caster 16 in which the culture tray 18 having the culture bag 18, the cell inoculation cassette 19 and the medium force set 20 mounted on the large tray 45. Confirm (S2 in Fig. 12). Before or after confirming the image output, the operator activates the tilt motor 76 of the canister 16 to lower the elevating part of the mounting table 46 and form the liquid reservoir 78 in the culture bag 18. Further, the operator measures the weight of the empty culture bag 18 with the weight meter 43 of the caster 16. [0144] After that, as shown in FIG. 9A, the operator closes the caster door 31 and starts culturing cells in the canister 16 (S3 in FIG. 12).
  • the cells are stimulated by the inducer for growth in the inducer stimulation container 65 of the cell inoculation cassette 19 (S4 in FIG. 12).
  • the CCD camera 88 of the caster 16 images the cells in the induction factor stimulation container 65 of the cell inoculation cassette 19 every predetermined time (for example, 6 hours), and the image processing computer 14 uses this imaging image power. Cell culture evaluation parameters are calculated. Further, the image processing computer 14 also calculates the lag time for this evaluation parameter force, determines whether the cell is stimulated by the induction factor and has a possibility of proliferation, and further calculates the minimum doubling time. And determine the proliferation ability of the cell (S5 in FIG. 12).
  • the operation control panel 13 receives the growth from the image processing computer 14 even if the cells are stimulated by the inducer in the inducer stimulation container 65 of the cell inoculation cassette 19 and the force is also applied for a predetermined time (eg, 72 hours). When a signal is received that the possibility is not recognized, a message to that effect is displayed. When the operation control panel 13 receives a signal from the image processing computer 14 that the cells in the induction factor stimulating vessel 65 of the cell inoculation cassette 19 have been determined to be proliferating, the operation control panel 13 Based on the above, the timing for transferring the cells to the culture bag 18 and the flow acceleration of the medium into the culture bag 18 are determined.
  • a predetermined time eg, 72 hours
  • the operation control panel 13 operates the first pump 48 to feed the medium in the medium bag 67 of the medium force set 20 to the cell inoculation cassette 19 as shown in FIG.
  • the cells in the inducer stimulation container 65 of the cell inoculation cassette 19 are transferred to the culture bag 18 and the medium in the medium bag 67 is fed to the culture bag 18 (S6 in FIG. 12).
  • the operation control panel 13 controls the culture solution in the culture bag 18 measured by the weighing scale 43. It is determined whether or not the weight exceeds the predetermined value b (S10 in FIG. 12). When the weight exceeds the predetermined value b, the operation motor 81 is started. As a result, the shaking device 80 operates as shown in FIG. 10 (B), and shaking culture in which the operating plate 85 in the shaking mechanism 91 of the shaking device 80 repeatedly presses the culture bag 18 is started (FIG. 12). Sl l). The operation control panel 13 continues to determine whether or not the weight of the culture solution in the culture bag 18 measured by the weigh scale 43 has reached the predetermined value c (S12 in FIG. 12).
  • the first pump 48 is stopped, the feeding of the medium from the medium bag 67 of the medium cassette 20 to the culture bag 18 is stopped, the operation motor 81 is stopped, and the inside of the culture bag 18 is stopped. Is stopped (S 13 in FIG. 13).
  • the operation control panel 13 operates the second pump 49, and as shown in Fig. 11 (A), the spent medium (culture medium) in the culture bag 18 is operated. The supernatant in the bag 18) is discharged into the used medium bag 68 of the medium cassette 20 (S14 in FIG. 13). Thereafter, the operation control panel 13 activates the first pump 48 to feed the medium from the medium bag 67 of the medium cassette 20 to the culture bag 18, starts the operation motor 81, and uses the shaking device 80 to incubate the culture bag 18. The shaking culture is performed inside (S15 in FIG. 13).
  • the operation control panel 13 stops the first pump 48 to stop the feeding of the medium from the medium bag 67 of the medium cassette 20 to the culture bag 18, stops the operating motor 81, and the culture bag 18 The shaking culture in the inside is stopped (S16 in Fig. 13).
  • the operation control panel 13 determines whether or not the force has reached a desired culture period depending on the use date and time of the cells to be proliferated, or the image processing computer 14 force cells in the culture bag 18 Is determined whether or not the power reaches the desired number of cells (S17 in FIG. 13).
  • the operation control panel 13 activates the third pump 50 (Fig. 11 (A)), and the cells in the culture bag 18 are activated. A part of the cell is transferred to the cell inoculation cassette 19 or the dummy cassette 70 (in most cases, the dummy cassette 70), and the CCD camera 88 images the cells.
  • the image of the cell is processed by the image processing computer 14, and it is determined whether the number of cells is equal to or greater than a specified value and transmitted to the operation control panel 13.
  • the operation control panel 13 repeats the processing operations of steps S14 to S17 when the culturing period or the number of cells has not been reached.
  • steps S13 to S17 are performed by discharging the culture medium used in the culture bag 18 and Is an intermittent perfusion culture in which new medium supply (feeding) is performed alternately in
  • steps S9 to S17 the presence or absence of cells in the induction factor stimulation container 65 of the cell inoculation cassette 19 is confirmed by the CCD camera 88, and the operation control panel 13 confirms that the cells are in the induction factor stimulation container 65. If it does not exist, the operator is prompted to replace the cell inoculation cassette 19 with the dummy cassette 70 so that the induction factor does not flow into the culture bag 18 from the induction factor stimulation vessel 65. When replacing the dummy cassette 70, the operation control panel 13 completes the replacement of the medium cassette 20 into the culture bag 18 from the medium cassette 20 and the shaking culture by the shaking device 80. Suspend until
  • Steps S9 to S17 when the operation control panel 13 determines that the medium has disappeared in the medium bag 67 of the medium power set 20 from the measured value of the weight scale 43, the medium cassette 20 is newly replaced. Encourage the operator to replace the media cassette 20. Even when the medium cassette 20 is replaced, the operation control panel 13 can replace the medium cassette 20 with the medium fed from the medium cassette 20 to the culture bag 18 and the shaking culture with the shaking device 80. Suspend until complete.
  • the operation control panel 13 When the operation control panel 13 reaches the desired culture period or reaches the desired cell number in step S17, the operation control panel 13 stops shaking, and after cell sedimentation, as shown in Fig. 11 (B).
  • the second pump 49 is activated, the spent medium in the culture bag 18 is discharged to the spent medium bag 68 of the medium cassette 20, and the culture solution in the culture bag 18 is discharged based on the measured value of the weighing scale 43.
  • About 1Z2 ⁇ Concentrate cells to about LZ3 (S18 in Fig. 12).
  • the operation control panel 13 then stops the second pump 49 and ends the cell culture (S 19 in FIG. 12). After completion of the culture, the operator moves the cells in the culture bag 18 to a centrifuge container in a clean bench or the like, and then collects the cells by centrifugation (S20 in FIG. 12).
  • FIGS. 14 and 15 show a case where the same factor-stimulated intermittent perfusion culture process includes a process of collecting cells with the cell collection bag 72 (FIG. 5). Accordingly, steps S21 to S38 in the steps shown in FIGS. 14 and 15 are the same as steps S1 to S18 in FIGS. [0156]
  • step S38 shown in Fig. 15 after the cells in the culture bag 18 are concentrated by starting the second pump 49, the operation control panel 13 stops the second pump 49 and the medium cassette 20 has been used. The operator is prompted to replace the medium bag 68 with the cell collection bag 72 (FIG. 5) (S39 in FIG. 13).
  • the cell collection bag 72 is a bag that can be attached to a centrifuge and used for centrifugation.
  • the operation control panel 13 activates the second pump 49 and the operating motor 81, and the shaking bag 80 causes the culture bag 18 to be activated. While shaking the inside, the cells in the culture bag 18 are transferred together with the medium to the cell recovery bag 72 attached to the medium cassette 20 (S40 in FIG. 15). The operation control panel 13 then stops the second pump 49 and the operating motor 81 to stop the cell culture (S41 in FIG. 15). After completion of the culture, the operator attaches the cell collection bag 72 to the centrifuge and collects the cells by centrifugation (S42 in FIG. 15).
  • Steps S51 to S62 in the induction factor stimulation continuous perfusion culture process shown in FIGS. 16 and 17 are the same as steps S1 to S12 in the induction factor stimulation intermittent perfusion culture process of FIGS. Is omitted.
  • a filter 71 is disposed between the culture bag 18 and the second pump 49.
  • the operation control panel 13 is fed with the medium from the medium bag 67 of the medium cassette 20 into the culture bag 18 (S56 in Fig. 16), and during the shaking culture by the shaking device 80 in the culture bag 18 ( (S61 in Fig. 16)
  • the second pump 49 is activated and the spent medium in the culture bag 18 is removed. Drain the media cassette 20 into the used media bag 68.
  • continuous perfusion culture in which feeding of the medium to the culture bag 18 and discharging of the spent medium from the culture bag 18 is started in the culture bag 18 (S63 in FIG. 17).
  • the cells in the culture bag 18 are blocked from flowing by the filter 71 and do not flow into the spent medium bag 68.
  • shaking culture with the shaking device 80 is also performed at the same time.
  • the operation control panel 13 reaches a desired culture period depending on the use date and time of the cells to be proliferated. Or whether or not the image processing computer 14 has reached the desired number of cells in the culture bag 18 (S64 in FIG. 17). When determining whether or not the cell has reached the desired number of cells in the culture bag 18, the operation control panel 13 activates the third pump 50 to transfer some of the cells in the culture bag 18 to the cell inoculation cassette. Move to 19 or dummy force set 70 (in most cases, dummy cassette 70) and have the CCD camera 88 take a picture of this cell.
  • the image of the cell is processed by the image processing computer 14, and it is determined whether or not the number of cells is equal to or greater than a specified value, and is transmitted to the operation control panel 13. Then, the operation control panel 13 repeats the continuous perfusion culture in step S63 when the culture period or the number of cells has not been reached.
  • steps S59 to S64 the presence or absence of cells in the induction factor stimulation container 65 of the cell inoculation cassette 19 is confirmed by the CCD camera 88, and the operation control panel 13 is installed in the induction factor stimulation container 65.
  • the operator is prompted to replace the cell inoculation cassette 19 with the dummy cassette 70 so that the induction factor does not flow into the culture bag 18 from the induction factor stimulation vessel 65.
  • the operation control panel 13 completes the replacement of the medium cassette 20 into the culture bag 18 from the medium cassette 20 and the shaking culture by the shaking device 80 into the dummy cassette 70. Suspend until
  • steps S59 to S64 when the operation control panel 13 determines that the medium is no longer in the medium bag 67 of the culture force set 20 from the measured value of the weight scale 43, the operation control panel 13 renews the medium cassette 20. Encourage the operator to replace the media cassette 20. Even when the medium cassette 20 is replaced, the operation control panel 13 can replace the medium cassette 20 with the medium fed from the medium cassette 20 to the culture bag 18 and the shaking culture with the shaking device 80. Suspend until complete.
  • the operation control panel 13 stops the first pump 48, the second pump 49, and the operation motor 81 at the time when the desired culture period in step S64 or the desired number of cells is reached, and the perfusion is performed.
  • the culture and shaking culture are stopped (S65 in FIG. 17).
  • the operation control panel 13 starts the second pump 49, discharges the used medium in the culture bag 18 to the used medium bag 68 of the medium cassette 20, and cultures based on the measured value of the weighing scale 43. Concentrate the cells until the culture in bag 18 is about 1Z2 to 1Z3. (S66 in Fig. 17).
  • the reason for stopping the shaking device during the concentration process is to prevent a large amount of cells from entering the tube and clogging the filter.
  • the operation control panel 13 then stops the second pump 49 and ends the cell culture (S 67 in FIG. 17). After this culture is completed, the operator moves the cells in the culture bag 18 to a centrifuge container in a clean bench or the like, and then collects the cells by centrifugation (S68 in FIG. 17).
  • the image of the cells in the cell inoculation cassette 19 imaged by the CCD camera 88 is processed by the image processing computer 14 to evaluate the cell culture evaluation parameters (average single cell projection area, non-single cell The rate of increase) is obtained, and the culture status (proliferation potential and proliferation ability of the cell) is evaluated.
  • the operation control panel 13 performs culture operations according to the culture conditions (such as the timing of cell transfer from the cell inoculation cassette 19 to the culture bag 18 and the addition of medium at a predetermined flow acceleration from the medium cassette 20 to the culture bag 18). ).
  • the culture conditions can be determined in a non-contact * non-invasive state, thus avoiding the risk of contamination and cell loss due to sampling that does not damage the cells.
  • the cells of one patient are inoculated into the cell inoculation cassette 19 of the culture cassette 17 housed in a single caster 16, and the culture operation according to the culture state of the cells is performed for each of these cells. Therefore, it is possible to realize an appropriate culture operation for each patient and to avoid cross contamination.
  • the culturing operation can be performed in units of time, culturing is promoted, and the culturing period can be shortened.
  • the medium cassette 20 is configured in a cassette structure and connected to the culture bag 18 and the cell inoculation cassette 19 also configured in a cassette structure, It can always be kept in the caster 16 in the optimum environment for culture.
  • the medium can be exchanged by simply opening and closing the main body door 21 of the thermostat 11 and the caster door 31 of the caster 16, it is possible to reduce the number of times the doors 21 and 31 are opened and closed. 11 and the change of the culture environment in the caster 16 can be suppressed. As a result, damage to the cells in the culture bag 18 due to environmental changes can be reduced, and aseptic operation for supplying the culture medium to the culture bag 18 in a clean bench or the like can be omitted.
  • the protrusion 86 of the working plate 85 in the shaking mechanism 91 of the shaking device 80 repeatedly presses the flexible culture bag 18 containing the medium inoculated with the cells, so that the inside of the culture bag 18 Since the culture solution is stirred, the cell distribution in the culture bag 18 and the concentration of the components in the medium are made uniform, and the oxygen supply ability is increased, thereby promoting cell growth. Cell culture efficiency can be improved.
  • the operation control panel 13 and the monitoring computer 15 collect and accumulate cell culture-related data related to cell culture for each culture unit 12 (canister 16 and culture cassette 17) in the thermostatic chamber 11. Therefore, it is possible to accurately grasp the culture history of the cells cultured in any culture unit 12.
  • the operation control panel 13 and the monitoring computer 15 monitor the cell culture state for each culture unit 12 (caster 16 and culture cassette 17) in the thermostatic chamber 11 based on cell culture-related data.
  • the culture state abnormality can be monitored for each culture unit 12.
  • the operation control panel 13 and the monitoring computer 15 replace the medium (exchange medium cassette 20) for each culture unit 12 (caster 16 and culture cassette 17) in the thermostat 11 based on the cell culture-related data. ) And cell collection after culturing (cell collection with culture bag 18 or cell collection bag 72), etc., and operations performed by the operator for each culture unit 12 in the thermostat 11 (operation) A work schedule can be easily created.
  • the management means is installed in the culture chamber 94 together with the thermostat 11, and has a function of controlling the culture in each culture unit 12 (the caster 16 and the culture cassette 17) of the thermostat 11.
  • An operation control panel 13 and a monitoring computer 15 which is installed in a monitoring room 95 other than the culture room 94 and receives, stores and displays (views) data held by the operation control panel 13.
  • the state of cell culture in the culture unit 12 in the thermostat 11 in the culture chamber 94 is observed and monitored in a monitoring room 95 other than the culture room 94 using the monitoring computer 15 and managed. can do.
  • history and other information can be recorded and stored automatically, preventing human falsification and recording errors.
  • the casters 16 of the thermostatic chamber 11 constituting the culture unit 12 are configured to be separated from each other by the intake filter 32 and the exhaust filter 33 so that cells or Z and bacteria do not enter and exit. Therefore, culture bags 18 and cells stored in each caster 16 It is possible to prevent contamination of the cells in the inoculation cassette 19 with bacteria.
  • each caster 16 in one thermostat 11 Since only one of the caster doors 31 of each caster 16 in one thermostat 11 is open, each caster 16 in one thermostat 11 Since two or more of the caster doors 31 are not opened at the same time, it is possible to prevent the culture bag 18 and the cell inoculation cassette 19 from being transferred in and out of the caster 16, and the cells are contaminated with each other. Cross contamination can be prevented.
  • FIG. 21 is a layout diagram showing the configuration (differentiation induction state) of the culture unit in the second embodiment of the cell culture device according to the present invention.
  • FIG. 22 is a layout diagram showing the configuration of the culture unit of FIG. In the second embodiment, the same parts as those in the first embodiment are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted.
  • the cell culture device 100 according to the second embodiment is different from the cell inoculation cassette 19 (Fig. 5) in the cell culture device 10 according to the first embodiment in the differentiation induction culture in which a differentiation inducing factor is added in advance. It is replaced with a sorting guide cassette 101 as a container.
  • this cell culture device 100 after the medium is introduced from the medium bag 67 of the medium cassette 20 to the culture bag 18 by starting the second pump 49 to proliferate the cells, the proliferated cells are transferred to the first pump 48. Is activated to give the cell a role, that is, the cell is differentiated.
  • differentiation means giving a cell a role as a heart cell, a role as a liver cell, or the like.
  • a dummy cassette 102 is arranged instead of the differentiation induction cassette 101 as shown in FIG.
  • Used medium power in culture bag 18 First cassette 48 activates medium cassette 2 via dummy cassette 102 It is discharged into a used medium bag 68 of 0. Similar to the dummy cassette 70 (FIG. 5), the dummy cassette 102 simply functions as a flow path for allowing the medium to flow.
  • the CCD camera 88 takes images of cells that are differentiated in the differentiation-inducing cassette 101 at predetermined time intervals.
  • Program power for executing this photographing is stored in the recording device of the operation control panel 13.
  • the image processing computer 14 performs, for example, a binarization process or a multi-value process on the cell image, and acquires the cell state as an evaluation parameter.
  • a program for executing the acquisition of the evaluation parameter is stored in the recording device of the image processing computer 14.
  • the image processing computer 14 also determines whether or not the cell has been differentiated with respect to the time-dependent change of the cell morphology.
  • the operation control panel 13 that has received a signal from the image processing computer 14 controls the differentiation induction operation by the differentiation induction cassette 101.
  • the operation control panel 13 continues the guidance operation, and otherwise displays that fact. To do.
  • a program for executing the above-described differentiation determination is recorded in the recording device of the image processing computer 14, and is stored in the recording device of the operation control panel 13 in order to execute the separation guidance operation.
  • a program for monitoring the cell culture state and a program for managing the cell culture operation are stored. Based on the above program, the operation control panel 13 collects and accumulates cell culture-related data for each of the canister 16 and the culture cassette 17 in the thermostat 11, almost as in the case of the first embodiment. Monitors the presence or absence of abnormalities and manages culture operations such as replacement of the medium cassette 20 (medium replacement operation) and replacement of the dummy cassette 102 with the dispensing guide cassette 101.
  • the monitoring computer 15 includes cell culture related data, culture history data, data on presence / absence of abnormality for each of the caster 16 and the culture cassette 17 of the thermostatic chamber 11, Data concerning the culture operation is received from the operation control panel 13 and stored, and can be displayed (viewed) on the monitor.
  • the cell culture-related data is acquired in the same manner as in the first embodiment.
  • the case for the guidance cassette 101 is different. That is, before cell culture (see FIG. 18), when the differentiation-inducing factor 103 is added to the differentiation-inducing container 103 (FIG. 21) of the differentiation-inducing cassette 101 in a talin bench or the like, the ID of this differentiation-inducing container 103, Differentiation induction factor ID and operator ID power The operation date and time are acquired by the operation control panel 13 and transmitted to the monitoring computer 15.
  • the differentiation induction container 103 is mounted on the differentiation induction cassette 101, it is acquired by the operation control panel 13 together with the ID of the differentiation induction container 103, the ID of the separation induction cassette 101, and the operator ID force operation date and time. Is sent to the computer 15.
  • the operation control panel 13 When the dummy cassette 102 is removed and replaced with the distribution induction cassette 101, the addresses of the thermostat 11 and caster 16, the ID of the differentiation induction cassette 101, the large tray 45 The ID and the operator ID are acquired by the operation control panel 13 together with the operation date and time, and transmitted to the monitoring computer 15.
  • the operator adds a medium and cells to the culture bag 18 in a clean bench or the like (S71 in FIG. 23), and places the culture bag 18 on the culture bag tray 47 via the mounting table 46. Attach this culture bag tray 47 to the large tray 45 (S72 in FIG. 23). Then, the operator carries the large tray 45 into the single canister 16 of the thermostatic chamber 11 in which the indicator lamp 44 is lit in green, for example.
  • the operator attaches the medium cassette 20 to the large tray 45 in the canister 16 and attaches the dummy cassette 102 (FIG. 22) (S73 in FIG. 23). Then, the operator closes the caster door 31 of the canister 16 and starts stationary culture of the cells in the culture bag 18 (S74 in FIG. 23). In this stationary culture, when the culture medium is initially small in the culture bag 18, the operator activates the tilt motor 76 to lower the elevating part of the mounting table 46, and the culture bag 18 has a liquid storage part 78. (Fig. 8) is formed.
  • the operation control panel 13 activates the second pump 49 to feed the medium from the medium bag 67 of the medium cassette 20 to the culture bag 18 (S75 in Fig. 23).
  • the operation control panel 13 also confirms whether or not the culture solution in the culture bag 18 has exceeded the predetermined value a by checking the measured value force of the weigh scale 43 (S76 in FIG. 23). When the value exceeds the specified value a
  • the tilt motor 76 is activated to raise the elevating part of the mounting table 46, and the culture bag 18 is set in a horizontal state to eliminate the liquid reservoir 78 (S77 in FIG. 23).
  • the operation control panel 13 determines whether or not the weight of the culture solution in the culture bag 18 measured by the weigh scale 43 is equal to or greater than the predetermined value b (S78 in FIG. 23). At this point, the operating motor 81 is activated, and the shaking device 80 is activated to start shaking culture (S79 in FIG. 23). The operation control panel 13 continues to determine whether or not the force of the culture solution in the culture bag 18 measured by the weigh scale 43 exceeds the predetermined value c (S80 in FIG. 23). At this point, the second pump 49 is stopped, the feeding of the medium from the medium bag 67 of the medium cassette 20 to the culture bag 18 is stopped, the operation motor 81 is stopped, and the inside of the culture bag 18 is stopped. Is stopped (S81 in FIG. 23).
  • the operation control panel 13 operates the first pump 48 to remove the spent medium (the supernatant in the culture bag 18) from the culture cassette 2 It is discharged into the used medium bag 68 of 0 (S82 in FIG. 24). Thereafter, the operation control panel 13 activates the second pump 49, feeds the medium from the medium bag 67 of the medium cassette 20 to the culture bag 18, activates the operating motor 81, and the shaking device 80 in the culture bag 18 Shake culture at (S83 in Fig. 24). After a predetermined time has elapsed, the operation control panel 13 stops the second pump 49, stops feeding the medium from the medium bag 67 of the medium cassette 20 to the culture bag 18, stops the operation motor 81, and stops the culture bag. Stop shaking culture in 18 (S84 in Fig. 24)
  • the operation control panel 13 determines whether or not the force has reached a desired culture period depending on the use date and time of the cells to be proliferated, or the image processing computer 14 force cells in the culture bag 18 Is determined whether or not the force has reached the desired number of cells (S85 in FIG. 24).
  • the operation control panel 13 activates the third pump 50 to transfer some of the cells in the culture bag 18 to the dummy cassette 102. And let the CCD camera 88 take pictures of these cells.
  • the image processing computer 14 performs image processing on the cell image, determines whether or not the number of cells is equal to or greater than a specified value, and transmits the image to the operation control panel 13.
  • the operation control panel 13 repeats the operations of steps S82 to S85 when the culturing period or the number of cells has not been reached.
  • the above steps S81 to S85 are intermittent perfusion culture in which discharge of the used medium in the culture bag 18 and supply of new medium (feeding) into the culture bag 18 are performed alternately. Is
  • Steps S77 to S85 if the operation control panel 13 determines that the medium is no longer in the medium bag 67 of the medium cassette 20 from the measured value of the weight scale 43, the medium cassette 20 is updated. Encourage the operator to replace the sputum medium force set. Even when the medium cassette 20 is replaced, the operation control panel 13 replaces the medium cassette 20 with the addition of the medium from the medium cassette 20 to the culture bag 18 and the shaking culture with the shaking device 80. Suspend until is completed.
  • the operation control panel 13 activates the first pump 48 when the desired culture period is reached or the desired number of cells is reached in step S85, and the spent medium in the culture bag 18 is used for the medium cassette 20.
  • the cells are discharged into the finished medium bag 68, and the cells are concentrated until the culture solution in the culture bag 18 becomes about 1Z2 to 1Z3 based on the measurement value of the weight scale 43 (S86 in FIG. 24).
  • the operation control panel 13 activates the second pump 49 to feed the medium in the medium bag 67 of the medium cassette 20 to the culture bag 18, and to operate.
  • the motor 81 is activated and the culture bag 18 is shake-cultured with the shaking device 80 (S88 in FIG. 24).
  • the operation control panel 13 activates the first pump 48 and continues the culture in the culture bag 18 while shaking culture in the culture bag 18 and the flow of the medium from the culture cassette 20. Is moved to the distribution guide cassette 101 (S89 in FIG. 24).
  • sorting induction culture is started in the differentiation-inducing cassette 101 (S90 in FIG. 24).
  • the operation control panel 13 captures the cells in the sorting induction cassette 101 with the CCD camera 88 every predetermined time (for example, 6 hours).
  • the image processing computer 14 performs image processing on the captured image, acquires the cell morphology as an evaluation parameter, and determines whether or not the cell has been differentiated in the differentiation-inducing cassette 101 from the time-dependent change in the cell morphology. (S91 in Fig. 24).
  • the operation control panel 13 stops the second pump 49, the first pump 48, and the operating motor 81 when receiving the signal that the image processing computer 14 has also determined that the cells have been separated in step S91. Then, the differentiation-inducing culture is stopped and the cell culture is terminated (S92 in FIG. 24). After the completion of the culture, the operator collects the cells in the differentiation-inducing cassette 101 by a cell collection operation in a clean bench or the like. (S93 in Figure 24).
  • the cell culture apparatuses 10 and 100 both have cells cultured in one culture container among a plurality of culture containers for culturing cells in different culture environments, and transferred to another culture container on the downstream side. Yes.
  • cells are stimulated with an inducing factor for growth in the cell inoculation cassette 19 which is one culture container, and then the cell inoculation cassette 19 is cultured in another culture container.
  • the cells are transferred to the bag 18 to grow the cells.
  • the cell culture apparatus 100 after the cells are grown in the culture bag 18 which is one culture container, the cells are transferred from the culture bag 18 to the separation guide cassette 101 which is another culture container. The cells are separated.
  • cell culture equipment According to devices 10 and 100, variations in cell culture form can be expanded.
  • the image processing computer 14 performs image processing on the image of the CCD camera 88 to calculate an evaluation parameter, and based on the evaluation parameter, the cell culture status (cell proliferation possibility, cell proliferation The power described for determining the capability)
  • the operation control panel 13 may perform the function of the image processing computer 14.
  • cell images may be taken with the CCD camera 88 in the culture bag 18.
  • a filter 71 is placed between the second pump 49 and the culture bag 18. You don't have to.
  • the culture solution in order to grow cells, is stirred using the shaking device 80.
  • the culture bag 18 is vibrated up and down or left and right.
  • the medium may be swung to flow the culture solution to make the cell distribution and the medium component concentration uniform, and to increase the oxygen supply capacity.
  • the operation control panel 13 and the image processing computer 14 control each canister in one thermostat. However, there are a plurality of similar thermostats. The operation control panel 13 and the image processing computer 14 may execute control for each of the canisters in the thermostatic chamber.
  • the operation control panel 13 and the image processing computer 14 control the operation of each canister 16 in one thermostat 11, respectively.
  • the operation control panel 13 and the monitoring computer 15 monitor and manage the cell culture, a plurality of thermostats 11 as shown in the third embodiment shown in FIG.
  • One operation control panel 13 is arranged in the thermostat 11, and one image processing computer 14 and one monitoring computer 15 are connected to each operation control panel 13, respectively. It may be possible to observe, monitor, and manage the cell culture performed in each of the casters 16 of the plurality of thermostats 11. With this management, The history etc. can be recorded and stored automatically, preventing artificial tampering and recording mistakes.
  • the remote monitoring computer is connected to one monitoring computer 15 using the public communication line 104. 1 05 may be connected.
  • the remote monitoring computer is connected to one monitoring computer 15 using the public communication line 104. 1 05 may be connected.
  • a culture abnormality or the like in a specific canister 16 of a specific thermostat 11 can be quickly grasped at a remote place using the remote monitoring computer 105.
  • FIG. 26 is a configuration diagram showing a fourth embodiment of the cell culture device according to the present invention.
  • FIG. 27 shows one spatially independent culture chamber 240 and low temperature chamber 230 in the cell culture device 200 according to the fourth embodiment, and the culture bag tray 241 and the low greenhouse 230 stored in the culture chamber 240.
  • FIG. 6 is a layout diagram showing the configuration of a culture unit 212 composed of a medium bag tray 231 and a waste solution bag tray 232 stored in the container.
  • the cell culture device 200 shown in FIG. 26 is a device that specifically cultures floating cells used for immune cell therapy, and includes a culture device 210 having a plurality of (eg, three) culture units 212. All of the data, including the operation control PLC (programmable 'logic' controller) 223 for controlling the operation of the plurality of culture units 212, the image processing unit 221 for processing cell images, Data collection device 224 to be collected, touch panel 222 for displaying and inputting control information of operation control PLC 223 and image processing unit 221, operation control PLC 223, image processing unit 221, data collection device 224 via hub 225 And a monitoring computer 226 for monitoring the cell culture device 200 and the culture unit 212.
  • the operation control PLC 223 and the image processing unit 221 function as control means.
  • Each of the plurality of culture units 212 is equipped with an observation camera (CCD camera) 302.
  • peripheral blood mononuclear cells LAK cells (Lymphokine Activated Killer cells), neural stem cells, ES cells and the like are known as the suspension cells.
  • LAK cells Lymphokine Activated Killer cells
  • neural stem cells ES cells and the like are known as the suspension cells.
  • ES cells ES cells and the like are known as the suspension cells.
  • These floating cells are hereinafter simply referred to as cells.
  • This cell culture device 200 can also be applied when culturing adhesion-dependent cells (for example, mesenchymal stem cells) other than the above suspension cells.
  • the cell culture device 200 is a plurality of (for example, three) cultures that are spatially and structurally independent. In the structure in which the units 212 are stacked, each culture unit 212 is separated into a low temperature chamber 230 and a culture chamber 240 as shown in FIG.
  • a culture bag tray 241 In the cell culture apparatus 200, a culture bag tray 241, a medium bag tray 231 and a waste liquid bag tray 232 are stored.
  • a culture bag 242 as a culture container for antibody stimulation and proliferation is placed on the culture bag tray 241
  • a culture bag as a culture medium storage means is placed on the culture medium bag tray 231 and the waste solution bag tray 232.
  • (New medium bag) 233 and waste liquid nog (waste medium bag) 234 as a waste liquid storage means are mounted.
  • the culture unit 212 includes doors (not shown) that can be opened and closed in the culture chamber 240 and the low temperature chamber 230.
  • the culture unit 212 keeps the environment (temperature and C02 concentration) in the culture chamber 240 in an environment necessary for culturing cells while keeping the door closed, and the environment (temperature) in the low temperature chamber 230 is maintained. Maintain an optimal environment for medium storage.
  • the culture unit 212 is provided with temperature sensors 236 and 243, a C02 sensor 244, a door sensor (not shown), and a heater (not shown). Further, a gas cylinder (not shown) installed outside is connected to the cell culture apparatus 200 (culture unit 212) via a C02 supply system 245. Signals from the temperature sensors 236, 243, the C02 sensor 244 and the door sensor are transmitted to the operation control PLC 223.
  • This operation control PLC 223 controls the heater based on the temperature signal from the temperature sensors 236 and 243, and based on the C02 concentration signal from the C02 sensor 244, adjusts the gas cylinder power and the amount of C02 gas supplied into each culture unit 212. Control. C02 in the room is discharged by a predetermined amount by a circulating pump 246.
  • the operation of the stirring fan 247 is controlled by the PLC 223 for operation control, and the operation of the stirring fan 247 stops when a signal indicating that the door of the culture unit 212 is opened is also sent to the PLC 223 for operation control.
  • the environmental change in the culture unit 212 is alleviated.
  • the cell culture device 200 has a dry heat sterilization function, and the sterilization in the device and each tray can be sterilized with the culture bag tray, the medium bag tray, and the waste solution bag tray set. Yes, bacterial growth in the culture unit 212 can be prevented.
  • each culture unit 212 has an independent spatial structure, it is isolated from the cells in other culture units 212 and stored in the culture unit 212.
  • the culture bag 242, the medium bag 233, and the waste solution bag 234 are installed in the culture unit 212 after being connected in a clean bench or the like, so the culture bag 242 stored in the culture unit 212 is a closed system (not open) System), and contamination in which cells in the culture bag 242 are contaminated by various bacteria is prevented.
  • the culture unit 212 further includes a door sensor (not shown), a door lock sensor (not shown), a temperature sensor 236, 243, a door lock mechanism (not shown), a heater (not shown), and a stirring fan 247.
  • the operation control PLC 223 controls the heater based on the temperature signals from the temperature sensors 236 and 243.
  • the operation control PLC 223 controls the operation of the stirring fan 247 to circulate air and C02 gas in the culture chamber 240. In this way, the inside of the culture chamber 240 is maintained in an optimum environment for culturing cells.
  • the operation control PLC 223 controls the operation of the door lock mechanism so that the doors of two or more culture units 212 are not simultaneously opened in one cell culture device 200. As a result, it is possible to prevent cells and culture media from being mistakenly carried in between different culture units 212.
  • the lock operation of the door lock mechanism is detected from the door lock sensor and transmitted to the operation control PLC 223. Further, the open / closed state of the door of the culture unit 212 is detected by a door sensor and transmitted to the operation control PLC 223.
  • a frame 250 is provided to support the culture bag tray 241 stored in the culture chamber 240.
  • the weight of the frame 250 installed on the upper part of the culture unit 212 A total of 251 are installed in support.
  • This weigh scale 251 measures the weight of the culture bag 242 of the culture bag tray 241 housed in the culture chamber 240. In actuality, the amount of medium supplied from the culture medium bag 233 to the culture bag 242 is measured. And the amount of waste liquid discharged from the culture bag 242 to the waste liquid bag 234 is measured. The measured value of the weigh scale 251 is also transmitted to the operation control PLC 223.
  • the culture unit 212 is provided with an indicator lamp (not shown) that displays the presence / absence of the culture bag 242 in the culture unit 212.
  • the operation control PLC 223 lights the indicator light, for example, red, and the culture bag 242 is stored in the culture chamber 240! Sometimes, the indicator light is lit in green, for example.
  • the culture bag tray 241 will be described. As shown in FIG. 27, the culture bag tray 241 is equipped with a culture bag 242.
  • the culture bag 242 is a culture container for culturing cells.
  • the culture bag 242 is a culture container for function expression for expressing functions (eg, proliferating cells, differentiating cells, etc.) in the cells.
  • the cells are stimulated with antibodies for proliferation. It is a culture vessel for antibody stimulation. It is also a growth culture container for growing cells stimulated with antibodies in the same culture bag 242.
  • the culture bag 242 is a flexible container that stores a medium inoculated with cells, and is placed on the culture bag tray 241 via the placement table 252.
  • the culture bag 242 is, for example, a bag having an oxygen-permeable material strength.
  • a supply pump 261 and a discharge pump 271 are arranged in the culture chamber 240.
  • One end side of the culture bag 242 is connected to the supply system joint 264 through the supply pump 261 using the tube 262. Further, the other end side of the culture bag 242 is connected to a discharge system joint 274 via a discharge pump 271 using a tube 272.
  • the culture bag 242 is connected to the supply system joint 264 by the tube 262 and connected to the medium bag 233 by the tube 265.
  • the culture bag 242 is connected to the discharge system joint 274 via the tube 272 and also connected to the waste liquid bag 234 via the tube 275.
  • the antibody is solidified inside a part of the bottom surface connected to the supply pump 261 of the culture bag 242, and the culture bag 242 is filled with the medium.
  • Cells are inoculated into the culture medium, and the culture bag 242 is placed on the culture bag tray 241 to form a cassette structure.
  • the operation of solidifying the antibody in the culture bag 242 and placing the medium and cells is performed in a sterile condition in a clean bench or the like.
  • the medium bag tray 231 and the waste liquid bag tray 232 each have a medium bag 233 as a medium storage container and a waste liquid bag 234 as a used medium storage container, and are configured in a cassette structure. .
  • the culture medium bag 233 stores the culture medium supplied to the culture bag 242.
  • the waste liquid bag 234 stores a used medium (supernatant) from which the culture bag 242 is also discharged.
  • Medium bag tray 231 force With the S-cassette structure, the medium bag tray 231 is simply installed in the low temperature chamber 230 of the culture unit 212 while the culture bag 242 is maintained in the culture chamber 240. Can be exchanged and supplied.
  • the culture bag tray 241 is detachably attached to the culture unit 212.
  • the supply system joint 264 of the culture bag 242 is aseptically coupled to the joint of the culture medium bag 233
  • the discharge system joint 274 is aseptically coupled to the joint of the waste liquid bag 234, respectively. That is, the supply system joint 264 and the joint of the culture medium bag 233 are aseptically coupled by inserting the other needle-like coupling part into one rubber-like coupling part, for example.
  • the operation of combining the culture bag 242 with the culture medium bag 233 and the waste liquid bag 234 is performed in a sterile condition in a clean bench or the like.
  • the culture bag 242, the culture medium bag 233, and the waste liquid bag 234 are connected as described above, whereby the culture medium in the culture medium bag 233 in the culture medium bag tray 231 is supplied to the culture bag 242 when the supply pump 261 is activated,
  • a closed loop is configured in which the spent medium in the culture bag 242 is discharged to the waste solution bag 234 of the waste solution bag tray 232 when the discharge pump 271 is activated. With this closed loop configuration, the system (culture bag 242, culture bag 233, waste solution bag 234) is maintained in a sterile state.
  • the supply pump 261 is activated to supply the culture medium in the culture bag 233 of the culture medium bag tray 231 to the culture bag 242 (flow calorie). And the supply pump 261 and the discharge pump 271 are activated to discharge the spent medium in the culture bag 242 to the waste bag 234 in the waste bag tray 232 and the medium bag 233.
  • perfusion culture includes intermittent perfusion culture in which used medium is discharged and medium is supplied alternately, and continuous perfusion culture in which used medium is discharged and medium is supplied simultaneously.
  • a filter that prevents the movement of cells is usually disposed in the tube 272 between the culture bag 242 and the discharge pump 271, and the cells in the culture bag 242 are discharged to the waste liquid bag 234. It is prevented.
  • the spent medium in the culture bag 242 is discharged to the waste solution bag 234 of the waste bag tray 232, and the cells in the culture bag 242 are concentrated. .
  • the discharge of the spent medium is performed by starting the discharge pump 271. Based on the measurement value of the weighing scale 251, the volume of the medium and cells in the culture bag 242 is reduced to about 1Z2 to 1Z3 by the control of the operation control PLC223. It is carried out until.
  • the concentration of the cells in the culture bag 242 reduces the number of times of centrifugation by the centrifuge performed thereafter.
  • the waste bag tray 232 after the cells in the culture bag 242 are concentrated as described above, the waste bag 234 is replaced with a cell collection bag as a cell collection container that can be attached to a centrifuge.
  • the culture solution (medium and cells) in which the cells are concentrated in the culture bag 242 may be supplied into the cell collection bag by starting the discharge pump 271. In this case, it is a condition that the tube 272 is not provided with a filter.
  • the cells can be collected in a bag that can be attached to the centrifuge in the culture unit 212, which is a closed system space, and the work of collecting the cells can be saved.
  • a culture bag tray 241 is accommodated in the culture unit 212, and the force with which the culture bag tray 241 is supported by the frame 250 of the culture chamber 240 is on the culture nog tray 241.
  • the mounting table 252 on which the culture bag 242 is directly mounted is composed of a pad 252a that does not move up and down and a plurality of connected area change parts 252b and 252c that can be moved up and down. These area change parts 252b and 252c can control the culture area of the culture bag 242.
  • an inclination motor (elevating mechanism) 280, a cam mechanism 281 and a positioning sensor are installed at positions below the area changing parts 252b and 252c of the culture bag tray 241.
  • the tilt motor 280 rotates the cam mechanism 281 to raise and lower the area changing parts 252b and 252c of the mounting table 252 independently of each other.
  • the position of the elevator is detected by the positioning sensor and transmitted to the operation control PLC 223.
  • the tilt motor 280 is controlled by the operation control PLC 223, and is controlled to lower the area changing parts 252b and 252c of the mounting table 252 in the initial stage of culture in the culture bag 242.
  • a liquid reservoir is formed in a portion corresponding to the area changing parts 252b and 252c of the culture bag 242.
  • the mounting table 252 shown in FIG. 28 can change the culture area in three stages by raising and lowering the height of the area changing parts 252b and 252c. Three or more area-changing parts may be provided. This allows fine adjustment of the culture area.
  • FIG. 28 is a perspective view showing the configuration of the mounting table 252 of FIG.
  • the culture conditions suitable for antibody stimulation that is, the cell density in the culture bag 242 is maintained at a density suitable for growth.
  • the tilting motor 280 raises the area changing parts 252b and 252c of the mounting table 252 via the cam mechanism 281 to remove the culture bag 242.
  • the area of the liquid reservoir is changed by setting only a predetermined area of the park to a horizontal state.
  • the cell density per unit area in the culture bag 242 is maintained at a density suitable for growth by changing the area of the cells and the reservoir of the medium. It is propagated efficiently.
  • the mounting table 252 can form two liquid pools, first, the medium and cells are held in the lowest part of the area change part 252c in FIG. Avoid lowering.
  • the height of the area change part 252c in Fig. 28 is increased by one step, and the area change part 252b and the area change part 252c can be cultivated at the same height. Increase the area of the appropriate culture bag 242 by a certain amount. As a result, a cell density suitable for proliferation can be maintained for a certain period of time.
  • the shaking mechanism 291 of the shaking device 290 is installed as a pressing means at an upper position where the culture bag 242 of the culture bag tray 241 is arranged.
  • the shaking device 290 includes the shaking mechanism 291, the operating motor 292, the cam mechanism 293, and a positioning sensor (not shown). As shown in FIG.
  • an operating plate 291 a as a pressing means is movably arranged on the apparatus frame 250 via a guide rod 250 a, and a plurality of shaking plates 291 a are arranged on the bottom surface of the operating plate 291 a.
  • the protruding portion 291b is projected.
  • the operation plate 291a is alternately moved upward or downward by the operation of the cam mechanism 293 by the operation motor 292, so that the protrusion 291b of the operation plate 291a moves the culture bag 242 positioned below the shaking mechanism 291.
  • Repeated pressing, that is, pressing and releasing the culture bag 242 is repeated.
  • the medium in the culture bag 242 is agitated, the cells in the culture bag 242 float and move in the medium, and the cell distribution and oxygen concentration distribution in the culture bag 242 are made uniform, Cell proliferation is promoted.
  • FIG. 29 is a plan view showing the configuration of the mounting table 352 according to the modification of the fourth embodiment.
  • (A) is a part 353 that does not move up and down and all the area change parts 354, 355, 356,
  • FIG. 35 is a diagram showing a state where 357 is on the same plane
  • FIG. Fig. 30 is a partial cross-sectional view along the ⁇ - ⁇ line of Fig. 29 (a), where (a) shows the part 353, the area changing part 355, and the area not moving up and down by lowering the area changing part.
  • B shows the state where three of the four area change parts 355, 356, 357 are on the same plane.
  • C is a diagram showing a state in which the part 353 that does not move up and down and all the area change parts 354, 355, 356, and 357 forces S are on the same plane.
  • the mounting table 352 has an area changing part 357, 356, 355, 3 54 in the shape of an isosceles triangle having the corner as a vertex from one corner 352a of the rectangular in plan view. And parts 353 that do not move up and down. Parts 353 that do not move up and down are placed on a horizontal plane. As shown in Fig. 30, the part 353 and the area change part 354 that do not move up and down are connected by the connecting member 353a, and the area change part 354 and the area change part 355 are connected by the connecting member 354a.
  • the area changing part 355 and the area changing part 356 are connected to each other by a connecting member 355a, and the area changing part 356 and the area changing part 357 are connected to each other by a connecting member 356a.
  • a connecting member 355a As the connecting rods 353a, 354a, 355a, 356a, hinges can be used if they are arranged.
  • the number of area changing parts may be two to three, which is four, or may be five or more.
  • Support legs 365 and 367 are bonded and fixed to the lower surfaces of the area change parts 355 and 357, respectively.
  • the lower surface of the support leg 365 is a plane 365a and a plane 365b on the horizontal plane where the corner 352a side force is also arranged in order, and an inclined plane connecting these planes 365a and 365b.
  • the plane 365a is located below the plane 365b.
  • the lower surface of the support leg 367 includes the flat surfaces 367a, 367b, and 367c on the horizontal plane where the one side 352a side force of the mounting table 352 is also arranged in order, the inclined surface 367d that connects the flat surfaces 367a and 367b, and the flat surface 367b and the flat surface 367c.
  • An inclined surface 367e that connects the two, and also a force, the plane 367a is positioned below the plane 367b, and the plane 367b is positioned below the plane 367c.
  • the distance from the area change part 355 of the plane 365a is the same as the distance from the area change part 357 of the plane 367a, and the distance from the area change part 355 of the plane 365b is the same as the distance from the area change part 357 of the 367b. It is the same as the distance.
  • a height adjustment plate 370 that can be moved by the motor 380 along the ⁇ - ⁇ line in Fig. 29 (a) (in the direction of arrow A in Fig. 30 (b)). Arranged. On the height adjusting plate 370, elevating members 375 and 377 for elevating the area changing parts are bonded and fixed.
  • the upper surface of the elevating member 375 includes a plane 375b and a plane 375a on the horizontal plane in which the corner 352a side force of the mounting table 352 is also arranged in order, and these planes 375a and 375b.
  • the plane 375a is located above the plane 375b.
  • the upper surface of the elevating member 377 includes horizontal planes 377c, 377b, 377a, an inclined plane 377d that connects the plane 377a and the plane 377b, and a plane 377b and a plane.
  • the inclined surface 377e connecting the 377c and the force, the plane 377a is located above the plane 377b, and the plane 377b is located above the plane 377c.
  • Lifting member 377 supports the upper surface It has a shape corresponding to the lower surface of the leg 367, and when the inclined surfaces 377d, 377e are brought into contact with the inclined surfaces 367e, 367d of the support leg 367, the planes 377a, 377b, 377c are the planes 367c of the support leg 36 7 , 367b and 367a, respectively.
  • the distance from the top surface of the height adjustment plate 370 on the plane 375a is the same as the distance from the top surface of the height adjustment plate 370 on the plane 377a, and the distance from the top surface of the height adjustment plate 370 on the plane 375a. Is the same as the distance from the upper surface of the height adjustment plate 370 on the plane 377b.
  • the support leg 367 rises along the shape of the upper surface of the elevating member 377 ( (B)) o Thereby, the planes 367a and 367b of the support leg 367 and the inclined surface 367d force abut on the planes 377b and 377a and the inclined surface 377d of the elevating rod 377, respectively.
  • the elevating member 375 moves relative to the support leg 365 while the flat surfaces 365a and 365b and the flat surfaces 375b and 375a are in contact with each other until the inclined surfaces 365c and the inclined surfaces 375c are in force contact.
  • the three area changing parts 355, 356, and 357 out of the four area changing parts are in the same plane.
  • the support leg 367 further moves along the shape of the upper surface of the elevating member 377. It rises (Fig. 30 (c)). As a result, the flat surface 367a of the support leg 367 comes into contact with the flat surface 377a of the elevating member 377.
  • the support leg 365 rises along the shape of the upper surface of the elevating member 375 and comes into force contact with the plane 365a of the support leg 365 and the plane 375a of the elevating member 375.
  • Figure 3 0 (c) As shown, the part 353 that does not move up and down and all the area change parts 354, 355, 356, 357 are arranged on the same plane.
  • the area changing parts 354 to 357 can be controlled to move up and down by moving the height adjusting plate 370, so that a desired portion can be used as a liquid reservoir.
  • the shaking mechanism 291 of the shaking device 290 is installed as a pressing means at an upper position where the culture bag 242 of the culture bag tray 241 is arranged.
  • the shaking device 290 includes the shaking mechanism 291, the operating motor 292, the cam mechanism 293, and a positioning sensor (not shown).
  • an operating plate 291 a as a pressing means is movably arranged on the apparatus frame 250 via a guide rod 250 a, and a plurality of shaking plates 291 a are arranged on the bottom surface of the operating plate 291 a.
  • the protruding portion 291b is projected.
  • the operation plate 291a is alternately moved upward or downward by the operation of the cam mechanism 293 by the operation motor 292, so that the protrusion 291b of the operation plate 291a moves the culture bag 242 positioned below the shaking mechanism 291.
  • Repeated pressing, that is, pressing and releasing the culture bag 242 is repeated.
  • the medium in the culture bag 242 is agitated, the cells in the culture bag 242 float and move in the medium, and the cell distribution and oxygen concentration distribution in the culture bag 242 are made uniform, Cell proliferation is promoted.
  • the position of the operation plate 291a is detected by the positioning sensor and transmitted to the operation control PLC 223, and the measured value of the weigh scale 251 is transmitted to the operation motor 292 by the PLC 223. Be controlled.
  • the cell culture (shaking culture) in the culture bag 242 using the shaking device 290 may be performed before the culture bag and the cells are fully filled in the culture bag 242. It may be implemented later.
  • the shaking device 290 is controlled by the operation control PLC 223 based on the detection position of the working plate and the measurement value of the weighing scale 251.
  • an illumination lamp 301 is provided above the position where the portion of the culture bag 242 where the antibody is solidified is arranged, and the image acquisition means is provided below.
  • C CD camera 302 is installed.
  • a lens, a prism, a lens barrel, and other optical devices are additionally used according to the observation mode.
  • the illumination lamp 301 illuminates the culture bag 242 from above.
  • the CCD camera 302 displays the cells in the culture bag 242. The downward force is also photographed and the image is acquired.
  • the illumination operation of the illumination lamp 301 and the imaging operation of the CCD camera 302 are controlled by the operation control PLC 223, and an image of the cells in the culture bag 242 is acquired every predetermined time (for example, 6 hours).
  • the cell image at every predetermined time is stored in an image memory circuit (not shown) of the image processing unit 221.
  • the image processing unit 221 performs image processing, for example, binarization processing or multi-value processing, on a cell image every predetermined time stored in the image memory circuit of the image processing unit 221, and
  • the average value of the projected area of one cell and the increase rate of non-single cells, which are cell aggregates in which single cells are aggregated, are calculated as evaluation parameters for cell culture.
  • the average value of the projected area of a single cell is determined by attaching the culture bag 242 to the culture bag tray 241 and storing the culture bag tray 241 in the culture chamber 240. For example, the cell image power after 24 hours is calculated.
  • the force whether the decision is a non-single cell described above with reference to the can 100 mu m 2 projected area, to determine when a 100 m 2 or more and the non-single cell, the 100 m 2 or less It is judged as a single cell. This is because the projection area of a single cell at the initial stage of culture was measured and all were 100 m 2 or less. From the images of cells over time (for example, images after 24 hours, 48 hours, and 72 hours from the start of culture), the change in the ratio of non-single cells to total cells is calculated, and Calculate the rate of increase. The increase rate of the non-single cells and the average projected area of the single cells are output from the image processing unit 221 to the operation control PLC 223.
  • the PLC223 for operation control calculates the lag time for the average projected area force of a single cell, and estimates the growth start time of the cell.
  • the lag time is the time of the induction period required for inoculating cells into the antibody solid layer part of the culture bag tray 241 and starting the force growth.
  • the PLC223 for operation control determines the quality of the cell by judging the state of the cell culture from the start of cell growth, that is, whether the cell has the potential to grow by antibody stimulation. Based on this determination, the operation control PLC 223 stops culturing in the cell culture device 200 for cells with extremely low proliferation potential.
  • the PLC 223 for operation control calculates the minimum doubling time of the cell from the increase rate of the non-single cell.
  • the minimum fold time is the number of cells at a certain time. Is the time required to reach double the number of cells.
  • the operation control PLC 223 determines the timing of flow of the culture medium to the culture bag 242 and the flow acceleration by judging the culture state of the cell, that is, the proliferation ability of the cell from the minimum doubling time.
  • the operation control PLC 223 and the image processing unit 221 functioning as control means are a CPU that executes computation and control, a storage device (memory) that stores processing programs and data, and data. And an input / output circuit for connecting to an input device such as a keyboard, a mouse or a touch panel, and an output device such as a monitor.
  • the image processing unit 221 includes an image memory circuit that stores image data from the CCD camera 302.
  • an image of the cells in the culture bag 242 taken by the CCD camera 302 every predetermined time is subjected to image processing (for example, binarization processing or multi-value processing).
  • image processing for example, binarization processing or multi-value processing.
  • a program for calculating evaluation parameters of cell culture average projected area of single cells, increase rate of non-single cells) and the like are stored.
  • the storage device of the operation control PLC223 includes a program for determining the cell culture status (cell proliferation possibility, cell proliferation capability) from the cell culture evaluation parameters, and the cell culture status.
  • a program for controlling the devices for example, the supply pump 261, the discharge pump 271 and the like
  • the storage device of the operation control PLC 223 includes a device control device for controlling devices related to the culture device 210 and the culture unit 212 based on signals from various sensors of the cell culture device 200 and the culture unit 212.
  • the program is also stored.
  • the storage device of the image processing unit 221 also stores a device control program such as controlling the CCD camera 302 at predetermined time intervals to acquire cell images.
  • FIG. 31 and FIG. 32 show the antibody-stimulated intermittent perfusion culture process, in which cells are collected in the culture bag 242.
  • FIG. 31 the operator solidifies the antibody in the culture bag 242 in a clean bench or the like (W01 in FIG. 31), puts the medium, and incubates the culture bag 242 inoculated with the cells. Attach to Nourishing Bag Tray 241.
  • the operator attaches the culture medium bag 233 into which the culture medium has been placed in a clean bench or the like to the culture medium bag tray 231, attaches the waste liquid bag 234 to the waste liquid bag tray 232, and culture bag 242, the culture medium bag 233, and the waste liquid bag 234 and 234 are connected by a supply joint 264 and a waste liquid joint 274, respectively (W02 in FIG. 31).
  • the operator places the culture bag tray 241, medium bag tray 231 and waste solution bag tray 232 in the single culture unit 212 of the cell culture device 200 whose indicator light is lit in green, for example.
  • the culture bag tray 241 is supported by the frame 250 of the culture chamber 240, and the medium bag tray 231 and the waste solution bag tray 232 are installed in the low temperature chamber 230.
  • the operator connects the pump tubes 262 and 272 of the culture bag 242 to the supply pump 261 and the output pump 271 respectively (W03 in FIG. 31).
  • the operator confirms the image output of the CCD camera 302 in the culture bag 242 stored in the culture unit 212 (W05 in FIG. 31). Before confirming the image output, the operator activates the tilting motor 280 of the culture unit 212 to lower the area changing parts 2 52b and 252c of the mounting table 252 to form a liquid reservoir in the culture bag 242. (W04 in Fig. 31). Further, the operator measures the weight of the installed culture bag 242 with the weighing scale 251 of the culture unit 212.
  • the operator closes the culture unit door and starts cell culture in the culture unit 212 (W06 in Fig. 31).
  • the cells are stimulated by the antibody for growth in the liquid reservoir of the culture bag 242 (W07 in FIG. 31).
  • the CCD camera 302 of the culture unit 212 photographs the cells in the liquid reservoir of the culture bag 242 every predetermined time (for example, 6 hours), and the image processing unit 221 evaluates the cell culture from the captured image. Calculate the parameters.
  • the PLC 223 for operation control calculates the lag time based on the evaluation parameter, determines whether the cell is stimulated by the antibody and has a possibility of proliferation, and further calculates the minimum doubling time. Thus, the proliferation ability of the cell is determined (W08 in FIG. 31).
  • the PLC223 for operation control uses this cell when the cell is stimulated by the antibody in the culture bag 242 and no growth is observed after a certain period of time (eg, 24 hours).
  • the cell culture in the culture apparatus 200 is stopped (W08 ′ in FIG. 31).
  • the operation control PLC 223 determines that the cells in the culture bag 242 have the possibility of growth, it is based on the proliferation ability of the cells! To decide. Based on this determination, the operation control PLC 223 operates the supply pump 261 to feed the medium in the medium bag 233 of the medium bag tray 231 to the culture bag 242 (W09 in FIG. 31).
  • the PLC 223 for operation control determines whether or not the weight of the culture medium and the cells in the culture bag 242 measured by the weigh scale 251 exceeds the predetermined value b (W14 in FIG. 31).
  • Actuator motor 292 is started when the value reaches or exceeds the constant value b.
  • the shaking device 290 is activated, and shaking culture in which the shaking mechanism 291 of the shaking device 290 repeatedly presses the culture bag 242 is started (W15 in FIG. 31).
  • the operation control PLC 223 continues to determine whether the weight of the culture medium and cells in the culture bag 242 measured by the weigh scale 251 is equal to or greater than the predetermined value c (W16 in FIG. 32).
  • the supply pump 261 is stopped, the medium bag 233 force of the medium bag tray 231 also stops feeding of the medium to the culture bag 242 (W17 in FIG. 32), the operation motor 292 is stopped, and the culture is stopped. Stop shaking culture in bag 242 (W18 in Figure 32).
  • the PLC223 for operation control operates the discharge pump 271 after the cells settle in the culture bag 242 to remove the spent medium (the supernatant in the culture bag 242) from the waste bag tray 232 To the waste liquid bag 234 (W19 in Fig. 32). Thereafter, the PLC 223 for operation control uses the culture medium 242 in the culture bag 242 measured by the weighing scale 251. It is determined whether or not the weight is less than or equal to the predetermined value d (W20 in FIG. 32). When the weight is less than or equal to the predetermined value d, the discharge pump 271 is stopped to discharge the spent medium from the culture bag 242. Stop (W21 in Fig. 32).
  • the supply pump 261 is activated, the medium is fed from the medium bag 233 of the medium bag tray 231 to the culture bag 242, the operating motor 292 is activated, and the shaking culture is performed in the culture bag 242 by the shaking device 290 ( (W22 in Figure 32).
  • the operation control PLC 223 stops the supply pump 261 to stop the feeding of the medium from the medium bag 233 of the medium bag tray 231 to the culture bag 242 and performs shaking culture while the operation motor 292 is activated. Continue (W23 in Figure 32).
  • the PLC 223 for operation control determines whether or not a desired culture period depending on the use date and time of the cells to be propagated has been reached, or the image processing unit 221 determines whether the cells in the culture bag 242 are desired. It is determined whether or not the force has reached the number of cells (W24 in FIG. 32). When these culture periods or the number of cells have not been reached, the processing operations of steps W18 to W23 are repeated. When measuring the number of cells, stop shaking device 290 once and wait until the cells settle. Next, an image in the culture bag 242 is taken by the CCD camera 302. The image processing unit 221 estimates and calculates the number of cells present in the bag from the acquired image.
  • the above steps W18 to W23 are intermittent perfusion culture in which the spent medium in the culture bag 242 is discharged and the new medium is fed (fed) into the culture nodule 242. It is.
  • Step W24 the operation control PLC 223 stops the operation motor 292 as shown in FIG. 32, and stops the shaking culture in the culture bag 242. (W25 in Figure 32).
  • the discharge pump 271 is activated, and the spent medium in the culture bag 242 is discharged to the waste solution bag 234 in the waste solution bag tray 232, based on the measurement value of the weigh scale 251.
  • the cells are concentrated until the medium and cells in the culture bag 242 become approximately 1Z2 to 1Z3 (W26 in FIG. 32).
  • the PLC 223 for operation control then stops the discharge pump 271 and ends the cell culture (W27 in Fig. 32). After completion of the culture, the operator transfers the cells in the culture bag 242 to a centrifuge container in a clean bench or the like, and then the cells are circulated by centrifugation. (W28 in Figure 32).
  • FIGS. 33 and 34 show a case where the same antibody-stimulated intermittent perfusion culture process includes a process of collecting cells with a cell collection bag. Therefore, steps W31 to W56 in the steps shown in FIGS. 33 and 34 are the same as steps WO 1 to W26 in FIGS.
  • step W56 shown in FIG. 34 after the cells in the culture bag 242 are concentrated by starting the discharge pump 271, the operation control PLC 223 stops the discharge pump 271, and the waste bag 234 in the waste liquid tray 232 is removed. Prompt the operator to replace the cell collection bag (W57 in Figure 34).
  • This cell collection bag is a bag that can be attached to a centrifuge and used for centrifugation.
  • the operation control PLC 223 activates the discharge pump 271 and the operation motor 292.
  • the cells in the culture bag 242 are transferred together with the culture medium to the cell collection bag mounted on the waste bag tray 232 (W58 in FIG. 34).
  • the operation control PLC 223 stops the discharge pump 271 and the operating motor 292 to stop the cell recovery from the culture bag 242 and end the cell culture (W59 in FIG. 34).
  • the operator attaches the cell collection bag to the centrifuge and collects the cells by centrifugation (W60 in FIG. 34).
  • Steps X01 to X15 in the antibody-stimulated continuous perfusion culture process shown in FIG. 35 and FIG. 36 are the same as steps W01 to W15 in the antibody-stimulated intermittent perfusion culture process of FIG. 31 and FIG.
  • a filter (not shown) is disposed between the culture bag 242 and the discharge pump 271.
  • the PLC 223 for operation control is used while the culture medium is fed from the culture medium bag 233 of the culture medium bag tray 231 into the culture bag 242 and shaking culture is performed by the shaking device 290 in the culture bag 242.
  • the discharge pump 271 is activated and the culture bag 242 is used.
  • the medium is discharged into the waste bag 234 of the waste bag tray 232.
  • continuous perfusion culture in which the feeding of the medium to the culture bag 242 and the discharge of the medium from the culture bag 242 are simultaneously started in the culture bag 242 (XI 7 in FIG. 36).
  • the cells in the culture bag 242 are blocked from flowing by the filter and do not flow into the waste liquid bag 234.
  • shaking culture with a shaking device 290 is also performed at the same time.
  • the PLC 223 for operation control determines whether or not the desired culture period depending on the use date and time of the cells to be proliferated has been reached, or the image processing unit 221 determines whether the cells in the culture bag 242 are desired. Determine whether the force has reached the number of cells (X18 in Fig. 36). If these culture periods or cell numbers have not been reached, repeat the continuous perfusion culture in step X17. When measuring the number of cells, stop the shaking device 290 once and wait until the cells settle. Next, an image in the culture bag 242 is taken by the CCD camera 302. The image processing unit 221 estimates and calculates the number of cells present in the bag from the acquired image.
  • the operation control PLC 223 stops the perfusion culture and the shaking culture by stopping the supply pump 261, the discharge pump 271 and the operation motor 292 when the desired culture period or cell number in step X18 is reached ( XI 9 in Figure 36).
  • the PLC 223 for operation control activates the discharge pump 271 after the cells settle in the culture node 242 to discharge the spent medium in the culture bag 242 to the waste bag 234 in the waste bag tray 232, and the weighing scale 251 Based on the measured value, concentrate the cells until the culture medium and cells in culture bag 242 are approximately 1Z2 to 1Z3 (X20 in Fig. 36).
  • the reason why the shaking device is stopped during the concentration process is to prevent a large amount of cells from flowing into the tube and clogging the filter.
  • the operation control PLC 223 then stops the discharge pump 271 and ends the cell culture (X21 in Fig. 36). After completion of the culture, the operator moves the cells in the culture bag 242 to a centrifuge container in a clean bench or the like, and then collects the cells by centrifugation (X22 in FIG. 36).
  • Steps YO 1 to Y15 in the antibody-stimulated continuous perfusion culture process shown in FIGS. 37 and 38 are the same as those in the antibody-stimulated intermittent perfusion culture process shown in FIGS. Since it is the same as steps WO 1 to W15, description thereof is omitted.
  • the PLC 223 for operation control determines whether the weight of the medium and cells in the culture bag 242 measured by the weighing scale 251 is equal to or greater than the predetermined value c (Y16 in FIG. 38). At this point, the supply pump 261 is stopped, the medium bag 233 force of the medium bag tray 231 is also stopped, and the feeding of the medium to the culture bag 242 is stopped, and the shaking culture is continued with the operating motor 292 activated (Fig. 38 Y17).
  • the PLC 223 for operation control determines whether or not the desired culture period depending on the use date and time of the cells to be proliferated has been reached, or the image processing unit 221 determines whether the cells in the culture bag 242 are desired. It is determined whether or not the force has reached the cell number (Y18 in FIG. 38). If the culture period or cell number has been reached, shaking culture is continued (No in Y18).
  • the image processing unit 221 estimates and calculates the number of cells present in the bag from the acquired image.
  • the operation control PLC 223 stops the operation motor 292 as shown in Fig. 38 to stop the shaking culture in the culture bag 242. (Y19 in FIG. 38), after the cells settle in the culture bag 242, the discharge pump 271 is activated to discharge the spent medium in the culture bag 242 to the waste bag 234 in the waste bag tray 232 and weigh Based on the 251 measurements, the cells are concentrated until the medium and cells in the culture bag 242 are approximately 1-2 cm to 1-3 cells (Fig. 38, ⁇ 20).
  • the operation control PLC 223 then stops the discharge pump 271 to end the cell culture ((21) in Fig. 38). After completion of the culture, the operator moves the cells in the culture bag 242 to a centrifuge container in a clean bench or the like, and then collects the cells by centrifugation ( ⁇ 22 in FIG. 38).
  • FIG. 39 and FIG. 40 showing this processing operation in the case where the same antibody-stimulated simple fed-batch culture process includes a process of recovering cells using a cell recovery bag is shown in FIGS. Accordingly, steps ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 31 to ⁇ 50 of the process shown in FIGS. 39 and 40 are the same as steps ⁇ 1 to ⁇ 20 of FIGS.
  • step ⁇ 50 shown in Fig. 40 the culture bag 242 is activated by the activation of the discharge pump 271.
  • the operation control PLC 223 stops the discharge pump 271 and prompts the operator to replace the waste bag 234 of the waste liquid tray 232 with a cell collection bag (Y51 in FIG. 40).
  • This cell collection bag is a bag that can be attached to a centrifuge and used for centrifugation.
  • the operation control PLC 223 activates the discharge pump 271 and the operating motor 292, and shakes the culture bag 242 with the shaking device 290. Then, the cells in the culture bag 242 are transferred together with the medium to the cell collection bag attached to the waste bag tray 232 ((52 in FIG. 40). Then, the operation control PLC 223 stops the first discharge pump 271 and the operating motor 292 to stop the cell recovery from the culture bag 242 and terminate the cell culture ((53 in FIG. 40). After the cell recovery is completed, the operator attaches the cell recovery bag to the centrifuge, and the cells are recovered by centrifugation ((54) in FIG. 40).
  • Image of cell in culture bag 242 captured by CCD camera 302 is processed by image processing unit 221 to evaluate cell culture evaluation parameters (average projected area of single cell, increase of non-single cell) Speed), and the operation control PLC223 evaluates and evaluates the culture status of the cell (proliferation potential and proliferation capability of the cell), and the culture operation according to this culture status (predetermined from the medium bag 233 to the culture bag 242) Perform medium feeding and timing at flow acceleration.
  • cell culture evaluation parameters average projected area of single cell, increase of non-single cell
  • Speed the operation control PLC223 evaluates and evaluates the culture status of the cell (proliferation potential and proliferation capability of the cell), and the culture operation according to this culture status (predetermined from the medium bag 233 to the culture bag 242) Perform medium feeding and timing at flow acceleration.
  • cells from one patient can be inoculated into a culture bag 242 stored in a single culture unit 212, and each cell can be cultured according to the culture status of the cell, thus realizing an appropriate culture operation. it can.
  • the culturing operation can be performed in units of hours, and the culturing can be promoted to shorten the culturing period.
  • FIG. 1 is a configuration diagram showing a first embodiment of a cell culture device according to the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view showing the thermostatic chamber of FIG.
  • FIG. 3 is a perspective view showing a culture cassette housed in a canister in the thermostatic chamber of FIG. 1.
  • FIG. 4 is a perspective view showing the culture bag tray, medium cassette and cell inoculation cassette in FIG. 3, respectively.
  • FIG. 5 is a layout diagram showing a configuration of a culture unit including one caster in the thermostatic chamber of FIG. 2 and a culture cassette housed in the caster.
  • FIG. 6 is a block diagram showing a control system of the culture unit of FIG.
  • FIG. 5 The shaking mechanism of the shaking device of FIG. 5 is shown, (A) is a perspective view, and (B) is a side view.
  • FIG. 8 is a process diagram showing a culture procedure in the culture unit of FIG. 5.
  • FIG. 9 shows a culturing procedure in the culturing unit of FIG. 5, and is a process diagram following FIG. 8.
  • FIG. 10 shows a culture procedure in the culture unit of FIG. 5, and is a process diagram following FIG.
  • FIG. 11 is a process chart subsequent to FIG. 10, showing the culture procedure in the culture unit of FIG. [12]
  • FIG. 12 is a flowchart showing the processing operation of the induction factor stimulation intermittent perfusion culture process in the culture unit of FIG.
  • FIG. 13 is a flowchart showing a continuation of the processing operation of FIG.
  • FIG. 14 is a flowchart showing the processing operation of the inducing factor-stimulated intermittent perfusion culture process (including cell recovery processing by the cell recovery bag) in the culture unit of FIG.
  • FIG. 15 is a flowchart showing a continuation of the processing operation of FIG.
  • FIG. 16 is a flowchart showing the processing operation of the induction factor stimulation continuous perfusion culture process in the culture unit of FIG.
  • FIG. 17 is a flowchart showing a continuation of the processing operation of FIG.
  • FIG. 18 is a diagram showing a flow of cell culture-related data before cell culture in the cell culture system of FIG.
  • FIG. 19 is a diagram showing a flow of cell culture-related data during cell culture of the cell culture system of FIG. 1.
  • FIG. 20 is a diagram showing a flow of cell culture-related data after cell culture in the cell culture system of FIG. 1.
  • ⁇ 21 A layout diagram showing the configuration (differentiation induction state) of the culture unit in the second embodiment of the cell culture device according to the present invention.
  • FIG. 22 is a layout diagram showing the configuration of the culture unit of FIG.
  • FIG. 23 is a flowchart showing the processing operation of the split induction-induced intermittent perfusion culture process in the culture unit of FIGS. 21 and 22.
  • FIG. 24 is a flowchart showing a continuation of the processing operation of FIG.
  • FIG. 25 is a configuration diagram showing a third embodiment of the cell culture system according to the present invention.
  • FIG. 26 is a configuration diagram showing a fourth embodiment of the cell culture device according to the present invention.
  • FIG. 28 is a perspective view showing a configuration of the mounting table in FIG. 27.
  • FIG. 29 A plan view showing a configuration of a mounting table according to a modification of the fourth embodiment, wherein (a) is a diagram showing a state in which the parts that do not move up and down and all the area changing parts are on the same plane b) is a diagram showing a state in which the area changing part is lowered.
  • FIG.30 A partial cross-sectional view along the ⁇ - ⁇ line in Fig. 29 (a).
  • (B) is a diagram showing a state where three of the four area-changing parts are on the same plane
  • (c) is a figure showing all the parts not moving up and down It is a figure which shows the state which has an area change part on the same plane.
  • FIG. 31 is a flowchart showing a processing operation in the case where the culture bag includes a process of collecting cells in the antibody-stimulated intermittent perfusion culture process in the culture unit of FIG. 27.
  • FIG. 32 is a flowchart showing a continuation of the processing operation of FIG. 31.
  • FIG. 33 is a flowchart showing the processing operation in the case where the cell recovery bag includes a process of recovering cells over the antibody-stimulated intermittent perfusion culture process in the culture unit of FIG. 27.
  • FIG. 34 is a flowchart showing a continuation of the processing operation of FIG. 33.
  • FIG. 28 is a flowchart showing the processing operation of the antibody-stimulated continuous perfusion culture process in the culture unit of FIG.
  • FIG. 36 is a flowchart showing a continuation of the processing operation of FIG. 35.
  • FIG. 37 is a flowchart showing the processing operation of the antibody-stimulated simple fed-batch culture step in the culture unit of FIG. 27.
  • FIG. 38 is a flowchart showing a continuation of the processing operation of FIG. 37.
  • FIG. 39 is a flowchart showing a processing operation in the case where the antibody-stimulated simple fed-batch culture step in the culture unit of FIG.
  • FIG. 40 is a flowchart showing a continuation of the processing operation of FIG. 39.
  • Waste liquid bag (Waste liquid storage means, used medium storage container)

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Abstract

　操作者の労力を軽減しつつ、細胞の培養状況に応じた適切な培養を実現できる細胞培養装置を提供すること。 　細胞を増殖するための培養バッグ１８と、増殖のために誘導因子により細胞を刺激する細胞接種カセット１９（または抗体刺激及び増殖用培養容器としての培養バッグ２４２）と、これらの培養バッグ１８、細胞接種カセット１９へ供給される培地を貯溜する培地カセット２０と、細胞接種カセット内の細胞の画像を取得するＣＣＤカメラ８８と、このＣＣＤカメラにて取得した細胞の画像から当該細胞の培養状況（細胞の増殖可能性と増殖能力）を判定し、この判定に基づき培養操作を実行させる画像処理用コンピュータ及び運転制御用コンピュータと、を有するものである。

Description

明 細 書
細胞培養装置、細胞培養方法、細胞培養プログラム、及び細胞培養シス テム
技術分野
[0001] 本発明は、細胞の培養状況を評価して細胞を培養する細胞培養装置、細胞培養 方法、細胞培養プログラム、及び細胞培養システムに関する。
背景技術
[0002] 細胞培養、特に免疫細胞療法に用いられる浮遊系細胞の細胞培養は、従来ほとん どが人的操作によって実施されている。例えば、患者力も採取した細胞を、抗体 (誘 導因子）が付着したフラスコに培地とともに接種して恒温槽に収納し、このフラスコを 日々恒温槽から取り出し、顕微鏡などを用いて培養状況 (例えば増殖状況)を観察し 、増殖等が認められたとき、または細胞接種力も所定期間経過した後に、上記フラス コに培地を添加して細胞を培養 (例えば増殖)して！/、る。
[0003] 上述のような人為的な細胞培養では、培養技術者の経験に依存した培養評価に基 づいて日単位の操作が行われるため、または予め定められたマニュアルに基づき全 ての細胞について画一的に培養操作が行われるため、採取した細胞によっては、培 養 (例えば増殖)が不充分となってしまうことがあった。患者ごとに異なる細胞の増殖 能力を最大限に引き出すためには、客観的な培養評価と、この評価に基づく時間単 位での培養操作が必要となる。
[0004] このような課題は、接着依存性細胞の培養にお!ヽては、特許文献 1に記載のように その一部が解決されている。つまり、特許文献 1では、個々の接着依存性細胞を無 襲撃、非破壊で画像により形態観察することによって、その細胞集団全体の増殖能 力を把握している。
[0005] また、上述のような人為的細胞培養に用いられるものとして、特許文献 2に、 1台の 恒温槽 (培養室）内に複数個のキヤ-スタ (収容部）が配置され、各キヤ-スタに培養 容器を 1個ずつ収納して細胞を培養する細胞の培養システムが開示されて 、る。この 培養システムでは、 1台の恒温槽の全てのキヤニスタにつ!、て培養環境が同一に設 定されている。
[0006] 特許文献 1 :特開 2002— 218995号公報
特許文献 2 :特開 2005-73566号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] ところが、免疫細胞療法に用いられる浮遊系細胞の培養に関しては、細胞の培養 状況を客観的に評価したり、その評価に基づいて細胞を培養する装置などが存在し ていない。
[0008] また、上記特許文献 2に記載の細胞培養システムを含む人為的細胞培養では、恒 温槽ゃキヤ-スタ内の培養環境データの収集、培地交換等の培養操作などを、培養 に従事している操作者が記録に残さなければならず、非常に煩雑な作業となってい る。また、細胞培養の異常を的確に把握できない恐れもある。
[0009] 本発明の目的は、上述の事情を考慮してなされたものであり、操作者の労力を軽減 しつつ、細胞の培養状況に応じた適切な培養を実現できる細胞培養装置、細胞培 養方法及び細胞培養プログラムを提供することにある。
[0010] また、本発明のさらなる目的は、細胞の培養に関連する細胞培養関連データを自 動で収集し蓄積できると共に、上記細胞培養関連データに基づ 、て細胞の培養を監 視し管理できる細胞培養システム、細胞培養方法及び細胞培養プログラムを提供す ることにめる。
課題を解決するための手段
[0011] 請求項 1に記載の発明に係る細胞培養装置は、細胞を培養する培養容器と、この 培養容器へ供給される培地を貯溜する培地貯溜手段と、上記培養容器内の細胞の 画像を取得する画像取得手段と、この画像取得手段にて取得した細胞の画像から当 該細胞の培養状況を判定し、この判定に基づき培養操作を実行させる制御手段と、 を有することを特徴とするものである。
[0012] 請求項 2に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 1に記載の発明にお 、て、 上記培養容器は、細胞を増殖するための増殖用培養容器と、細胞に機能を発現さ せるための機能発現用培養容器とであり、この機能発現用培養容器内の細胞の画 像を画像取得手段が取得することを特徴とするものである。
[0013] 請求項 3に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 2に記載の発明において、 上記機能発現用培養容器は、増殖のために誘導因子により細胞を刺激する誘導因 子刺激用培養容器であり、制御手段は、上記誘導因子刺激用培養容器内の細胞の 画像に基づき、細胞の増殖可能性と細胞の増殖能力を判定し、上記誘導因子刺激 用培養容器カゝら増殖用培養容器へ細胞を移行させるタイミング、培地貯溜手段から 上記増殖用培養容器への培地の供給などの培養操作を制御することを特徴とするも のである。
[0014] 請求項 4に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 2に記載の発明にお 、て、 上記機能発現用培養容器は、細胞を分化させる分化誘導用培養容器であり、制御 手段は、上記分化誘導用培養容器内の細胞の画像に基づき、分化誘導操作を制御 することを特徴とするものである。
[0015] 請求項 5に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 1乃至 4のいずれかに記載 の発明において、上記培地貯溜手段はカセット構造に構成されて、培養容器に接続 されることを特徴とするものである。
[0016] 請求項 6に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 5に記載の発明にお 、て、 上記機能発現用培養容器はカセット構造に構成されて、増殖用培養容器及び培地 貯溜手段に接続されることを特徴とするものである。
[0017] 請求項 7に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 2乃至 6のいずれかに記載 の発明において、上記培地貯溜手段、機能発現用培養容器及び増殖用培養容器 が閉鎖系にて構成されたことを特徴とするものである。
[0018] 請求項 8に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 2乃至 7のいずれかに記載 の発明において、上記増殖用培養容器には液溜り部が形成可能に設けられ、当該 増殖用培養容器内での培養初期段階で、上記液溜り部に細胞及び培地が貯溜され ることを特徴とするちのである。
[0019] 請求項 9に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 2乃至 8のいずれかに記載 の発明にお 、て、上記増殖用培養容器内で増殖された細胞を機能発現用培養容器 内へ導き、この細胞の画像が画像取得手段により取得されることを特徴とするもので ある。
[0020] 請求項 10に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 2乃至 9のいずれかに記 載の発明において、上記培地貯溜手段には、使用済み培地を貯溜可能な使用済み 培地貯溜容器が、培養容器へ供給する培地を貯溜可能な培地貯溜容器と共に設置 され、増殖用培養容器内の使用済み培地が上記使用済み培地貯溜容器に排出さ れて貯溜されるよう構成されたことを特徴とするものである。
[0021] 請求項 11に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 2乃至 10のいずれかに記 載の発明において、上記培地貯溜手段には、細胞を回収する細胞回収容器が装着 可能とされ、増殖用培養容器内で濃縮された細胞が上記細胞回収容器内に回収さ れるよう構成されたことを特徴とするちのである。
[0022] 請求項 12に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 1乃至 11のいずれかに記 載の発明にお 、て、上記細胞が浮遊系細胞であることを特徴とするものである。
[0023] 請求項 13に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 1乃至 12のいずれかに記 載の発明にお ヽて、上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とするもので ある。
[0024] 請求項 14に記載の発明に係る細胞培養方法は、細胞を培養する培養容器内の細 胞の画像を画像取得手段が取得し、この画像取得手段にて取得した細胞の画像か ら当該細胞の培養状況を判定し、この判定に基づき上記培養容器へ培養操作を実 行することを特徴とするものである。
[0025] 請求項 15に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 14に記載の発明にお 、 て、上記培養容器は、細胞を増殖するための増殖用培養容器と、細胞に機能を発現 させるための機能発現用培養容器とであり、この機能発現用培養容器内の細胞の画 像を画像取得手段が取得することを特徴とするものである。
[0026] 請求項 16に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 15に記載の発明にお 、 て、上記機能発現用培養容器は、増殖のために誘導因子により細胞を刺激する誘 導因子刺激用培養容器であり、上記誘導因子刺激用培養容器内の細胞の画像に 基づき、細胞の増殖可能性と細胞の増殖能力を判定し、上記誘導因子刺激用培養 容器カゝら増殖用培養容器へ細胞を移行させるタイミング、培地貯溜手段カゝら上記増 殖用培養容器への培地の供給などの培養操作を実行することを特徴とするものであ る。
[0027] 請求項 17に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 15に記載の発明にお 、 て、上記機能発現用培養容器は、細胞を分化させる分化誘導用培養容器であり、上 記分化誘導用培養容器内の細胞の画像に基づき、分化誘導操作を実行することを 特徴とするものである。
[0028] 請求項 18に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 15乃至 17のいずれかに 記載の発明において、上記増殖用培養容器内での培養初期段階では、上記増殖用 培養容器の液溜り部に細胞及び培地を貯溜することを特徴とするものである。
[0029] 請求項 19に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 15乃至 18のいずれかに 記載の発明にお 、て、上記増殖用培養容器内で増殖された細胞を機能発現用培養 容器内へ導き、この細胞の画像を画像取得手段が取得することを特徴とするもので ある。
[0030] 請求項 20に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 15乃至 19のいずれかに 記載の発明において、上記増殖用培養容器内の使用済み培地を、培地貯溜手段の 使用済み培地貯溜容器に排出することを特徴とするものである。
[0031] 請求項 21に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 15乃至 20のいずれかに 記載の発明において、上記増殖用培養容器内で濃縮された細胞を、培地貯溜手段 の細胞回収容器内に回収することを特徴とするものである。
[0032] 請求項 22に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 14乃至 21のいずれかに 記載の発明にお 、て、上記細胞が浮遊系細胞であることを特徴とするものである。
[0033] 請求項 23に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 14乃至 22のいずれかに 記載の発明にお ヽて、上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とするもの である。
[0034] 請求項 24に記載の発明に係る細胞培養プログラムは、細胞の培養を実行するため にコンピュータに記憶した細胞培養プログラムであって、細胞を培養する培養容器内 の細胞の画像を画像取得手段が取得する手順と、この画像取得手段にて取得した 細胞の画像から当該細胞の培養状況を判定する手順と、この判定に基づき上記培 養容器へ培養操作を実行する手順と、を有することを特徴とするものである。
[0035] 請求項 25に記載の発明に係る細胞培養プログラムは、細胞の培養を実行するため にコンピュータに記憶した細胞培養プログラムであって、細胞に機能を発現させるた めの機能発現用培養容器内の細胞の画像を画像取得手段が取得する手順と、この 画像取得手段にて取得した細胞の画像から当該細胞の培養状況を判定する手順と
、この判定に基づき上記機能発現用培養容器、及び Zまたは細胞を増殖するための 増殖用培養容器へ培養操作を実行する手順と、を有することを特徴とするものである
[0036] 請求項 26に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 1乃至請求項 3のうち、い ずれ力 1に記載の発明において、上記培養容器は載置台に載置され、上記載置台 の一部を昇降させることにより培養面積を変化させることを特徴とするものである。
[0037] 請求項 27に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 1乃至請求項 13のうち、 Vヽずれか 1に記載の発明にお!/ヽて、単純流加培養及び灌流培養の一方を選択可能 であることを特徴とするものである。
[0038] 請求項 28に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 27に記載の発明にお 、 て、間欠式灌流培養及び連続式灌流培養の一方を選択可能であることを特徴とする ものである。
[0039] 請求項 29に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 14乃至請求項 16のうち、 いずれか 1に記載の発明において、上記培養容器は載置台に載置され、上記載置 台の一部を昇降させることにより培養面積を変化させることを特徴とするものである。
[0040] 請求項 30に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 14乃至請求項 23のうち、 Vヽずれか 1に記載の発明にお!/ヽて、単純流加培養及び灌流培養の一方を選択可能 であることを特徴とするものである。
[0041] 請求項 31に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 30に記載の発明にお 、 て、間欠式灌流培養及び連続式灌流培養の一方を選択可能であることを特徴とする ものである。
[0042] 請求項 32に記載の発明に係る細胞培養システムは、細胞を培養し、その培養を監 視し管理する細胞培養システムであって、細胞を培養する培養容器をそれぞれ配設 する複数の培養ユニットが互いに隔離して配置され、上記培養ユニット毎に独立した 培養環境下で細胞を培養する恒温槽と、この恒温槽の上記培養ユニット毎に、細胞 の培養に関する細胞培養関連データを収集して蓄積し、上記細胞培養関連データ に基づき上記培養ユニット毎に、細胞の培養状態を監視し、細胞の培養操作を管理 する管理手段と、を有することを特徴とする。
[0043] 請求項 33に記載の発明に係る細胞培養システムは、請求項 32に記載の発明にお いて、上記管理手段は、恒温槽と共に培養室内に設置され、上記恒温槽の各培養 ユニットにおける培養を制御する機能を兼ね備えた運転制御盤と、上記培養室以外 に設置され、上記運転制御盤が有するデータを受信して表示する監視用コンビユー タと、を有して構成されたことを特徴とする。
[0044] 請求項 34に記載の発明に係る細胞培養システムは、請求項 32または 33に記載の 発明において上記細胞培養関連データは、細胞、培地、培養容器、恒温槽、培養ュ ニット及び操作者の識別符号と、恒温槽及び培養ユニット内の培養環境データと、培 養容器内の細胞の画像データとの少なくとも 1つであることを特徴とする。
[0045] 請求項 35に記載の発明に係る細胞培養システムは、請求項 33または 34に記載の 発明において、上記恒温槽が複数台設置され、各恒温槽に運転制御盤が接続され ると共に、これら複数台の運転制御盤に 1台の監視用コンピュータが接続されたこと を特徴とする。
[0046] 請求項 36に記載の発明に係る細胞培養システムは、請求項 33乃至 35のいずれ 力 1に記載の発明において、上記監視用コンピュータに、公衆通信回線を経て遠隔 監視用コンピュータが接続されたことを特徴とする。
[0047] 請求項 37に記載の発明に係る細胞培養システムは、請求項 32乃至 36のいずれ かに記載の発明において、上記培養ユニットを構成する恒温槽のキヤニスタは、それ ぞれが、細菌などの出入りのない状態に隔離されて構成されたことを特徴とする。
[0048] 請求項 38に記載の発明に係る細胞培養システムは、請求項 32乃至 37のいずれ かに記載の発明において、上記培養ユニットを構成する恒温槽のキヤニスタには、上 記恒温槽内の空気を上記キヤニスタへ導くファンが設置され、 1つの恒温槽における 全てのキヤニスタの上記ファンは、当該恒温槽のドアが開放されたときに停止するよう 構成されたことを特徴とする。
[0049] 請求項 39に記載の発明に係る細胞培養システムは、請求項 32乃至 38のいずれ かに記載の発明において、上記培養ユニットを構成する恒温槽のキヤニスタでは、 1 つの恒温槽における各キヤニスタのドア力 V、ずれか 1枚のみ開放されるよう構成さ れたことを特徴とする。
[0050] 請求項 40に記載の発明に係る細胞培養システムは、請求項 32乃至 39のいずれ かに記載の発明にお 、て、上記細胞が浮遊系細胞であることを特徴とする。
[0051] 請求項 41に記載の発明に係る細胞培養システムは、請求項 32乃至 40の 、ずれ かに記載の発明にお 、て、上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とする
[0052] 請求項 42に記載の発明に係る細胞培養方法は、細胞を培養し、その培養を監視 し管理する細胞培養方法であって、細胞を培養する培養容器をそれぞれ配設する複 数の培養ユニットが互いに隔離して配置され、上記培養ユニット毎に独立した培養環 境下で細胞を培養する恒温槽を用いて、この恒温槽の上記培養ユニット毎に、細胞 の培養に関する細胞培養関連データを収集して蓄積し、上記細胞培養関連データ に基づき上記培養ユニット毎に、細胞の培養状態を監視し、細胞の培養操作を管理 することを特徴とする。
[0053] 請求項 43に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 42に記載の発明にお 、 て、上記細胞培養関連データは、細胞、培地、培養容器、恒温槽、培養ユニット及び 操作者の識別符号と、恒温槽及び培養ユニット内の培養環境データと、培養容器内 の細胞の画像データとの少なくとも 1つであることを特徴とする。
[0054] 請求項 44に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 42または 43の 、ずれか に記載の発明にお 、て、上記細胞が浮遊系細胞であることを特徴とする。
[0055] 請求項 45に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 42乃至 44の ヽずれかに 記載の発明にお ヽて、上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とする。
[0056] 請求項 46に記載の発明に係る細胞培養プログラムは、細胞を培養し、その培養を 監視し管理するためにコンピュータに記憶した細胞培養プログラムであって、細胞を 培養する培養容器をそれぞれ配設する複数の培養ユニットが互いに隔離して配置さ れ、上記培養ユニット毎に独立した培養環境下で細胞を培養する恒温槽の上記培 養ユニット毎に、細胞の培養に関する細胞培養関連データを収集して蓄積する手順 と、上記細胞培養関連データに基づき上記培養ユニット毎に細胞の培養状態を監視 する手順と、上記細胞培養関連データに基づき上記培養ユニット毎に細胞の培養操 作を管理する手順と、を有することを特徴とする。
[0057] 請求項 47に記載の発明に係る細胞培養装置は、細胞を培養する複数の培養容器 が順次接続され、各培養容器は、異なる培養環境で細胞を培養して、下流側の上記 培養容器へ培養した細胞を移行して培養する構成としたことを特徴とする。
[0058] 請求項 48に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 47に記載の発明にお 、 て、上記培養容器は 2個設置され、一の培養容器が細胞に機能を発現させる培養環 境を有する機能発現用培養容器であり、他の培養容器が細胞を増殖させる培養環 境を有する増殖用培養容器であることを特徴とする。
[0059] 請求項 49に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 48に記載の発明におい て、上記機能発現用培養容器は、増殖のために誘導因子により細胞に刺激を与える 培養環境を有する誘導因子刺激用培養容器であることを特徴とする。
[0060] 請求項 50に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 48に記載の発明におい て、上記機能発現用培養容器は、増殖した細胞を分化させる培養環境を有する分化 誘導用培養容器であることを特徴とする。
[0061] 請求項 51に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 47乃至 50のいずれかに 記載の発明にお 、て、上記細胞は浮遊系細胞であることを特徴とする。
[0062] 請求項 52に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 47乃至 51のいずれかに 記載の発明にお ヽて、上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とする。
[0063] 請求項 53に記載の発明に係る細胞培養方法は、複数の培養容器にお!、てそれぞ れ異なる培養環境で細胞を培養させ、一の培養容器で培養した細胞を下流側の他 の培養容器へ順次移行して培養を実施することを特徴とする。
[0064] 請求項 54に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 53に記載の発明にお 、 て、上記培養容器は 2個であり、一の培養容器で増殖のために誘導因子により細胞 を刺激した後に、他の培養容器で細胞を増殖させることを特徴とする。 [0065] 請求項 55に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 53に記載の発明にお 、 て、上記培養容器は 2個であり、一の培養容器で細胞を増殖させた後に、他の培養 容器で細胞を分化させることを特徴とする。
[0066] 請求項 56に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 53乃至 55のいずれかに 記載の発明にお 、て、上記細胞は浮遊系細胞であることを特徴とする。
[0067] 請求項 57に記載の発明に係る細胞培養方法は、請求項 53乃至 56のいずれかに 記載の発明にお ヽて、上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とする。
[0068] 請求項 58に記載の発明に係る細胞培養装置は、細胞を培養する培養容器と、上 記培養容器を載置する載置台と、を備えた細胞培養装置であって、上記載置台は昇 降可能な部分を有し、上記昇降可能な部分が昇降することにより、載置された培養 容器の培養可能な面積が変化することを特徴とする。
[0069] 請求項 59に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 58に記載の発明におい て、上記細胞が浮遊系細胞であることを特徴とする。
[0070] 請求項 60に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 58又は請求項 59に記載 の発明において、上記細胞が免疫細胞療法に使用されることを特徴とする。
[0071] 請求項 61に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 58乃至請求項 60のうち、 いずれか 1に記載の発明において、上記培養容器に、この培養容器へ供給される培 地を貯溜する培地貯留手段が接続されていることを特徴とする。
[0072] 請求項 62に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 61に記載の発明にお 、 て、上記培地貯溜手段、培養容器が閉鎖系にて構成されたことを特徴とする。
[0073] 請求項 63に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 61又は請求項 62に記載 の発明において、上記培地貯溜手段には、使用済み培地を貯溜可能な使用済み培 地貯溜容器が、培養容器へ供給する培地を貯溜可能な培地貯溜容器と共に設置さ れ、増殖用培養容器内の使用済み培地を上記使用済み培地貯溜容器に排出し貯 溜するよう構成されたことを特徴とする。
[0074] 請求項 64に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 58乃至請求項 63のうち、 V、ずれか 1に記載の発明にお 、て、上記培養容器内の細胞の画像を取得するため の画像撮影手段と、前記画像取得手段にて取得した細胞の画像から当該細胞の培 養状況を判定し、この判定に基づき培養操作を実行する制御手段と、を備えることを 特徴とする。
[0075] 請求項 65に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 58に記載の発明におい て、上記培養容器は、細胞を増殖するための増殖用培養容器と、細胞に機能を発現 させるための機能発現用培養容器とであり、この機能発現用培養容器内の細胞の画 像を画像取得手段が取得することを特徴とする。
[0076] 請求項 66に記載の発明に係る細胞培養装置は、請求項 65に記載の発明におい て、上記機能発現用培養容器は、増殖のために誘導因子により細胞を刺激する誘 導因子刺激用培養容器であり、制御手段は、上記誘導因子刺激用培養容器内の細 胞の画像に基づき、細胞の増殖可能性と細胞の増殖能力を判定し、培養可能な面 積を変化させるタイミング、培地貯溜手段力 上記増殖用培養容器への培地の供給 などの培養操作を制御することを特徴とする。
発明の効果
[0077] 請求項 1乃至 4、 12、 13、 14乃至 17、 22乃至 25のいずれかに記載の発明によれ ば、培養容器内の細胞の画像から当該細胞の培養状況を判定し、この培養状況に 応じた培養操作を実施することから、細胞の培養状況を非接触状態で判定できるの で当該細胞にダメージを与えることがなぐまた、培養操作を操作者が逐次実施する 必要がないので操作者の労力を軽減でき、更に、細胞の培養状況に応じた培養操 作を実施できるので適切な培養操作を実現できる。この細胞の培養状況に応じた適 切な培養操作を実現できることで、時間単位での培養操作が可能となり培養期間を 短縮できる。
[0078] 請求項 5または 6に記載の発明によれば、培地貯溜手段力 Sカセット構造に構成され て、培養容器 (機能発現用培養容器、増殖用培養容器)に接続されることから、培養 容器を培養に最適な環境に常に維持できるので、環境変化に伴う培養容器内細胞 へのダメージを低減できると共に、クリーンベンチ等内で培養容器に培地を補給する 無菌操作を省略できる。
[0079] 請求項 7、及び請求項 47乃至請求項 57に記載の発明によれば、培地貯溜手段、 機能発現用培養容器及び増殖用培養容器が閉鎖系にて構成されたことから、これら の培地貯溜手段、機能発現用培養容器及び増殖用培養容器を無菌状態に保持す ることがでさる。
[0080] 請求項 8または 18に記載の発明によれば、増殖用培養容器内での培養初期段階 に、この増殖用培養容器の液溜り部に細胞及び培地が貯溜されることから、面積当 たりの細胞密度を増殖に好適な密度に維持することで、細胞を効率よく増殖させるこ とがでさる。
[0081] 請求項 9または 19に記載の発明によれば、増殖用培養容器内で増殖された細胞を 機能発現用培養容器内へ導き、この細胞の画像が画像取得手段により取得されるこ とから、増殖用培養容器内で増殖された細胞を画像として取得して、その細胞数や 細胞の形態を観察することができる。
[0082] 請求項 10または 20に記載の発明によれば、増殖用培養容器内の使用済み培地 が培地貯溜手段の使用済み培地貯溜容器に排出されて貯溜されることから、増殖用 培養容器内の細胞密度を高めて濃縮することができるので、細胞回収のための遠心 分離操作回数を低減できる。この結果、細胞回収作業の省力化を実現できると共に 、遠心分離に伴う細胞へのダメージも低減できる。
[0083] 請求項 11または 21に記載の発明によれば、増殖用培養容器内で濃縮された細胞 を培地貯溜手段の細胞回収容器内に全量回収させることで、この細胞回収容器を遠 心分離機に直接装着して細胞を回収することができ、細胞回収作業の省力化を実現 できる。
[0084] 請求項 26乃至請求項 31に記載の発明によれば、培養容器内で細胞及び培地が 貯溜される液溜り部を所定の面積で変化させることができることから、培養中の面積 当たりの細胞密度を増殖に好適な密度に維持することで、細胞を効率よく増殖させる ことができる。
[0085] 請求項 32乃至請求項 36、請求項 42乃至請求項 46に記載の発明によれば、運転 制御盤及び監視用コンピュータが、恒温槽の培養ユニット毎に、細胞の培養に関す る細胞培養関連データを収集して蓄積することから、任意の培養ユニットで培養され た細胞に関する培養履歴を的確に把握することができる。また、運転制御盤及び監 視用コンピュータが、恒温槽の培養ユニット毎に、細胞培養関連データに基づいて 細胞の培養状態を監視することから、培養ユニット毎に培養状態の異常を監視するこ とができる。更に、運転制御盤及び監視用コンピュータ力 恒温槽の培養ユニット (キ ヤニスタ及び培養カセット）毎に、細胞培養関連データに基づいて、培地の交換 (培 地力セットの交換)や培養終了後の細胞回収 (培養バックまたは細胞回収バックによ る細胞回収)などの細胞培養操作を管理することから、恒温槽の培養ユニット毎操作 者が実施する操作 (作業)のための作業スケジュールを容易に作成することができる 。また、管理手段が、恒温槽と共に培養室内に設置され、恒温槽の各培養ユニット（ キヤ-スタ及び培養カセット）における培養を制御する機能を兼ね備えた運転制御盤 と、上記培養室以外の監視室に設置され、上記運転制御盤が有するデータを受信し て保存し表示 (閲覧)可能とする監視用コンピュータとを有して構成されたことから、培 養室内の恒温槽における培養ユニット内での細胞の培養状態を、監視用コンビユー タを用いて培養室以外の監視室において観察して監視し、管理することができ、この 管理によって、履歴等を自動的に記録'保管し、人為的な改ざんや記録ミスを防ぐこ とがでさる。
[0086] 請求項 37乃至請求項 41に記載の発明によれば、培養ユニットを構成する恒温槽 のキヤニスタは、それぞれが吸気フィルタ及び排気フィルタによって細胞又は Z及び 細菌の出入りのない状態に隔離されて構成されたことから、各キヤ-スタ内に収納さ れる培養バック及び細胞接種カセット内の細胞が細菌に汚染されるコンタミネーショ ンを防止することができる。 1つの恒温槽における全てのキヤ-スタの送風ファンが、 当該恒温槽の本体ドアが開放されたときに停止するよう構成されたことから、恒温槽 の本体ドアの開放時に、当該恒温槽における各キヤニスタの密閉状態を保持できる ので、各キヤニスタについて独立した培養環境を良好に確保でき、キヤ-スタ内の培 養環境の変動を抑制できる。 1つの恒温槽における各キヤ-スタのキヤ-スタドアが、 いずれか 1枚のみ開放されるよう構成されたことから、 1つの恒温槽において各キヤ- スタのキヤ-スタドアが同時に 2以上開放されることがないので、キヤニスタ内での培 養バック及び細胞接種カセットの搬入出の取り違いを防止できると共に、細胞同士が 互いに汚染されるクロスコンタミネーシヨンを防止することができる。
[0087] 請求項 58乃至請求項 66に記載の発明によれば、培養バッグ内での培養初期段階 の抗体刺激と細胞増殖を同一培養バッグ内で行 、、この培養バッグ内で細胞及び培 地が貯溜される液溜り部を所定の面積で変化させることができることから、培養中の 面積当たりの細胞密度を増殖に好適な密度に維持することで、細胞を効率よく増殖 させることがでさる。
発明を実施するための最良の形態
[0088] 以下、本発明を実施するための最良の形態を、図面に基づき説明する。
[A]第 1の実施の形態（図 1〜図 20)
図 1 (a)は、本発明に係る細胞培養装置における第 1の実施の形態を示す構成図で あり、図 1 (b)は、本発明に係る細胞培養システムにおける第 1の実施の形態を示す 構成図である。図 2は、図 1の恒温槽を示す斜視図である。図 5は、図 2の恒温槽に おける一つのキヤ-スタと、このキヤ-スタ内に収納される培養カセットと力 なる培養 ユニットの構成を示すレイアウト図である。
[0089] 図 1 (a)に示す細胞培養装置 10は、特に、免疫細胞療法に用いられる浮遊系細胞 を培養するものであり、複数個（例えば 8個）の培養ユニット 12を備えた恒温槽 11と、 この恒温槽 11及び培養ユニット 12の運転を制御する運転制御盤 13と、細胞の画像 を処理するための画像処理用コンピュータ 14と、運転制御盤 13及び画像処理用コ ンピュータ 14に接続されて、恒温槽 11及び培養ユニット 12を監視するための監視用 コンピュータ 15とを有して構成される。上記運転制御盤 13及び画像処理用コンピュ ータ 14が制御手段として機能する。
[0090] 上記細胞培養装置 10は細胞培養システムとして実現することもでき、この細胞培養 システム 10は、特に、免疫細胞療法に用いられる浮遊系細胞を培養し、その培養を 監視し管理するものであり、上記細胞培養装置と同じぐ恒温槽 11、運転制御盤 13 、画像処理用コンピュータ 14及び監視用コンピュータ 15を有して構成される。図 l (b )に示すように、上記恒温槽 11、運転制御盤 13及び画像処理用コンピュータ 14は、 細胞の培養に適した培養室 (クリーンルーム） 94内に設置され、監視用コンピュータ 1 5は、この培養室 94以外の監視室 95に設置される。上記恒温槽 11は、細胞培養す る培養容器 (後述の増殖用培養容器、誘導因子刺激培養容器)をそれぞれ配設する 複数個（例えば 8個）の培養ユニット 12が互いに隔離して配置されたものである。この 恒温槽 11では、培養ユニット 12毎に独立した培養環境下で上記培養容器内の細胞 が培養される。
[0091] 上記運転制御盤 13は、恒温槽 11及び培養ユニット 12の運転を制御すると共に、 細胞の培養を恒温槽 11の培養ユニット 12毎に監視し管理する。また、上記画像処 理用コンピュータ 14は、恒温槽 11の培養ュ-ット 12毎に培養中の細胞の画像を処 理し、運転制御盤 13と共に、培養操作を制御する制御手段として機能する。更に、 上記監視用コンピュータ 15は、運転制御盤 13及び画像処理用コンピュータ 14に接 続され、これらの運転制御盤 13及び画像処理用コンピュータ 14が有するデータを受 信して保存すると共に表示 (閲覧)可能とし、運転制御盤 13と共に、細胞の培養を監 視し管理する管理手段として機能する。
[0092] ここで、上記浮遊系細胞としては、末梢血単核球、 LAK細胞（Lymphokine Acti vated Killer細胞）、神経幹細胞、 ES細胞などが知られている。これらの浮遊系細 胞を以下単に細胞と称する。なお、これらの細胞をそれぞれの細胞にあった誘導因 子で刺激して培養する。各誘導因子は、細胞毎に異なり、例えば LAK細胞では抗ヒ ト CD3抗体等であり、神経幹細胞の誘導因子では EGF等の上皮成長因子であり、 E S細胞の誘導因子では FGF— 8b等の線維芽細胞増殖因子である。また、本細胞培 養装置 10は、上記浮遊系細胞以外の接着依存性細胞を培養する場合にも適用可 能である。
[0093] 上記培養ユニット 12は、恒温槽 11内で互いに隔離して分離された複数個（例えば 8個）のキヤ-スタ 16 (図 2及び図 5)と、各キヤ-スタ 16内に収納される培養カセット 1 7 (図 2及び図 3)とを有してなる。この培養カセット 17は、後に詳説するように、増殖用 培養容器としての培養バッグ 18、誘導因子刺激用培養容器としての細胞接種カセッ ト 19、及び培地貯溜手段としての培地カセット 20を備える。これらの培養容器 (培養 ノ ッグ 18、細胞接種カセット 19)内の細胞は、キヤ-スタ 16ごとに独立した、培養環 境下で培養される。
[0094] 上記恒温槽 11は、図 2に示すように、開閉可能な本体ドア 21を備えた恒温槽本体 22内に複数段の棚 23が設置され、各棚 23にキヤニスタ 16が 1個ずつ配置されてな る。この恒温槽 11は、本体ドア 21を閉じた状態で、恒温槽本体 22内の環境 (温度、 湿度及び C02濃度）を、細胞を培養するために必要な環境に維持する。
[0095] このため、恒温槽本体 22内には、図 5及び図 6に示すように、温度センサ 24、 C02 センサ 25、ドアセンサ 26及びヒータ 27が配設され、更にこの恒温槽本体 22に、外部 に設置されたガスボンベ 28が連結される。温度センサ 24、 C02センサ 25及びドアセ ンサ 26からの信号は、運転制御盤 13へ送信される。この運転制御盤 13は、温度セ ンサ 24からの温度信号に基づ!/、てヒータ 27を制御し、 C02センサ 25からの C02濃 度信号に基づ 、て、ガスボンベ 28から恒温槽本体 22内へ供給される C02ガス量を 制御する。
[0096] 上記キヤ-スタ 16は、図 5及び図 6に示すように、キヤ-スタ本体 30に開閉可能な キヤ-スタドア 31が取り付けられ、キヤ-スタ本体 30に吸気フィルタ 32及び排気フィ ルタ 33が設置されると共に、キヤ-スタ本体 30の吸気フィルタ 32側に送風ファン 34 が設置されたものである。
[0097] 吸気フィルタ 32及び排気フィルタ 33は、細菌を除去するフィルタであり、送風ファン 34の運転により恒温槽本体 22内の空気及び C02ガスがキヤ-スタ 16内へ取り込ま れる際に、恒温槽本体 22からキヤ-スタ 16内への細菌の流入を防止する。また、送 風ファン 34の運転は運転制御盤 13により制御され、恒温槽 11の本体ドア 21が開い た旨の信号がドアセンサ 26から運転制御盤 13へ送信された際に、送風ファン 34の 運転が停止されて、キヤニスタ 16の密閉状態が確保される。
[0098] 吸気フィルタ 32及び排気フィルタ 33による恒温槽本体 22からキヤ-スタ 16内への 細菌流入防止機能と、送風ファン 34の運転停止によるキヤ-スタ 16の密閉性確保と によって、各キヤ-スタ 16内がそれぞれ独立した培養環境となる。これにより、恒温槽 11における一つのキヤ-スタ 16に収納される培養カセット 17内の細胞が他のキヤ- スタ 16内の細胞に対して隔離されると共に、このキヤ-スタ 16に収納される培養カセ ット 17内の細胞が雑菌によって汚染されるコンタミネーシヨンが防止される。また、他 の患者の細胞によって汚染されるいわゆるクロスコンタミネーシヨンも防止される。
[0099] キヤ-スタ本体 30には、更にドアセンサ 35、ドアロックセンサ 36、温度センサ 37、 湿度センサ 38、ドアロック機構 39、ヒータ 40及び循環ファン 41が配設されている。運 転制御盤 13は、温度センサ 37からの温度信号に基づいてヒータ 40を制御する。ま た、運転制御盤 13は、循環ファン 41の運転を制御して、キヤニスタ 16内で空気及び C02ガスを循環させる。上記湿度センサ 38は、キヤニスタ 16内の湿度を検出して運 転制御盤 13へ送信し、その異常を検出する。このようにして、キヤニスタ 16内は細胞 を培養するための最適な環境に保持される。
[0100] また、運転制御盤 13は、一つの恒温槽 11において 2以上のキヤ-スタドア 31が同 時に開動作を行うことがないようにドアロック機構 39の動作を制御する。これにより、 異なるキヤ-スタ 16間で細胞や培地などが取り違えて搬入されることが防止される。 このドアロック機構 39のロック動作はドアロックセンサ 36により検出されて、運転制御 盤 13へ送信される。また、キヤニスタドア 31の開閉状態はドアセンサ 35によって検出 されて、運転制御盤 13へ送信される。
[0101] 図 5に示すキヤニスタ本体 30内の下部には、キヤ-スタ 16内に収納される培養カセ ット 17を支持するステージ 42が設けられ、このステージ 42に重量計 43が設置される 。この重量計 43は、キヤ-スタ 16内に収納された培養カセット 17の培養バッグ 18の 重量を計測するものであり、実際には、培地カセット 20から培養バッグ 18へ供給され る培地量を計測する。この重量計 43の計測値も運転制御盤 13へ送信される。また、 キヤ-スタ本体 30には、表示灯 44が設けられている。キヤ-スタ 16内で自動培養を 行っているときに、このキヤ-スタ 16の表示灯 44を例えば赤色点灯させ、操作指令 が出力されたキヤニスタ 16と、内部に培養カセット 17が収納されていないキヤ-スタ 1 6の表示灯 44を緑色点灯させる。これにより、自動培養を行っているキヤ-スタ 16に ついては他のキヤ-スタ 16とは独立した培養環境が確保され、他のキヤ-スタ 16に 収納されて 、る検体 (細胞）とのクロスコンタミネーシヨンや取り違 、を防止することが 可能となる。
[0102] ここで、上記培養カセット 17について説明する。
この培養カセット 17は、図 3及び図 5に示すように、ラージトレイ 45に培養バッグ 18 、細胞接種カセット 19及び培地カセット 20が装着されたものであり、培養バッグ 18及 び細胞接種カセット 19が細胞を培養する培養容器である。このうち、細胞接種カセッ ト 19は、細胞に機能を発現させる (例えば細胞を増殖させる、細胞を分化 (後述)させ る等)ための機能発現用培養容器であり、本実施形態では、増殖のために誘導因子 により細胞を刺激する誘導因子刺激用培養容器である。また、培養バッグ 18は、細 胞接種カセット 19において誘導因子により刺激された細胞を増殖するための増殖用 培養容器である。
[0103] 培養バッグ 18は、細胞が接種された培養液を収容する可撓性のデイスポーサブル の容器であり、載置台 46 (図 5)を介して、図 4 (A)に示す培養バッグトレイ 47に載置 され、この培養バッグトレイ 47が図 3及び図 5に示すラージトレイ 45に着脱可能に装 着される。上記培養バッグ 18は、例えば酸素透過性材質力もなるノ ッグである。上記 ラージトレイ 45には、図 5に示すように、第 1ポンプ 48、第 2ポンプ 49及び第 3ポンプ 50が配置される。培養バッグ 18の一端側は、チューブ 63を用い第 2ポンプ 49を経て 第 7コネクタ 57に接続される。また、培養バッグ 18の他端側は、チューブ 60を用いて 第 1コネクタ 51に接続される。上記第 1ポンプ 48、第 2ポンプ 49、第 3ポンプ 50は、 滅菌チューブ交換の利便性から、蠕動型 (ぺリスタルティックタイプ)ポンプが好まし い。
[0104] このラージトレイ 45では、チューブ 61の一端は第 3コネクタ 53に接続され、他端は 第 5コネクタ 55に接続される。このチューブ 61は、第 1ポンプ 48の図示しない回転駆 動部に配設されている。チューブ 63の一端は、前述の如く第 7コネクタ 57に接続され 、他端は培養バッグ 18に接続される。このチューブ 63は、第 2ポンプ 49の図示しな い回転駆動部に配設されている。チューブ 62は、一端がコネクタ Xによりチューブ 61 に接続され、他端がコネクタ Yによりチューブ 63に接続される。このチューブ 62は、 第 3ポンプ 50の図示しな ヽ回転駆動部に配設されて ヽる。
[0105] 上記細胞接種カセット 19は、図 4 (C)に示すように、誘導因子刺激容器 65の底面 内側に誘導因子を固層化し、この誘導因子刺激容器 65内に培地を投入し、この培 地に細胞を接種し、この誘導因子刺激容器 65をカセットフレーム 66に設置して、力 セット構造に構成されたものである。上記誘導因子刺激容器 65に誘導因子、培地及 び細胞を入れる作業は、クリーンベンチ又は安全キャビネット（以下、本実施の形態 において、クリーンベンチ等という）内で無菌状態で実施される。尚、培地及び細胞 の混合液を培養液と称する。
[0106] 上記細胞接種カセット 19は、図 3に示すように、ラージトレイ 45に着脱可能に装着 される。このときには、図 5に示すように、細胞接種カセット 19の第 2コネクタ 52及び 第 4コネクタ 54がラージトレイ 45の第 1コネクタ 51、第 3コネクタ 53のそれぞれに無菌 的に結合される。つまり、第 1コネクタ 51と第 2コネクタ 52は、例えば一方のゴム状結 合部に他方の針状結合部が差し込まれることで無菌的に結合される。第 3コネクタ 53 と第 4コネクタ 54との結合にっ ヽても同様である。
[0107] 第 1コネクタ 51と第 2コネクタ 52との結合によりチューブ 60を用いて、異なる培養環 境の細胞接種カセット 19と培養バッグ 18、つまり細胞を誘導因子により刺激して当該 細胞に増殖機能を発現させるための培養環境を有する細胞接種カセット 19と、細胞 を増殖するための培養環境を有する培養バッグ 18とが接続されることになる。従って 、細胞接種カセット 19において誘導因子により刺激され、増殖を開始し始めた細胞 を培養バッグ 18へ移行させ、この培養バッグ 18において増殖のみを実施させること が可能となる。
[0108] 前記培地カセット 20は、図 4 (B)に示すように、培地貯溜容器としての培地バッグ 6 7、及び使用済み培地貯溜容器としての使用済み培地バッグ 68が培地バッグトレイ 6 9に載置されて、カセット構造に構成されたものである。上記培地バッグ 67は、培養 ノ ッグ 18、細胞接種カセット 19へ供給される培地を貯溜するものである。また、上記 使用済み培地バッグ 68は、培養バッグ 18から排出される使用済み培地（上澄み）を 貯溜するものである。培地カセット 20がカセット構造に構成されたことにより、培養バ ッグ 18をキヤニスタ 16内に維持した状態で、当該キヤニスタ 16内の培養カセット 17 に培地カセット 20を装着するだけで培地の交換、供給が可能となる。
[0109] 上記培地カセット 20は、ラージトレイ 45 (図 3)に着脱可能に装着される。このとき、 図 5に示すように、培地カセット 20の第 6コネクタ 56、第 8コネクタ 58がラージトレイ 45 の第 5コネクタ 55、第 7コネクタ 57のそれぞれに、第 1コネクタ 51及び第 2コネクタ 52 の場合と同様にして無菌的に結合される。第 6コネクタ 56と第 5コネクタ 55との結合に より、培地バッグ 67と細胞接種カセット 19とが接続される。また、第 7コネクタ 57と第 8 コネクタ 58との結合により、使用済み培地バッグ 68と培養バッグ 18とが接続される。
[0110] 培養バッグ 18、細胞接種カセット 19及び培地カセット 20が上述のように接続される ことで、培地カセット 20における培地バッグ 67内の培地力 第 1ポンプ 48の起動によ り細胞接種カセット 19を経て培養バッグ 18へ供給され、この培養バッグ 18内の使用 済み培地が、第 2ポンプ 49の起動により培地カセット 20の使用済み培地バッグ 68へ 排出される閉鎖系が構成される。この閉鎖系の構成により、当該系統 (培養バッグ 18 、細胞接種カセット 19及び培地カセット 20が無菌状態に保持される。
[0111] 尚、上記細胞接種カセット 19は、内部に細胞がなくなった段階でダミーカセット 70 に置き換えられる。これにより、細胞接種カセット 19内の誘導因子が培養バッグ 18内 へ移行することが防止される。また、培地カセット 20は、培地バッグ 67が空になった 段階で、培地が満たされた培地バッグ 67と空の使用済み培地バッグ 68とを具備する 新たな培地カセット 20に交換される。この交換は操作者によって実施される。上記ダ ミーカセット 70は、単に、培地を流動させる流路として機能するものである。
[0112] 培養バッグ 18内での培養（細胞増殖）には、第 1ポンプ 48を起動させて、培地カセ ット 20の培地バッグ 67内の培地を培養バッグ 18へ供給 (流加）することで細胞を増 殖させる流加培養と、第 1ポンプ 48及び第 2ポンプ 49を起動させて、培養バッグ 18 内の使用済み培地を培地カセット 20の使用済み培地バッグ 68へ排出し、且つ培地 ノ ッグ 67内の培地を培養バッグ 18へ供給することで細胞を増殖させる灌流培養と、 後述の振盪装置 80を用いた振盪培養と、振盪を実施しない静置培養とがある。この うち灌流培養には、使用済み培地の排出と培地の供給とを交互に実施する間欠式 灌流培養と、使用済み培地の排出と培地の供給とを同時に実施する連続式灌流培 養とがある。この連続式灌流培養では、通常、チューブ 63のうち培養バッグ 18と第 2 ポンプ 49との間に、細胞の移動を阻止するフィルタ 71が配設されて、培養バッグ 18 内の細胞が使用済み培地バッグ 68へ排出されることが防止される。
[0113] 前記第 3ポンプ 50は、培養バッグ 18内で増殖された細胞を画像により観察する場 合などに起動される。つまり、培養バッグ 18内の細胞は、チューブ 63にフィルタ 71が 配設されていない場合には、培養バッグ 18力もチューブ 63、チューブ 62及びチュー ブ 61を経て、細胞接種カセット 19またはダミーカセット 70へ導かれ、後述の CCD力 メラ 88により撮像されて、増殖された細胞数などが観察される。上記チューブ 63にフ ィルタ 71が配設されている場合には、第 3ポンプ 50の上流側がバイパスチューブ 73 を介して培養バッグ 18に接続され、培養バッグ 18内の細胞は、上記バイパスチュー ブ 73及びチューブ 62を経て、細胞接種カセット 19またはダミーカセット 70内へ導か れ、 CCDカメラ 88を用いて観察される。
[0114] 上記培地カセット 20の使用済み培地バッグ 68へは、培養バッグ 18における細胞の 増殖終了後に、培養バッグ 18内の使用済み培地が排出されて、この培養バッグ 18 内の細胞が濃縮される。この使用済み培地の排出は第 2ポンプ 49の起動により実施 され、重量計 43の計測値に基づき運転制御盤 13の制御によって、培養バッグ 18内 の培養液の容量が約 1Z2〜： LZ3程度になるまで実施される。この培養バッグ 18内 での細胞の濃縮により、その後に実施される細胞洗浄'濃縮を目的とした遠心分離 機による遠心分離回数が低減される。
[0115] また、培地カセット 20では、培養バッグ 18における細胞が上述のように濃縮された 後に、使用済み培地バッグ 68を、遠心分離機に装着可能な細胞回収容器としての 細胞回収バッグ 72に置き換え、この細胞回収バッグ 72内へ、培養バッグ 18内で細 胞が濃縮された培養液 (培地及び細胞)を、第 2ポンプ 49の起動により供給してもよ い。この場合には、チューブ 63にフィルタ 71が配設されていないことが条件となる。こ れにより、遠心分離機に装着可能なバッグでの細胞の回収を、閉鎖系空間であるキ ヤニスタ 16内で実施でき、細胞の回収作業が省力化される。
[0116] キヤ-スタ 16内に収納される培養カセット 17のラージトレイ 45には、図 5及び図 6に 示すように、細胞接種カセット 19またはダミーカセット 70がラージトレイ 45に装着され たことを検出する細胞接種カセットセンサ 74と、培地カセット 20がラージトレイ 45に装 着されたことを検出する培地カセットセンサ 75とが設置されて 、る。これらのセンサ 7 4及び 75の信号は運転制御盤 13へ送信される。この運転制御盤 13は、培養カセット 17のラージトレイ 45に細胞接種カセット 19またはダミーカセット 70が装着され、且つ 培地カセット 20が装着されたことを確認して、第 1ポンプ 48、第 2ポンプ 49及び第 3 ポンプ 50を起動させる。
[0117] ところで、図 5に示すように、キヤ-スタ 16内には培養カセット 17が収納され、この培 養カセット 17がキヤ-スタ 16のステージ 42に支持される力 このステージ 42には、培 養カセット 17の培養バッグトレイ 47が配置される下方位置に傾斜モータ 76、カム機 構 79及び位置決めセンサ 77が設置される。培養バッグトレイ 47上で培養バッグ 18 を直接載置する載置台 46は、その一部（図示しない昇降部）が昇降可能に構成され る。上記傾斜モータ 76はカム機構 79を回動させて、載置台 46の上記昇降部を昇降 させる。この昇降部の位置が位置決めセンサ 77により検出されて、運転制御盤 13へ 送信される。傾斜モータ 76は運転制御盤 13により制御され、培養バッグ 18における 培養初期段階で、載置台 46の昇降部を下降させるよう制御される。これにより、培養 ノ ッグ 18に液溜り部 78 (図 8及び図 9)が形成される。
[0118] 培養バッグ 18における培養初期段階で、細胞接種カセット 19からの培養液 (培地 及び細胞）が液溜り部 78に貯溜されることにより、培養バッグ 18内の面積当たりの細 胞密度が増殖に好適な密度に保持されて、培養初期に細胞が効率的に増殖される 。培養バッグ 18内に培養液が所定量 a (後述)以上になる培養中期及び後期には、 傾斜モータ 76がカム機構 79を介して載置台 46の昇降部を上昇させ、培養バッグ 18 を水平状態として上記液溜り部 78を解消する。
[0119] 更に、キヤ-スタ 16内には、図 5に示すように、培養カセット 17の培養バッグトレイ 4 7が配置される上方位置に、振盪装置 80の振盪機構 91が押圧手段として設置され る。この振盪装置 80は、上記振盪機構 91、作動モータ 81、カム機構 90及び位置決 めセンサ 82を有する。振盪機構 91は、図 7に示すように、装置フレーム 83に、ガイド ロッド 84を介して、作動板 85が上下移動自在に配設され、この作動板 85の底面に 複数の突出部 86が突設されたものである。作動板 85が作動モータ 81により、カム機 構 90 (図 5)の作用で上方または下方に交互に移動されることで、この作動板 85の突 出部 86が、振盪機構 91の下方に位置する培養バッグ 18を繰り返し押圧、つまり培 養バッグ 18に対し押圧と押圧解除を繰り返す。これにより、培養バッグ 18内の培養 液が攪拌されて、培養バッグ 18内の細胞が培養液内で浮遊して移動し、この培養バ ッグ 18内での細胞の分布及び培地の成分濃度が均一化され、また酸素供給能も高 くなることにより細胞の増殖が促進される。
[0120] 図 6に示すように、上記位置決めセンサ 82により作動板 85の位置が検出されて運 転制御盤 13へ送信され、この運転制御盤 13により作動モータ 81が制御される。上 記振盪装置 80を用いた培養バッグ 18内での細胞培養 (振盪培養）は、培養バッグ 1 8内に培養液が一杯程度に満たされる前に実施されてもよぐまたは一杯程度に満た された後に実施されてもょ ヽ。
[0121] また、キヤ-スタ 16内には、図 5に示すように、培養カセット 17の細胞接種カセット 1 9またはダミーカセット 70が配置される位置の上方に照明用 LED87が、下方に画像 取得手段としての CCDカメラ 88が設置される。照明用 LED87は、細胞接種カセット 19またはダミーカセット 70を上方から照明するものである。 CCDカメラ 88は、細胞接 種カセット 19またはダミーカセット 70内の細胞を下方力も撮影して、その画像を取得 するものである。これらの照明用 LED87の照明動作と CCDカメラ 88の撮影動作は 運転制御盤 13 (図 6)により制御され、所定時間（例えば 6時間）毎に細胞接種カセッ ト 19またはダミーカセット 70内の細胞の画像が取得される。所定時間毎の細胞画像 は、画像処理用コンピュータ 14の画像メモリ回路 89に記憶される。
[0122] 前記画像処理用コンピュータ 14は、画像メモリ回路 89内に記憶された所定時間毎 の細胞画像を画像処理、例えば 2値化処理や多値化処理して、単一細胞の投影面 積の平均値と、単一細胞が凝集した細胞凝集塊である非単一細胞の増加速度とを 細胞培養の評価パラメータとして算出する。単一細胞の投影面積の平均値 (単一細 胞の平均投影面積）は、細胞接種カセット 19を培養カセット 17に装着し、この培養力 セット 17をキヤニスタ 16内に収納して培養を開始した時力も例えば 24時間経過後の 細胞画像から算出する。
[0123] また、上述の非単一細胞である力否かは、培養初期の単一細胞の投影面積が 100 μ m2未満であることから、投影面積が 100 m2以上の場合を非単一細胞と判断す る。細胞の経時的な画像 (例えば、培養開始から 24時間、 48時間、 72時間経過後 の画像)から、全細胞に対する非単一細胞の割合の変化を演算して、非単一細胞の 増加速度を算出する。
[0124] 画像処理用コンピュータ 14は、単一細胞の平均投影面積力もラグタイムを算出し、 当該細胞の増殖開始時期を推定する。ここで、上記ラグタイムとは、細胞接種カセット 19の誘導因子刺激容器 65に細胞を接種してから増殖開始までに要する誘導期の 時間である。画像処理用コンピュータ 14は、細胞の増殖開始時期から当該細胞の培 養状況、つまり当該細胞が誘導因子の刺激により増殖の可能性があるか否かを判断 する。そして、画像処理用コンピュータ 14は、当該細胞の判定結果 (例えば、当該細 胞が増殖する可能性がある場合には「YES」そうでな 、場合には「NO」等の信号)を 運転制御盤 13に対して送信する。運転制御盤 13は、細胞接種カセット 19の誘導因 子刺激容器 65内の細胞について増殖の可能性が著しく低いと判断した旨の信号を 受けたときには、当該細胞について、その状態を表示する。尚、ラグタイムが長すぎる 細胞は、誘導因子による刺激が著しく入り難い細胞であり、増殖の可能性が低いと判 断される。
[0125] また、画像処理用コンピュータ 14は、非単一細胞の増加速度から当該細胞の最小 倍化時間を算出する。ここで、倍ィ匕時間とは、ある時間における細胞の細胞数が倍の 細胞数になるまでに要する時間をいう。画像処理用コンピュータ 14は、この最小倍化 時間から当該細胞の培養状況、つまり当該細胞の増殖能力を判断して運転制御盤 1 3へ送信する。そして、画像処理用コンピュータ 14から信号を受けた運転制御盤 13 は、上記細胞の増殖能力に基づいて、細胞接種カセット 19から培養バッグ 18へ細 胞を移動させるタイミングや、培養バッグ 18へ培地を流加させる流加速度などを決定 する。尚、最小倍ィ匕時間が長すぎる細胞は、増殖能力が著しく低い細胞であると判 断される。
[0126] 制御手段として機能する運転制御盤 13及び画像処理用コンピュータ 14は、図示し ないが、演算や制御を実行する CPUと、処理プログラムやデータを記憶する記憶装 置 (メモリ）と、データやコマンドなどを入力するためのキーボード、マウスまたはタツチ パネルなどの入力装置やモニタなどの出力装置との接続を行う入出力回路とを有し て構成される。更に、画像処理用コンピュータ 14にあっては、 CCDカメラ 88力 の画 像データを記憶する画像メモリ回路 89を備える。
[0127] 画像処理用コンピュータ 14の記憶装置には、 CCDカメラ 88が所定時間毎に撮影 した細胞接種カセット 19内の細胞の画像を画像処理 (例えば 2値化処理や多値化処 理)して、細胞培養の評価パラメータ (単一細胞の平均投影面積、非単一細胞の増 加速度)などを算出し、この細胞培養の評価パラメータから細胞の培養状況 (細胞の 増殖可能性、細胞の増殖能力）を判定するためのプログラムが記憶されて 、る。
[0128] また、運転制御盤 13の記憶装置には、細胞の培養状況に応じて恒温槽 11、キヤ二 スタ 16及び培養カセット 17に関する機器 (例えば第 1ポンプ 48、第 2ポンプ 49など） を制御し、培養操作を実行するためのプログラムが記憶されている。更に、この運転 制御盤 13の記憶装置には、 CCDカメラ 88を所定時間毎に制御して細胞の画像を取 得するなど、恒温槽 11、キヤニスタ 16及び培養カセット 17の各種センサからの信号 に基づいて、これらの恒温槽 11、キヤニスタ 16及び培養カセット 17に関する機器を 制御する機器制御用のプログラムも記憶されて 、る。
[0129] 細胞培養システム 10においては、管理手段としての上記運転制御盤 13及び監視 用コンピュータ 15のうち、運転制御盤 13の記録装置には、恒温槽 11のキヤ-スタ 16 毎に、及びこのキヤ-スタ 16内に収納された培養カセット 17毎に、細胞の培養に関 する細胞培養関連データを収集して蓄積するプログラムと、上記細胞培養関連デー タに基づきキヤニスタ 16及び培養カセット 17毎に細胞の培養状態を監視するプログ ラムと、上記細胞培養関連データに基づきキヤ-スタ 16及び培養カセット 17毎に細 胞の培養操作を管理するプログラムとが記憶されている。
[0130] ここで、上記細胞培養関連データは、細胞、培地、誘導因子、培養バック 18、ラー ジトレイ 45、培地バック 67、培地カセット 20、誘導因子刺激容器 65、細胞接種カセッ ト 19、細胞回収バック 72、操作者のそれぞれの IDや、恒温槽 11、キヤ-スタ 16の各 アドレスなどのように、例えばバーコードリーダで読み取り可能な識別符号と、恒温槽 11、キヤ-スタ 16及び培養カセット 17の各種センサ（温度センサ 24、ドアセンサ 35、 培地カセットセンサ 75、重量計 43等）が検出し、または各種機器 (第 1ポンプ 48、第 2ポンプ 49、送風ファン 34、作動モータ 81等）の動作状態を示す培養環境データと 、画像処理用コンピュータ 14が取得した細胞の画像データ（CCDカメラ 88による画 像データ、この画像を 2値化等の処理をした後の画像データ、この画像データから算 出した評価パラメータ等）との少なくとも一つである。
[0131] 従って、運転制御盤 13は、上述のプログラムに基づき、恒温槽 11のキヤニスタ 16 及び培養カセット 17毎に、細胞培養関連データを所定時間（例えば 1分毎）に取得し て収集し蓄積する。これにより、恒温槽 11の任意のキヤニスタ 16及び培養カセット 17 で培養された細胞に関する培養履歴が操作者によらず自動で取得される。また、運 転制御盤 13は、同様にして、恒温槽 11のキヤ-スタ 16及び培養カセット 17毎に、培 養関連データに基づき細胞の培養状態を観察して、異常の有無を監視する。更に、 運転制御盤 13は、同様にして、恒温槽 11のキヤ-スタ 16及び培養カセット 17毎に、 培地カセット 20の交換操作 (培地交換操作）、ダミーカセット 70への置換え操作、細 胞回収バック 72への置換え操作などの各種培養操作を管理して、それらの操作を促 す旨を操作者などに告知する。この管理によって、履歴等を自動的に記録'保管し、 人為的な改ざんや記録ミスを防ぐことができる。
[0132] また、監視用コンピュータ 15は、上記運転制御盤 13が有する恒温槽 11のキヤニス タ 16及び培養カセット 17毎の細胞培養関連データ、培養履歴データ、異常の有無 に関するデータ、培養操作に関するデータを運転制御盤 13から受信して保存し、モ ユタ上で表示 (閲覧)可能とする。これにより、操作者は、恒温槽 11が設置された培 養室 94以外の監視室 95にお 、て、当該恒温槽 11にて培養されて 、る細胞の培養 を観察して監視し、管理することが可能となる。この管理によって、履歴等を自動的に 記録'保管し、人為的な改ざんや記録ミスを防ぐことができる。
[0133] 上記細胞培養関連データの取得を、細胞培養前、細胞培養中、細胞培養後につ いて、図 18〜図 20を用いて説明する。
図 18に示すように、細胞培養前にクリーンベンチ等内で、誘導因子刺激容器 65に 誘導因子及び培地を添加し、細胞を接種する際には、バーコードリーダを用いて誘 導因子刺激容器 65の ID、誘導因子及び培地の各収納容器に付された ID、細胞の 試料 、操作者 IDが操作日時共に運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15へ送信される。そして、この誘導因子刺激容器 65を細胞接種カセット 19に装着す る際には、誘導因子刺激容器 65の ID、細胞接種カセット 19の ID、及び操作者 IDが 操作日時と共に、バーコードリーダを用いて運転制御盤 13に取得され、監視用コン ピュータ 15へ送信される。更に、培養バック 18をラージトレイ 45に装着する際には、 培養バック 18の ID、ラージトレイ 45の ID、及び操作者 IDが操作日時と共に、バーコ 一ドリーダを用いて運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15へ送信される 。また、培地バック 67及び使用済み培地バック 68を培地カセット 20に装着する際に は、培地バック 67の ID、培地カセット 20の ID及び操作者 IDが操作日時と共に、ノ 一コードリ一ダを用 、て運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15へ送信さ れる。 [0134] 同様に、細胞培養前に、恒温槽 11のキヤ-スタ 16内にラージトレイ 45を搬入する 際には、恒温槽 11及びキヤ-スタ 16のアドレス、ラージトレイ 45の ID及び操作者 ID が操作日時と共に、バーコードリーダを用いて運転制御盤 13に取得され、監視用コ ンピュータ 15へ送信される。細胞培養前に、上記恒温槽 11のキヤニスタ 16内に収納 されたラージトレイ 45に培地カセット 20を装着する際には、恒温槽 11及びキヤニスタ 16のアドレス、培地カセット 20の ID及び操作者 IDが操作日時と共に、バーコ一ドリ ーダを用いて運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15に送信される。細胞 培養前に、上記恒温槽 11のキヤ-スタ 16内に収納されたラージトレイ 45に細胞接種 カセット 19を装着する際には、恒温槽 11及びキヤニスタ 16のアドレス、細胞接種カセ ット 19の ID及び操作者 IDが操作日時と共に、バーコードリーダを用いて運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15へ送信される。
[0135] 図 19に示すように、細胞培養中には、日時及び恒温槽 11のアドレスと共に、当該 恒温槽 11の運転'停止状態や、当該恒温槽 11の各種センサ（温度センサ 24等）の 計測データが運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15へ送信される。また 、この細胞培養中には、日時及びキヤニスタ 16のアドレスと共に、当該恒温槽 11、当 該キヤ-スタ 16及びこのキヤ-スタ 16内の培養カセット 17の運転 ·停止状態や、当 該キヤ-スタ 16及び培養カセット 16における各種機器 (送風ファン 34、第 1ポンプ 48 等）の運転 ·停止状態、当該キヤニスタ 16及び培養カセット 17の各種センサ (温度セ ンサ 37、重量計 43等)の計測データが運転制御盤 13に取得され、監視用コンビュ ータ 15へ送信される。更に、この細胞培養中には、日時及びキヤ-スタ 16のアドレス と共に、 CCDカメラ 88により撮影された細胞の画像データ、当該画像データを 2値化 処理などした処理データ及び評価パラメータが、画像処理用コンピュータ 14から運 転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15へ送信される。このとき運転制御盤 1 3は、恒温槽 11、キヤ-スタ 16及び培養カセット 17に対して、各種機器などを制御す るための制御信号を前述の如く出力する。
[0136] この細胞培養中に細胞接種カセット 19内に細胞がなくなりダミーカセット 70に置き 換える際には、該当する恒温槽 11及びキヤ-スタ 16のアドレス、ラージトレイ 45の ID 、細胞接種カセット 19の ID及び操作者 ID力 操作日時と共に運転制御盤 13に取得 され、監視用コンピュータ 15へ送信される。また、細胞培養中に培地カセット 20の培 地バック 67内が空になり、培地が満たされた培地バック 67を具備する新たな培地力 セット 20に交換する際 (培地交換の際）には、該当する恒温槽 11及びキヤ-スタ 16 のアドレス、培地カセット 20の ID、培地バック 67の ID及び操作者 ID力 操作日時と 共に運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15へ送信される。
[0137] 更に、細胞を培養バック 18ではなく細胞回収バック 72にて回収する場合には、細 胞培養中に培養バック 18内で細胞が濃縮され、培地カセット 20の使用済み培地バ ック 68を細胞回収バック 72に置き換える際に、該当する恒温槽 11及びキヤ-スタ 16 のアドレス、ラージトレイ 45の ID、培地カセット 20の ID、細胞回収バック 72の ID及び 操作者 IDが、操作日時と共に運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15へ 送信される。尚、これらのダミーカセット 70への置換えや、培地カセット 20の交換 (培 地交換)、細胞回収バック 72への置換えに際して、運転制御盤 13は、該当する恒温 槽 11のキヤ-スタ 16におけるドアロック機構 39を作動してドアロックを解除させ、細 胞接種カセットセンサ 74または培地カセットセンサ 75からの信号によって、上記ダミ 一力セット 70への置換え、培地カセット 20の交換 (培地交換）、細胞回収バック 72へ の置換えを確認する。
[0138] 図 20 (A)に示すように、細胞培養終了後に培養バック 18にて細胞を回収する場合 には、ラージトレイ 45を取り外す際に、該当する恒温槽 11及びキヤ-スタ 16のァドレ ス、ラージトレイ 45の ID及び操作者 ID力 操作日時と共に運転制御盤 13に取得さ れ、監視用コンピュータ 15へ送信される。その後、クリーンベンチ等でラージトレイ 45 力も培養バック 18を取り出す際には、当該ラージトレイ 45の ID、培養バッグ 18の ID 及び操作者 IDが、操作日時と共に運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 1 5へ送信される。尚、このラージトレイ 45及び培養バック 18の取り外しの際に、運転制 御盤 13は、該当する恒温槽 11のキヤ-スタ 16におけるドアロック機構 39を作動して ドアロックを解除させる。
[0139] 図 20 (B)に示すように、細胞培養終了後に細胞回収バック 72にて細胞を回収する 場合には、細胞回収バック 72を備えた培地カセット 20を取り外す際に、該当する恒 温槽 11及びキヤ-スタ 16のアドレス、培地カセット 20の ID、細胞回収バック 72の ID 及び操作者 IDが、操作日時と共に運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 1 5へ送信される。その後、クリーンベンチ等で培地カセット 20から細胞回収バック 72 を取り外す際には、当該培地カセット 20の ID、細胞回収バック 72の ID及び操作者 I Dが、操作日時と共に運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15へ送信され る。
[0140] 次に、運転制御盤 13及び画像処理用コンピュータ 14が上記プログラムを実行して 細胞を培養する工程を、図 8〜図 11の工程図及び図 12〜図 17に示すフローチヤ一 トを用いて説明する。この細胞培養工程で、運転制御盤 13及び画像処理用コンビュ ータ 14は、恒温槽 11のキヤニスタ 16毎に独立して培養環境を設定し制御して、各キ ヤニスタ 16に収納された培養カセット 17における細胞を培養する。
[0141] 図 8乃至図 13は、誘導因子刺激間欠式灌流培養工程を示し、培養バッグ 18に細 胞を回収する場合である。まず、図 8 (A)及び図 12に示すように、操作者は、空の培 養バッグ 18を載置台 46を介して培養バッグトレイ 47に載置し、この培養バッグトレイ 47をラージトレイ 45に装着し、培養バッグ 18を第 1ポンプ 48、第 2ポンプ 49及び第 3 ポンプ 50に接続する。
[0142] 次に、操作者は、このラージトレイ 45を恒温槽 11の、表示灯 44が例えば緑色に点 灯された単一のキヤニスタ 16内に搬入し、そのステージ 42に支持させる。そして、操 作者は、クリーンベンチ等内で誘導因子刺激容器 65に誘導因子を固層化し、培地を 投入し、細胞を接種させた細胞接種カセット 19を、図 8 (B)に示すように、上記キヤ- スタ 16内の上記ラージトレイ 45に装着する。引き続き、操作者は、クリーンベンチ等 内で培地バッグ 67に培地を投入した培地カセット 20を、上記キヤ-スタ 16内の上記 ラージトレイ 45に装着する（図 12の Sl)。
[0143] 次に、操作者は、ラージトレイ 45に培養バッグ 18、細胞接種カセット 19及び培地力 セット 20が装着された培養カセット 17を収納したキヤ-スタ 16における CCDカメラ 8 8の画像出力を確認する（図 12の S2)。この画像出力確認の前または後に、操作者 は当該キヤニスタ 16の傾斜モータ 76を起動させて載置台 46の昇降部を下降させ、 培養バッグ 18に液溜り部 78を形成しておく。更に操作者は、当該キヤ-スタ 16の重 量計 43により、空の培養バッグ 18の重量を計測しておく。 [0144] その後、図 9 (A)に示すように、操作者は、キヤ-スタドア 31を閉めて当該キヤニス タ 16内で細胞の培養を開始させる（図 12の S3)。これにより、細胞接種カセット 19の 誘導因子刺激容器 65において、増殖のために誘導因子により細胞が刺激される（図 12の S4)。当該キヤ-スタ 16の CCDカメラ 88は、細胞接種カセット 19の誘導因子刺 激容器 65内の細胞を所定時間（例えば 6時間）毎に撮影し、画像処理用コンビユー タ 14は、この撮像画像力 細胞培養の評価パラメータを算出する。更に、画像処理 用コンピュータ 14は、この評価パラメータ力もラグタイムを算出して、当該細胞が誘導 因子により刺激を受けて増殖の可能性があるか否力判定し、更に最小倍ィ匕時間を算 出して、当該細胞の増殖能力を判定する（図 12の S5)。
[0145] 運転制御盤 13は、画像処理用コンピュータ 14から、細胞が細胞接種カセット 19の 誘導因子刺激容器 65内で誘導因子により刺激されて力も所定時間（例えば 72時間 )経過しても増殖の可能性が認められないと判断した信号を受けたときには、その旨 を表示する。また、運転制御盤 13は、画像処理用コンピュータ 14から細胞接種カセ ット 19の誘導因子刺激容器 65内の細胞に増殖の可能性があると判断した信号を受 けたときには、当該細胞の増殖能力に基づいて、当該細胞を培養バッグ 18へ移行 するタイミングや、培養バッグ 18内への培地の流加速度などを決定する。運転制御 盤 13は、この決定に基づき第 1ポンプ 48を作動して、図 9 (B)に示すように、培地力 セット 20の培地バッグ 67内の培地を細胞接種カセット 19へ流加させ、この細胞接種 カセット 19の誘導因子刺激容器 65内の細胞を培養バッグ 18へ移行させると共に、 培地バッグ 67内の培地を培養バッグ 18へ流加させる（図 12の S6)。
[0146] この第 1ポンプ 48の作動により、培養バッグ 18の液溜り部 78内での細胞の静置培 養が開始される（図 12の S7)。運転制御盤 13は、プログラムに従い、培地を流加しな 力 流加培養し、重量計 43により計測される培養バッグ 18内の培養液の重量が所 定値 a以上となったか否かを判断する（図 12の S8)。運転制御盤 13は、所定値 a以 上となった時点で傾斜モータ 76を起動させ、カム機構 79を介して載置台 46の昇降 部を上昇させ、図 10 (A)に示すように、培養バッグ 18を水平状態として液溜り部 78 を解消させる（図 12の S9)。
[0147] その後、運転制御盤 13は、重量計 43により計測される培養バッグ 18内の培養液の 重量が所定値 b以上になったか否かを判断し（図 12の S10)、所定値 b以上になった 時点で作動モータ 81を起動させる。これにより、図 10 (B)に示すように振盪装置 80 が作動して、振盪装置 80の振盪機構 91における作動板 85が培養バッグ 18を繰り返 し押圧する振盪培養を開始する（図 12の Sl l)。運転制御盤 13は、引き続き、重量 計 43により計測される培養バッグ 18内の培養液の重量が所定値 c以上となったカゝ否 かを判断し（図 12の S12)、所定値 c以上となった時点で、第 1ポンプ 48を停止して 培地カセット 20の培地バッグ 67から培養バッグ 18への培地の流加を停止し、作動モ ータ 81を停止して、培養バッグ 18内での振盪培養を停止する（図 13の S 13)。
[0148] 運転制御盤 13は、培養バッグ 18内で細胞が沈降した後に、第 2ポンプ 49を作動さ せて、図 11 (A)に示すように、培養バッグ 18内の使用済み培地 (培養バッグ 18内の 上澄み）を培地カセット 20の使用済み培地バッグ 68へ排出する（図 13の S14)。その 後、運転制御盤 13は、第 1ポンプ 48を起動して培地カセット 20の培地バッグ 67から 培養バッグ 18へ培地を流加させ、作動モータ 81を起動して、振盪装置 80により培養 バッグ 18内で振盪培養を実施する（図 13の S15)。所定時間経過後、運転制御盤 1 3は、第 1ポンプ 48を停止して培地カセット 20の培地バッグ 67から培養バッグ 18へ の培地流加を停止し、作動モータ 81を停止して培養バッグ 18内での振盪培養を停 止する（図 13の S16)。
[0149] 運転制御盤 13が、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間に至つ た力否かを判断し、または、画像処理用コンピュータ 14力 培養バッグ 18内での細 胞が所望の細胞数に至った力否かを判断する（図 13の S17)。培養バッグ 18内で細 胞が所望の細胞数に至った力否かの判断に際しては、運転制御盤 13は、第 3ポンプ 50 (図 11 (A) )を起動させ、培養バッグ 18内の細胞の一部を細胞接種カセット 19ま たはダミーカセット 70 (ほとんどの場合にはダミーカセット 70)へ移行させ、この細胞を CCDカメラ 88に撮影させる。この細胞の画像を画像処理用コンピュータ 14が画像処 理し、細胞数が規定値以上である力否かを判断して運転制御盤 13へ送信する。そし て、運転制御盤 13は、これらの培養期間または細胞数に至っていない場合には、ス テツプ S 14〜S 17の処理動作を繰り返す。
[0150] 上記ステップ S13〜S17は、培養バッグ 18内で使用済みの培地の排出と、培養バ ッグ 18内への新 、培地の供給 (流加）とを交互に実施する間欠式灌流培養である
[0151] また、ステップ S9〜S17において、細胞接種カセット 19の誘導因子刺激容器 65内 での細胞の有無は CCDカメラ 88で確認され、運転制御盤 13は、誘導因子刺激容器 65内に細胞が存在しない場合には、この誘導因子刺激容器 65から培養バッグ 18内 へ誘導因子が流入しな 、ように、細胞接種カセット 19をダミーカセット 70に置き換え るよう操作者に促す。このダミーカセット 70への置き換えに際しては、運転制御盤 13 は、培地カセット 20から培養バッグ 18への培地の流加と、振盪装置 80による振盪培 養とを、ダミーカセット 70への置き換えが完了するまで一時中断させる。
[0152] 更に、ステップ S9〜S17において、運転制御盤 13は、重量計 43の計測値から培 地力セット 20の培地バッグ 67に培地が無くなつたと判断した場合には、培地カセット 20を新 、培地カセット 20に交換するように操作者に促す。この新し 、培地カセット 20への交換に際しても、運転制御盤 13は、培地カセット 20から培養バッグ 18への 培地の流加と、振盪装置 80による振盪培養とを、培地カセット 20への交換が完了す るまで一時中断させる。
[0153] 運転制御盤 13は、ステップ S17において所望の培養期間に至り、または所望の細 胞数に至った時点で、振盪を停止し、細胞沈降の後、図 11 (B)に示すように第 2ボン プ 49を起動させ、培養バッグ 18内の使用済み培地を培地カセット 20の使用済み培 地バッグ 68へ排出して、重量計 43の計測値に基づき、培養バッグ 18内の培養液が 約 1Z2〜： LZ3程度になるまで細胞を濃縮させる（図 12の S 18)。
[0154] 運転制御盤 13は、その後第 2ポンプ 49を停止して細胞培養を終了する（図 12の S 19)。この培養終了後に、操作者により培養バッグ 18内の細胞がクリーンベンチ等内 で遠心分離機用の容器に移され、その後、遠心分離によって細胞が回収される（図 1 2の S20)。
[0155] 次に、同様な誘導因子刺激間欠式灌流培養工程において、細胞回収バッグ 72 ( 図 5)により細胞を回収する処理が含まれる場合を図 14及び図 15に示す。従って、こ の図 14及び図 15に示す工程のステップ S21〜S38は、図 12及び図 13のステップ S 1〜S 18と同様であるため説明を省略する。 [0156] 図 15に示すステップ S38において、第 2ポンプ 49の起動により培養バッグ 18内の 細胞が濃縮された後、運転制御盤 13は、第 2ポンプ 49を停止し、培地カセット 20の 使用済み培地バッグ 68を細胞回収バッグ 72 (図 5)に交換するように操作者に促す（ 図 13の S39)。この細胞回収バッグ 72は、遠心分離機に装着されて遠心分離に使 用され得るバッグである。
[0157] 培地カセット 20の使用済み培地バッグ 68が細胞回収バッグ 72に交換された後、運 転制御盤 13は、第 2ポンプ 49及び作動モータ 81を起動させて、振盪装置 80により 培養バッグ 18内を振盪させながら、この培養バッグ 18内の細胞を培地と共に、培地 カセット 20に装着された細胞回収バッグ 72へ移行させる（図 15の S40)。運転制御 盤 13は、その後第 2ポンプ 49及び作動モータ 81を停止して細胞培養を停止する（ 図 15の S41)。この培養終了後に、操作者により細胞回収バッグ 72が遠心分離機に 装着されて、遠心分離により細胞が回収される（図 15の S42)。
[0158] 次に、誘導因子刺激連続式灌流培養工程を、図 16及び図 17に基づいて説明する 。この図 16及び図 17に示す誘導因子刺激連続式灌流培養工程におけるステップ S 51〜S62は、図 12及び図 13の誘導因子刺激間欠式灌流培養工程におけるステツ プ S1〜S12と同様であるため説明を省略する。この誘導因子刺激連続式灌流培養 工程では、培養バッグ 18と第 2ポンプ 49との間にフィルタ 71が配設されている。
[0159] 運転制御盤 13は、培養バッグ 18内へ培地カセット 20の培地バッグ 67から培地が 流加されて（図 16の S56)、培養バッグ 18内での振盪装置 80による振盪培養中に（ 図 16の S61)、培養バッグ 18内の培養液の重量が所定値 c以上となった時点で（図 1 6の S62)第 2ポンプ 49を起動させて、培養バッグ 18内の使用済み培地を培地カセッ ト 20の使用済み培地バッグ 68へ排出させる。これにより、培養バッグ 18への培地の 流加と培養バッグ 18からの使用済み培地の排出とを同時に実施する連続式灌流培 養が培養バッグ 18内で開始される（図 17の S63)。このとき、培養バッグ 18内の細胞 は、フィルタ 71により流動が阻止されて使用済み培地バッグ 68内へ流動することが ない。上記連続式灌流培養中には、振盪装置 80による振盪培養も同時に実施され ている。
[0160] 運転制御盤 13が、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間に至つ た力否かを判断し、または、画像処理用コンピュータ 14力 培養バッグ 18内での細 胞が所望の細胞数に至った力否かを判断する（図 17の S64)。培養バッグ 18内で細 胞が所望の細胞数に至った力否かの判断に際しては、運転制御盤 13は、第 3ポンプ 50を起動させ、培養バッグ 18内の細胞の一部を細胞接種カセット 19またはダミー力 セット 70 (ほとんどの場合にはダミーカセット 70)へ移行させ、この細胞を CCDカメラ 8 8に撮影させる。この細胞の画像を画像処理用コンピュータ 14が画像処理し、細胞 数が規定値以上である力否かを判断して運転制御盤 13へ送信する。そして、運転制 御盤 13は、これらの培養期間または細胞数に至っていない場合には、ステップ S63 の連続式灌流培養を繰り返す。
[0161] ここで、ステップ S59〜S64において、細胞接種カセット 19の誘導因子刺激容器 6 5内での細胞の有無は CCDカメラ 88で確認され、運転制御盤 13は、誘導因子刺激 容器 65内に細胞が存在しない場合には、この誘導因子刺激容器 65から培養バッグ 18内へ誘導因子が流入しないように、細胞接種カセット 19をダミーカセット 70に置き 換えるよう操作者に促す。このダミーカセット 70への置き換えに際しては、運転制御 盤 13は、培地カセット 20から培養バッグ 18への培地の流加と、振盪装置 80による振 盪培養とを、ダミーカセット 70への置き換えが完了するまで一時中断させる。
[0162] また、ステップ S59〜S64において、運転制御盤 13は、重量計 43の計測値から培 地力セット 20の培地バッグ 67に培地が無くなつたと判断した場合には、培地カセット 20を新 、培地カセット 20に交換するように操作者に促す。この新し 、培地カセット 20への交換に際しても、運転制御盤 13は、培地カセット 20から培養バッグ 18への 培地の流加と、振盪装置 80による振盪培養とを、培地カセット 20への交換が完了す るまで一時中断させる。
[0163] 運転制御盤 13は、ステップ S64における所望の培養期間に至り、または所望の細 胞数に至った時点で、第 1ポンプ 48、第 2ポンプ 49及び作動モータ 81を停止させて 、灌流培養及び振盪培養を停止させる（図 17の S65)。
[0164] 運転制御盤 13は、その後第 2ポンプ 49を起動させ、培養バッグ 18内の使用済み 培地を培地カセット 20の使用済み培地バッグ 68へ排出させ、重量計 43の計測値に 基づき、培養バッグ 18内の培養液が約 1Z2〜1Z3程度になるまで細胞を濃縮させ る（図 17の S66)。濃縮過程において振盪装置を停止させるのは多量の細胞がチュ ーブに流入し、フィルタが目詰まりするのを防ぐためである。
[0165] 運転制御盤 13は、その後第 2ポンプ 49を停止して細胞培養を終了する（図 17の S 67)。この培養終了後に、操作者により培養バッグ 18内の細胞がクリーンベンチ等内 で遠心分離機用の容器に移され、その後、遠心分離によって細胞が回収される（図 1 7の S68)。
[0166] 以上のように構成されたことから、上記実施の形態によれば、次の効果（1)〜（8)を 奏する。
(1) CCDカメラ 88が撮像した細胞接種カセット 19内の細胞の画像を、画像処理用 コンピュータ 14が画像処理して細胞培養の評価パラメータ（単一細胞の平均投影面 積、非単一細胞の増加速度)を取得し、当該細胞の培養状況 (細胞の増殖可能性及 び増殖能力）を判定評価する。運転制御盤 13はこの培養状況に応じた培養操作 (細 胞接種カセット 19から培養バッグ 18への細胞移行のタイミングや、培地カセット 20か ら培養バッグ 18への所定流加速度での培地流加等）を実施する。この結果、細胞の 培養状況を非接触 *非侵襲状態で判定できるので当該細胞にダメージを与えること がなぐサンプリングによるコンタミネーシヨンの危険性及び細胞の損失を回避できる
[0167] また、培養操作を操作者が逐次実施する必要がな!ヽので操作者の労力を軽減でき ると共に、培養状況観察のために恒温槽 11の本体ドア 21及びキヤ-スタ 16のキヤ- スタドア 31を開閉する必要がないので、恒温槽 11及びキヤ-スタ 16内の培養環境を 良好に維持できる。
[0168] 更に、一患者の細胞を単一のキヤ-スタ 16内に収納される培養カセット 17の細胞 接種カセット 19に接種させ、この細胞ごとに、細胞の培養状況に応じた培養操作を 実施できるので患者ごとに適切な培養操作を実現でき、クロスコンタミネーシヨンを回 避できる。この細胞の培養状況に応じた適切な培養操作を実現できることで、時間単 位での培養操作が可能となり、培養が促進されて培養期間を短縮できる。
[0169] (2)培地カセット 20がカセット構造に構成されて、培養バッグ 18、及び同じくカセッ ト構造に構成された細胞接種カセット 19に接続されることから、特に培養バッグ 18を 培養に最適な環境のキヤ-スタ 16内に常に保持できる。また、恒温槽 11の本体ドア 21及びキヤ-スタ 16のキヤ-スタドア 31を、一度開閉するだけで培地の交換が可能 となるので、上記両ドア 21及び 31の開閉回数を低減でき、恒温槽 11及びキヤ-スタ 16内の培養環境の変動を抑制できる。これらの結果、環境変化に伴う培養バッグ 18 内の細胞へのダメージを低減できると共に、クリーンベンチ等内で培養バッグ 18に培 地を供給する無菌操作を省略できる。
[0170] (3)培地カセット 20、細胞接種カセット 19及び培養バッグ 18が接続されて閉鎖系 が構成されたことから、これらの培地カセット 20、細胞接種カセット 19及び培地カセッ ト 20を無菌状態に保持することができる。
[0171] (4)培養バッグ 18内での培養初期段階に、この培養バッグ 18の液溜り部 78内に培 養液が貯溜されることから、面積当たりの細胞密度を増殖に好適な密度に維持する ことで、培養初期段階に細胞を効率よく増殖させることができる。
[0172] (5)培養バッグ 18内で増殖された細胞を細胞接種カセット 19またはダミーカセット 7 0内へ導き、この細胞の画像力 SCCDカメラ 88により取得される場合には、培養バッグ 18内で増殖された細胞を画像として取得することでサンプリングすることなぐその細 胞数ゃ細胞の形態を観察することができる。
[0173] (6)培養バッグ 18内の使用済み培地が培地カセット 20の使用済み培地バッグ 68 に排出されて貯溜されることから、培養バッグ 18内の細胞密度を高めて濃縮すること ができるので、細胞回収のための遠心分離操作回数を低減できる。この結果、細胞 回収作業の省力化を実現できると共に、遠心分離に伴う細胞のダメージも低減できる
[0174] (7)培養バッグ 18内で濃縮された細胞を、培地カセット 20に装着された細胞回収 ノ ッグ 72に全量回収させる場合には、この細胞回収バッグ 72を遠心分離機に直接 装着して細胞を回収することができるので、細胞回収作業の省力化を実現できる。
[0175] (8)細胞が接種された培地を収容する可撓性の培養バッグ 18を、振盪装置 80の 振盪機構 91における作動板 85の突出部 86が繰り返し押圧して、当該培養バッグ 18 内の培養液を撹拌することから、この培養バッグ 18内の細胞の分布及び培地の成分 濃度が均一化され、また酸素供給能も高くなることにより細胞の増殖が促進されて、 細胞の培養効率を向上させることができる。
また、細胞は、振盪装置 80の作動板 85により繰り返し押圧されて撹拌された培養 液内を浮遊するだけなので、ダメージを蒙ることが防止される。
[0176] (9)運転制御盤 13及び監視用コンピュータ 15が、恒温槽 11の培養ユニット 12 (キ ヤニスタ 16及び培養カセット 17)毎に、細胞の培養に関する細胞培養関連データを 収集して蓄積することから、任意の培養ユニット 12で培養された細胞に関する培養 履歴を的確に把握することができる。
また、運転制御盤 13及び監視用コンピュータ 15が、恒温槽 11の培養ユニット 12 ( キヤ-スタ 16及び培養カセット 17)毎に、細胞培養関連データに基づいて細胞の培 養状態を監視することから、培養ユニット 12毎に培養状態の異常を監視することがで きる。
更に、運転制御盤 13及び監視用コンピュータ 15が、恒温槽 11の培養ユニット 12 ( キヤ-スタ 16及び培養カセット 17)毎に、細胞培養関連データに基づいて、培地の 交換 (培地カセット 20の交換)や培養終了後の細胞回収 (培養バック 18または細胞 回収バック 72による細胞回収)などの細胞培養操作を管理することから、恒温槽 11 の培養ユニット 12毎に操作者が実施する操作 (作業)のための作業スケジュールを 容易に作成することができる。
[0177] (10)管理手段は、恒温槽 11と共に培養室 94内に設置され、恒温槽 11の各培養 ユニット 12 (キヤ-スタ 16及び培養カセット 17)における培養を制御する機能を兼ね 備えた運転制御盤 13と、上記培養室 94以外の監視室 95に設置され、上記運転制 御盤 13が有するデータを受信して保存し表示 (閲覧)可能とする監視用コンピュータ 15とを有して構成されたことから、培養室 94内の恒温槽 11における培養ユニット 12 内での細胞の培養状態を、監視用コンピュータ 15を用いて培養室 94以外の監視室 95において観察して監視し、管理することができる。この管理によって、履歴等を自 動的に記録'保管し、人為的な改ざんや記録ミスを防ぐことができる。
[0178] (11)培養ユニット 12を構成する恒温槽 11のキヤ-スタ 16は、それぞれが吸気フィ ルタ 32及び排気フィルタ 33によって細胞又は Z及び細菌の出入りのない状態に隔 離されて構成されたことから、各キヤ-スタ 16内に収納される培養バック 18及び細胞 接種カセット 19内の細胞が細菌に汚染されるコンタミネーシヨンを防止することができ る。
[0179] (12) 1つの恒温槽 11における全てのキヤ-スタ 16の送風ファン 34力 当該恒温槽 11の本体ドア 21が開放されたときに停止するよう構成されたことから、恒温槽 11の本 体ドア 21の開放時に、当該恒温槽 11における各キヤ-スタ 16の密閉状態を保持で きるので、各キヤ-スタ 16について独立した培養環境を良好に確保でき、キヤ-スタ 16内の培養環境の変動を抑制できる。
[0180] (13) 1つの恒温槽 11における各キヤ-スタ 16のキヤ-スタドア 31が、いずれか 1枚 のみ開放されるよう構成されたことから、 1つの恒温槽 11において各キヤ-スタ 16の キヤ-スタドア 31が同時に 2以上開放されることがないので、キヤ-スタ 16内での培 養バック 18及び細胞接種カセット 19の搬入出の取り違いを防止できると共に、細胞 同士が互いに汚染されるクロスコンタミネーシヨンを防止することができる。
[0181] [B]第 2の実施の形態（図 21〜図 24)
図 21は、本発明に係る細胞培養装置の第 2の実施の形態における培養ユニットの構 成 (分化誘導状態)を示すレイアウト図である。図 22は、図 21の培養ユニットの分ィ匕 誘導前状態の構成を示すレイアウト図である。この第 2の実施の形態において、前記 第 1の実施の形態と同様な部分は、同一の符号を付すことにより説明を省略する。
[0182] この第 2の実施の形態の細胞培養装置 100は、第 1の実施の形態の細胞培養装置 10における細胞接種カセット 19 (図 5)を、分化誘導因子が予め添加された分化誘導 培養容器としての分ィ匕誘導カセット 101に置き換えたものである。そして、この細胞培 養装置 100では、培地カセット 20の培地バッグ 67から培養バッグ 18へ第 2ポンプ 49 の起動により培地を導いて細胞を増殖させた後に、この増殖した細胞を第 1ポンプ 4 8の起動により分ィ匕誘導カセット 101へ導いて当該細胞に役割を与える、つまり当該 細胞を分化させる。ここで、分化とは、細胞に心臓の細胞としての役割を持たせたり、 肝臓の細胞としての役割を持たせたりすること等である。培養バッグ 18にて増殖され た細胞を分ィ匕誘導カセット 101にて分ィ匕させる前までは、図 22に示すように、この分 化誘導カセット 101の代わりにダミーカセット 102が配置されて、培養バッグ 18内の 使用済み培地力 第 1ポンプ 48の起動によりダミーカセット 102を経て培地カセット 2 0の使用済み培地バッグ 68へ排出される。上記ダミーカセット 102は、ダミーカセット 70 (図 5)と同様に、単に培地を流動させるための流路として機能する。
[0183] この第 2の実施の形態では、図 21に示すように、分化誘導カセット 101内で分化さ れて ヽる細胞の画像を CCDカメラ 88が所定時間ごとに撮影する。この撮影を実行す るためのプログラム力 運転制御盤 13の記録装置に記憶されている。画像処理用コ ンピュータ 14は、この細胞の画像を例えば 2値化処理や多値化処理して、細胞の形 態を評価パラメータとして取得する。この評価パラメータの取得を実行するためのプロ グラムが画像処理用コンピュータ 14の記録装置に記憶されている。画像処理用コン ピュータ 14は、細胞の形態の経時的変化力も当該細胞が分化されたか否かを判定 する。画像処理用コンピュータ 14からの信号を受けた運転制御盤 13は、この分化誘 導カセット 101による分化誘導操作を制御する。例えば運転制御盤 13は、画像処理 用コンピュータ 14が、当該細胞に分ィ匕の可能性があると判断した場合には分ィ匕誘導 操作を継続し、そうでない場合には、その旨を表示する。上述の分化の判定を実行 するためのプログラムが画像処理用コンピュータ 14の記録装置に記録され、分ィ匕誘 導操作を実行するためのプログラム力 運転制御盤 13の記録装置に記憶されて 、る
[0184] 更に、運転制御盤 13の記録装置には、前記第 1の実施形態の場合とほぼ同様に、 恒温槽 11のキヤニスタ 16及び培養カセット 17毎に、細胞培養関連データを取得す るプログラム、細胞の培養状態を監視するプログラム、細胞の培養操作を管理するプ ログラムが記憶されている。運転制御盤 13は、上述のプログラムに基づき、第 1の実 施の形態の場合とほぼ同様に、恒温槽 11のキヤニスタ 16及び培養カセット 17毎に、 細胞培養関連データを収集して蓄積し、異常の有無を監視し、培地カセット 20の交 換操作 (培地の交換操作）、ダミーカセット 102から分ィ匕誘導カセット 101への置換え 操作などの培養操作を管理する。また、監視用コンピュータ 15は、前記第 1の実施の 形態の場合と同様に、恒温槽 11のキヤ-スタ 16及び培養カセット 17毎の細胞培養 関連データ、培養履歴データ、異常の有無に関するデータ、培養操作に関するデー タを運転制御盤 13から受信して保存し、モニタ上に表示 (閲覧)可能とする。
[0185] 上記細胞培養関連データの取得も、第 1の実施の形態と同様になされるが、分ィ匕 誘導カセット 101に関する場合が異なる。つまり、細胞培養前には（図 18参照）、タリ ーンベンチ等内で分化誘導カセット 101の分化誘導容器 103 (図 21)に分化誘導因 子を添加する際に、この分化誘導容器 103の ID、分化誘導因子の ID及び操作者 ID 力 操作日時と共に運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15へ送信される 。そして、この分化誘導容器 103を分化誘導カセット 101に装着する際に、分化誘導 容器 103の ID、分ィ匕誘導カセット 101の ID及び操作者 ID力 操作日時と共に運転 制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 15へ送信される。細胞培養中には（図 19 参照）、ダミーカセット 102を取り外して分ィ匕誘導カセット 101に置き換える際に、恒温 槽 11及びキヤ-スタ 16のアドレス、分化誘導カセット 101の ID、ラージトレイ 45の ID 及び操作者 IDが、操作日時と共に運転制御盤 13に取得され、監視用コンピュータ 1 5へ送信される。
[0186] 次に、上記細胞培養装置 100による分化誘導間欠式灌流培養工程を、図 23及び 図 24を用いて説明する。
[0187] まず、操作者は、クリーンベンチ等内で培養バッグ 18に培地及び細胞を添加し（図 23の S71)、この培養バッグ 18を載置台 46を介して培養バッグトレイ 47に載置し、こ の培養バッグトレイ 47をラージトレイ 45に取り付ける（図 23の S72)。そして、操作者 は、このラージトレイ 45を恒温槽 11の、表示灯 44が例えば緑色に点灯された単一の キヤニスタ 16内に搬入する。
[0188] 次に、操作者は、上記キヤニスタ 16内のラージトレイ 45に培地カセット 20を装着し 、ダミーカセット 102 (図 22)を装着する（図 23の S73)。そして、操作者により上記キ ヤニスタ 16のキヤ-スタドア 31が閉じられて、培養バッグ 18内での細胞の静置培養 が開始される（図 23の S74)。この静置培養に際し、当初培養バッグ 18内に培養液 が少ない場合には、操作者は、傾斜モータ 76を起動させて載置台 46の昇降部を下 降させ、培養バッグ 18に液溜り部 78 (図 8)を形成しておく。
[0189] 静置培養開始後、運転制御盤 13は、第 2ポンプ 49を起動させて、培地カセット 20 の培地バッグ 67からの培地を培養バッグ 18へ流加させる（図 23の S75)。運転制御 盤 13は、培養バッグ 18内の培養液が所定値 a以上となったカゝ否かを、重量計 43の 計測値力も確認し（図 23の S76)、重量計の計測値が上記所定値 a以上となった場 合に、傾斜モータ 76を起動させて載置台 46の昇降部を上昇させ、培養バッグ 18を 水平状態として液溜り部 78を解消する（図 23の S77)。
[0190] その後、運転制御盤 13は、重量計 43により計測される培養バッグ 18内の培養液の 重量が所定値 b以上になったか否かを判断し（図 23の S78)、所定値 b以上になった 時点で作動モータ 81を起動させ、振盪装置 80を作動させて振盪培養を開始する（ 図 23の S79)。運転制御盤 13は、引き続き、重量計 43により計測される培養バッグ 1 8内の培養液の重量が所定値 c以上となった力否かを判断し（図 23の S80)、所定値 c以上となった時点で、第 2ポンプ 49を停止して、培地カセット 20の培地バッグ 67か ら培養バッグ 18への培地の流加を停止し、作動モータ 81を停止して、培養バッグ 18 内での振盪培養を停止する（図 23の S81)。
[0191] 運転制御盤 13は、培養バッグ 18内で細胞が沈降した後に、第 1ポンプ 48を作動さ せて、培養バッグ 18内の使用済み培地（培養バッグ 18内の上澄み）を培地カセット 2 0の使用済み培地バッグ 68へ排出する（図 24の S82)。その後、運転制御盤 13は第 2ポンプ 49を起動して、培地カセット 20の培地バッグ 67から培養バッグ 18へ培地を 流加させ、作動モータ 81を起動して、振盪装置 80により培養バッグ 18内で振盪培 養を実施する（図 24の S83)。所定時間経過後、運転制御盤 13は、第 2ポンプ 49を 停止して、培地カセット 20の培地バッグ 67から培養バッグ 18への培地の流加を停止 し、作動モータ 81を停止して培養バッグ 18内での振盪培養を停止する（図 24の S84
) o
[0192] 運転制御盤 13が、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間に至つ た力否かを判断し、または、画像処理用コンピュータ 14力 培養バッグ 18内での細 胞が所望の細胞数に至った力否かを判断する（図 24の S85)。培養バッグ 18内で細 胞が所望の細胞数に至った力否かの判断に際しては、運転制御盤 13は、第 3ポンプ 50を起動させ、培養バッグ 18内の細胞の一部をダミーカセット 102へ移行させ、この 細胞を CCDカメラ 88に撮影させる。この細胞の画像を画像処理用コンピュータ 14が 画像処理し、細胞数が規定値以上であるか否かを判断して運転制御盤 13へ送信す る。運転制御盤 13は、これらの培養期間または細胞数に至っていない場合には、ス テツプ S82〜S85の操作を繰り返す。 [0193] 上記ステップ S81〜S85は、培養バッグ 18内で使用済みの培地の排出と、培養バ ッグ 18内への新 、培地の供給 (流加）とを交互に実施する間欠式灌流培養である
[0194] ここで、ステップ S77〜S85において、運転制御盤 13は、重量計 43の計測値から 培地カセット 20の培地バッグ 67に培地が無くなつたと判断した場合には、培地カセッ ト 20を新 ヽ培地力セットに交換するように操作者に促す。この新し 、培地カセット 2 0への交換に際しても、運転制御盤 13は、培地カセット 20から培養バッグ 18への培 地の流加と、振盪装置 80による振盪培養とを、培地カセット 20の交換が完了するま で一時中断させる。
運転制御盤 13は、ステップ S85において所望の培養期間に至り、または所望の細 胞数に至った時点で、第 1ポンプ 48を起動させ、培養バッグ 18内の使用済み培地を 培地カセット 20の使用済み培地バッグ 68へ排出して、重量計 43の計測値に基づき 、培養バッグ 18内の培養液が約 1Z2〜1Z3程度になるまで細胞を濃縮させる（図 2 4の S86)。
[0195] その後、運転制御盤 13により第 1ポンプ 48が停止された後に、操作者は、図 21に 示すように、ダミーカセット 102を分化誘導カセット 101に交換する（図 24の S87)。
[0196] 分ィ匕誘導カセット 101への交換完了後に、運転制御盤 13は、第 2ポンプ 49を起動 して、培地カセット 20の培地バッグ 67内の培地を培養バッグ 18へ流加させ、作動モ ータ 81を起動して培養バッグ 18内を振盪装置 80により振盪培養させる（図 24の S8 8)。次に、運転制御盤 13は、第 1ポンプ 48を起動して、培養バッグ 18内での振盪培 養及び培地カセット 20からの培地の流カ卩を継続しながら、培養バッグ 18内の培養液 を分ィ匕誘導カセット 101へ移動させる（図 24の S89)。これにより、この分化誘導カセ ット 101内で分ィ匕誘導培養が開始される（図 24の S90)。
[0197] 運転制御盤 13は、上記分化誘導培養中に、分ィ匕誘導カセット 101内の細胞を CC Dカメラ 88により所定時間（例えば 6時間）毎に撮影する。画像処理用コンピュータ 1 4は、この撮像画像を画像処理し、細胞の形態を評価パラメータとして取得し、この細 胞の形態の経時的変化から、当該細胞が分化誘導カセット 101内で分化されたか否 かを判断する（図 24の S91)。 [0198] 運転制御盤 13は、ステップ S91で画像処理用コンピュータ 14力も細胞が分ィ匕され たと判断した信号を受けたときに、第 2ポンプ 49、第 1ポンプ 48及び作動モータ 81を 停止して、分化誘導培養を停止し、細胞培養を終了する（図 24の S92)。この培養終 了後に、操作者は、クリーンベンチ等内での細胞回収操作により、分化誘導カセット 101内の細胞を回収する。 （図 24の S93)。
[0199] 以上のように構成されたことから、上記第 2の実施の形態によれば、前記第 1の実施 の形態の効果（2)〜（6)及び (8)と同様な効果 (但し、細胞接種カセット 19を分ィ匕誘 導カセット 101に置き換える）を奏する他、次の効果（9)を奏する。
[0200] (9)分化誘導カセット 101内の細胞の画像を画像処理して細胞培養の評価パラメ ータ (細胞の形態)を取得し、当該細胞の培養状況 (細胞が分化されたか否か)を判 定し、この培養状況に応じた培養操作 (培地カセット 20から培養バッグ 18への所定 流加速度での培地流加や培養バッグ 18から分化誘導カセット 101への細胞移行の タイミング等)を実施することから、細胞の培養状況を非接触'非侵襲状態で判定でき るので、当該細胞にダメージを与えることがなぐサンプリングによるコンタミネーシヨン の危険性及び細胞の損失を回避でき、また、操作者の労力を軽減できる。更に、一 患者の細胞を単一のキヤニスタ 16内に収納される培養カセット 17の培養バッグ 18に て増殖させ、分ィ匕誘導カセット 101において分ィ匕させるので、患者ごとに細胞の培養 を適切に実施でき、クロスコンタミネーシヨンを回避できる。
[0201] また、上記第 1及び第 2の実施の形態における細胞培養装置 10及び 102によれば 、次の効果（10)を奏する。
(10)細胞培養装置 10及び 100は、共に、異なる培養環境で細胞を培養する複数 の培養容器のうち、一の培養容器で培養された細胞が、下流側の他の培養容器へ 移行されている。つまり、細胞培養装置 10では、一の培養容器である細胞接種カセ ット 19にて増殖のために誘導因子により細胞を刺激し、その後、この細胞接種カセッ ト 19から他の培養容器である培養バッグ 18へ上記細胞を移行して、当該細胞を増 殖させている。また、細胞培養装置 100では、一の培養容器である培養バッグ 18に て細胞を増殖した後に、この培養バッグ 18から他の培養容器である分ィ匕誘導カセッ ト 101へ上記細胞を移行して、当該細胞を分ィ匕させている。このように、細胞培養装 置 10及び 100によれば、細胞の培養形態のバリエーションを拡大することができる。
[0202] 以上、本発明を上記実施の形態に基づいて説明した力 本発明はこれに限定され るものではない。
例えば、上記両実施の形態では、画像処理用コンピュータ 14が CCDカメラ 88の画 像を画像処理して評価パラメータを算出し、当該評価パラメータから細胞の培養状況 (細胞の増殖可能性、細胞の増殖能力）を判定するものを述べた力 この画像処理 用コンピュータ 14の機能を運転制御盤 13が実施してもよい。
[0203] また、 CCDカメラ 88による細胞画像の撮影は、培養バッグ 18において実施してもよ い。更に、誘導因子刺激連続式灌流培養工程 (図 16及び図 17)において、振盪装 置 80による振盪培養を実施しない場合には、第 2ポンプ 49と培養バッグ 18との間に フィルタ 71を配設しなくてもよい。
[0204] 上記、両実施の形態では、細胞を増殖させるために、振盪装置 80を用いて、培養 液を攪拌するものを述べたが、培養バッグ 18を上下方向に振動させ、または左右方 向に揺動させて培養液を流動し、細胞の分布及び培地の成分濃度を均一化し、また 酸素供給能を高くしても良い。
[0205] また、両実施の形態では、運転制御盤 13及び画像処理用コンピュータ 14が 1つの 恒温槽内の各キヤニスタにつ 、て制御するものを述べたが、同様な恒温槽が複数個 あり、これらの恒温槽の各キヤニスタについて、運転制御盤 13及び画像処理用コン ピュータ 14が制御を実行しても良 、。
[0206] [C]第 3の実施の形態（図 25)
また、第 1及び第 2の実施の形態では、 1台の恒温槽 11の各キヤニスタ 16について 、それぞれ 1台の運転制御盤 13及び画像処理用コンピュータ 14が運転を制御し、そ れぞれ 1台の運転制御盤 13及び監視用コンピュータ 15が細胞培養を監視し管理す るものを述べたが、図 25に示す第 3の実施の形態の如ぐ恒温槽 11が複数台設置さ れ、各恒温槽 11に運転制御盤 13が 1台ずつ配置され、各運転制御盤 13に 1台の画 像処理用コンピュータ 14、及び 1台の監視用コンピュータ 15がそれぞれ接続されて 、監視用コンピュータ 15により複数台の恒温槽 11の各キヤ-スタ 16内で実施されて いる細胞の培養を観察して監視し、管理できるようにしてもよい。この管理によって、 履歴等を自動的に記録'保管し、人為的な改ざんや記録ミスを防ぐことができる。
[0207] また、第 1、第 2の実施の形態（図 1)または第 3の実施の形態（図 25)において、 1 台の監視用コンピュータ 15に公衆通信回線 104を用いて遠隔監視用コンピュータ 1 05が接続されてもよい。この場合には、例えば特定の恒温槽 11の特定のキヤニスタ 16内における培養異常等を、遠隔監視用コンピュータ 105を用い遠隔地において 迅速に把握することが可能となる利点がある。
[0208] [D]第 4の実施の形態（図 26〜図 38)
図 26は、本発明に係る細胞培養装置の第 4の実施の形態を示す構成図である。図 27は、第 4の実施の形態に係る細胞培養装置 200における一つの空間的に独立し た培養室 240と低温室 230、この培養室 240内に収納される培養バッグトレイ 241と 低温室 230に収納される培地バッグトレイ 231、廃液バッグトレイ 232からなる培養ュ ニット 212の構成を示すレイアウト図である。
[0209] 図 26に示す細胞培養装置 200は、特に、免疫細胞療法に用いられる浮遊系細胞 を培養するものであり、複数個（例えば 3個）の培養ユニット 212を備えた培養装置 21 0と、この複数個の培養ユニット 212の運転を制御する運転制御用 PLC (プログラマ ブル 'ロジック'コントローラ） 223と、細胞の画像を処理するための画像処理用ュ-ッ ト 221と、全てのデータを収集するデータ収集装置 224と、運転制御用 PLC223と画 像処理用ユニット 221の情報表示および制御入力するタツチパネル 222と、ハブ 225 を介して運転制御用 PLC223、画像処理用ユニット 221、データ収集装置 224に接 続されて、細胞培養装置 200及び培養ユニット 212を監視するための監視用コンビュ ータ 226と、を有して構成される。上記運転制御用 PLC223及び画像処理用ユニット 221が制御手段として機能する。複数個の培養ユニット 212はそれぞ;^察用カメラ (CCDカメラ） 302を備えて 、る。
[0210] ここで、上記浮遊系細胞としては、末梢血単核球、 LAK細胞（Lymphokine Acti vated Killer細胞）、神経幹細胞、 ES細胞などが知られている。これらの浮遊系細 胞を以下単に細胞と称する。本細胞培養装置 200は、上記浮遊系細胞以外の接着 依存性細胞 (例えば、間葉系幹細胞)を培養する場合にも適用可能である。
[0211] 上記細胞培養装置 200は、空間的 ·構造的に独立した複数個（例えば 3個）の培養 ユニット 212が積み重ねられた構造で、各培養ユニット 212は図 27に示すように低温 室 230と培養室 240〖こ分離される。この細胞培養装置 200内には、培養バッグトレイ 241、培地バッグトレイ 231及び、廃液バッグトレイ 232が収納されている。培養バッ グトレイ 241には、後に詳説するように、抗体刺激及び増殖用培養容器としての培養 バッグ 242が載置され、培地バッグトレイ 231、及び廃液バッグトレイ 232には、培地 貯溜手段としての培地バッグ (新培地バッグ） 233および廃液貯溜手段としての廃液 ノッグ (廃培地バッグ） 234がそれぞれ載置される。
[0212] 上記培養ユニット 212は、培養室 240および低温室 230に開閉可能なドア（不図示 )を備えている。この培養ユニット 212は、ドアを閉じた状態で、培養室 240内の環境 (温度及び C02濃度）を、細胞を培養するために必要な環境に維持し、低温室 230 内の環境 (温度）を、培地保存に最適な環境に維持する。
[0213] このため、培養ユニット 212には、温度センサ 236、 243、 C02センサ 244、ドアセ ンサ (不図示)及びヒータ (不図示）が配設されて 、る。更に細胞培養装置 200 (培養 ユニット 212)には、 C02供給系 245を経由して、外部に設置されたガスボンベ（不 図示）が連結される。温度センサ 236、 243、 C02センサ 244及びドアセンサからの 信号は、運転制御用 PLC223へ送信される。この運転制御 PLC223は、温度センサ 236、 243からの温度信号に基づいてヒータを制御し、 C02センサ 244からの C02 濃度信号に基づいて、ガスボンベ力 各培養ユニット 212内へ供給される C02ガス 量を制御する。室内の C02は循環ポンプ 246により、あらかじめ定めた一定量ずつ 排出される。
[0214] 攪拌ファン 247の運転は運転制御用 PLC223により制御され、培養ユニット 212の ドアが開いた旨の信号がドアセンサ力も運転制御用 PLC223へ送信された際に、攪 拌ファン 247の運転が停止されて、培養ユニット 212内の環境変化が緩和される。
[0215] この細胞培養装置 200は乾熱滅菌機能を有しており、培養バッグトレイ、培地バッ グトレイ、廃液バッグトレィをそれぞれセットした状態で、装置内の滅菌及び各トレイを 滅菌することが可能であり、培養ユニット 212内での細菌増殖を防止することができる 。また、各培養ユニット 212がそれぞれ独立した空間構造でできているため、他の培 養ユニット 212内の細胞に対して隔離されると共に、培養ユニット 212に収納される 培養バッグ 242、培地バッグ 233、廃液バッグ 234は、クリーンベンチ等内で接続さ れた後、培養ユニット 212に設置されるため、この培養ユニット 212に収納される培養 バッグ 242は閉鎖系（非開放系）に確保され、培養バッグ 242内の細胞が雑菌によつ て汚染されるコンタミネーシヨンが防止される。
[0216] 培養ユニット 212には、更にドアセンサ (不図示）、ドアロックセンサ（不図示）、温度 センサ 236、 243、ドアロック機構 (不図示）、ヒータ（不図示)及び攪拌ファン 247が 配設されている。運転制御用 PLC223は、温度センサ 236、 243からの温度信号に 基づいてヒータを制御する。また、運転制御用 PLC223は、攪拌ファン 247の運転を 制御して、培養室 240内で空気及び C02ガスを循環させる。このようにして、培養室 240内は細胞を培養するための最適な環境に保持される。
[0217] また、運転制御用 PLC223は、一つの細胞培養装置 200において 2以上の培養ュ ニット 212のドアが同時に開動作を行うことがないようにドアロック機構の動作を制御 する。これにより、異なる培養ユニット 212間で細胞や培地などが取り違えて搬入され ることが防止される。このドアロック機構のロック動作はドアロックセンサ〖こより検出され て、運転制御用 PLC223へ送信される。また、培養ユニット 212のドアの開閉状態は ドアセンサによって検出されて、運転制御用 PLC223へ送信される。
[0218] 図 27に示す培養ユニット 212内の下部には、培養室 240内に収納される培養バッ グトレイ 241を支持するフレーム 250が設けられ、このフレーム 250を培養ユニット 21 2上部に設置した重量計 251が支持して設置される。この重量計 251は、培養室 24 0内に収納された培養バッグトレイ 241の培養バッグ 242の重量を計測するものであ り、実際には、培地バッグ 233から培養バッグ 242へ供給される培地量を計測するの と、培養バッグ 242から廃液バッグ 234に排出される廃液量を計測する。この重量計 251の計測値も運転制御用 PLC223へ送信される。また、培養ユニット 212本体に は、培養ユニット 212内の培養バッグ 242の有無を表示する表示灯 (不図示）が設け られる。運転制御用 PLC223は、培養室 240内に培養バッグ 242が収納されている ときに、表示灯を、例えば赤色点灯させ、培養室 240内に培養バッグ 242が収納され て！、な 、ときに、表示灯を例えば緑色点灯させる。
[0219] ここで、上記培養バッグトレイ 241について説明する。 この培養バッグトレイ 241は、図 27に示すように培養バッグ 242が装着されたもので あり、培養バッグ 242が細胞を培養する培養容器である。この培養バッグ 242は、細 胞に機能を発現させる（例えば細胞を増殖させる、細胞を分化させる等)ための機能 発現用培養容器であり、本実施形態では、増殖のために抗体により細胞を刺激する 抗体刺激用培養容器である。また、同一の培養バッグ 242において抗体により刺激 された細胞を増殖するための増殖用培養容器でもある。
[0220] 培養バッグ 242は、細胞が接種された培地を収容する可撓性の容器であり、載置 台 252を介して、培養バッグトレイ 241に載置される。上記培養バッグ 242は、例えば 酸素透過性材質力もなるバッグである。
[0221] ここで、培養ユニット 212について説明する。
培養室 240には、図 27に示すように、供給ポンプ 261、排出ポンプ 271が配置され る。培養バッグ 242は、一端側がチューブ 262を用いて供給ポンプ 261を経て供給 系継ぎ手 264に接続される。また、培養バッグ 242の他端側は、チューブ 272を用い て排出ポンプ 271を経て排出系継ぎ手 274に接続される。
[0222] この培養ユニット 212では、培養バッグ 242は、チューブ 262により供給系継ぎ手 2 64に接続されると共に、チューブ 265により培地バッグ 233に接続される。また、培 養バッグ 242は、チューブ 272を介して排出系継ぎ手 274に接続されると共に、チュ ーブ 275により廃液バッグ 234に接続される。
[0223] 上記培養バッグ 242は、図 27に示すように、培養バッグ 242の供給ポンプ 261に接 続される一部底面内側に抗体を固層化し、この培養バッグ 242に培地を投入し、この 培地に細胞を接種し、この培養バッグ 242を培養バッグトレイ 241に設置して、カセッ ト構造に構成したものである。上記培養バッグ 242に抗体を固層化し、培地及び細胞 を入れる作業は、クリーンベンチ等内で無菌状態で実施される。
[0224] 上記培養バッグ 242において一部抗体を固層化したことにより、つまり細胞を抗体 により刺激して当該細胞に増殖機能を発現させるための培養環境と、細胞を増殖す るための培養環境を同一培養バッグ 242で作り出すことができる。従って、培養バッ グ 242の一部で抗体により刺激され、増殖を開始し始めた細胞に、培地を供給するこ とで効率よく同一の培養バッグ 242で増殖を実施させることが可能となる。 [0225] 前記培地バッグトレイ 231、及び廃液バッグトレイ 232には、培地貯溜容器としての 培地バッグ 233、及び使用済み培地貯溜容器としての廃液バッグ 234がそれぞれ載 置されて、カセット構造に構成される。上記培地バッグ 233は、培養バッグ 242へ供 給される培地を貯溜するものである。また、上記廃液バッグ 234は、培養バッグ 242 力も排出される使用済み培地 (上澄み)を貯溜するものである。培地バッグトレイ 231 力 Sカセット構造に構成されたことにより、培養バッグ 242を培養室 240内に維持した 状態で、当該培養ユニット 212内の低温室 230に培地バッグトレイ 231を装着するだ けで培地の交換、供給が可能となる。
[0226] 上記培養バッグトレイ 241は、培養ユニット 212に着脱可能に装着される。このとき には、培養バッグ 242の供給系継ぎ手 264は、培地バッグ 233の継ぎ手に、排出系 継ぎ手 274は廃液バッグ 234の継ぎ手にそれぞれに無菌的に結合される。つまり、 供給系継ぎ手 264と培地バッグ 233の継ぎ手は、例えば一方のゴム状結合部に他方 の針状結合部が差し込まれることで無菌的に結合される。排出系継ぎ手 274と廃液 ノ ッグ 234との結合についても同様である。上記培養バッグ 242と、培地バッグ 233 及び廃液バッグ 234と、を結合させる作業は、クリーンベンチ等内で無菌状態で実施 される。
[0227] 培養バッグ 242、培地バッグ 233および廃液バッグ 234が上述のように接続される ことで、培地バッグトレイ 231における培地バッグ 233内の培地が供給ポンプ 261の 起動により培養バッグ 242へ供給され、この培養バッグ 242内の使用済み培地が排 出ポンプ 271の起動により廃液バッグトレイ 232の廃液バッグ 234へ排出されるという 閉ループが構成される。この閉ループの構成により、当該系統 (培養バッグ 242、培 地バッグ 233、廃液バッグ 234)が無菌状態に保持される。
[0228] 培養バッグ 242内での培養（細胞増殖）には、供給ポンプ 261を起動させて、培地 バッグトレイ 231の培地バッグ 233内の培地を培養バッグ 242へ供給（流カロ）すること で細胞を増殖させる静置培養（単純流加）と、供給ポンプ 261及び排出ポンプ 271を 起動させて、培養バッグ 242内の使用済み培地を廃液バッグトレイ 232の廃液バッグ 234へ排出し、且つ培地バッグ 233内の培地を培養バッグ 242へ供給することで細 胞を増殖させる灌流培養と、後述の振盪装置 290を用いた振盪培養と、がある。この うち灌流培養には、使用済み培地の排出と培地の供給とを交互に実施する間欠式 灌流培養と、使用済み培地の排出と培地の供給とを同時に実施する連続式灌流培 養とがある。この連続式灌流培養では、通常、培養バッグ 242と排出ポンプ 271との 間のチューブ 272に細胞の移動を阻止するフィルタが配設されて、培養バッグ 242 内の細胞が廃液バッグ 234へ排出されることが防止される。
[0229] 上記廃液バッグトレイ 232の廃液バッグ 234へは、培養バッグ 242における細胞の 増殖終了後に、培養バッグ 242内の使用済み培地が排出されて、この培養バッグ 24 2内の細胞が濃縮される。この使用済み培地の排出は排出ポンプ 271の起動により 実施され、重量計 251の計測値に基づき運転制御用 PLC223の制御によって、培 養バッグ 242内の培地及び細胞の容量が約 1Z2〜1Z3程度になるまで実施される 。この培養バッグ 242内での細胞の濃縮により、その後に実施される遠心分離機によ る遠心分離回数が低減される。
[0230] また、廃液バッグトレイ 232では、培養バッグ 242における細胞が上述のように濃縮 された後に、廃液バッグ 234を、遠心分離機に装着可能な細胞回収容器としての細 胞回収バッグに置き換え、この細胞回収バッグ内へ、培養バッグ 242内で細胞が濃 縮された培養液 (培地及び細胞）を、排出ポンプ 271の起動により供給してもよい。こ の場合には、チューブ 272にフィルタが配設されていないことが条件となる。これによ り、遠心分離機に装着可能なバッグでの細胞の回収を、閉鎖系空間である培養ュニ ット 212内で実施でき、細胞の回収作業が省力化される。
[0231] ここで、図 27に示すように、培養ユニット 212内には培養バッグトレイ 241が収納さ れ、この培養バッグトレイ 241が培養室 240のフレーム 250に支持される力 この培養 ノッグトレイ 241上で培養バッグ 242を直接載置する載置台 252は、昇降しないパー ッ 252aと、昇降可能な複数の連結した面積変化パーツ 252b、 252cと、により構成さ れる。これらの面積変化パーツ 252b、 252cにより培養バッグ 242の培養面積を制御 することができる。また、培養バッグトレイ 241の面積変化パーツ 252b、 252cが配置 される下方位置には傾斜モータ (昇降機構) 280、カム機構 281及び位置決めセン サ（不図示）が設置されている。上記傾斜モータ 280はカム機構 281を回動させて、 載置台 252の上記面積変化パーツ 252b、 252cを互いに別個独立に昇降させる。こ の昇降部の位置が位置決めセンサにより検出されて、運転制御用 PLC223へ送信さ れる。傾斜モータ 280は運転制御用 PLC223により制御され、培養バッグ 242にお ける培養初期段階で、載置台 252の面積変化パーツ 252b、 252cを下降させるよう 制御される。これにより、培養バッグ 242の面積変化パーツ 252b、 252cに対応する 部分に液溜り部が形成される。例えば、図 28に示した載置台 252は面積変化パーツ 252b, 252cの高さをそれぞれ上下させることで培養面積を 3段階に変化させること ができる。なお、面積変化パーツは 3以上設けても良ぐこれにより培養面積の調整を より微細に行うことができる。ここで、図 28は、図 27の載置台 252の構成を示す斜視 図である。
[0232] 培養バッグ 242における培養初期段階で細胞および培地が液溜り部に貯溜される ことにより、抗体刺激に好適な培養条件、すなわち培養バッグ 242内の細胞密度が 増殖に好適な密度に保持される。また培養バッグ 242内に培地及び細胞が所定量 以上になる培養中期及び後期には、傾斜モータ 280がカム機構 281を介して載置台 252の面積変化パーツ 252b、 252cを上昇させ、培養バッグ 242を所定の面積のパ ーッだけを水平状態とすることにより上記液溜り部の面積を変化させる。培養の進行 に合わせて、細胞及び培地の液溜り部の面積を変化させることにより、培養バッグ 24 2内の面積当たりの細胞密度が増殖に好適な密度に保持されて、細胞増殖段階に 細胞が効率的に増殖される。
[0233] 例えば、図 28に示すように載置台 252が液溜まりを 2段形成可能な場合、まず一番 低い図 28の面積変化パーツ 252cの部分に培地と細胞を保持し、細胞の密度が低く ならないようにする。
細胞が増殖を開始して培地量を増やした際には図 28の面積変化パーツ 252cの高 さを 1段階上げて面積変化パーツ 252bと面積変化パーツ 252cを同じ高さにすること で、培養可能な培養バッグ 242の面積を一定量拡大する。これにより、再度増殖に好 適な細胞密度を一定時間保持することができる。
さらに細胞が増殖して培地量を増やした際には面積変化パーツ 252bと面積変化 パーツ 252cの高さをさらに一段階上げてパーツ 252aと同じ高さにし、培養バッグ 24 2全体で培養することができるようにする。 [0234] 更に培養室 240内には、図 27に示すように、培養バッグトレイ 241の培養バッグ 24 2が配置される上方位置に振盪装置 290の振盪機構 291が押圧手段として設置され る。この振盪装置 290は、上記振盪機構 291、作動モータ 292、カム機構 293及び 位置決めセンサ (不図示)を有する。振盪機構 291は、図 27に示すように、装置フレ ーム 250に、ガイドロッド 250aを介して、押圧手段としての作動板 291aが上下移動 自在に配設され、この作動板 291aの底面に複数の突出部 291bが突設されたもの である。作動板 291aが作動モータ 292により、カム機構 293の作用で上方または下 方に交互に移動されることで、この作動板 291aの突出部 291bが、振盪機構 291の 下方に位置する培養バッグ 242を繰り返し押圧、つまり培養バッグ 242に対し押圧と 押圧解除を繰り返す。これにより、培養バッグ 242内の培地が攪拌されて、培養バッ グ 242内の細胞が培地内で浮遊して移動し、この培養バッグ 242内での細胞分布及 び酸素濃度分布が均一化され、細胞の増殖が促進される。
[0235] 上述の載置台 252に代えて、図 29及び図 30に示す載置台 352を用いて、この載 置台 352上に載置した培養バッグ 242における培養面積を変化させることもできる。 ここで、図 29は、第 4の実施の形態の変形例に係る載置台 352の構成を示す平面図 であり、（a)は昇降しないパーツ 353とすべての面積変化パーツ 354、 355、 356、 3 57が同一平面上にある状態を示す図、 (b)は面積変化パーツを下降させた状態を 示す図である。図 30は、図 29 (a)の ΙΠΧ—ΙΠΧ線に沿った一部断面図であって、（a )は面積変化パーツを下降させて、昇降しないパーツ 353、面積変化パーツ 355、及 び面積変化パーツ 357を、階段状に、別の平面上に配置した状態を示す図、（b)は 4つの面積変化パーツのうち 3つの面積変化パーツ 355、 356、 357が同一平面上 にある状態を示す図、（c)は昇降しないパーツ 353とすべての面積変化パーツ 354、 355、 356、 357力 S同一平面上にある状態を示す図である。
[0236] 載置台 352は、図 29に示すように、平面視長方形の一角 352aから、この角を頂点 とする二等辺三角形状に順次切り取った形状の面積変化パーツ 357、 356、 355、 3 54、及び昇降しないパーツ 353を備える。昇降しないパーツ 353は水平面上に配置 される。図 30に示すように、昇降しないパーツ 353と面積変化パーツ 354は連結部 材 353aにより、面積変化パーツ 354と面積変化パーツ 355は連結部材 354aにより、 面積変化パーツ 355と面積変化パーツ 356は連結部材 355aにより、面積変化パー ッ 356と面積変化パーツ 357は連結部材 356aにより、それぞれ互いに回動可能に 連結されて ヽる。連結咅材 353a、 354a, 355a, 356aとしては、 ί列えば、蝶番を用 ヽ ることがでさる。
なお、載置台 352では、面積変化パーツの数は 4つであった力 2〜3つでもよいし 、 5つ以上であってもよい。
[0237] 面積変化パーツ 355、 357の下面には、支持脚 365、 367がそれぞれ接着固定さ れている。
図 30 (c)に示すように、支持脚 365の下面は、載置台 352の一角 352a側力も順に 配置された水平面上の平面 365a及び平面 365bと、これらの平面 365a、 365bをつ なぐ傾斜面 365cからなり、平面 365aは平面 365bよりも下方に位置している。一方、 支持脚 367の下面は、載置台 352の一角 352a側力も順に配置された水平面上の平 面 367a、 367b, 367cと、平面 367aと 367bをつなぐ傾斜面 367dと、平面 367bと平 面 367cをつなぐ傾斜面 367eと、力もなり、平面 367aは 367bよりも、 367bは平面 36 7cよりも、下方に位置している。また、平面 365aの面積変化パーツ 355からの距離 は、平面 367aの面積変化パーツ 357からの距離と同一であり、平面 365bの面積変 化パーツ 355からの距離は、 367bの面積変化パーツ 357からの距離と同一である。
[0238] 載置台 352の下方には、モータ 380により、図 29 (a)の ΠΙΧ— ΙΠΧ線に沿って（図 3 0 (b)の矢印 A方向に)移動可能な高さ調整板 370が配置されて 、る。この高さ調整 板 370上には、面積変化パーツを昇降させるための昇降部材 375、 377が接着固定 されている。
[0239] 図 30 (c)に示すように、昇降部材 375の上面は、載置台 352の一角 352a側力も順 に配置された水平面上の平面 375b及び平面 375aと、これらの平面 375a、 375bを つなぐ傾斜面 375cからなり、平面 375aは平面 375bよりも上方に位置している。一 方、昇降部材 377の上面は、載置台 352の一角 352a側から順に配置された水平面 上の平面 377c、 377b, 377aと、平面 377aと平面 377bをつなぐ傾斜面 377dと、平 面 377bと平面 377cをつなぐ傾斜面 377eと、力らなり、平面 377aは平面 377bよりも 、平面 377bは平面 377cよりも、上方に位置している。昇降部材 377の上面は支持 脚 367の下面に対応した形状を備えており、傾斜面 377d、 377eを支持脚 367の傾 斜面 367e、 367dにそれぞれ当接させたとき、平面 377a、 377b, 377cは支持脚 36 7の平面 367c、 367b, 367aにそれぞれ当接する。また、平面 375aの高さ調整板 3 70の上面からの距離は、平面 377aの高さ調整板 370の上面からの距離と同一であ り、平面 375bの高さ調整板 370の上面からの距離は、平面 377bの高さ調整板 370 の上面からの距離と同一である。
[0240] つづいて、図 30を参照しつつ、高さ調整板 370を矢印 A方向に移動させることによ り面積変化パーツを昇降させる操作例について説明する。
030 (a)【こ示すよう【こ、支持脚 367の平面 367a、 367b, 367c,傾斜面 367d、 36 7eを、昇降部材 377の平面 377c、 377b, 377a,にそれぞれ当接させると、傾斜面 365cと傾斜面 375cとが離間した状態で、支持脚 365の平面 365a、 365bと、昇降 部材 375の平面 375b、 375aと、がそれぞれ当接する。この結果、面積変化パーツ 3 55と面積変化パーツ 357が水平方向に沿って配置されると同時に面積変化パーツ 3 54と面積変化パーツ 356が鉛直方向に配置されて、載置台 352は、載置台 352の 一角 352a側力も順に高くなる階段状をなす。
[0241] 図 30 (a)に示す状態から、モータ 380により、高さ調整板 370を矢印 A方向に移動 させていくと、支持脚 367は昇降部材 377の上面の形状に沿って上昇する（図 30 (b ) ) oこれにより、支持脚 367の平面 367a、 367b,傾斜面 367d力 昇降咅材 377の 平面 377b、 377a,傾斜面 377dにそれぞれ当接する。一方、昇降部材 375は、傾 斜面 365cと傾斜面 375cと力当接するまで、平面 365a、 365bと、平面 375b、 375a とが当接したまま支持脚 365に対して相対移動する。この結果、図 30 (b)に示すよう に、 4つの面積変化パーツのうち 3つの面積変化パーツ 355、 356、 357が同一平面 上にある状態となる。
[0242] さらに、図 30 (b)に示す状態から、モータ 380により、高さ調整板 370を矢印 A方向 に移動させていくと、支持脚 367は昇降部材 377の上面の形状に沿ってさらに上昇 する（図 30 (c) )。これにより、支持脚 367の平面 367a力 昇降部材 377の平面 377 aに当接する。一方、支持脚 365は、昇降部材 375の上面の形状に沿って上昇し、 支持脚 365の平面 365aと昇降咅材 375の平面 375aと力当接する。これにより、図 3 0 (c)〖こ示すように、昇降しないパーツ 353とすべての面積変化パーツ 354、 355、 3 56、 357が同一平面上に配置される。
[0243] 以上のように、高さ調整板 370を移動させることにより、面積変化パーツ 354〜357 を昇降制御することができるため、所望部分を液溜り部とすることができる。
[0244] 更に培養室 240内には、図 27に示すように、培養バッグトレイ 241の培養バッグ 24 2が配置される上方位置に振盪装置 290の振盪機構 291が押圧手段として設置され る。この振盪装置 290は、上記振盪機構 291、作動モータ 292、カム機構 293及び 位置決めセンサ (不図示)を有する。振盪機構 291は、図 27に示すように、装置フレ ーム 250に、ガイドロッド 250aを介して、押圧手段としての作動板 291aが上下移動 自在に配設され、この作動板 291aの底面に複数の突出部 291bが突設されたもの である。作動板 291aが作動モータ 292により、カム機構 293の作用で上方または下 方に交互に移動されることで、この作動板 291aの突出部 291bが、振盪機構 291の 下方に位置する培養バッグ 242を繰り返し押圧、つまり培養バッグ 242に対し押圧と 押圧解除を繰り返す。これにより、培養バッグ 242内の培地が攪拌されて、培養バッ グ 242内の細胞が培地内で浮遊して移動し、この培養バッグ 242内での細胞分布及 び酸素濃度分布が均一化され、細胞の増殖が促進される。
[0245] また、図 27に示すように、上記位置決めセンサにより作動板 291aの位置が検出さ れて運転制御用 PLC223へ送信され、かつ重量計 251の計測値がこの PLC223に より作動モータ 292が制御される。上記振盪装置 290を用いた培養バッグ 242内で の細胞培養 (振盪培養）は、培養バッグ 242内に培地及び細胞が一杯程度に満たさ れる前に実施されてもよぐまたは一杯程度に満たされた後に実施されてもよい。この 振盪装置 290は、作動版の検出位置及び重量計 251の計測値に基づいて、運転制 御用 PLC223により制御される。
[0246] また、培養室 240内には、図 27に示すように、培養バッグ 242の抗体を固層化した 部位が配置される位置の上方に照明ランプ 301が、下方に画像取得手段としての C CDカメラ 302が設置される。 CCDカメラ 302には、観察形態などに応じて、レンズ、 プリズム、鏡筒その他の光学機器を追加使用する。照明ランプ 301は、培養バッグ 2 42を上方から照明するものである。 CCDカメラ 302は、培養バッグ 242内の細胞を 下方力も撮影して、その画像を取得するものである。これらの照明ランプ 301の照明 動作と CCDカメラ 302の撮影動作は運転制御用 PLC223により制御され、所定時間 (例えば 6時間）毎に培養バッグ 242内の細胞の画像が取得される。所定時間毎の細 胞画像は画像処理用ユニット 221の画像メモリ回路 (不図示）に記憶される。
[0247] 前記画像処理用ユニット 221は、画像処理用ユニット 221の画像メモリ回路内に記 憶された所定時間毎の細胞画像を画像処理、例えば 2値化処理や多値化処理して 、単一細胞の投影面積の平均値と、単一細胞が凝集した細胞凝集塊である非単一 細胞の増加速度とを細胞培養の評価パラメータとして算出する。単一細胞の投影面 積の平均値 (単一細胞の平均投影面積）は、培養バッグトレイ 241に培養バッグ 242 を装着し、この培養バッグトレイ 241を培養室 240内に収納して培養を開始した時か ら例えば 24時間経過後の細胞画像力も算出する。
[0248] また、上述の非単一細胞である力否かの判断は投影面積が 100 μ m2を基準として 、 100 m2以上の場合を非単一細胞と判断し、 100 m2以下のものを単一細胞と 判断している。これは、培養初期の単一細胞の投影面積を測定した結果、すべて 10 0 m2以下であったためである。細胞の経時的な画像 (例えば、培養開始から 24時 間、 48時間、 72時間経過後の画像)から、全細胞に対する非単一細胞の割合の変 化を演算して、非単一細胞の増加速度を算出する。この非単一細胞の増加速度と上 記単一細胞の平均投影面積は、画像処理用ユニット 221から運転制御用 PLC223 へ出力される。
[0249] 運転制御用 PLC223は、単一細胞の平均投影面積力もラグタイムを算出し、当該 細胞の増殖開始時期を推定する。ここで、上記ラグタイムとは、培養バッグトレイ 241 の抗体固層部に細胞を接種して力 増殖開始までに要する誘導期の時間である。運 転制御用 PLC223は、細胞の増殖開始時期から当該細胞の培養状況、つまり当該 細胞が抗体の刺激により増殖の可能性がある力否かを判断してこの細胞の良否を判 定する。この判定に基づいて、運転制御用 PLC223は増殖可能性が著しく低い細胞 につ 、て、本細胞培養装置 200での培養を中止する。
[0250] また、運転制御用 PLC223は、非単一細胞の増加速度から当該細胞の最小倍ィ匕 時間を算出する。ここで、上記最小倍ィ匕時間とは、ある時間における細胞の細胞数 が倍の細胞数になるまでに要する時間をいう。運転制御用 PLC223は、この最小倍 化時間から当該細胞の培養状況、つまり当該細胞の増殖能力を判断して、培養バッ グ 242へ培地を流加させるタイミングや流加速度などを決定する。
[0251] 制御手段として機能する運転制御用 PLC223及び画像処理用ユニット 221は、図 示しないが、演算や制御を実行する CPUと、処理プログラムやデータを記憶する記 憶装置 (メモリ）と、データやコマンドなどを入力するためのキーボード、マウスまたは タツチパネルなどの入力装置やモニタなどの出力装置との接続を行う入出力回路と を有して構成される。更に、画像処理用ユニット 221には、 CCDカメラ 302からの画 像データを記憶する画像メモリ回路を備える。
[0252] 画像処理用ユニット 221の記憶装置には、 CCDカメラ 302が所定時間毎に撮影し た培養バッグ 242内の細胞の画像を画像処理 (例えば 2値化処理や多値化処理)し て、細胞培養の評価パラメータ（単一細胞の平均投影面積、非単一細胞の増加速度 )などを算出するためのプログラムが記憶されている。
[0253] また、運転制御用 PLC223の記憶装置には、細胞培養の評価パラメータから細胞 の培養状況 (細胞の増殖可能性、細胞の増殖能力）を判定するためのプログラムと、 この細胞の培養状況に応じて細胞培養装置 200及び培養ユニット 212に関する機器 (例えば供給ポンプ 261、排出ポンプ 271など）を制御し、培養操作を実行するため のプログラムとが記憶されている。更に、この運転制御用 PLC223の記憶装置には、 細胞培養装置 200及び培養ユニット 212の各種センサからの信号に基づいて、これ らの培養装置 210及び培養ユニット 212に関する機器を制御する機器制御用のプロ グラムも記憶されている。画像処理用ユニット 221の記憶装置には、 CCDカメラ 302 を所定時間毎に制御して細胞の画像を取得するなどの機器制御用のプログラムも記 憶されている。
[0254] 次に、運転制御用 PLC223及び画像処理用ユニット 221が上記プログラムを実行 して細胞を培養する工程を、図 31〜図 40の工程図に示すフローチャートを用いて説 明する。
[0255] 図 31及び図 32は、抗体刺激間欠式灌流培養工程を示し、培養バッグ 242に細胞 を回収する場合である。 まず、図 31に示すように、操作者は、クリーンベンチ等内で培養バッグ 242に抗体 を固層化し（図 31の W01)、培地を投入し、細胞を接種させた培養バッグ 242を、培 養バッグトレイ 241に装着する。引き続き、操作者はクリーンベンチ等内で培地を投 入した培地バッグ 233を培地バッグトレイ 231に装着し、廃液バッグ 234を廃液バッグ トレイ 232に装着し、培養バッグ 242と、培地バッグ 233および廃液バッグ 234と、を 供給継ぎ手 264および廃液継ぎ手 274によってそれぞれ連結する（図 31の W02)。
[0256] 次に、操作者は、この培養バッグトレイ 241、培地バッグトレイ 231及び廃液バッグト レイ 232を細胞培養装置 200の、表示灯が例えば緑色に点灯された単一の培養ュ ニット 212内に搬入し、培養バッグトレイ 241は培養室 240のフレーム 250に支持さ せて、培地バッグトレイ 231及び廃液バッグトレイ 232は低温室 230に設置する。そし て、操作者は、培養バッグ 242のポンプチューブ 262、 272を供給ポンプ 261及び 出ポンプ 271にそれぞれ接続する（図 31の W03)。
[0257] 次に、操作者は、培養ユニット 212に収納した培養バッグ 242における CCDカメラ 302の画像出力を確認する（図 31の W05)。この画像出力確認の前に、操作者は当 該培養ユニット 212の傾斜モータ 280を起動させて載置台 252の面積変化パーツ 2 52b、 252cを下降させ、培養バッグ 242に液溜り部を形成しておく（図 31の W04)。 更に操作者は、当該培養ユニット 212の重量計 251により、設置された培養バッグ 24 2の重量を計測しておく。
[0258] その後、操作者は、培養ユニットドアを閉めて当該培養ユニット 212内で細胞の培 養を開始させる（図 31の W06)。これにより、培養バッグ 242の液溜り部において、増 殖のために抗体により細胞が刺激される（図 31の W07)。当該培養ユニット 212の C CDカメラ 302は、培養バッグ 242の液溜り部の細胞を所定時間（例えば 6時間）毎に 撮影し、画像処理用ユニット 221は、この撮像画像カゝら細胞培養の評価パラメータを 算出する。運転制御用 PLC223は、この評価パラメータカゝらラグタイムを算出して、当 該細胞が抗体により刺激を受けて増殖の可能性がある力否力判定し、更に最小倍ィ匕 時間を算出して、当該細胞の増殖能力を判定する（図 31の W08)。
[0259] 運転制御用 PLC223は、細胞が培養バッグ 242内で抗体により刺激されて力も所 定時間（例えば 24時間）経過しても増殖の可能性が認められない場合には、本細胞 培養装置 200での細胞の培養を中止する（図 31の W08')。運転制御用 PLC223は 、培養バッグ 242内の細胞に増殖の可能性があると判断したときには、当該細胞の 増殖能力に基づ!、て、当該培養バッグ 242内への培地の流加速度やタイミングなど を決定する。運転制御用 PLC223は、この決定に基づき供給ポンプ 261を作動して 、培地バッグトレイ 231の培地バッグ 233内の培地を培養バッグ 242へ流加させる（ 図 31の W09)。
[0260] この供給ポンプ 261の作動により、培養バッグ 242内で所定の面積の液溜り部にお いて細胞の静置培養が開始される（図 31の W10)。運転制御用 PLC223は、重量 計 251により計測される培養バッグ 242内の培地及び細胞の重量が所定値 a以上と なった力否かを判断し（図 31の W11)、所定値 a以上となった時点で傾斜モータ 280 を起動させ、カム機構 281を介して載置台 252の面積変化パーツ 252b、 252cを上 昇させ、培養バッグ 242の所定の面積を水平状態として液溜り部を変化させる（図 31 の W12)。この工程は載置台 252に形成された段差がすべて解消され、培養バッグ 2 42が水平となるまで繰り返される（図 31の W13)。
[0261] その後、運転制御用 PLC223は、重量計 251により計測される培養バッグ 242内 の培地及び細胞の重量が所定値 b以上になった力否かを判断し（図 31の W14)、所 定値 b以上になった時点で作動モータ 292を起動させる。これにより、振盪装置 290 が作動して、振盪装置 290の振盪機構 291が培養バッグ 242を繰り返し押圧する振 盪培養を開始する（図 31の W15)。運転制御用 PLC223は、引き続き、重量計 251 により計測される培養バッグ 242内の培地及び細胞の重量が所定値 c以上となった か否かを判断し（図 32の W16)、所定値 c以上となった時点で、供給ポンプ 261を停 止して培地バッグトレイ 231の培地バッグ 233力も培養バッグ 242への培地の流加を 停止し（図 32の W17)、作動モータ 292を停止して培養バッグ 242内での振盪培養 を停止する（図 32の W18)。
[0262] 運転制御用 PLC223は、培養バッグ 242内で細胞が沈降した後に、排出ポンプ 27 1を作動させて、培養バッグ 242内の使用済み培地 (培養バッグ 242内の上澄み）を 廃液バッグトレイ 232の廃液バッグ 234へ排出する（図 32の W19)。その後、運転制 御用 PLC223は、重量計 251により計測される培養バッグ 242内の培地及び細胞の 重量が所定値 d以下になったか否かを判断し（図 32の W20)、所定値 d以下になった 時点で、排出ポンプ 271を停止して、培養バッグ 242からの使用済み培地の排出を 停止する（図 32の W21)。そして供給ポンプ 261を起動して培地バッグトレイ 231の 培地バッグ 233から培養バッグ 242へ培地を流加させ、作動モータ 292を起動して、 振盪装置 290により培養バッグ 242内で振盪培養を実施する（図 32の W22)。所定 時間経過後、運転制御用 PLC223は、供給ポンプ 261を停止して培地バッグトレイ 2 31の培地バッグ 233から培養バッグ 242への培地流加を停止し、作動モータ 292を 起動したまま振盪培養を継続する（図 32の W23)。
[0263] 運転制御用 PLC223は、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間 に至ったか否かを判断し、または画像処理用ユニット 221が、培養バッグ 242内での 細胞が所望の細胞数に到った力否かを判断する（図 32の W24)、これらの培養期間 または細胞数に至っていない場合には、ステップ W18〜W23の処理動作を繰り返 す。細胞数の測定を行う場合は振盪装置 290を一度停止し、細胞が沈降するまで待 つ。次いで、 CCDカメラ 302で培養バッグ 242内の画像を撮影する。画像処理用ュ ニット 221は取得した画像からバッグ内に存在する細胞数を推定 ·算出する。
[0264] 上記ステップ W18〜W23は、培養バッグ 242内で使用済みの培地の排出と、培養 ノ ッグ 242内への新 、培地の供給 (流加）とを交互に実施する間欠式灌流培養で ある。
[0265] 運転制御用 PLC223は、ステップ W24において所望の培養期間または細胞数に 至った時点で、図 32に示すように作動モータ 292を停止して、培養バッグ 242内で の振盪培養を停止する（図 32の W25)。次いで、培養バッグ 242内で細胞が沈降し た後に排出ポンプ 271を起動させ、培養バッグ 242内の使用済み培地を廃液バッグ トレイ 232の廃液バッグ 234へ排出して、重量計 251の計測値に基づき、培養バッグ 242内の培地及び細胞が約 1Z2〜1Z3程度になるまで細胞を濃縮させる（図 32の W26)。
[0266] 運転制御用 PLC223は、その後排出ポンプ 271を停止して細胞培養を終了する（ 図 32の W27)。この培養終了後に、操作者により培養バッグ 242内の細胞がクリーン ベンチ等内で遠心分離機用の容器に移され、その後、遠心分離によって細胞が回 収される（図 32の W28)。
[0267] 次に、同様な抗体刺激間欠式灌流培養工程において、細胞回収バッグにより細胞 を回収する処理が含まれる場合を図 33及び図 34に示す。従って、この図 33及び図 34に示す工程のステップ W31〜W56は、図 31及び図 32のステップ WO 1〜W26と 同様であるため説明を省略する。
[0268] 図 34に示すステップ W56において、排出ポンプ 271の起動により培養バッグ 242 内の細胞が濃縮された後、運転制御用 PLC223は排出ポンプ 271を停止し、廃液 ノ ッグトレイ 232の廃液バッグ 234を細胞回収バッグに交換するように操作者に促す (図 34の W57)。この細胞回収バッグは、遠心分離機に装着されて遠心分離に使用 され得るバッグである。
[0269] 廃液バッグトレイ 232の廃液バッグ 234が細胞回収バッグに交換された後、運転制 御用 PLC223は排出ポンプ 271及び作動モータ 292を起動する。次いで、振盪装 置 290により培養バッグ 242内を振盪させながら、この培養バッグ 242内の細胞を培 地と共に廃液バッグトレイ 232に装着した細胞回収バッグへ移行させる（図 34の W5 8)。運転制御用 PLC223は、その後排出ポンプ 271及び作動モータ 292を停止し て培養バッグ 242からの細胞回収を停止し、細胞培養を終了する（図 34の W59)。こ の細胞回収終了後に、操作者により細胞回収バッグが遠心分離機に装着されて、遠 心分離により細胞が回収される（図 34の W60)。
[0270] 次に、抗体刺激連続式灌流培養工程を、この工程の処理動作を示す図 35及び図 36に基づいて説明する。この図 35及び図 36に示す抗体刺激連続式灌流培養工程 におけるステップ X01〜X15は、図 31及び図 32の抗体刺激間欠式灌流培養工程 におけるステップ W01〜W15と同様であるため説明を省略する。
この抗体刺激連続式灌流培養工程では、培養バッグ 242と排出ポンプ 271との間 にフィルタ（不図示）が配設されて 、る。
[0271] 運転制御用 PLC223は、培養バッグ 242内へ培地バッグトレイ 231の培地バッグ 2 33から培地が流加されて、培養バッグ 242内での振盪装置 290による振盪培養が行 われている間に、培養バッグ 242内の培地及び細胞の重量が所定値 c以上となった 時点（図 36の X16)で排出ポンプ 271を起動させて、培養バッグ 242内の使用済み 培地を廃液バッグトレイ 232の廃液バッグ 234へ排出させる。これにより、培養バッグ 242への培地の流加と培養バッグ 242からの培地の排出とを同時に実施する連続式 灌流培養が培養バッグ 242内で開始される（図 36の XI 7)。このとき、培養バッグ 24 2内の細胞は、フィルタにより流動が阻止されて廃液バッグ 234内へ流動することは ない。なお、上記連続式灌流培養中には、振盪装置 290による振盪培養も同時に実 施されている。
[0272] 運転制御用 PLC223は、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間 に至ったか否かを判断し、または画像処理用ユニット 221が、培養バッグ 242内での 細胞が所望の細胞数に到った力否かを判断する（図 36の X18)。これらの培養期間 または細胞数に至っていない場合には、ステップ X17の連続式灌流培養を繰り返す 。細胞数の測定を行う場合は振盪装置 290を一度停止し、細胞が沈降するまで待つ 。次いで、 CCDカメラ 302で培養バッグ 242内の画像を撮影する。画像処理用ュ- ット 221は取得した画像からバッグ内に存在する細胞数を推定 ·算出する。
[0273] 運転制御用 PLC223は、ステップ X18における所望の培養期間または細胞数に至 つた時点で、供給ポンプ 261、排出ポンプ 271及び作動モータ 292を停止させて、 灌流培養及び振盪培養を停止させる（図 36の XI 9)。運転制御用 PLC223は、培養 ノ ッグ 242内で細胞が沈降した後に、排出ポンプ 271を起動させ、培養バッグ 242内 の使用済み培地を廃液バッグトレイ 232の廃液バッグ 234へ排出させ、重量計 251 の計測値に基づき、培養バッグ 242内の培地及び細胞が約 1Z2〜1Z3程度になる まで細胞を濃縮させる（図 36の X20)。濃縮過程において振盪装置を停止させるの は多量の細胞がチューブに流入し、フィルタが目詰まりするのを防ぐためである。
[0274] 運転制御用 PLC223は、その後排出ポンプ 271を停止して細胞培養を終了する（ 図 36の X21)。この培養終了後に、操作者により培養バッグ 242内の細胞がクリーン ベンチ等内で遠心分離機用の容器に移され、その後、遠心分離によって細胞が回 収される（図 36の X22)。
[0275] 次に、抗体刺激単純流加培養工程を、この工程の処理動作を示す図 37及び図 38 に基づいて説明する。この図 37及び図 38に示す抗体刺激連続式灌流培養工程に おけるステップ YO 1〜Y15は、図 31及び図 32の抗体刺激間欠式灌流培養工程に おけるステップ WO 1〜W15と同様であるため説明を省略する。
[0276] 運転制御用 PLC223は、重量計 251により計測される培養バッグ 242内の培地及 び細胞の重量が所定値 c以上となったか否かを判断し（図 38の Y16)、所定値 c以上 となった時点で、供給ポンプ 261を停止して培地バッグトレイ 231の培地バッグ 233 力も培養バッグ 242への培地の流加を停止し、作動モータ 292を起動したまま振盪 培養を継続する（図 38の Y17)。
[0277] 運転制御用 PLC223は、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間 に至ったか否かを判断し、または画像処理用ユニット 221が培養バッグ 242内での細 胞が所望の細胞数に到った力否かを判断する（図 38の Y18)、これらの培養期間ま たは細胞数に至って 、な 、場合には、振盪培養を継続する (Y18で No)。
細胞数の測定を行う場合は振盪装置 290を一度停止し、細胞が沈降するまで待つ 。次いで、 CCDカメラ 302で培養バッグ 242内の画像を撮影する。画像処理用ュ- ット 221は取得した画像からバッグ内に存在する細胞数を推定 ·算出する。
[0278] 運転制御用 PLC223は、ステップ Y18において所望の培養期間または細胞数に 至った時点で、図 38に示すように作動モータ 292を停止して、培養バッグ 242内で の振盪培養を停止し（図 38の Y19)、培養バッグ 242内で細胞が沈降した後に、排 出ポンプ 271を起動させ、培養バッグ 242内の使用済み培地を廃液バッグトレイ 232 の廃液バッグ 234へ排出して、重量計 251の計測値に基づき、培養バッグ 242内の 培地及び細胞が約 1Ζ2〜1Ζ3程度になるまで細胞を濃縮させる（図 38の Υ20)。
[0279] 運転制御用 PLC223は、その後排出ポンプ 271を停止して細胞培養を終了する（ 図 38の Υ21)。この培養終了後に、操作者により培養バッグ 242内の細胞がクリーン ベンチ等内で遠心分離機用の容器に移され、その後、遠心分離によって細胞が回 収される（図 38の Υ22)。
[0280] 次に、同様な抗体刺激単純流加培養工程において、細胞回収バッグにより細胞を 回収する処理が含まれる場合を、この処理動作を示す図 39及び図 40に示す。従つ て、この図 39及び図 40に示す工程のステップ Υ31〜Υ50は、図 37及び図 38のステ ップ ΥΟ 1〜Υ20と同様であるため説明を省略する。
[0281] 図 40に示すステップ Υ50において、排出ポンプ 271の起動により培養バッグ 242 内の細胞が濃縮された後、運転制御用 PLC223は、排出ポンプ 271を停止し、廃液 ノ ッグトレイ 232の廃液バッグ 234を細胞回収バッグに交換するように操作者に促す (図 40の Y51)。この細胞回収バッグは、遠心分離機に装着されて遠心分離に使用 され得るバッグである。
[0282] 廃液バッグトレイ 232の廃液バッグ 234が細胞回収バッグに交換された後、運転制 御用 PLC223は排出ポンプ 271及び作動モータ 292を起動させて、振盪装置 290 により培養バッグ 242内を振盪させながら、この培養バッグ 242内の細胞を培地と共 に、廃液バッグトレイ 232に装着された細胞回収バッグへ移行させる（図 40の Υ52)。 運転制御用 PLC223は、その後第排出ポンプ 271及び作動モータ 292を停止して 培養バッグ 242からの細胞回収を停止し、細胞培養を終了する（図 40の Υ53)。この 細胞回収終了後に、操作者により細胞回収バッグが遠心分離機に装着されて、遠心 分離により細胞が回収される（図 40の Υ54)。
[0283] 以上のように構成されたことから、上記実施の形態によれば、次の効果（1)〜（7)を 奏する。
(1) CCDカメラ 302が撮像した培養バッグ 242内の細胞の画像を、画像処理用ュ ニット 221が画像処理して細胞培養の評価パラメータ（単一細胞の平均投影面積、 非単一細胞の増加速度）を取得し、運転制御用 PLC223が当該細胞の培養状況（ 細胞の増殖可能性及び増殖能力）を判定評価し、この培養状況に応じた培養操作 ( 培地バッグ 233から培養バッグ 242への所定流加速度での培地流加やタイミング）を 実施する。この結果、細胞の培養状況を非接触状態で判定できるので当該細胞にダ メージを与えることがなぐまた、培養操作を操作者が逐次実施する必要がないので 操作者の労力を軽減できる。更に、一患者の細胞を単一の培養ユニット 212内に収 納される培養バッグ 242に接種させ、この細胞ごとに、細胞の培養状況に応じた培養 操作を実施できるので適切な培養操作を実現できる。この細胞の培養状況に応じた 適切な培養操作を実現できることで、時間単位での培養操作が可能となり、培養が 促進されて培養期間を短縮できる。
[0284] (2)培地バッグ 233、廃液バッグ 234および培養バッグ 242をクリーンベンチ等内で 連結し、培養ユニット 212に設置するため閉ループに構成されたことから、完全閉鎖 系の無菌状態に保持することができる。
[0285] (3)培養バッグトレイ 241、培地バッグトレイ 231及び廃液バッグトレイ 232を培養開 始時に培養ユニット 212内に設置してから、培養終了までは自動で培養工程が実施 されるため、環境変化に伴う培養バッグ 242内の細胞へのダメージを低減できると共 に、クリーンベンチ等内で培養バッグ 242に培地を供給する無菌操作を省略できる。
[0286] (4)培養バッグ 242内での培養初期段階の抗体刺激と細胞増殖を同一培養バッグ 242内で行 ヽ、この培養バッグ 242内で細胞及び培地が貯溜される液溜り部を所定 の面積で変化させることができることから、培養中の面積当たりの細胞密度を増殖に 好適な密度に維持することで、細胞を効率よく増殖させることができる。
[0287] (5)培養バッグ 242内の使用済み培地が廃液バッグトレイ 232の廃液バッグ 234に 排出されて貯溜されることから、培養バッグ 242の細胞密度を高めて濃縮することが できるので、細胞回収のための遠心分離操作回数を低減できる。この結果、細胞回 収作業の省力化を実現できると共に、遠心分離に伴う細胞のダメージも低減できる。
[0288] (6)培養バッグ 242内で濃縮された細胞を、廃液バッグトレイ 232に装着された細 胞回収バッグに全量回収させる場合には、この細胞回収バッグを遠心分離機に直接 装着して細胞を回収することができるので、細胞回収作業の省力化を実現できる。
[0289] (7)細胞が接種された培地を収容する可撓性の培養バッグ 242を、振盪装置 290 の振盪機構 291における作動板 291aの突出部 291bが繰り返し押圧して、当該培養 ノ ッグ 242内の培地を撹拌することから、この培養バッグ 242内の細胞分布及び酸 素濃度分布を均一化できるので、細胞の増殖が促進されて、細胞の培養効率を向上 させることがでさる。
また、細胞は、振盪装置 290の作動板 291aにより繰り返し押圧されて撹拌された 培地内を浮遊するだけなので、ダメージを蒙ることが防止される。
図面の簡単な説明
[0290] [図 1]本発明に係る細胞培養装置における第 1の実施の形態を示す構成図である。
[図 2]図 1の恒温槽を示す斜視図である。
[図 3]図 1の恒温槽におけるキヤニスタ内に収納される培養カセットを示す斜視図であ る。 圆 4]図 3の培養バッグトレイ、培地カセット及び細胞接種カセットをそれぞれ示す斜 視図である。
[図 5]図 2の恒温槽における一つのキヤ-スタと、このキヤ-スタ内に収納される培養 カセットとからなる培養ユニットの構成を示すレイアウト図である。
[図 6]図 5の培養ユニットの制御系統を示すブロック図である。
圆 7]図 5の振盪装置の振盪機構を示し、（A)が斜視図、（B)が側面図である。
[図 8]図 5の培養ユニットにおける培養手順を示す工程図である。
[図 9]図 5の培養ユニットにおける培養手順を示し、図 8に続く工程図である。
[図 10]図 5の培養ユニットにおける培養手順を示し、図 9に続く工程図である。
[図 11]図 5の培養ユニットにおける培養手順を示し、図 10に続く工程図である。 圆 12]図 5の培養ユニットにおける誘導因子刺激間欠式灌流培養工程の処理動作を 示すフローチャートである。
[図 13]図 12の処理動作の続きを示すフローチャートである。
圆 14]図 5の培養ユニットにおける誘導因子刺激間欠式灌流培養工程 (細胞回収バ ッグによる細胞回収処理を含む）の処理動作を示すフローチャートである。
[図 15]図 14の処理動作の続きを示すフローチャートである。
圆 16]図 5の培養ユニットにおける誘導因子刺激連続式灌流培養工程の処理動作を 示すフローチャートである。
[図 17]図 16の処理動作の続きを示すフローチャートである。
[図 18]図 1の細胞培養システムの細胞培養前における細胞培養関連データの流れを 示す図である。
[図 19]図 1の細胞培養システムの細胞培養中における細胞培養関連データの流れを 示す図である。
[図 20]図 1の細胞培養システムの細胞培養後における細胞培養関連データの流れを 示す図である。
圆 21]本発明に係る細胞培養装置の第 2の実施の形態における培養ユニットの構成 (分化誘導状態)を示すレイアウト図である。
圆 22]図 21の培養ユニットの分ィ匕誘導前状態の構成を示すレイアウト図である。 [図 23]図 21及び図 22の培養ユニットにおける分ィ匕誘導間欠式灌流培養工程の処理 動作を示すフローチャートである。
[図 24]図 23の処理動作の続きを示すフローチャートである。
圆 25]本発明に係る細胞培養システムにおける第 3の実施の形態を示す構成図であ る。
圆 26]本発明に係る細胞培養装置の第 4の実施の形態を示す構成図である。
圆 27]第 4の実施の形態に係る細胞培養装置における一つの空間的に独立した培 養室と低温室、この培養室内に収納される培養バッグトレイと低温室に収納される培 地バッグ ·廃液バッグトレイカもなる培養ユニットの構成を示すレイアウト図である。
[図 28]図 27の載置台の構成を示す斜視図である。
圆 29]第 4の実施の形態の変形例に係る載置台の構成を示す平面図であり、 (a)は 昇降しないパーツとすべての面積変化パーツが同一平面上にある状態を示す図、 ( b)は面積変化パーツを下降させた状態を示す図である。
[図 30]図 29 (a)の ΠΙΧ— ΠΙΧ線に沿った一部断面図であって、（a)は面積変化パー ッを下降させて、昇降しないパーツと面積変化パーツを、階段状に、別の平面上に 配置した状態を示す図、（b)は 4つの面積変化パーツのうち 3つの面積変化パーツが 同一平面上にある状態を示す図、 (c)は昇降しないパーツとすべての面積変化パー ッが同一平面上にある状態を示す図である。
[図 31]図 27の培養ユニットにおける抗体刺激間欠式灌流培養工程において、培養 バッグに細胞を回収する処理が含まれる場合の処理動作を示すフローチャートであ る。
[図 32]図 31の処理動作の続きを示すフローチャートである。
[図 33]図 27の培養ユニットにおける抗体刺激間欠式灌流培養工程にぉ ヽて、細胞 回収バッグに細胞を回収する処理が含まれる場合の処理動作を示すフローチャート である。
[図 34]図 33の処理動作の続きを示すフローチャートである。
圆 35]図 27の培養ユニットにおける抗体刺激連続式灌流培養工程の処理動作を示 すフローチャートである。 [図 36]図 35の処理動作の続きを示すフローチャートである。
[図 37]図 27の培養ユニットにおける抗体刺激単純流加培養工程の処理動作を示す フローチャートである。
[図 38]図 37の処理動作の続きを示すフローチャートである。
[図 39]図 27の培養ユニットにおける抗体刺激単純流加培養工程において、細胞回 収バッグにより細胞を回収する処理が含まれる場合の処理動作を示すフローチャート である。
[図 40]図 39の処理動作の続きを示すフローチャートである。
符号の説明
10 細胞培養装置 (細胞培養システム）
11 恒温槽
12 培養ユニット
13 運転制御盤
14 画像処理用コンピュータ
15 監視用コンピュータ
16 キヤニスタ
17 培養カセット
18 培養バッグ (増殖用培養容器）
19 細胞接種カセット (機能発現用培養容器、誘導因子刺激用培養容器)
20 培地カセット (培地貯溜手段）
46 載置台
47 培養バッグトレイ
48 第 1ポンプ
49 第 2ポンプ
65 誘導因子刺激容器
67 培地バッグ (培地貯溜容器）
68 使用済み培地バッグ (使用済み培地貯溜容器）
72 細胞回収バッグ (細胞回収容器） 80 振盪装置
85 作動板
86 突出部
87 照明用 LED
88 CCDカメラ（画像取得手段）
89 画像メモリ回路
91 振盪機構 (押圧手段）
94 培養室
95 監視室 100 細胞培養装置
101 分化誘導カセット (分化誘導用培養容器）
104 公衆通信回線
105 遠隔監視用コンピュータ
200 細胞培養装置
212 培養ユニット
221 画像処理用ユニット
230 低温室
231 培地バッグトレイ
232 廃液バッグトレイ
233 培地バッグ (培地貯溜手段、培地貯溜容器）
234 廃液バッグ (廃液貯溜手段、使用済み培地貯溜容器)
240 培養室
241 培養バッグトレイ
242 培養バッグ (抗体刺激用培養容器、増殖用培養容器)
252 載置台
252b 面積変化パーツ
252c 面積変化パーツ
261 供給ポンプ
271 出ポンプ 290 振盪装置
291 振盪機構
291a 作動板 (押圧手段）
291b 突出部
302 CCDカメラ (画像取得手段)
352 載置台
354 面積変化パーツ
355 面積変化パーツ
356 面積変化パーツ
357 面積変化パーツ
370 高さ調整板

Claims

請求の範囲
[1] 細胞を培養する培養容器と、
この培養容器へ供給される培地を貯溜する培地貯溜手段と、
上記培養容器内の細胞の画像を取得する画像取得手段と、
この画像取得手段にて取得した細胞の画像から当該細胞の培養状況を判定し、こ の判定に基づき培養操作を実行させる制御手段と、を有することを特徴とする細胞培 養装置。
[2] 上記培養容器は、細胞を増殖するための増殖用培養容器と、細胞に機能を発現さ せるための機能発現用培養容器とであり、この機能発現用培養容器内の細胞の画 像を画像取得手段が取得することを特徴とする請求項 1に記載の細胞培養装置。
[3] 上記機能発現用培養容器は、増殖のために誘導因子により細胞を刺激する誘導 因子刺激用培養容器であり、
制御手段は、上記誘導因子刺激用培養容器内の細胞の画像に基づき、細胞の増 殖可能性と細胞の増殖能力を判定し、上記誘導因子刺激用培養容器から増殖用培 養容器へ細胞を移行させるタイミング、培地貯溜手段カゝら上記増殖用培養容器への 培地の供給などの培養操作を制御することを特徴とする請求項 2に記載の細胞培養 装置。
[4] 上記機能発現用培養容器は、細胞を分化させる分化誘導用培養容器であり、 制御手段は、上記分化誘導用培養容器内の細胞の画像に基づき、分化誘導操作 を制御することを特徴とする請求項 2に記載の細胞培養装置。
[5] 上記培地貯溜手段はカセット構造に構成されて、培養容器に接続されることを特徴 とする請求項 1乃至 4のいずれかに記載の細胞培養装置。
[6] 上記機能発現用培養容器はカセット構造に構成されて、増殖用培養容器及び培 地貯溜手段に接続されることを特徴とする請求項 5に記載の細胞培養装置。
[7] 上記培地貯溜手段、機能発現用培養容器及び増殖用培養容器が閉鎖系にて構 成されたことを特徴とする請求項 2乃至 6のいずれかに記載の細胞培養装置。
[8] 上記増殖用培養容器には液溜り部が形成可能に設けられ、当該増殖用培養容器 内での培養初期段階で、上記液溜り部に細胞及び培地が貯溜されることを特徴とす る請求項 2乃至 7のいずれかに記載の細胞培養装置。
[9] 上記増殖用培養容器内で増殖された細胞を機能発現用培養容器内へ導き、この 細胞の画像が画像取得手段により取得されることを特徴とする請求項 2乃至 8のいず れかに記載の細胞培養装置。
[10] 上記培地貯溜手段には、使用済み培地を貯溜可能な使用済み培地貯溜容器が、 培養容器へ供給する培地を貯溜可能な培地貯溜容器と共に設置され、増殖用培養 容器内の使用済み培地が上記使用済み培地貯溜容器に排出されて貯溜されるよう 構成されたことを特徴とする請求項 2乃至 9のいずれかに記載の細胞培養装置。
[11] 上記培地貯溜手段には、細胞を回収する細胞回収容器が装着可能とされ、増殖用 培養容器内で濃縮された細胞が上記細胞回収容器内に回収されるよう構成されたこ とを特徴とする請求項 2乃至 10のいずれかに記載の細胞培養装置。
[12] 上記細胞が浮遊系細胞であることを特徴とする請求項 1乃至 11のいずれかに記載 の細胞培養装置。
[13] 上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とする請求項 1乃至 12のいずれ かに記載の細胞培養装置。
[14] 細胞を培養する培養容器内の細胞の画像を画像取得手段が取得し、
この画像取得手段にて取得した細胞の画像から当該細胞の培養状況を判定し、 この判定に基づき上記培養容器へ培養操作を実行することを特徴とする細胞培養 方法。
[15] 上記培養容器は、細胞を増殖するための増殖用培養容器と、細胞に機能を発現さ せるための機能発現用培養容器とであり、この機能発現用培養容器内の細胞の画 像を画像取得手段が取得することを特徴とする請求項 14に記載の細胞培養方法。
[16] 上記機能発現用培養容器は、増殖のために誘導因子により細胞を刺激する誘導 因子刺激用培養容器であり、
上記誘導因子刺激用培養容器内の細胞の画像に基づき、細胞の増殖可能性と細 胞の増殖能力を判定し、上記誘導因子刺激用培養容器から増殖用培養容器へ細胞 を移行させるタイミング、培地貯溜手段カゝら上記増殖用培養容器への培地の供給な どの培養操作を実行することを特徴とする請求項 15に記載の細胞培養方法。
[17] 上記機能発現用培養容器は、細胞を分化させる分化誘導用培養容器であり、 上記分化誘導用培養容器内の細胞の画像に基づき、分化誘導操作を実行するこ とを特徴とする請求項 15に記載の細胞培養方法。
[18] 上記増殖用培養容器内での培養初期段階では、上記増殖用培養容器の液溜り部 に細胞及び培地を貯溜することを特徴とする請求項 15乃至 17のいずれかに記載の 細胞培養方法。
[19] 上記増殖用培養容器内で増殖された細胞を機能発現用培養容器内へ導き、この 細胞の画像を画像取得手段が取得することを特徴とする請求項 15乃至 18のいずれ かに記載の細胞培養方法。
[20] 上記増殖用培養容器内の使用済み培地を、培地貯溜手段の使用済み培地貯溜 容器に排出することを特徴とする請求項 15乃至 19のいずれかに記載の細胞培養方 法。
[21] 上記増殖用培養容器内で濃縮された細胞を、培地貯溜手段の細胞回収容器内に 回収することを特徴とする請求項 15乃至 20のいずれかに記載の細胞培養方法。
[22] 上記細胞が浮遊系細胞であることを特徴とする請求項 14乃至 21のいずれかに記 載の細胞培養方法。
[23] 上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とする請求項 14乃至 22の 、ず れかに記載の細胞培養方法。
[24] 細胞の培養を実行するためにコンピュータに記憶した細胞培養プログラムであって 細胞を培養する培養容器内の細胞の画像を画像取得手段が取得する手順と、 この画像取得手段にて取得した細胞の画像から当該細胞の培養状況を判定する 手順と、
この判定に基づき上記培養容器へ培養操作を実行する手順と、を有することを特 徴とする細胞培養プログラム。
[25] 細胞の培養を実行するためにコンピュータに記憶した細胞培養プログラムであって 細胞に機能を発現させるための機能発現用培養容器内の細胞の画像を画像取得 手段が取得する手順と、
この画像取得手段にて取得した細胞の画像から当該細胞の培養状況を判定する 手順と、
この判定に基づき上記機能発現用培養容器、及び Zまたは細胞を増殖するための 増殖用培養容器へ培養操作を実行する手順と、を有することを特徴とする細胞培養 プログラム。
[26] 上記培養容器は載置台に載置され、上記載置台の一部を昇降させることにより培 養面積を変化させることを特徴とする請求項 1乃至請求項 3のうち、いずれ力 1に記 載の細胞培養装置。
[27] 単純流加培養及び灌流培養の一方を選択可能であることを特徴とする請求項 1乃 至請求項 13のうち、いずれか 1に記載の細胞培養装置。
[28] 間欠式灌流培養及び連続式灌流培養の一方を選択可能であることを特徴とする請 求項 27に記載の細胞培養装置。
[29] 上記培養容器は載置台に載置され、上記載置台の一部を昇降させることにより培 養面積を変化させることを特徴とする請求項 14乃至請求項 16のうち、いずれか 1に 記載の細胞培養方法。
[30] 単純流加培養及び灌流培養の一方を選択可能であることを特徴とする請求項 14 乃至請求項 23のうち、 V、ずれか 1に記載の細胞培養方法。
[31] 間欠式灌流培養及び連続式灌流培養の一方を選択可能であることを特徴とする請 求項 30に記載の細胞培養方法。
[32] 細胞を培養し、その培養を監視し管理する細胞培養システムであって、
細胞を培養する培養容器をそれぞれ配設する複数の培養ユニットが互いに隔離し て配置され、上記培養ユニット毎に独立した培養環境下で細胞を培養する恒温槽と この恒温槽の上記培養ユニット毎に、細胞の培養に関する細胞培養関連データを 収集して蓄積し、上記細胞培養関連データに基づき上記培養ユニット毎に、細胞の 培養状態を監視し、細胞の培養操作を管理する管理手段と、を有することを特徴とす る細胞培養システム。
[33] 上記管理手段は、恒温槽と共に培養室内に設置され、上記恒温槽の各培養ュニッ トにおける培養を制御する機能を兼ね備えた運転制御盤と、
上記培養室以外に設置され、上記運転制御盤が有するデータを受信して表示する 監視用コンピュータと、を有して構成されたことを特徴とする請求項 32に記載の細胞 培養システム。
[34] 上記細胞培養関連データは、細胞、培地、培養容器、恒温槽、培養ユニット及び操 作者の識別符号と、恒温槽及び培養ユニット内の培養環境データと、培養容器内の 細胞の画像データとの少なくとも 1つであることを特徴とする請求項 32または 33に記 載の細胞培養システム。
[35] 上記恒温槽が複数台設置され、各恒温槽に運転制御盤が接続されると共に、これ ら複数台の運転制御盤に 1台の監視用コンピュータが接続されたことを特徴とする請 求項 33または 34に記載の細胞培養システム。
[36] 上記監視用コンピュータに、公衆通信回線を経て遠隔監視用コンピュータが接続さ れたことを特徴とする請求項 33乃至 35のいずれかに記載の細胞培養システム。
[37] 上記培養ユニットを構成する恒温槽のキヤ-スタは、それぞれが、細菌などの出入 りのない状態に隔離されて構成されたことを特徴とする請求項 32乃至 36のいずれか に記載の細胞培養システム。
[38] 上記培養ユニットを構成する恒温槽のキヤ-スタには、上記恒温槽内の空気を上 記キヤ-スタへ導くファンが設置され、 1つの恒温槽における全てのキヤ-スタの上記 ファンは、当該恒温槽のドアが開放されたときに停止するよう構成されたことを特徴と する請求項 32乃至 37のいずれかに記載の細胞培養システム。
[39] 上記培養ユニットを構成する恒温槽のキヤ-スタでは、 1つの恒温槽における各キ ヤニスタのドアが、 V、ずれ力 1枚のみ開放されるよう構成されたことを特徴とする請求 項 32乃至 38のいずれかに記載の細胞培養システム。
[40] 上記細胞が浮遊系細胞であることを特徴とする請求項 32乃至 39の 、ずれかに記 載の細胞培養システム。
[41] 上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とする請求項 32乃至 40の 、ず れかに記載の細胞培養システム。
[42] 細胞を培養し、その培養を監視し管理する細胞培養方法であって、 細胞を培養する培養容器をそれぞれ配設する複数の培養ユニットが互いに隔離し て配置され、上記培養ユニット毎に独立した培養環境下で細胞を培養する恒温槽を 用いて、
この恒温槽の上記培養ユニット毎に、細胞の培養に関する細胞培養関連データを 収集して蓄積し、上記細胞培養関連データに基づき上記培養ユニット毎に、細胞の 培養状態を監視し、細胞の培養操作を管理することを特徴とする細胞培養方法。
[43] 上記細胞培養関連データは、細胞、培地、培養容器、恒温槽、培養ユニット及び操 作者の識別符号と、恒温槽及び培養ユニット内の培養環境データと、培養容器内の 細胞の画像データとの少なくとも 1つであることを特徴とする請求項 42に記載の細胞 培養方法。
[44] 上記細胞が浮遊系細胞であることを特徴とする請求項 42または 43の 、ずれかに 記載の細胞培養方法。
[45] 上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とする請求項 42乃至 44の 、ず れかに記載の細胞培養方法。
[46] 細胞を培養し、その培養を監視し管理するためにコンピュータに記憶した細胞培養 プログラムであって、
細胞を培養する培養容器をそれぞれ配設する複数の培養ユニットが互いに隔離し て配置され、上記培養ユニット毎に独立した培養環境下で細胞を培養する恒温槽の 上記培養ユニット毎に、細胞の培養に関する細胞培養関連データを収集して蓄積す る手川頁と、
上記細胞培養関連データに基づき上記培養ユニット毎に細胞の培養状態を監視 する手順と、
上記細胞培養関連データに基づき上記培養ユニット毎に細胞の培養操作を管理 する手順と、を有することを特徴とする細胞培養プログラム。
[47] 細胞を培養する複数の培養容器が順次接続され、
各培養容器は、異なる培養環境で細胞を培養して、下流側の上記培養容器へ培 養した細胞を移行して培養する構成としたことを特徴とする細胞培養装置。
[48] 上記培養容器は 2個設置され、一の培養容器が細胞に機能を発現させる培養環境 を有する機能発現用培養容器であり、他の培養容器が細胞を増殖させる培養環境を 有する増殖用培養容器であることを特徴とする請求項 47に記載の細胞培養装置。
[49] 上記機能発現用培養容器は、増殖のために誘導因子により細胞に刺激を与える培 養環境を有する誘導因子刺激用培養容器であることを特徴とする請求項 48に記載 の細胞培養装置。
[50] 上記機能発現用培養容器は、増殖した細胞を分化させる培養環境を有する分ィ匕 誘導用培養容器であることを特徴とする請求項 48に記載の細胞培養装置。
[51] 上記細胞は浮遊系細胞であることを特徴とする請求項 47乃至 50のいずれかに記 載の細胞培養装置。
[52] 上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とする請求項 47乃至 51のいず れかに記載の細胞培養装置。
[53] 複数の培養容器にぉ ヽてそれぞれ異なる培養環境で細胞を培養させ、
一の培養容器で培養した細胞を下流側の他の培養容器へ順次移行して培養を実 施することを特徴とする細胞培養方法。
[54] 上記培養容器は 2個であり、一の培養容器で増殖のために誘導因子により細胞を 刺激した後に、他の培養容器で細胞を増殖させることを特徴とする請求項 53に記載 の細胞培養方法。
[55] 上記培養容器は 2個であり、一の培養容器で細胞を増殖させた後に、他の培養容 器で細胞を分化させることを特徴とする請求項 53に記載の細胞培養方法。
[56] 上記細胞は浮遊系細胞であることを特徴とする請求項 53乃至 55のいずれかに記 載の細胞培養方法。
[57] 上記細胞が免疫細胞療法で使用されることを特徴とする請求項 53乃至 56のいず れかに記載の細胞培養方法。
[58] 細胞を培養する培養容器と、
上記培養容器を載置する載置台と、を備えた細胞培養装置であって、 上記載置台は昇降可能な部分を有し、
上記昇降可能な部分が昇降することにより、載置された培養容器の培養可能な面 積が変化することを特徴とする細胞培養装置。
[59] 上記細胞が浮遊系細胞であることを特徴とする請求項 58に記載の細胞培養装置。
[60] 上記細胞が免疫細胞療法に使用されることを特徴とする請求項 58又は請求項 59 に記載の細胞培養装置。
[61] 上記培養容器に、この培養容器へ供給される培地を貯溜する培地貯留手段が接 続されて!、ることを特徴とする請求項 58乃至請求項 60のうち、 V、ずれか 1に記載の 細胞培養装置。
[62] 上記培地貯溜手段、培養容器が閉鎖系にて構成されたことを特徴とする請求項 61 に記載の細胞培養装置。
[63] 上記培地貯溜手段には、使用済み培地を貯溜可能な使用済み培地貯溜容器が、 培養容器へ供給する培地を貯溜可能な培地貯溜容器と共に設置され、増殖用培養 容器内の使用済み培地を上記使用済み培地貯溜容器に排出し貯溜するよう構成さ れたことを特徴とする請求項 61又は請求項 62に記載の細胞培養装置。
[64] 上記培養容器内の細胞の画像を取得するための画像撮影手段と、前記画像取得 手段にて取得した細胞の画像から当該細胞の培養状況を判定し、この判定に基づき 培養操作を実行する制御手段と、を備えることを特徴とする請求項 58乃至請求項 63 のうち、いずれか 1に記載の細胞培養装置。
[65] 上記培養容器は、細胞を増殖するための増殖用培養容器と、細胞に機能を発現さ せるための機能発現用培養容器とであり、この機能発現用培養容器内の細胞の画 像を画像取得手段が取得することを特徴とする請求項 58に記載の細胞培養装置。
[66] 上記機能発現用培養容器は、増殖のために誘導因子により細胞を刺激する誘導 因子刺激用培養容器であり、制御手段は、上記誘導因子刺激用培養容器内の細胞 の画像に基づき、細胞の増殖可能性と細胞の増殖能力を判定し、培養可能な面積 を変化させるタイミング、培地貯溜手段力 上記増殖用培養容器への培地の供給な どの培養操作を制御することを特徴とする請求項 65に記載の細胞培養装置。
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