JP2004357523A - 細胞培養検出装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】生細胞への負担を低減すると共に、生細胞から蛍光強度等の特徴量を正確且つリアルタイムに測定すること。
【解決手段】細胞Ａを培養液Ｗと共に収容する培養容器１０と、細胞Ａを所定の培養条件で培養する培養手段２０と、培養中の細胞Ａから該細胞Ａの特徴量を検出する検出手段３０と、前記特徴量を検出しないときに培養容器１０を環境光Ｌから遮断する光遮断手段４０とを備えている細胞培養検出装置１を提供する。
【選択図】 図１
【解決手段】細胞Ａを培養液Ｗと共に収容する培養容器１０と、細胞Ａを所定の培養条件で培養する培養手段２０と、培養中の細胞Ａから該細胞Ａの特徴量を検出する検出手段３０と、前記特徴量を検出しないときに培養容器１０を環境光Ｌから遮断する光遮断手段４０とを備えている細胞培養検出装置１を提供する。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、培養中の細胞の反応による情報を検出する細胞培養検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子技術の進歩に伴って、人を含む多くの生物における遺伝子配列が明らかになると共に、解析されたタンパク質等の遺伝子産物と疾病との因果関係も少しずつ解明され始めている。また、今後さらに、各種タンパク質や遺伝子等を網羅的且つ統計的に解析するため、細胞を用いた様々な検査方法や装置が考えられ始めている。特に、上記解析を行なうには、細胞を長期間培養しながら、所定の情報を検出することが必要である。そのため、顕微鏡下で細胞を培養し、観察することが可能な装置が求めれられている。
【０００３】
このような装置の１つとして、各種の細胞の培養条件を設定可能な顕微鏡観察用透明恒温培養容器を使用する装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。
この顕微鏡観察用透明恒温培養容器は、温度調節器により所定温度に制御可能な一対の透明発熱プレート、容器内部の二酸化炭素濃度を調整するための二酸化炭素供給口及び二酸化炭素排出口、シール用パッキンにより密閉された容器内に所定湿度を保つための蒸発皿を有している。
この顕微鏡観察用透明恒温培養容器を使用しての観察では、容器内部の温度、二酸化炭素濃度及び湿度を制御可能であるので、細胞培養しながら観察を行なうことが可能である。即ち、透明発熱プレートの下方から、例えば、対物レンズで観察することにより、細胞の培養状態の経時的変化等を観察することが可能である。
【０００４】
従って、上記顕微鏡観察用透明恒温培養容器を利用した観察によれば、生物、生殖又はバイオテクノロジー等の研究分野において、各種の細胞の培養状態の観察、写真撮影等の記録を行なう際に、顕微鏡観察を行ないながら温度、二酸化炭素濃度及び湿度を自由に制御して培養状態を各種設定し、その経時的変化の観察及び記録が連続的且つ簡便に行なうことができる。
特に、細胞は、遺伝子等とは異なり、生きている状態での蛍光検出、例えば、細胞内でのＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）発現の検出等が測定手法として多用されているため、細胞を培養するための環境条件の管理が、正確な測定結果を得るための重要な項目となっている。従って、長時間の顕微鏡観察により細胞を死滅させないように、顕微鏡下に配置する培養容器、例えば、プラスチック製又はガラス製のディッシュ、シャーレ等は、上述したように温度及び二酸化炭素濃度の管理が必須とされている。
【０００５】
また、細胞は、種類に応じて様々な性質を有しており、例えば、外部環境の変化に対して非常に弱い性質を有する細胞がある。該細胞は、例えば、温度上昇の急激な昇温動作や偏った温度分布等が原因で簡単に死滅する場合がある。細胞種類によっても異なるが、細胞を培養する条件として、一般に温度３７±０．５℃、二酸化炭素濃度３〜８％を一定に維持することが必要とされている。また、温度や二酸化炭素濃度等だけでなく、これ以外の管理環境項目も無視することはできない。例えば、太陽光や室内光等の光の影響も重要な管理項目の１つである。つまり、長時間の光照射による光毒性が、細胞内の活性酸素を上昇させて該細胞の育成に影響を与えてしまう。また、細胞の長期間培養においては、塵埃等の混入を発生させずに細胞培養液の半バッチ交換等を行なうことも重要な培養環境条件の管理項目である。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１０−２８５７６号公報（段落番号０００４−０００７、図１−図４）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記特許文献１記載の顕微鏡観察用透明恒温培養容器を利用した観察では、温度、二酸化炭素濃度及び湿度を任意に制御して、細胞を培養しながら観察を行なうことができるが、例えば、室内の光が容易に細胞に照射して細胞に負担がかかったり、培養液の交換の際、塵埃等が混入する可能性があった。そのため、細胞を長期間培養することが困難であると共に、細胞から正確な蛍光強度等の情報を検出することが難しかった。
【０００８】
この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、その目的は、生細胞への負担を低減すると共に、生細胞から蛍光強度等の特徴量を正確且つリアルタイムに測定することができる細胞培養検出装置を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、細胞を培養液と共に収容する培養容器と、前記細胞を所定の培養条件で培養する培養手段と、培養中の前記細胞から該細胞の特徴量を検出する検出手段と、前記特徴量を検出しないときに、前記培養容器を環境光から遮断する光遮断手段とを備えている細胞培養検出装置を提供する。
【００１０】
この発明に係る細胞培養検出装置においては、培養手段により、細胞を培養容器内で所定の培養条件、例えば、温度３７℃、二酸化炭素濃度５％を維持しながら培養を行えると共に、培養しながら検出手段により細胞の特徴量、例えば、細胞画像や蛍光標識による蛍光強度等をリアルタイムで測定が行なえる。また、細胞の特徴量検出を行なわないときは、光遮断手段により培養容器を室内光等の環境光から遮断するので、培養容器内の細胞に光が照射されることはない。これにより、光照射による光毒性の影響を低減するので、生細胞にかかる負担を低減することができる。従って、細胞を培養容器内で確実に長期間培養することができ、培養中の細胞から蛍光強度等の特徴量を正確且つリアルタイムに測定することができる。
【００１１】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の細胞培養検出装置において、前記光遮断手段が、前記培養容器の周囲を遮光する遮光ユニットと、前記培養容器を前記遮光ユニットの内部に搬送する培養容器搬送手段とを備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、細胞の特徴量測定を行う測定時以外、培養容器は光が遮断された状態で遮光ユニット内に収容されている。つまり、培養容器内の生細胞は、遮光ユニットにより完全に環境光から遮断されているので、光毒性の影響がなくなり細胞の長期間の生存が可能となる。また、測定終了後、培養容器搬送手段により、培養容器を移動させるだけで容易に遮光ユニット内に収容できるので、光毒性の影響を可能な限り低減することができる。
【００１２】
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の細胞培養検出装置において、前記光遮断手段が、前記培養容器の周囲を遮光する遮光ユニットと、該遮光ユニットを前記培養容器の周囲に搬送する遮光ユニット搬送手段とを備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、細胞の特徴量測定を行う測定時以外、培養容器は光が遮断された状態で遮光ユニット内に収容されているので、光毒性の影響がなくなり生細胞の長期間の生存が可能となる。また、測定終了後、遮光ユニット搬送手段により遮光ユニットを移動させるだけで、容易に培養容器の周囲に位置できるので、光毒性の影響を可能な限り低減することができる。また、培養容器を移動する必要がないので、より細胞の負担が低減する。
【００１３】
請求項４に係る発明は、請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞培養検出装置において、前記培養手段が、前記培養液を循環する循環ポンプと、前記培養液を攪拌して、該培養液内の二酸化炭素を所定濃度に維持する攪拌ユニットと、前記培養液の温度を制御する培養液加温ユニットとを備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、循環ポンプにより培養容器内の培養液を循環するので、細胞から排出される相互作用物質を完全に入れ替えずに、個々の細胞育成に必要な細胞間相互作用を維持した培養が行なえると共に、随時細胞に栄養素の供給を行なえる。また、攪拌ユニットにより、培養液の二酸化炭素濃度を最適な培養濃度（例えば５％）で均一に維持することができ、培養液加温ユニットにより、培養液の温度を制御して、培養容器の温度を最適温度（例えば３７℃）に維持することができる。従って、細胞にかける負担を確実に低減して培養を行なうことができる。
【００１４】
請求項５に係る発明は、請求項４に記載の細胞培養検出装置において、前記循環ポンプが、圧力変動を発生せずに前記培養液を送液する無脈動循環ポンプである細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、シリンジピストンポンプ等の無脈動循環ポンプにより、圧力変動を与えずに培養液を送液するので、培養容器内の細胞に不要な圧力波動を与えることはない。これにより、例えば、細胞の剥離や培養容器内面への接着性に影響を与えることはない。従って、培養液の圧力変化による細胞への負担を低減でき、長期間培養が可能となる。
【００１５】
請求項６に係る発明は、細胞を培養液と共に収容する培養容器と、前記細胞を所定の培養条件で培養する培養手段と、培養中の前記細胞から該細胞の特徴量を検出する検出手段とを備え、前記培養手段が、前記培養容器の温度を測定する温度センサと、前記培養容器を加温する培養容器加温ユニット若しくは前記培養容器内に前記培養液を供給又は排出する配管を加温する配管加温ユニット若しくは前記培養液を加温する培養液加温ユニットの少なくともいずれか１つを有する加温手段を有し、前記温度センサで測定した温度に基づいて前記加温手段を所定温度になるよう温度制御する細胞培養検出装置を提供する。
【００１６】
この発明に係る細胞培養検出装置においては、温度センサで測定した温度に基づいて加温手段を温度制御するので、培養容器の温度を高精度に所定温度（例えば、３７℃）に維持することができる。つまり、培養容器加温ユニットにより直接的に培養容器を加温したり、配管加温ユニットにより供給又は排出用の配管を介して配管内部の培養液を加温し、該培養液によって培養容器を加温したり、培養液加温ユニットにより培養液自体を加温して培養容器を加温する。このようにして、培養容器を所定温度に維持することで、培養容器内の細胞への温度による負担を低減することができる。また、培養容器加温ユニット、配管加温ユニット及び培養液加温ユニットを適時組み合わせることにより、より確実に培養容器を所定温度に維持することができる。
【００１７】
請求項７に係る発明は、細胞を培養液と共に収容する培養容器と、前記細胞を所定の培養条件で培養する培養手段と、培養中の前記細胞から該細胞の特徴量を検出する検出手段とを備え、前記培養手段が、前記培養容器の温度を測定する温度センサと、前記培養容器を加温する培養容器加温ユニットを有し、該培養容器加温ユニットが、前記温度センサで測定した温度に基づいて温風を前記培養容器の外表面に向けて送風する細胞培養検出装置。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、温度センサで測定した温度に基づいて、培養容器加温手段により培養容器の外表面に直接温風を送風するので、培養容器の温度を均一に所定温度、例えば３７℃に維持することが可能である。このように培養容器を所定温度に維持することで、培養容器内の細胞への温度による負担を低減することができる。
【００１８】
請求項８に係る発明は、請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞培養検出装置において、前記培養液の自家蛍光量を測定する測定手段と、該測定手段による測定結果に基づいて、前記培養液が劣化しているか否かを判別する判別手段とを備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、測定手段により、細胞を培養している間の培養液の劣化状態を測定が行なえる。つまり、培養中の培養液には、細胞からの老廃物等が蓄積し経時的に劣化し始めている。この劣化状態を自家蛍光量として測定している。即ち、自家蛍光量が増加すれば、劣化が進行していることとなる。よって、判別手段により測定した自家蛍光量を、例えば、閾値等と比較することにより、培養液が劣化しているか否かを判別することができる。従って、培養過程において、培養液の劣化を定量的に判別しながら細胞培養を行なえるので、培養液劣化による細胞への負担を低減することができ、長期間の培養を行なうことができる。
【００１９】
請求項９に係る発明は、請求項８に記載の細胞培養検出装置において、前記判別手段が、前記培養液が劣化していると判断したときに、自動的に該培養液を交換又は補充する培養液交換手段を備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、培養液交換手段により、培養液を劣化していない最適な状態に自動的に維持しながら、細胞培養を行なえる。従って、常に最適な培養液中で培養でき、培養液の劣化による細胞への負担をより低減することができる。
【００２０】
請求項１０に係る発明は、請求項８又は９に記載の細胞培養検出装置において、前記判別手段が、前記培養液が劣化していると判断したときに、警報を発する報知手段を備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、報知手段により、細胞を培養している際に、培養液が劣化したことを正確且つ容易に知ることができ、培養液の交換等必要な処理を効率良く行なえる。従って、常に最適な培養液中で培養でき、培養液の劣化による細胞への負担をより低減することができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る細胞培養検出装置の第１実施形態について図１から図６を参照して説明する。
本実施形態の細胞培養検出装置１は、図１に示すように、細胞Ａを培養液Ｗと共に収容する培養容器１０と、該細胞Ａを所定の培養条件で培養する培養手段２０と、培養中の細胞Ａから該細胞Ａの特徴量を検出する検出手段３０と、該特徴量を検出しないときに培養容器１０を環境光Ｌから遮断する光遮断手段４０と、培養液Ｗの自家蛍光量を測定する測定手段５０と、該測定手段５０による測定結果に基づいて培養液Ｗが劣化しているか否かを判別する判別部（判別手段）６０とを備えている。
上記培養容器１０は、図１及び図２に示すように、該培養容器１０よりも十分大きい矩形形状に形成された筐体１００の内部に収納されている。また、この筐体１００は、図示しない倒立顕微鏡のＸＹステージ上に固定されている。これにより、培養容器１０及び筐体１００は、ＸＹステージのＸＹ走査に同期して水平方向に移動可能とされている。なお、この筐体１００については、後に詳しく説明する。
【００２２】
培養容器１０は、図３に示すように、細胞毒性を有しない材質、例えば、テフロン（登録商標）、ＰＥＥＫ（登録商標）や耐食性ステンレス等で形成された培養容器上枠１１及び培養容器下枠１２が、Ｏリング１３を介して図示しないネジ等の締結部材により互いに上下方向に接続されることにより、内部空間１４を有する箱形状に構成されている。また、培養容器上枠１１及び培養容器下枠１２には、それぞれ光学的な平面を有するガラス部材１５が、細胞毒性を有しない接着剤等により接合されている。即ち、培養容器１０の上下面は、一対のガラス部材１５で覆われている。なお、一対のガラス部材１５を接着している接着剤は、オートクレープ条件（１２０℃、４気圧等）に耐えうる接着剤が好ましい。
また、培養容器下枠１２の両側には、それぞれ内部空間１４内に培養液Ｗを供給する培養液供給口１２ａ、及び内部空間１４から培養液Ｗを排出する培養液排出口１２ｂが形成されている。
【００２３】
上記培養手段２０は、図１及び図２に示すように培養液Ｗを循環させるシリンジピストンポンプ（循環ポンプ）７１、培養液Ｗを攪拌して該培養液Ｗ内の二酸化炭素を所定濃度に維持する攪拌ユニット７２、培養容器１０の温度を測定する温度センサ７３及び培養容器１０を加温する加温手段９０を備えている。また、該加温手段９０は、培養容器１０内に培養液Ｗを供給又は排出する配管を加温する筒形状ヒータ（配管加温ユニット）９１、培養液Ｗを加温する培養液タンクヒータ（培養液加温ユニット）９２、培養容器１０を加温する培養容器加温ユニット９３を有している。
【００２４】
ここで、図３に示すように、培養容器１０の培養液供給口１２ａには、フレキシブルに形成された培養液供給配管７４ａの一端が接続されており、培養液排出口１２ｂには、フレキシブルに形成された培養液排出配管７４ａの一端が接続されている。上記培養液供給配管７４ａの他端は、図１に示すように、培養液タンク７５内に保持されている培養液Ｗに浸漬されている。即ち、培養液供給配管７４ａの他端は、培養液Ｗの供給口７６ａとされている。また、上記培養液排出配管７４ｂの他端は、上記シリンジピストンポンプ７１を介在して培養液タンク７５内に挿通されている。即ち、培養液排出配管７４ｂの他端は、培養液Ｗの排出口７６ｂとされている。
【００２５】
上記シリンジピストンポンプ７１は、圧力変動を発生せずに培養液Ｗを送液する無脈動循環ポンプであり、内部に上下移動なピストン７１ａを有している。また、培養液排出配管７４ｂには、シリンジピストンポンプ７１を挟んで電磁弁８０、８１が介在されている。一方の電磁弁８０は、培養液タンク側７５に介在され、他方の電磁弁８１は、培養容器１０側に介在されている。これら、ピストン７１ａ及び両電磁弁８０、８１は、パーソナルコンピュータ（以下ＰＣ）１２０によって総合的に制御されている。
例えば、一方の電磁弁８０を閉状態、他方の電磁弁８１を開状態としてシリンジピストンポンプ７１内に培養液Ｗを充填するようにピストン７１ａを作動（紙面に対して上方向）させると、供給口７６ａから培養液Ｗが吸い込まれ、培養容器１０の内部空間１４内に培養容器供給配管７４ａから培養液Ｗを供給する流れとなる。
このように、培養液Ｗは、シリンジピストンポンプ７１及び両電磁弁８０、８１により、供給口７６ａから培養液供給配管７４ａ内を流れて培養容器１０内に供給された後、培養液排出配管７４ｂを流れて排出口７６ｂから再び培養液タンク７５に戻ってくる循環式とされている。
また、培養液Ｗの流速は、ピストン７１ａの移動速度を変化させることで、任意の流速、例えば、１ｍｌ／３０ｍｉｎ程度の低速度等の流速に自由に設定することが可能である。なお、上述したタイミングを反転させることにより、培養液Ｗの供給排出方向を切り替えることも可能である。
【００２６】
上記培養液タンク７５は、熱伝導性に優れた材料、例えば、耐食性ステンレスやガラス等で内部を密閉するように形成されている。また、培養液タンク７５には、内部に新たな培養液Ｗを供給するタンク供給配管８２及び培養液タンク７５から培養液Ｗを排出するタンク排出配管８３が設けられている。なお、タンク排出配管８３は、培養液タンク７５の底面付近に位置するように設けられている。上記タンク供給配管８２は、基端が図示しない培養液供給源に接続されており、タンク供給ポンプ８２ａにより培養液Ｗを培養液供給源から培養液タンク７５内に供給可能とされている。また、タンク排出配管８３は、基端が図示しない排出タンクに接続されており、タンク排出ポンプ８３ａにより培養液Ｗを培養液タンク７５から排出可能とされている。
上記タンク供給ポンプ８２ａ及びタンク排出ポンプ８３ａは、ＰＣ１２０によって駆動が制御されており、ＰＣ１２０からの信号を受けて自動的に培養液タンク７５内の培養液Ｗを交換したり、補充することが可能である。
【００２７】
また、上述した培養液供給配管７４ａ及び培養液排出配管７４ｂの周囲には、ほぼ全長に渡って両配管７４ａ、７４ｂを加温する上記筒形状ヒータ９１が配設されている。該筒形状ヒータ９１は、両配管７４ａ、７４ｂを加温することで、内部を流れる培養液Ｗを加温し、該培養液Ｗを介して培養容器１０を加温する機能を有している。この筒形状ヒータ９１は、ＰＣ１２０により温度制御されている。
【００２８】
また、培養液タンク７５には、該培養液タンク７５内に規定濃度（例えば、５％）の二酸化炭素を供給する二酸化炭素供給配管８５が設けられている。この二酸化炭素供給配管８５は、外部に配された図示しない二酸化炭素供給源より二酸化炭素を供給している。また、培養液タンク７５の下方には、上記培養液タンクヒータ９２が設けられている。該培養液タンクヒータ９２は、熱伝導性に優れた培養液タンク７５を介して内部の培養液Ｗを加温する機能を有している。なお、この培養液タンクヒータ９２は、ＰＣ１２０により温度制御されている。
更に、培養液タンク７５内の底面には、磁界の回転により回転する攪拌子８６が回転可能に取り付けられており、培養液タンクヒータ９２の下部に取り付けられたマグネットスターラ８７からの磁界により回転するようになっている。即ち、これら攪拌子８６及びマグネットスターラ８７は、上記攪拌ユニット７２を構成している。
【００２９】
前述した筐体１００は、図２に示すように熱伝導性に優れたアルミ等の金属で形成されており、培養容器１０を設置している下面は、図示しない光学的に透明な薄板状のガラス又は穴が設けられている。これにより、筐体１００の下面から培養容器１０を観察可能とされている。また、筐体１００の上部には、ガラス部材１０１を有する蓋部材１０２が分離可能に取り付けられている。これにより、筐体１００の内部に培養容器１０を出し入れすることが可能である。
筐体１００の内部には、上記温度センサ７３及び上記光遮断手段４０が配設されている。温度センサ７３は、例えば、バネ部材等に固定されバネ力を利用して接触するような可動式であり、培養容器１０が設置された際に培養容器１０の側面に接触して温度を測定するようになっている。この温度センサ７３は、測定した培養容器１０の温度をＰＣ１２０に送る機能を有している。
【００３０】
上記光遮断手段４０は、図４に示すように、培養容器１０の周囲を遮光する遮光ユニット４１と、培養容器１０を遮光ユニット４１の内部に搬送する培養容器搬送手段４２を有している。
遮光ユニット４１は、光学的に光を透過しない材料により断面視コ型形状で内部に培養容器１０を収納可能な大きさに形成され、開口部４１ａを培養容器１０側に向けて筐体１００内に固定されている。また、開口部４１ａの高さは、培養容器１０の厚さとほぼ同一の高さになるように形成されている。即ち、図５に示すように、遮光ユニット４１は、培養容器１０の上下面に配されている一対のガラス部材１５の全面積を遮光して、室内光等の環境光Ｌが内部空間１４に入り込むことを防止する機能を有している。
【００３１】
また、図４（ｂ）に示すように、遮光ユニット４１と培養容器１０との間には、ボールネジ４３が設けられており、該ボールネジ４３は培養容器１０の図示しない係止部に回転可能に係止されている。該ボールネジ４３の一端は、モータ４４に連結されている。つまり、モータ４４を駆動させてボールネジ４３を回転させることにより、培養容器１０を筐体１００内の観察位置から遮光ユニット４２内に移動して収納できるようになっている。即ち、これらボールネジ４３及びモータ４４は、上記培養容器搬送手段４２を構成している。また、モータ４４は、ＰＣ１２０によって駆動が制御されている。
【００３２】
また、図２に示すように、筐体１００内の内側側面の全周には、筐体１００自体及び筐体１００の内部空間を加温する筐体加温ヒータ１０３が配設されている。この筐体加温ヒータ１０３は、ＰＣ１２０により温度制御されている。更に、筐体１００の内側には、筐体１００内部の空気を攪拌するファン１０４が設けられている。即ち、ファン１０４は、筐体加温ヒータ１０３で加温された筐体１００内の空気を、温風として培養容器１０の外表面に向けて送風する機能を有している。なお、このファン１０４は、ＰＣ１２０によって作動が制御され、温風を送風する量が制御されている。
なお、筐体１００の外部には、筐体加温ヒータ１０３の出力線、ファン１０４の電源線、培養液供給配管７４ａ及び培養液排出配管７４ｂを接続する図示しないコネクタ等の接続部が設けられており、外部と内部とを確実且つ容易に接続している。また、培養液供給配管７４ａは、培養容器１００の周囲を、例えば、一周回転するように筐体１００内に配設されている。
これら、筐体１００、筐体加温ヒータ１０３及びファン１０４は、上記培養容器加温ユニット９３を構成している。
【００３３】
また、図１に示すように、筐体１００の下部には、細胞Ａの画像や蛍光強度等を検出する対物レンズ１１０が配設され、筐体１００の上部には、位相差測定や微分干渉測定等により、細胞Ａの画像を取得するために該細胞Ａに光を照射する透過光源１１１が配設されている。対物レンズ１１０で検出された細胞Ａの画像イメージは、図示しないＣＣＤ等を介してＰＣ１２０に電子画像として記録されるようになっている。また、細胞Ａ内の蛍光標識の発現等を観察する場合には、特定波長の光が対物レンズ１１０を通して落射されると共に、細胞Ａから発せられた蛍光成分を含む光を対物レンズ１１０で捕らえる。そして、図示しない波長選択フィルタ等により、検査に必要な蛍光のみをＣＣＤやフォトマルチプレイヤやフォトダイオード等の光強度検出素子により蛍光強度を数値化し、ＰＣ１２０に記録するようになっている。即ち、これら対物レンズ１１０、透過光源１１１及びＰＣ１２０は、上記検出手段３０を構成している。
【００３４】
また、対物レンズ１１０及び透過光源１１１は、上述したように細胞Ａから蛍光強度等の特徴量を検出することに加え、培養容器１０内の培養液Ｗの自家蛍光量を測定する機能も有している。即ち、図６に示すように、対物レンズ１１０により培養容器１０内に満たされている培養液Ｗを下方から観察して自家蛍光量を検出する。また、測定した培養液Ｗの自家蛍光量は、ＰＣ１２０に送られるようになっている。即ち、これら対物レンズ１１０及び透過光源１１１は、上記測定手段５０を構成している。
【００３５】
上記ＰＣ１２０は、上述した各構成品を総合的に制御する機能を有していると共に、温度センサ７３で測定した培養容器１０の温度に基づいて、該培養容器１０の温度が所定温度、例えば、３７℃になるように上記加温手段９０を温度制御する機能を有している。即ち、ＰＣ１２０は、筒形状ヒータ９１、培養液タンクヒータ９２、培養容器加温ユニット９３を総合的に制御している。
【００３６】
また、ＰＣ１２０は、培養液Ｗが劣化しているか否かを判別する上記判別部６０を有している。該判別部６０は、上記測定手段５０から送られてきた培養液Ｗの自家蛍光量を蓄積すると共に強度に応じた測定値に変換して、予め設定されている閾値と比較することにより培養液Ｗの劣化を判別する機能を有している。また、判別部６０は、培養液Ｗが劣化していると判断した場合には、タンク供給ポンプ８２ａ及びタンク排出ポンプ８３ａを作動させて、培養液タンク７５内の培養液Ｗを自動的に交換又は補充すると共に、シリンジピストンポンプ７１を作動させて培養容器１０内に新たな培養液Ｗを供給する機能を有している。即ち、判別部６０、タンク供給ポンプ８２ａ、タンク排出ポンプ８３ａ、シリンジピストンポンプ７１、培養液供給配管７４ａ及び培養液排出配管７４ｂは、自動的に培養液Ｗを交換又は補充する培養液交換手段１２５を構成している。
なお、培養液タンク７５、培養液供給配管７４ａ、培養液排出配管７４ｂ、両電磁弁８０、８１及び二酸化炭素供給配管８５も、上記培養手段２０を構成している一部である。
【００３７】
このように構成された細胞培養検出装置１により、培養中の細胞Ａから細胞画像や蛍光標識による蛍光強度等の特徴量を検出する場合について以下に説明する。
まず、培養容器１０を筐体１００内に収納する前の初期設定として、ＰＣ１２０は、タンク供給ポンプ８２ａを作動して培養液供給源から培養液タンク７５内に培養液Ｗを供給口７６ａより上面になるまで供給する。
【００３８】
培養液タンク７５内に保持された培養液Ｗは、培養液タンクヒータ９２により、培養容器１０の所定温度（例えば、３７℃）より高めであって組成を傷めない程度の温度に加温される。つまり、培養容器１０までの送液過程の冷却作用を考慮して高めの温度に設定している。また、同時に二酸化炭素供給配管８５より所定濃度（例えば、５％）の二酸化炭素を培養液タンク７５内に供給すると共に、攪拌ユニット７２の攪拌子８６を回転して、培養液Ｗ内に均一に所定濃度の二酸化炭素を溶け込ませる。
【００３９】
更に、ＰＣ１２０は、筒形状ヒータ９１を培養液供給配管７４ａ及び培養液排出配管７４ｂを培養容器１０の所定温度（例えば、３７℃）より高めの温度になるように温度制御する。つまり、上述した培養液タンクヒータ９２と同様に、冷却作用を考慮して高めの温度に設定している。
また、ＰＣ１２０は、筐体加温ヒータ１０３を所定温度（例えば、３７℃）になるように温度制御して、筐体１００を伝熱的に加温すると共に、筐体１００内の内部空気を加温する。なお、筐体１００に対する外面からの冷却作用を低減するために、筐体１００の外周面に断熱部材等を設けても構わない。
【００４０】
上述した初期設定の終了後、筐体１００内に細胞を保持している培養容器１０を収納する。培養容器１０を収納すると、温度センサ７３が培養容器１０の外表面に接触して該培養容器１０の温度を測定し、測定結果をＰＣ１２０に送る。また、ＰＣ１２０は、モータ４４によりボールネジ４３を回転させ培養容器１０を遮光ユニット４１内に収容する。
更に、ＰＣ１２０は、シリンジピストンポンプ７１のピストン７１ａ及び両電磁弁８０、８１を総合的に制御しながら作動させ、培養液Ｗを循環させる。即ち、供給口７６ａから培養液Ｗを培養液供給配管７４ａ内に取り込んで、培養容器１０の内部空間１４内に培養液供給口１２ａから供給し、培養液排出口１２ｂから培養液排出配管７４ｂ内を流して排出口７６ｂより培養液タンク７５内に再度戻して循環する。
【００４１】
この際、培養液Ｗは、例えば、１ｍｌ／３０ｍｉｎ位の低速度で且つ無脈動状態で培養容器１０内を流れている。即ち、培養液Ｗは、細胞Ａに圧力波動を与えずに循環している。これにより、例えば、ＨＥＫ２９３細胞等の接着性の弱い細胞であっても、接着性に影響を与えず剥離を防止することができる。また、細胞Ａは、培養過程において細胞周期により、分裂したり、大きさや形状を変化させながら育成している。ここで、圧力波動が変化した場合には、細胞膜表面に外力を作用させることになる。すると、細胞Ａは、外力による刺激に対して防衛的になり、分裂や形状の変化等を停止する可能性がある。ところが、本実施形態においては、シリンジピストンポンプ７１により、圧力波動を変化させずに培養液Ｗを循環するので、上述したような細胞にかかる負担を低減しながら循環培養により細胞Ａに適時栄養分を供給しながら育成することができる。
更に、培養液Ｗは、循環しているので、細胞から排出されるタンパク質等の相互作用物質を完全に入れ替えずに再度利用でき、個々の細胞Ａの育成に必要な細胞間相互作用を維持した培養が可能となり、より効率よく細胞Ａを培養することができる。
【００４２】
また、ＰＣ１２０は、温度センサ７３から培養容器１０の温度が送られてくると、該温度に基づいて上記培養液タンクヒータ９２、筒形状ヒータ９１、筐体加温ヒータ１０３及びファン１０４を総合的に制御して、培養容器１０の温度を所定温度（例えば、３７℃）に維持する。つまり、外部の環境温度変化や所定温度値に応じて、例えば、培養液タンクヒータ９２だけをＯＮ／ＯＦＦしたり、筒形状ヒータ９１の温度をより高めに設定する等の作動を適時組み合わせて、高精度に培養容器１０の温度を所定温度に維持する。これにより、培養容器１０内の細胞への温度による負担を確実に低減することができる。
このように、細胞Ａは、培養容器１０内で最適な培養温度及び二酸化炭素濃度で循環培養方式により培養されている共に、図５に示すように遮光ユニット４１内によって室内光等の環境光Ｌから遮光された暗室状態で光毒性の影響を受けずに培養されている。従って、細胞Ａに負担をかけずに長期間の培養を行なうことができる。
【００４３】
ここで、細胞Ａの特徴量検出を行なう場合には、ＰＣ１２０によりモータ４４を介してボールネジ４３を回転させ、培養容器１０を遮光ユニット４１内から筐体１００の観察面に移動させる。次いで、図３に示すように、ＸＹステージを移動させて、対物レンズ１１０の真上に観察対象の細胞Ａを位置させる。そして、透過光源１１１より励起光等の光を照射し、該照射によって細胞から発せられた蛍光を対物レンズ１１０で検出することにより、細胞Ａの蛍光強度を検出することができる。また、対物レンズ１１０により、細胞Ａの細胞画像等も検出することが可能である。更に、ＸＹステージを移動させることで、培養容器１０内の各細胞Ａの細胞画像や蛍光強度等の特徴量を検出することができる。
【００４４】
なお、特徴量検出の際、図６に示すように、細胞Ａの特徴量検出を行なう前に、細胞Ａから外れた位置に光を照射して対物レンズ１１０によりバックグラウンドを測定し、その後、細胞Ａの特徴量検出を行なっても構わない。この場合には、検出した細胞Ａの特徴量から不要なバックグラウンド成分の除去が行なえるので、より正確な細胞Ａの特徴量検出を行なうことができる。
【００４５】
細胞Ａの特徴量検出後、再度培養容器搬送手段４２により培養容器１０を、遮光ユニット４１内に収容する。こうすることで、特徴量検出時以外、細胞Ａを環境光Ｌから遮光して光毒性の影響を低減させるので、細胞Ａの負担が減り長期的な細胞培養を確実に行なうことができる。また、培養容器搬送手段４２により、容易に培養容器１０を遮光ユニット４１に出し入れ可能であるので、培養過程において必要時にリアルタイムで細胞Ａの特徴量検出を行なうことができる。
【００４６】
また、細胞Ａの培養中において、循環している培養液Ｗを常に劣化していない最適な状態に維持することが可能である。
即ち、培養初期段階において、図６に示すように、対物レンズ１１０により培養液Ｗの自家蛍光強度を測定し、ＰＣ１２０の判別部６０に送る。該判別部６０は、送られてきた自家蛍光強度を、強度に応じた測定値に変換すると共に蓄積する。そして、細胞Ａの培養過程の経過と共に、対物レンズ１１０により適宜培養液Ｗの自家蛍光強度を測定する。例えば、細胞Ａの特徴量検出に合わせて行なっても構わないし、ある一定時間毎に培養液Ｗの自家蛍光強度だけを測定して構わない。
このように測定されて判別部６０に蓄積された自家蛍光強度は、時間の経過と共に測定値が増加する。つまり、培養過程において細胞Ａは、細胞間相互作用物質を排出すると共に老廃物も培養液Ｗに排出する。これに伴って、培養液Ｗ内の栄養分が減少する。これらの相互作用の結果、培養液Ｗが劣化して自家蛍光強度が増加している。
【００４７】
そして、判別部６０は、送られてきた測定値と予め設定された閾値とを比較して、測定値が閾値以上の値になったときに、培養液Ｗが劣化したと判断する。劣化を判断すると判別部６０は、培養液供給ポンプ８２ａを作動させて、培養液供給源から新たな培養液Ｗを培養液タンク７５内に補充する。これにより、培養液タンク７５内の培養液Ｗに、劣化していない新たな培養液が混ざるので、全体的に培養液Ｗの劣化が緩和する。
【００４８】
また、判別部６０が、例えば、送られてきた測定値が閾値よりはるかに大きな値であり、その差が設定された値以上である場合には、培養液Ｗが著しく劣化していると判断して、培養液供給ポンプ８２ａを作動して新たな培養液Ｗを供給すると共に培養液排出ポンプ８３ａも作動させて培養液タンク７５から今まで使用していた培養液Ｗを排出して、必要量培養液Ｗを交換する。
この際、ＰＣ１２０は、図示しない液面センサ等により、培養液Ｗの液面が供給口７６ａより下方に下がらないように培養液供給ポンプ８２ａ及び培養液排出ポンプ８３ａを制御している。これにより、供給口７６ａから空気が吸い込まれて、気泡が培養容器１０内に入り込まないようになっている。
【００４９】
上述したように、この細胞培養検出装置１においては、培養手段２０により細胞Ａを培養容器１０内で所定の培養条件、例えば、温度３７℃、二酸化炭素濃度５％に維持すると共に随時栄養素を供給する循環培養方式により細胞Ａを培養することができる。特に、細胞Ａの特徴量検出を行なわないときは、光遮断手段４０により培養容器１０を室内光等の環境光Ｌから遮光するので、光照射による光毒性の影響をなくし、細胞Ａへの負担を低減することができる。従って、細胞Ａを長期的に培養しながら、検出手段３０により細胞Ａから蛍光強度等の特徴量を正確且つリアルタイムに測定することができる。
また、測定終了後、培養容器搬送手段４０により、培養容器１０を容易に遮光ユニット４１内に収容できるので、光毒性の影響を可能な限り低減することができる。
【００５０】
また、シリンジピストンポンプ７１により、培養液Ｗを循環するので、細胞Ａから排出される相互作用物質を完全に入れ替えずに、個々の細胞育成に必要な細胞間相互作用を維持した培養を行うことができる。この際、攪拌ユニット７２により、培養液Ｗの二酸化炭素濃度を最適な培養濃度で均一に維持することができるので、細胞Ａにかける負担を確実に低減して培養を行なうことができる。
更に、シリンジピストンポンプ７１により、圧力変動を与えずに培養液Ｗを循環するので、培養容器内の細胞に不要な圧力波動を与えることはない。これにより、例えば、細胞Ａの剥離を防止したり、圧力波動による刺激を与えないので、培養液Ｗの圧力変化による細胞Ａへの負担を低減することができる。
更に、温度センサ７３で測定した培養容器１０の温度に基づいて加温手段９０、即ち、筐体加温ヒータ１０３、ファン１０４、筒形状ヒータ９１及び培養液タンクヒータ９２を総合的に温度制御するので、培養容器１０を、例えば３７℃の高精度に維持でき、培養容器１０内の細胞Ａへの温度による負担を低減することができる。
【００５１】
また、細胞Ａの培養過程において、培養測定手段５０により、培養液Ｗの自家蛍光強度を測定し、該自家蛍光強度に基づいて判別部６０が培養液Ｗの劣化状態を判別し、劣化していると判断した場合には、培養液交換手段１２５により、培養液Ｗの補充や交換を行い劣化していない最適な状態に維持しながら細胞培養を行なえる。従って、常に最適な培養液中で細胞培養でき、培養液Ｗの劣化による細胞Ａへの負担を低減することができる。特に、培養液交換手段１２５により自動的に培養液Ｗの交換等を行なうので、常に一定の培養条件を維持を行なえる。
上述したように、ＸＹステージ上で細胞Ａの負担を低減して、長期間の培養を行なえるので、リアルタイムで細胞Ａの経時的変化を測定したり、培養過程で生じる変化等を容易に検出することができると共に、常に活性化（安定化）した細胞Ａの挙動を正確に検出することができる。
【００５２】
次に、本発明の第２実施形態を、図７を参照して説明する。なお、この第２実施形態においては、第１実施形態における構成要素と同一の部分については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第２実施形態と第１実施形態との異なる点は、第１実施形態では、培養容器搬送手段４２により培養容器１０を移動させて、遮光ユニット４１内に出し入れしていたのに対し、第２実施形態の光遮断手段１３０では、遮光ユニット１３１を移動させて培養容器１０を遮光する点である。
【００５３】
即ち、図７に示すように、光遮断手段１３０は、培養容器１０の周囲を遮光する遮光ユニット１３１、培養容器１０を遮光ユニット１３１の周囲に搬送する遮光ユニット搬送手段１３２を備えている。上記遮光ユニット１３１は、軸部材１３１ａ及び一対の薄板部材１３１ｂを有しており、断面視コ型形状で開口部が培養容器１０に向くように、また、内部に培養容器１０を収納可能な大きさになるように、軸部材１３１ａの上下に薄板部材１３１ｂの一端側が取り付けられている。なお、遮光ユニット１３１の内面に、低反射部材のスポンジ等を取り付けて、外部からの環境光Ｌの遮光性を高めても構わない。
【００５４】
上記軸部材１３１ａは、一端が延在しており、該軸部材１３１ａに直交するように配設されたボールネジ１３３に係止されている。また、該ボールネジ１３３の基端は、筐体１００内に固定されたモータ１３４に回転可能に支持されている。また、モータ１３４はＰＣ１２０により作動が制御されている。即ち、これらボールネジ１３３及びモータ１３４は、上記遮光ユニット搬送手段１３２を構成している。なお、培養容器１０は、筐体１００内の観察面に固定されている。
【００５５】
このように構成された光遮断手段１３０においては、細胞Ａの特徴量検出以外は、培養容器１０の周囲に遮光ユニット１３１を位置させて、環境光Ｌから細胞Ａを遮光する。また、細胞Ａの検出を行なう場合には、ＰＣ１２０によりモータ１３４を駆動してボールネジ１３３を回転させることにより、遮光ユニット１３１を移動して培養容器１０を露出させた後、観察を行なうことができる。
このように、遮光ユニット搬送手段１３２によって、容易且つ確実に培養容器１０を遮光することができ、内部の細胞Ａへの光毒性の影響を低減することができる。また、培養容器１０を移動する必要がないので、より細胞Ａにかかる負担を低減することができる。
【００５６】
次に、本発明の第３実施形態を、図８及び図９を参照して説明する。なお、この第３実施形態においては、第１実施形態における構成要素と同一の部分については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第３実施形態と第１実施形態との異なる点は、第１実施形態では、培養液Ｗを循環させながら細胞Ａを培養していたのに対し、第３実施形態の細胞培養検出装置１４０では、培養液Ｗを循環させずに細胞Ａを培養する点である。
【００５７】
即ち、図８及び図９に示すように、細胞培養検出装置１４０は、細胞Ａを培養液Ｗと共に収容する９６穴マイクロプレート（培養容器）１５０と、該細胞Ａを所定の培養条件で培養する培養手段１６０と、培養中の細胞Ａから該細胞Ａの特徴量を検出しないときに９６穴マイクロプレート１５０を環境光Ｌから遮断する筐体カバー（光遮断手段）１７０と、細胞Ａから特徴量を検出する検出手段３０と、培養液Ｗの自家蛍光量を測定する測定手段５０と、該測定手段５０による測定結果に基づいて培養液Ｗが劣化しているか否かを判別する判別部６０とを備えている。
【００５８】
上記９６穴マイクロプレート１５０は、筐体１４１内部に配設されている図示しない顕微鏡ステージ上に載置されている。この９６穴マイクロプレート１５０は、図９に示すように、樹脂製のプレート１５１に、約９ｍｍ間隔で区切られた穴１５２が９６個形成されており、各穴１５２内に細胞Ａ及び培養液Ｗを収容可能である。また、プレート１５１の底面は、光学的平面を有するガラス部材となっており、下面から対物レンズ１１０で各穴１５２内の細胞Ａを観察可能とされている。
【００５９】
また、９６穴マイクロプレート１５０は、図８に示すように加温手段の１つである加温ヒータ（培養容器加温ユニット）１４３により伝熱的に加温されるようになっている。なお、加温ヒータ１４３は、ＰＣ１２０により温度制御されている。更に、９６穴マイクロプレート１５０は、温度センサ１４４により温度が測定されており、ＰＣ１２０に測定結果が送られている。
【００６０】
上記筐体１４１内には、培養液Ｗを保持する培養液タンク７５、不要な培養液Ｗを貯液する培養液排出タンク１４６、外部に配された二酸化炭素供給源から筐体１４１内に所定濃度（例えば、５％）の二酸化炭素を供給する二酸化炭素供給配管１４７、筐体１４１内の内部空気を対流させるファン１４８、培養液Ｗを分注する分注ユニット１８０が設けられている。更に、筐体１４１の周囲には、該筐体１４１の内部空間を加温するための加温手段の１つである筐体加温ヒータ（培養液加温ユニット）１４９が設けられ、ＰＣ１２０によって温度制御されている。つまり、筐体１４１内は、上記二酸化炭素供給配管１４７により所定濃度の二酸化炭素が充満していると共に、筐体加温ヒータ１４９及びファン１４８によって加温された空気が対流して所定温度（例えば、３７℃）の均一温度に維持されている。従って、９６穴マイクロプレート１５０の各穴１５２内に収容されている培養液Ｗは、例えば、温度３７℃、二酸化炭素濃度５％の状態に維持されている。
【００６１】
上記培養液タンク７５は、９６穴マイクロプレート１５０の一方側に隣接するように配置されている。この培養液タンク７５に保持された培養液Ｗは、培養液タンクヒータ９２によって加温されており、攪拌ユニット７２によって均一に所定濃度の二酸化炭素を含んでいる。
上記培養液排出タンク１４６は、９６穴マイクロプレート１５０の他方側に隣接するように配置されている。
【００６２】
上記分注ユニット１８０は、筐体１４１の上方に設けられており、筐体１４１内を水平方向且つ上下方向に移動可能な分注ノズル１８１を有している。即ち、分注ノズル１８１は、培養液タンク７５及び培養液排出タンク１４６間を移動すると共に、９６穴マイクロプレート１５０の各穴１５２を移動して走査できるようになっている。また、分注ノズル１８１は、内部に培養液Ｗを吸引及び吐出することができ、加温手段の１つである筒形状ヒータ（培養液加温ユニット）１８２によって内部に吸引した培養液Ｗを加温できるようになっている。この筒形状ヒータ１８２は、ＰＣ１２０によって温度制御されている。
なお、分注ユニット１８０は、分注ノズル１８１の他に、図示しない配管、シリンジピストンポンプ、電磁弁、走査軸ユニット等を有している。
【００６３】
上記筐体カバー１７０は、光学的に光を透過させない材料で筐体１４１を周囲から覆う大きさに形成されており、図示しない筐体カバー搬送手段によって筐体１４１を覆い、筐体１４１内部を暗室状態にして外部からの環境光Ｌから遮光できるようになっている。
上述した筐体１４１、培養液タンク７５、培養液排出タンク１４６、二酸化炭素供給配管１４７、ファン１４８、分注ユニット１８０、攪拌ユニット７２、加温ヒータ１４３、筐体加温ヒータ１４９、培養液タンクヒータ９２及び筒形状ヒータ１８２は、上記培養手段１６０を構成している。
なお、本実施形態においては、判別部６０が、培養液Ｗが劣化していると判断した場合には、分注装置１８０を作動させて培養液Ｗを自動的に補充又は交換するように設定されている。
【００６４】
このように構成された細胞培養検出装置１４０においては、９６穴マイクロプレート１５０の各穴１５２内に培養液Ｗ及び細胞Ａ収容し、筐体１４１内に載置した後、筐体カバー搬送手段により筐体１４１の周囲を筐体カバー１４８で覆う。また同時に、ＰＣ１２０は、温度センサ１４４から送られてきた９６穴マイクロプレート１５０の温度に基づいて、該９６穴マイクロプレート１５０の温度が、所定温度（例えば３７℃）になるように、加温ヒータ１４３、筐体加温ヒータ１４９及びファン１４８を総合的に制御する。
これにより、細胞Ａは、例えば、温度３７℃、二酸化炭素５％で且つ、環境光Ｌが遮断された暗室状態で光毒性の影響を受けずに培養されている。
【００６５】
また、ＰＣ１２０は、培養液タンクヒータ９２及び攪拌ユニット７２を制御して、培養液タンク７５内の培養液Ｗを所定温度（例えば、３７℃）より高めであって組成を傷めない程度に加温すると共に、所定濃度（例えば、５％）の二酸化炭素濃度を溶け込ませる。更に、ＰＣ１２０は、筒形状ヒータ１８２を温度制御して、分注ノズル１８１を所定温度（例えば、３７℃）より高めに加温する。
つまり、９６穴マイクロブレート１５０までの間の冷却作用を考慮して、高めの温度に設定されている。
【００６６】
ここで、細胞Ａの特徴量検出を行なう場合には、筐体カバー搬送手段により筐体カバー１７０を筐体１４１の周囲から移動させる。次いで、顕微鏡ステージを走査しながら、透過光源１１１より励起光を照射し、細胞Ａから発せられた蛍光を対物レンズ１１０で検出することにより、細胞Ａの蛍光強度を検出することができる。また、細胞Ａの細胞画像を検出することも可能である。
細胞Ａの特徴量検出後、筐体カバー搬送手段により筐体カバー１７０を移動させて筐体１４１の周囲を覆う。こうすることで、特徴量検出以外、細胞Ａを環境光Ｌから遮光して光毒性の影響を低減させるので、細胞Ａの負担が減り長期的な細胞培養を確実に行なうことができる。
【００６７】
また、細胞Ａの培養中において、培養液Ｗの劣化状態に応じて、培養液Ｗを補充又は交換することが可能である。即ち、判別部６０は、対物レンズ１１０から送られてきた培養液Ｗの自家蛍光強度が予め設定された閾値以上の値となり、培養液Ｗが劣化していると判断した場合には、分注ユニット１８０を作動させる。分注ユニット１８０は、ＰＣ１２０からの信号を受けると、分注ノズル１８１を培養液タンク７５に移動させ、内部に培養液Ｗを吸引する。吸引後、分注ノズル１８１を９６穴マイクロプレート１５０の穴１５２に移動させ、吸引した培養液Ｗを吐出して補充する。これにより、穴１５２内に劣化していない新たな培養液Ｗが混ざるので、全体的に培養液Ｗの劣化が緩和する。
また、培養液Ｗが著しく劣化していると判断した場合には、培養液Ｗを交換することも可能である。即ち、分注ノズル１８１により、穴１５２内の劣化している培養液Ｗを培養液排出タンク１４５に排出した後、培養液タンク７５から新たな培養液Ｗを吐出する。
なお、培養液Ｗは、分注ノズル１８１によって吸引され移動している間、筒形状ヒータ１８２によって加温されているので、各穴１５２に吐出される直前まで、培養液タンク７５内に保持されていたときの所定温度が維持されている。従って、細胞Ａの温度による負担を減らすことができる。
【００６８】
また、９６穴マイクロプレート１５０の各穴１５２内に異なる数の細胞Ａを培養したり、異なる種類の細胞Ａを培養する場合、培養液Ｗの劣化速度が異なるが、本実施形態においては、各穴１５２毎に培養液Ｗの劣化を検出すると共に、培養液Ｗを各穴１５２毎に選択的に補充又は交換することが可能である。つまり、細胞間相互作用物質を安易に入れ替えてしまうことを防止することができる。
【００６９】
この細胞培養検出装置１４０においては、筐体１４１内で細胞Ａの負担を低減して長期間の培養を行なうことができる。特に、９６穴マイクロプレート１５０の各穴１５２内で異なる数の細胞Ａや、異なる種類の細胞Ａを長期間培養することができるので、リアルタイムで、細胞数、細胞種類による経時的変化や、培養過程で生じる変化等を容易に検出することができると共に、常に活性化（安定化）した培養細胞の挙動を正確に検出することができる。
【００７０】
なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の変更を加えることが可能である。
なお、第１実施形態においては、培養液タンク内に保持されている培養液の二酸化炭素濃度を均一にするため、攪拌ユニットを採用したが、これに限られず、二酸化炭素濃度を均一にする構成であれば構わない。例えば、培養液タンク全体を揺動して攪拌する揺動攪拌方式や、超音波の照射によって攪拌する超音波攪拌方式等の攪拌方式を採用しても良い。
【００７１】
更に、判別部が、培養液が劣化していると判断したときに、培養液交換手段を作動させて、培養液の補充又は交換を行なったが、警報を発するように構成しても構わない。
即ち、図１０に示すように、判別部６０は、培養液Ｗが劣化していると判断したときに、警報を発するブザー（報知手段）６１を有している。これにより、例えば、観察者は、ブザー６１が鳴ったことを受けて、培養液Ｗが劣化したことを正確且つ容易に知ることができるので、培養液Ｗの交換等の必要な処理を効率良く行なうことができる。
なお、第１実施形態の細胞培養検出装置１に上記ブザー６１を同時に配設した構成にしても構わない。
【００７２】
また、上記第３実施形態においては、光遮断手段として、筐体カバーを採用したが、これに限られず、例えば、９６穴マイクロプレートのみを覆って環境光から遮断する構成にしても構わない。
また、培養液の乾燥蒸発を防止するため、筐体内部を高湿度に維持するようにしても良い。また、筐体内部を滅菌環境にしても良く、外部からの空気の流入個所にヘパフィルタを設けても良い。
【００７３】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る細胞培養検出装置によれば、培養手段により、細胞を培養容器内で所定の培養条件を維持しながら培養を行なえると共に、培養しながら検出手段により細胞の特徴量検出を行なえる。また、光遮断手段により培養容器を環境光から遮断するので、光照射による光毒性の影響を低減でき、生細胞にかかる負担を低減することができる。従って、細胞を培養容器内で確実に長期間培養することができ、培養中の細胞から蛍光強度等の特徴量を正確且つリアルタイムに測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る細胞培養検出装置の第１実施形態を示す構成図である。
【図２】図１に示す細胞培養検出装置の培養容器を筐体に設置した状態を示す斜視図である。
【図３】細胞の特徴量検出を行なっている状態を示す断面図である。
【図４】培養容器と光遮断手段との関係を示す図であって、（ａ）は培養容器及び遮光ユニットの側面図、（ｂ）は（ａ）の矢視Ｂ−Ｂ図である。
【図５】培養容器を遮光ユニット内に収容した状態を示す断面図である。
【図６】培養液の自家蛍光量を測定している状態を示す断面図である。
【図７】本発明に係る細胞培養検出装置の第２実施形態での培養容器と光遮断手段との関係を示す図であって、（ａ）は培養容器及び遮光ユニットの側面図、（ｂ）は（ａ）の矢視Ｃ−Ｃ図である。
【図８】本発明に係る細胞培養検出装置の第３実施形態を示す構成図である。
【図９】図８に示す９６穴マイクロプレートを示す図であって、（ａ）は断面図、（ｂ）は（ａ）の矢視Ｄ−Ｄ図である。
【図１０】本発明に係る細胞培養検出装置の判別部の変形例を示す図である。
【符号の説明】
Ａ 細胞
Ｌ 環境光
Ｗ 培養液
１、１４０ 細胞培養検出装置
１０ 培養容器
２０、１６０ 培養手段
３０ 検出手段
４０、１３０ 光遮断手段
４１、１３１ 遮光ユニット
４２ 培養容器搬送手段
５０ 測定手段
６０ 判別部（判別手段）
６１ ブザー（報知手段）
７１ シリンジピストンポンプ（無脈動循環ポンプ、循環ポンプ）
７２ 攪拌ユニット
７３、１４４ 温度センサ
９０ 加温手段
９１ 筒形状ヒータ（配管加温ユニット）
９２ 培養液タンクヒータ（培養液加温ユニット）
９３ 培養容器加温ユニット
１２５ 培養液交換手段
１３２ 遮光ユニット搬送手段
１４３ 加温ヒータ（培養容器加温ユニット）
１４９ 筐体加温ヒータ（培養液加温ユニット）
１５０ ９６穴マイクロプレート（培養容器）
１７０ 筐体カバー（光遮断手段）
１８２ 筒形状ヒータ（培養液加温ユニット）
【発明の属する技術分野】
この発明は、培養中の細胞の反応による情報を検出する細胞培養検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子技術の進歩に伴って、人を含む多くの生物における遺伝子配列が明らかになると共に、解析されたタンパク質等の遺伝子産物と疾病との因果関係も少しずつ解明され始めている。また、今後さらに、各種タンパク質や遺伝子等を網羅的且つ統計的に解析するため、細胞を用いた様々な検査方法や装置が考えられ始めている。特に、上記解析を行なうには、細胞を長期間培養しながら、所定の情報を検出することが必要である。そのため、顕微鏡下で細胞を培養し、観察することが可能な装置が求めれられている。
【０００３】
このような装置の１つとして、各種の細胞の培養条件を設定可能な顕微鏡観察用透明恒温培養容器を使用する装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。
この顕微鏡観察用透明恒温培養容器は、温度調節器により所定温度に制御可能な一対の透明発熱プレート、容器内部の二酸化炭素濃度を調整するための二酸化炭素供給口及び二酸化炭素排出口、シール用パッキンにより密閉された容器内に所定湿度を保つための蒸発皿を有している。
この顕微鏡観察用透明恒温培養容器を使用しての観察では、容器内部の温度、二酸化炭素濃度及び湿度を制御可能であるので、細胞培養しながら観察を行なうことが可能である。即ち、透明発熱プレートの下方から、例えば、対物レンズで観察することにより、細胞の培養状態の経時的変化等を観察することが可能である。
【０００４】
従って、上記顕微鏡観察用透明恒温培養容器を利用した観察によれば、生物、生殖又はバイオテクノロジー等の研究分野において、各種の細胞の培養状態の観察、写真撮影等の記録を行なう際に、顕微鏡観察を行ないながら温度、二酸化炭素濃度及び湿度を自由に制御して培養状態を各種設定し、その経時的変化の観察及び記録が連続的且つ簡便に行なうことができる。
特に、細胞は、遺伝子等とは異なり、生きている状態での蛍光検出、例えば、細胞内でのＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）発現の検出等が測定手法として多用されているため、細胞を培養するための環境条件の管理が、正確な測定結果を得るための重要な項目となっている。従って、長時間の顕微鏡観察により細胞を死滅させないように、顕微鏡下に配置する培養容器、例えば、プラスチック製又はガラス製のディッシュ、シャーレ等は、上述したように温度及び二酸化炭素濃度の管理が必須とされている。
【０００５】
また、細胞は、種類に応じて様々な性質を有しており、例えば、外部環境の変化に対して非常に弱い性質を有する細胞がある。該細胞は、例えば、温度上昇の急激な昇温動作や偏った温度分布等が原因で簡単に死滅する場合がある。細胞種類によっても異なるが、細胞を培養する条件として、一般に温度３７±０．５℃、二酸化炭素濃度３〜８％を一定に維持することが必要とされている。また、温度や二酸化炭素濃度等だけでなく、これ以外の管理環境項目も無視することはできない。例えば、太陽光や室内光等の光の影響も重要な管理項目の１つである。つまり、長時間の光照射による光毒性が、細胞内の活性酸素を上昇させて該細胞の育成に影響を与えてしまう。また、細胞の長期間培養においては、塵埃等の混入を発生させずに細胞培養液の半バッチ交換等を行なうことも重要な培養環境条件の管理項目である。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１０−２８５７６号公報（段落番号０００４−０００７、図１−図４）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記特許文献１記載の顕微鏡観察用透明恒温培養容器を利用した観察では、温度、二酸化炭素濃度及び湿度を任意に制御して、細胞を培養しながら観察を行なうことができるが、例えば、室内の光が容易に細胞に照射して細胞に負担がかかったり、培養液の交換の際、塵埃等が混入する可能性があった。そのため、細胞を長期間培養することが困難であると共に、細胞から正確な蛍光強度等の情報を検出することが難しかった。
【０００８】
この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、その目的は、生細胞への負担を低減すると共に、生細胞から蛍光強度等の特徴量を正確且つリアルタイムに測定することができる細胞培養検出装置を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、細胞を培養液と共に収容する培養容器と、前記細胞を所定の培養条件で培養する培養手段と、培養中の前記細胞から該細胞の特徴量を検出する検出手段と、前記特徴量を検出しないときに、前記培養容器を環境光から遮断する光遮断手段とを備えている細胞培養検出装置を提供する。
【００１０】
この発明に係る細胞培養検出装置においては、培養手段により、細胞を培養容器内で所定の培養条件、例えば、温度３７℃、二酸化炭素濃度５％を維持しながら培養を行えると共に、培養しながら検出手段により細胞の特徴量、例えば、細胞画像や蛍光標識による蛍光強度等をリアルタイムで測定が行なえる。また、細胞の特徴量検出を行なわないときは、光遮断手段により培養容器を室内光等の環境光から遮断するので、培養容器内の細胞に光が照射されることはない。これにより、光照射による光毒性の影響を低減するので、生細胞にかかる負担を低減することができる。従って、細胞を培養容器内で確実に長期間培養することができ、培養中の細胞から蛍光強度等の特徴量を正確且つリアルタイムに測定することができる。
【００１１】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の細胞培養検出装置において、前記光遮断手段が、前記培養容器の周囲を遮光する遮光ユニットと、前記培養容器を前記遮光ユニットの内部に搬送する培養容器搬送手段とを備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、細胞の特徴量測定を行う測定時以外、培養容器は光が遮断された状態で遮光ユニット内に収容されている。つまり、培養容器内の生細胞は、遮光ユニットにより完全に環境光から遮断されているので、光毒性の影響がなくなり細胞の長期間の生存が可能となる。また、測定終了後、培養容器搬送手段により、培養容器を移動させるだけで容易に遮光ユニット内に収容できるので、光毒性の影響を可能な限り低減することができる。
【００１２】
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の細胞培養検出装置において、前記光遮断手段が、前記培養容器の周囲を遮光する遮光ユニットと、該遮光ユニットを前記培養容器の周囲に搬送する遮光ユニット搬送手段とを備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、細胞の特徴量測定を行う測定時以外、培養容器は光が遮断された状態で遮光ユニット内に収容されているので、光毒性の影響がなくなり生細胞の長期間の生存が可能となる。また、測定終了後、遮光ユニット搬送手段により遮光ユニットを移動させるだけで、容易に培養容器の周囲に位置できるので、光毒性の影響を可能な限り低減することができる。また、培養容器を移動する必要がないので、より細胞の負担が低減する。
【００１３】
請求項４に係る発明は、請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞培養検出装置において、前記培養手段が、前記培養液を循環する循環ポンプと、前記培養液を攪拌して、該培養液内の二酸化炭素を所定濃度に維持する攪拌ユニットと、前記培養液の温度を制御する培養液加温ユニットとを備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、循環ポンプにより培養容器内の培養液を循環するので、細胞から排出される相互作用物質を完全に入れ替えずに、個々の細胞育成に必要な細胞間相互作用を維持した培養が行なえると共に、随時細胞に栄養素の供給を行なえる。また、攪拌ユニットにより、培養液の二酸化炭素濃度を最適な培養濃度（例えば５％）で均一に維持することができ、培養液加温ユニットにより、培養液の温度を制御して、培養容器の温度を最適温度（例えば３７℃）に維持することができる。従って、細胞にかける負担を確実に低減して培養を行なうことができる。
【００１４】
請求項５に係る発明は、請求項４に記載の細胞培養検出装置において、前記循環ポンプが、圧力変動を発生せずに前記培養液を送液する無脈動循環ポンプである細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、シリンジピストンポンプ等の無脈動循環ポンプにより、圧力変動を与えずに培養液を送液するので、培養容器内の細胞に不要な圧力波動を与えることはない。これにより、例えば、細胞の剥離や培養容器内面への接着性に影響を与えることはない。従って、培養液の圧力変化による細胞への負担を低減でき、長期間培養が可能となる。
【００１５】
請求項６に係る発明は、細胞を培養液と共に収容する培養容器と、前記細胞を所定の培養条件で培養する培養手段と、培養中の前記細胞から該細胞の特徴量を検出する検出手段とを備え、前記培養手段が、前記培養容器の温度を測定する温度センサと、前記培養容器を加温する培養容器加温ユニット若しくは前記培養容器内に前記培養液を供給又は排出する配管を加温する配管加温ユニット若しくは前記培養液を加温する培養液加温ユニットの少なくともいずれか１つを有する加温手段を有し、前記温度センサで測定した温度に基づいて前記加温手段を所定温度になるよう温度制御する細胞培養検出装置を提供する。
【００１６】
この発明に係る細胞培養検出装置においては、温度センサで測定した温度に基づいて加温手段を温度制御するので、培養容器の温度を高精度に所定温度（例えば、３７℃）に維持することができる。つまり、培養容器加温ユニットにより直接的に培養容器を加温したり、配管加温ユニットにより供給又は排出用の配管を介して配管内部の培養液を加温し、該培養液によって培養容器を加温したり、培養液加温ユニットにより培養液自体を加温して培養容器を加温する。このようにして、培養容器を所定温度に維持することで、培養容器内の細胞への温度による負担を低減することができる。また、培養容器加温ユニット、配管加温ユニット及び培養液加温ユニットを適時組み合わせることにより、より確実に培養容器を所定温度に維持することができる。
【００１７】
請求項７に係る発明は、細胞を培養液と共に収容する培養容器と、前記細胞を所定の培養条件で培養する培養手段と、培養中の前記細胞から該細胞の特徴量を検出する検出手段とを備え、前記培養手段が、前記培養容器の温度を測定する温度センサと、前記培養容器を加温する培養容器加温ユニットを有し、該培養容器加温ユニットが、前記温度センサで測定した温度に基づいて温風を前記培養容器の外表面に向けて送風する細胞培養検出装置。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、温度センサで測定した温度に基づいて、培養容器加温手段により培養容器の外表面に直接温風を送風するので、培養容器の温度を均一に所定温度、例えば３７℃に維持することが可能である。このように培養容器を所定温度に維持することで、培養容器内の細胞への温度による負担を低減することができる。
【００１８】
請求項８に係る発明は、請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞培養検出装置において、前記培養液の自家蛍光量を測定する測定手段と、該測定手段による測定結果に基づいて、前記培養液が劣化しているか否かを判別する判別手段とを備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、測定手段により、細胞を培養している間の培養液の劣化状態を測定が行なえる。つまり、培養中の培養液には、細胞からの老廃物等が蓄積し経時的に劣化し始めている。この劣化状態を自家蛍光量として測定している。即ち、自家蛍光量が増加すれば、劣化が進行していることとなる。よって、判別手段により測定した自家蛍光量を、例えば、閾値等と比較することにより、培養液が劣化しているか否かを判別することができる。従って、培養過程において、培養液の劣化を定量的に判別しながら細胞培養を行なえるので、培養液劣化による細胞への負担を低減することができ、長期間の培養を行なうことができる。
【００１９】
請求項９に係る発明は、請求項８に記載の細胞培養検出装置において、前記判別手段が、前記培養液が劣化していると判断したときに、自動的に該培養液を交換又は補充する培養液交換手段を備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、培養液交換手段により、培養液を劣化していない最適な状態に自動的に維持しながら、細胞培養を行なえる。従って、常に最適な培養液中で培養でき、培養液の劣化による細胞への負担をより低減することができる。
【００２０】
請求項１０に係る発明は、請求項８又は９に記載の細胞培養検出装置において、前記判別手段が、前記培養液が劣化していると判断したときに、警報を発する報知手段を備えている細胞培養検出装置を提供する。
この発明に係る細胞培養検出装置においては、報知手段により、細胞を培養している際に、培養液が劣化したことを正確且つ容易に知ることができ、培養液の交換等必要な処理を効率良く行なえる。従って、常に最適な培養液中で培養でき、培養液の劣化による細胞への負担をより低減することができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る細胞培養検出装置の第１実施形態について図１から図６を参照して説明する。
本実施形態の細胞培養検出装置１は、図１に示すように、細胞Ａを培養液Ｗと共に収容する培養容器１０と、該細胞Ａを所定の培養条件で培養する培養手段２０と、培養中の細胞Ａから該細胞Ａの特徴量を検出する検出手段３０と、該特徴量を検出しないときに培養容器１０を環境光Ｌから遮断する光遮断手段４０と、培養液Ｗの自家蛍光量を測定する測定手段５０と、該測定手段５０による測定結果に基づいて培養液Ｗが劣化しているか否かを判別する判別部（判別手段）６０とを備えている。
上記培養容器１０は、図１及び図２に示すように、該培養容器１０よりも十分大きい矩形形状に形成された筐体１００の内部に収納されている。また、この筐体１００は、図示しない倒立顕微鏡のＸＹステージ上に固定されている。これにより、培養容器１０及び筐体１００は、ＸＹステージのＸＹ走査に同期して水平方向に移動可能とされている。なお、この筐体１００については、後に詳しく説明する。
【００２２】
培養容器１０は、図３に示すように、細胞毒性を有しない材質、例えば、テフロン（登録商標）、ＰＥＥＫ（登録商標）や耐食性ステンレス等で形成された培養容器上枠１１及び培養容器下枠１２が、Ｏリング１３を介して図示しないネジ等の締結部材により互いに上下方向に接続されることにより、内部空間１４を有する箱形状に構成されている。また、培養容器上枠１１及び培養容器下枠１２には、それぞれ光学的な平面を有するガラス部材１５が、細胞毒性を有しない接着剤等により接合されている。即ち、培養容器１０の上下面は、一対のガラス部材１５で覆われている。なお、一対のガラス部材１５を接着している接着剤は、オートクレープ条件（１２０℃、４気圧等）に耐えうる接着剤が好ましい。
また、培養容器下枠１２の両側には、それぞれ内部空間１４内に培養液Ｗを供給する培養液供給口１２ａ、及び内部空間１４から培養液Ｗを排出する培養液排出口１２ｂが形成されている。
【００２３】
上記培養手段２０は、図１及び図２に示すように培養液Ｗを循環させるシリンジピストンポンプ（循環ポンプ）７１、培養液Ｗを攪拌して該培養液Ｗ内の二酸化炭素を所定濃度に維持する攪拌ユニット７２、培養容器１０の温度を測定する温度センサ７３及び培養容器１０を加温する加温手段９０を備えている。また、該加温手段９０は、培養容器１０内に培養液Ｗを供給又は排出する配管を加温する筒形状ヒータ（配管加温ユニット）９１、培養液Ｗを加温する培養液タンクヒータ（培養液加温ユニット）９２、培養容器１０を加温する培養容器加温ユニット９３を有している。
【００２４】
ここで、図３に示すように、培養容器１０の培養液供給口１２ａには、フレキシブルに形成された培養液供給配管７４ａの一端が接続されており、培養液排出口１２ｂには、フレキシブルに形成された培養液排出配管７４ａの一端が接続されている。上記培養液供給配管７４ａの他端は、図１に示すように、培養液タンク７５内に保持されている培養液Ｗに浸漬されている。即ち、培養液供給配管７４ａの他端は、培養液Ｗの供給口７６ａとされている。また、上記培養液排出配管７４ｂの他端は、上記シリンジピストンポンプ７１を介在して培養液タンク７５内に挿通されている。即ち、培養液排出配管７４ｂの他端は、培養液Ｗの排出口７６ｂとされている。
【００２５】
上記シリンジピストンポンプ７１は、圧力変動を発生せずに培養液Ｗを送液する無脈動循環ポンプであり、内部に上下移動なピストン７１ａを有している。また、培養液排出配管７４ｂには、シリンジピストンポンプ７１を挟んで電磁弁８０、８１が介在されている。一方の電磁弁８０は、培養液タンク側７５に介在され、他方の電磁弁８１は、培養容器１０側に介在されている。これら、ピストン７１ａ及び両電磁弁８０、８１は、パーソナルコンピュータ（以下ＰＣ）１２０によって総合的に制御されている。
例えば、一方の電磁弁８０を閉状態、他方の電磁弁８１を開状態としてシリンジピストンポンプ７１内に培養液Ｗを充填するようにピストン７１ａを作動（紙面に対して上方向）させると、供給口７６ａから培養液Ｗが吸い込まれ、培養容器１０の内部空間１４内に培養容器供給配管７４ａから培養液Ｗを供給する流れとなる。
このように、培養液Ｗは、シリンジピストンポンプ７１及び両電磁弁８０、８１により、供給口７６ａから培養液供給配管７４ａ内を流れて培養容器１０内に供給された後、培養液排出配管７４ｂを流れて排出口７６ｂから再び培養液タンク７５に戻ってくる循環式とされている。
また、培養液Ｗの流速は、ピストン７１ａの移動速度を変化させることで、任意の流速、例えば、１ｍｌ／３０ｍｉｎ程度の低速度等の流速に自由に設定することが可能である。なお、上述したタイミングを反転させることにより、培養液Ｗの供給排出方向を切り替えることも可能である。
【００２６】
上記培養液タンク７５は、熱伝導性に優れた材料、例えば、耐食性ステンレスやガラス等で内部を密閉するように形成されている。また、培養液タンク７５には、内部に新たな培養液Ｗを供給するタンク供給配管８２及び培養液タンク７５から培養液Ｗを排出するタンク排出配管８３が設けられている。なお、タンク排出配管８３は、培養液タンク７５の底面付近に位置するように設けられている。上記タンク供給配管８２は、基端が図示しない培養液供給源に接続されており、タンク供給ポンプ８２ａにより培養液Ｗを培養液供給源から培養液タンク７５内に供給可能とされている。また、タンク排出配管８３は、基端が図示しない排出タンクに接続されており、タンク排出ポンプ８３ａにより培養液Ｗを培養液タンク７５から排出可能とされている。
上記タンク供給ポンプ８２ａ及びタンク排出ポンプ８３ａは、ＰＣ１２０によって駆動が制御されており、ＰＣ１２０からの信号を受けて自動的に培養液タンク７５内の培養液Ｗを交換したり、補充することが可能である。
【００２７】
また、上述した培養液供給配管７４ａ及び培養液排出配管７４ｂの周囲には、ほぼ全長に渡って両配管７４ａ、７４ｂを加温する上記筒形状ヒータ９１が配設されている。該筒形状ヒータ９１は、両配管７４ａ、７４ｂを加温することで、内部を流れる培養液Ｗを加温し、該培養液Ｗを介して培養容器１０を加温する機能を有している。この筒形状ヒータ９１は、ＰＣ１２０により温度制御されている。
【００２８】
また、培養液タンク７５には、該培養液タンク７５内に規定濃度（例えば、５％）の二酸化炭素を供給する二酸化炭素供給配管８５が設けられている。この二酸化炭素供給配管８５は、外部に配された図示しない二酸化炭素供給源より二酸化炭素を供給している。また、培養液タンク７５の下方には、上記培養液タンクヒータ９２が設けられている。該培養液タンクヒータ９２は、熱伝導性に優れた培養液タンク７５を介して内部の培養液Ｗを加温する機能を有している。なお、この培養液タンクヒータ９２は、ＰＣ１２０により温度制御されている。
更に、培養液タンク７５内の底面には、磁界の回転により回転する攪拌子８６が回転可能に取り付けられており、培養液タンクヒータ９２の下部に取り付けられたマグネットスターラ８７からの磁界により回転するようになっている。即ち、これら攪拌子８６及びマグネットスターラ８７は、上記攪拌ユニット７２を構成している。
【００２９】
前述した筐体１００は、図２に示すように熱伝導性に優れたアルミ等の金属で形成されており、培養容器１０を設置している下面は、図示しない光学的に透明な薄板状のガラス又は穴が設けられている。これにより、筐体１００の下面から培養容器１０を観察可能とされている。また、筐体１００の上部には、ガラス部材１０１を有する蓋部材１０２が分離可能に取り付けられている。これにより、筐体１００の内部に培養容器１０を出し入れすることが可能である。
筐体１００の内部には、上記温度センサ７３及び上記光遮断手段４０が配設されている。温度センサ７３は、例えば、バネ部材等に固定されバネ力を利用して接触するような可動式であり、培養容器１０が設置された際に培養容器１０の側面に接触して温度を測定するようになっている。この温度センサ７３は、測定した培養容器１０の温度をＰＣ１２０に送る機能を有している。
【００３０】
上記光遮断手段４０は、図４に示すように、培養容器１０の周囲を遮光する遮光ユニット４１と、培養容器１０を遮光ユニット４１の内部に搬送する培養容器搬送手段４２を有している。
遮光ユニット４１は、光学的に光を透過しない材料により断面視コ型形状で内部に培養容器１０を収納可能な大きさに形成され、開口部４１ａを培養容器１０側に向けて筐体１００内に固定されている。また、開口部４１ａの高さは、培養容器１０の厚さとほぼ同一の高さになるように形成されている。即ち、図５に示すように、遮光ユニット４１は、培養容器１０の上下面に配されている一対のガラス部材１５の全面積を遮光して、室内光等の環境光Ｌが内部空間１４に入り込むことを防止する機能を有している。
【００３１】
また、図４（ｂ）に示すように、遮光ユニット４１と培養容器１０との間には、ボールネジ４３が設けられており、該ボールネジ４３は培養容器１０の図示しない係止部に回転可能に係止されている。該ボールネジ４３の一端は、モータ４４に連結されている。つまり、モータ４４を駆動させてボールネジ４３を回転させることにより、培養容器１０を筐体１００内の観察位置から遮光ユニット４２内に移動して収納できるようになっている。即ち、これらボールネジ４３及びモータ４４は、上記培養容器搬送手段４２を構成している。また、モータ４４は、ＰＣ１２０によって駆動が制御されている。
【００３２】
また、図２に示すように、筐体１００内の内側側面の全周には、筐体１００自体及び筐体１００の内部空間を加温する筐体加温ヒータ１０３が配設されている。この筐体加温ヒータ１０３は、ＰＣ１２０により温度制御されている。更に、筐体１００の内側には、筐体１００内部の空気を攪拌するファン１０４が設けられている。即ち、ファン１０４は、筐体加温ヒータ１０３で加温された筐体１００内の空気を、温風として培養容器１０の外表面に向けて送風する機能を有している。なお、このファン１０４は、ＰＣ１２０によって作動が制御され、温風を送風する量が制御されている。
なお、筐体１００の外部には、筐体加温ヒータ１０３の出力線、ファン１０４の電源線、培養液供給配管７４ａ及び培養液排出配管７４ｂを接続する図示しないコネクタ等の接続部が設けられており、外部と内部とを確実且つ容易に接続している。また、培養液供給配管７４ａは、培養容器１００の周囲を、例えば、一周回転するように筐体１００内に配設されている。
これら、筐体１００、筐体加温ヒータ１０３及びファン１０４は、上記培養容器加温ユニット９３を構成している。
【００３３】
また、図１に示すように、筐体１００の下部には、細胞Ａの画像や蛍光強度等を検出する対物レンズ１１０が配設され、筐体１００の上部には、位相差測定や微分干渉測定等により、細胞Ａの画像を取得するために該細胞Ａに光を照射する透過光源１１１が配設されている。対物レンズ１１０で検出された細胞Ａの画像イメージは、図示しないＣＣＤ等を介してＰＣ１２０に電子画像として記録されるようになっている。また、細胞Ａ内の蛍光標識の発現等を観察する場合には、特定波長の光が対物レンズ１１０を通して落射されると共に、細胞Ａから発せられた蛍光成分を含む光を対物レンズ１１０で捕らえる。そして、図示しない波長選択フィルタ等により、検査に必要な蛍光のみをＣＣＤやフォトマルチプレイヤやフォトダイオード等の光強度検出素子により蛍光強度を数値化し、ＰＣ１２０に記録するようになっている。即ち、これら対物レンズ１１０、透過光源１１１及びＰＣ１２０は、上記検出手段３０を構成している。
【００３４】
また、対物レンズ１１０及び透過光源１１１は、上述したように細胞Ａから蛍光強度等の特徴量を検出することに加え、培養容器１０内の培養液Ｗの自家蛍光量を測定する機能も有している。即ち、図６に示すように、対物レンズ１１０により培養容器１０内に満たされている培養液Ｗを下方から観察して自家蛍光量を検出する。また、測定した培養液Ｗの自家蛍光量は、ＰＣ１２０に送られるようになっている。即ち、これら対物レンズ１１０及び透過光源１１１は、上記測定手段５０を構成している。
【００３５】
上記ＰＣ１２０は、上述した各構成品を総合的に制御する機能を有していると共に、温度センサ７３で測定した培養容器１０の温度に基づいて、該培養容器１０の温度が所定温度、例えば、３７℃になるように上記加温手段９０を温度制御する機能を有している。即ち、ＰＣ１２０は、筒形状ヒータ９１、培養液タンクヒータ９２、培養容器加温ユニット９３を総合的に制御している。
【００３６】
また、ＰＣ１２０は、培養液Ｗが劣化しているか否かを判別する上記判別部６０を有している。該判別部６０は、上記測定手段５０から送られてきた培養液Ｗの自家蛍光量を蓄積すると共に強度に応じた測定値に変換して、予め設定されている閾値と比較することにより培養液Ｗの劣化を判別する機能を有している。また、判別部６０は、培養液Ｗが劣化していると判断した場合には、タンク供給ポンプ８２ａ及びタンク排出ポンプ８３ａを作動させて、培養液タンク７５内の培養液Ｗを自動的に交換又は補充すると共に、シリンジピストンポンプ７１を作動させて培養容器１０内に新たな培養液Ｗを供給する機能を有している。即ち、判別部６０、タンク供給ポンプ８２ａ、タンク排出ポンプ８３ａ、シリンジピストンポンプ７１、培養液供給配管７４ａ及び培養液排出配管７４ｂは、自動的に培養液Ｗを交換又は補充する培養液交換手段１２５を構成している。
なお、培養液タンク７５、培養液供給配管７４ａ、培養液排出配管７４ｂ、両電磁弁８０、８１及び二酸化炭素供給配管８５も、上記培養手段２０を構成している一部である。
【００３７】
このように構成された細胞培養検出装置１により、培養中の細胞Ａから細胞画像や蛍光標識による蛍光強度等の特徴量を検出する場合について以下に説明する。
まず、培養容器１０を筐体１００内に収納する前の初期設定として、ＰＣ１２０は、タンク供給ポンプ８２ａを作動して培養液供給源から培養液タンク７５内に培養液Ｗを供給口７６ａより上面になるまで供給する。
【００３８】
培養液タンク７５内に保持された培養液Ｗは、培養液タンクヒータ９２により、培養容器１０の所定温度（例えば、３７℃）より高めであって組成を傷めない程度の温度に加温される。つまり、培養容器１０までの送液過程の冷却作用を考慮して高めの温度に設定している。また、同時に二酸化炭素供給配管８５より所定濃度（例えば、５％）の二酸化炭素を培養液タンク７５内に供給すると共に、攪拌ユニット７２の攪拌子８６を回転して、培養液Ｗ内に均一に所定濃度の二酸化炭素を溶け込ませる。
【００３９】
更に、ＰＣ１２０は、筒形状ヒータ９１を培養液供給配管７４ａ及び培養液排出配管７４ｂを培養容器１０の所定温度（例えば、３７℃）より高めの温度になるように温度制御する。つまり、上述した培養液タンクヒータ９２と同様に、冷却作用を考慮して高めの温度に設定している。
また、ＰＣ１２０は、筐体加温ヒータ１０３を所定温度（例えば、３７℃）になるように温度制御して、筐体１００を伝熱的に加温すると共に、筐体１００内の内部空気を加温する。なお、筐体１００に対する外面からの冷却作用を低減するために、筐体１００の外周面に断熱部材等を設けても構わない。
【００４０】
上述した初期設定の終了後、筐体１００内に細胞を保持している培養容器１０を収納する。培養容器１０を収納すると、温度センサ７３が培養容器１０の外表面に接触して該培養容器１０の温度を測定し、測定結果をＰＣ１２０に送る。また、ＰＣ１２０は、モータ４４によりボールネジ４３を回転させ培養容器１０を遮光ユニット４１内に収容する。
更に、ＰＣ１２０は、シリンジピストンポンプ７１のピストン７１ａ及び両電磁弁８０、８１を総合的に制御しながら作動させ、培養液Ｗを循環させる。即ち、供給口７６ａから培養液Ｗを培養液供給配管７４ａ内に取り込んで、培養容器１０の内部空間１４内に培養液供給口１２ａから供給し、培養液排出口１２ｂから培養液排出配管７４ｂ内を流して排出口７６ｂより培養液タンク７５内に再度戻して循環する。
【００４１】
この際、培養液Ｗは、例えば、１ｍｌ／３０ｍｉｎ位の低速度で且つ無脈動状態で培養容器１０内を流れている。即ち、培養液Ｗは、細胞Ａに圧力波動を与えずに循環している。これにより、例えば、ＨＥＫ２９３細胞等の接着性の弱い細胞であっても、接着性に影響を与えず剥離を防止することができる。また、細胞Ａは、培養過程において細胞周期により、分裂したり、大きさや形状を変化させながら育成している。ここで、圧力波動が変化した場合には、細胞膜表面に外力を作用させることになる。すると、細胞Ａは、外力による刺激に対して防衛的になり、分裂や形状の変化等を停止する可能性がある。ところが、本実施形態においては、シリンジピストンポンプ７１により、圧力波動を変化させずに培養液Ｗを循環するので、上述したような細胞にかかる負担を低減しながら循環培養により細胞Ａに適時栄養分を供給しながら育成することができる。
更に、培養液Ｗは、循環しているので、細胞から排出されるタンパク質等の相互作用物質を完全に入れ替えずに再度利用でき、個々の細胞Ａの育成に必要な細胞間相互作用を維持した培養が可能となり、より効率よく細胞Ａを培養することができる。
【００４２】
また、ＰＣ１２０は、温度センサ７３から培養容器１０の温度が送られてくると、該温度に基づいて上記培養液タンクヒータ９２、筒形状ヒータ９１、筐体加温ヒータ１０３及びファン１０４を総合的に制御して、培養容器１０の温度を所定温度（例えば、３７℃）に維持する。つまり、外部の環境温度変化や所定温度値に応じて、例えば、培養液タンクヒータ９２だけをＯＮ／ＯＦＦしたり、筒形状ヒータ９１の温度をより高めに設定する等の作動を適時組み合わせて、高精度に培養容器１０の温度を所定温度に維持する。これにより、培養容器１０内の細胞への温度による負担を確実に低減することができる。
このように、細胞Ａは、培養容器１０内で最適な培養温度及び二酸化炭素濃度で循環培養方式により培養されている共に、図５に示すように遮光ユニット４１内によって室内光等の環境光Ｌから遮光された暗室状態で光毒性の影響を受けずに培養されている。従って、細胞Ａに負担をかけずに長期間の培養を行なうことができる。
【００４３】
ここで、細胞Ａの特徴量検出を行なう場合には、ＰＣ１２０によりモータ４４を介してボールネジ４３を回転させ、培養容器１０を遮光ユニット４１内から筐体１００の観察面に移動させる。次いで、図３に示すように、ＸＹステージを移動させて、対物レンズ１１０の真上に観察対象の細胞Ａを位置させる。そして、透過光源１１１より励起光等の光を照射し、該照射によって細胞から発せられた蛍光を対物レンズ１１０で検出することにより、細胞Ａの蛍光強度を検出することができる。また、対物レンズ１１０により、細胞Ａの細胞画像等も検出することが可能である。更に、ＸＹステージを移動させることで、培養容器１０内の各細胞Ａの細胞画像や蛍光強度等の特徴量を検出することができる。
【００４４】
なお、特徴量検出の際、図６に示すように、細胞Ａの特徴量検出を行なう前に、細胞Ａから外れた位置に光を照射して対物レンズ１１０によりバックグラウンドを測定し、その後、細胞Ａの特徴量検出を行なっても構わない。この場合には、検出した細胞Ａの特徴量から不要なバックグラウンド成分の除去が行なえるので、より正確な細胞Ａの特徴量検出を行なうことができる。
【００４５】
細胞Ａの特徴量検出後、再度培養容器搬送手段４２により培養容器１０を、遮光ユニット４１内に収容する。こうすることで、特徴量検出時以外、細胞Ａを環境光Ｌから遮光して光毒性の影響を低減させるので、細胞Ａの負担が減り長期的な細胞培養を確実に行なうことができる。また、培養容器搬送手段４２により、容易に培養容器１０を遮光ユニット４１に出し入れ可能であるので、培養過程において必要時にリアルタイムで細胞Ａの特徴量検出を行なうことができる。
【００４６】
また、細胞Ａの培養中において、循環している培養液Ｗを常に劣化していない最適な状態に維持することが可能である。
即ち、培養初期段階において、図６に示すように、対物レンズ１１０により培養液Ｗの自家蛍光強度を測定し、ＰＣ１２０の判別部６０に送る。該判別部６０は、送られてきた自家蛍光強度を、強度に応じた測定値に変換すると共に蓄積する。そして、細胞Ａの培養過程の経過と共に、対物レンズ１１０により適宜培養液Ｗの自家蛍光強度を測定する。例えば、細胞Ａの特徴量検出に合わせて行なっても構わないし、ある一定時間毎に培養液Ｗの自家蛍光強度だけを測定して構わない。
このように測定されて判別部６０に蓄積された自家蛍光強度は、時間の経過と共に測定値が増加する。つまり、培養過程において細胞Ａは、細胞間相互作用物質を排出すると共に老廃物も培養液Ｗに排出する。これに伴って、培養液Ｗ内の栄養分が減少する。これらの相互作用の結果、培養液Ｗが劣化して自家蛍光強度が増加している。
【００４７】
そして、判別部６０は、送られてきた測定値と予め設定された閾値とを比較して、測定値が閾値以上の値になったときに、培養液Ｗが劣化したと判断する。劣化を判断すると判別部６０は、培養液供給ポンプ８２ａを作動させて、培養液供給源から新たな培養液Ｗを培養液タンク７５内に補充する。これにより、培養液タンク７５内の培養液Ｗに、劣化していない新たな培養液が混ざるので、全体的に培養液Ｗの劣化が緩和する。
【００４８】
また、判別部６０が、例えば、送られてきた測定値が閾値よりはるかに大きな値であり、その差が設定された値以上である場合には、培養液Ｗが著しく劣化していると判断して、培養液供給ポンプ８２ａを作動して新たな培養液Ｗを供給すると共に培養液排出ポンプ８３ａも作動させて培養液タンク７５から今まで使用していた培養液Ｗを排出して、必要量培養液Ｗを交換する。
この際、ＰＣ１２０は、図示しない液面センサ等により、培養液Ｗの液面が供給口７６ａより下方に下がらないように培養液供給ポンプ８２ａ及び培養液排出ポンプ８３ａを制御している。これにより、供給口７６ａから空気が吸い込まれて、気泡が培養容器１０内に入り込まないようになっている。
【００４９】
上述したように、この細胞培養検出装置１においては、培養手段２０により細胞Ａを培養容器１０内で所定の培養条件、例えば、温度３７℃、二酸化炭素濃度５％に維持すると共に随時栄養素を供給する循環培養方式により細胞Ａを培養することができる。特に、細胞Ａの特徴量検出を行なわないときは、光遮断手段４０により培養容器１０を室内光等の環境光Ｌから遮光するので、光照射による光毒性の影響をなくし、細胞Ａへの負担を低減することができる。従って、細胞Ａを長期的に培養しながら、検出手段３０により細胞Ａから蛍光強度等の特徴量を正確且つリアルタイムに測定することができる。
また、測定終了後、培養容器搬送手段４０により、培養容器１０を容易に遮光ユニット４１内に収容できるので、光毒性の影響を可能な限り低減することができる。
【００５０】
また、シリンジピストンポンプ７１により、培養液Ｗを循環するので、細胞Ａから排出される相互作用物質を完全に入れ替えずに、個々の細胞育成に必要な細胞間相互作用を維持した培養を行うことができる。この際、攪拌ユニット７２により、培養液Ｗの二酸化炭素濃度を最適な培養濃度で均一に維持することができるので、細胞Ａにかける負担を確実に低減して培養を行なうことができる。
更に、シリンジピストンポンプ７１により、圧力変動を与えずに培養液Ｗを循環するので、培養容器内の細胞に不要な圧力波動を与えることはない。これにより、例えば、細胞Ａの剥離を防止したり、圧力波動による刺激を与えないので、培養液Ｗの圧力変化による細胞Ａへの負担を低減することができる。
更に、温度センサ７３で測定した培養容器１０の温度に基づいて加温手段９０、即ち、筐体加温ヒータ１０３、ファン１０４、筒形状ヒータ９１及び培養液タンクヒータ９２を総合的に温度制御するので、培養容器１０を、例えば３７℃の高精度に維持でき、培養容器１０内の細胞Ａへの温度による負担を低減することができる。
【００５１】
また、細胞Ａの培養過程において、培養測定手段５０により、培養液Ｗの自家蛍光強度を測定し、該自家蛍光強度に基づいて判別部６０が培養液Ｗの劣化状態を判別し、劣化していると判断した場合には、培養液交換手段１２５により、培養液Ｗの補充や交換を行い劣化していない最適な状態に維持しながら細胞培養を行なえる。従って、常に最適な培養液中で細胞培養でき、培養液Ｗの劣化による細胞Ａへの負担を低減することができる。特に、培養液交換手段１２５により自動的に培養液Ｗの交換等を行なうので、常に一定の培養条件を維持を行なえる。
上述したように、ＸＹステージ上で細胞Ａの負担を低減して、長期間の培養を行なえるので、リアルタイムで細胞Ａの経時的変化を測定したり、培養過程で生じる変化等を容易に検出することができると共に、常に活性化（安定化）した細胞Ａの挙動を正確に検出することができる。
【００５２】
次に、本発明の第２実施形態を、図７を参照して説明する。なお、この第２実施形態においては、第１実施形態における構成要素と同一の部分については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第２実施形態と第１実施形態との異なる点は、第１実施形態では、培養容器搬送手段４２により培養容器１０を移動させて、遮光ユニット４１内に出し入れしていたのに対し、第２実施形態の光遮断手段１３０では、遮光ユニット１３１を移動させて培養容器１０を遮光する点である。
【００５３】
即ち、図７に示すように、光遮断手段１３０は、培養容器１０の周囲を遮光する遮光ユニット１３１、培養容器１０を遮光ユニット１３１の周囲に搬送する遮光ユニット搬送手段１３２を備えている。上記遮光ユニット１３１は、軸部材１３１ａ及び一対の薄板部材１３１ｂを有しており、断面視コ型形状で開口部が培養容器１０に向くように、また、内部に培養容器１０を収納可能な大きさになるように、軸部材１３１ａの上下に薄板部材１３１ｂの一端側が取り付けられている。なお、遮光ユニット１３１の内面に、低反射部材のスポンジ等を取り付けて、外部からの環境光Ｌの遮光性を高めても構わない。
【００５４】
上記軸部材１３１ａは、一端が延在しており、該軸部材１３１ａに直交するように配設されたボールネジ１３３に係止されている。また、該ボールネジ１３３の基端は、筐体１００内に固定されたモータ１３４に回転可能に支持されている。また、モータ１３４はＰＣ１２０により作動が制御されている。即ち、これらボールネジ１３３及びモータ１３４は、上記遮光ユニット搬送手段１３２を構成している。なお、培養容器１０は、筐体１００内の観察面に固定されている。
【００５５】
このように構成された光遮断手段１３０においては、細胞Ａの特徴量検出以外は、培養容器１０の周囲に遮光ユニット１３１を位置させて、環境光Ｌから細胞Ａを遮光する。また、細胞Ａの検出を行なう場合には、ＰＣ１２０によりモータ１３４を駆動してボールネジ１３３を回転させることにより、遮光ユニット１３１を移動して培養容器１０を露出させた後、観察を行なうことができる。
このように、遮光ユニット搬送手段１３２によって、容易且つ確実に培養容器１０を遮光することができ、内部の細胞Ａへの光毒性の影響を低減することができる。また、培養容器１０を移動する必要がないので、より細胞Ａにかかる負担を低減することができる。
【００５６】
次に、本発明の第３実施形態を、図８及び図９を参照して説明する。なお、この第３実施形態においては、第１実施形態における構成要素と同一の部分については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第３実施形態と第１実施形態との異なる点は、第１実施形態では、培養液Ｗを循環させながら細胞Ａを培養していたのに対し、第３実施形態の細胞培養検出装置１４０では、培養液Ｗを循環させずに細胞Ａを培養する点である。
【００５７】
即ち、図８及び図９に示すように、細胞培養検出装置１４０は、細胞Ａを培養液Ｗと共に収容する９６穴マイクロプレート（培養容器）１５０と、該細胞Ａを所定の培養条件で培養する培養手段１６０と、培養中の細胞Ａから該細胞Ａの特徴量を検出しないときに９６穴マイクロプレート１５０を環境光Ｌから遮断する筐体カバー（光遮断手段）１７０と、細胞Ａから特徴量を検出する検出手段３０と、培養液Ｗの自家蛍光量を測定する測定手段５０と、該測定手段５０による測定結果に基づいて培養液Ｗが劣化しているか否かを判別する判別部６０とを備えている。
【００５８】
上記９６穴マイクロプレート１５０は、筐体１４１内部に配設されている図示しない顕微鏡ステージ上に載置されている。この９６穴マイクロプレート１５０は、図９に示すように、樹脂製のプレート１５１に、約９ｍｍ間隔で区切られた穴１５２が９６個形成されており、各穴１５２内に細胞Ａ及び培養液Ｗを収容可能である。また、プレート１５１の底面は、光学的平面を有するガラス部材となっており、下面から対物レンズ１１０で各穴１５２内の細胞Ａを観察可能とされている。
【００５９】
また、９６穴マイクロプレート１５０は、図８に示すように加温手段の１つである加温ヒータ（培養容器加温ユニット）１４３により伝熱的に加温されるようになっている。なお、加温ヒータ１４３は、ＰＣ１２０により温度制御されている。更に、９６穴マイクロプレート１５０は、温度センサ１４４により温度が測定されており、ＰＣ１２０に測定結果が送られている。
【００６０】
上記筐体１４１内には、培養液Ｗを保持する培養液タンク７５、不要な培養液Ｗを貯液する培養液排出タンク１４６、外部に配された二酸化炭素供給源から筐体１４１内に所定濃度（例えば、５％）の二酸化炭素を供給する二酸化炭素供給配管１４７、筐体１４１内の内部空気を対流させるファン１４８、培養液Ｗを分注する分注ユニット１８０が設けられている。更に、筐体１４１の周囲には、該筐体１４１の内部空間を加温するための加温手段の１つである筐体加温ヒータ（培養液加温ユニット）１４９が設けられ、ＰＣ１２０によって温度制御されている。つまり、筐体１４１内は、上記二酸化炭素供給配管１４７により所定濃度の二酸化炭素が充満していると共に、筐体加温ヒータ１４９及びファン１４８によって加温された空気が対流して所定温度（例えば、３７℃）の均一温度に維持されている。従って、９６穴マイクロプレート１５０の各穴１５２内に収容されている培養液Ｗは、例えば、温度３７℃、二酸化炭素濃度５％の状態に維持されている。
【００６１】
上記培養液タンク７５は、９６穴マイクロプレート１５０の一方側に隣接するように配置されている。この培養液タンク７５に保持された培養液Ｗは、培養液タンクヒータ９２によって加温されており、攪拌ユニット７２によって均一に所定濃度の二酸化炭素を含んでいる。
上記培養液排出タンク１４６は、９６穴マイクロプレート１５０の他方側に隣接するように配置されている。
【００６２】
上記分注ユニット１８０は、筐体１４１の上方に設けられており、筐体１４１内を水平方向且つ上下方向に移動可能な分注ノズル１８１を有している。即ち、分注ノズル１８１は、培養液タンク７５及び培養液排出タンク１４６間を移動すると共に、９６穴マイクロプレート１５０の各穴１５２を移動して走査できるようになっている。また、分注ノズル１８１は、内部に培養液Ｗを吸引及び吐出することができ、加温手段の１つである筒形状ヒータ（培養液加温ユニット）１８２によって内部に吸引した培養液Ｗを加温できるようになっている。この筒形状ヒータ１８２は、ＰＣ１２０によって温度制御されている。
なお、分注ユニット１８０は、分注ノズル１８１の他に、図示しない配管、シリンジピストンポンプ、電磁弁、走査軸ユニット等を有している。
【００６３】
上記筐体カバー１７０は、光学的に光を透過させない材料で筐体１４１を周囲から覆う大きさに形成されており、図示しない筐体カバー搬送手段によって筐体１４１を覆い、筐体１４１内部を暗室状態にして外部からの環境光Ｌから遮光できるようになっている。
上述した筐体１４１、培養液タンク７５、培養液排出タンク１４６、二酸化炭素供給配管１４７、ファン１４８、分注ユニット１８０、攪拌ユニット７２、加温ヒータ１４３、筐体加温ヒータ１４９、培養液タンクヒータ９２及び筒形状ヒータ１８２は、上記培養手段１６０を構成している。
なお、本実施形態においては、判別部６０が、培養液Ｗが劣化していると判断した場合には、分注装置１８０を作動させて培養液Ｗを自動的に補充又は交換するように設定されている。
【００６４】
このように構成された細胞培養検出装置１４０においては、９６穴マイクロプレート１５０の各穴１５２内に培養液Ｗ及び細胞Ａ収容し、筐体１４１内に載置した後、筐体カバー搬送手段により筐体１４１の周囲を筐体カバー１４８で覆う。また同時に、ＰＣ１２０は、温度センサ１４４から送られてきた９６穴マイクロプレート１５０の温度に基づいて、該９６穴マイクロプレート１５０の温度が、所定温度（例えば３７℃）になるように、加温ヒータ１４３、筐体加温ヒータ１４９及びファン１４８を総合的に制御する。
これにより、細胞Ａは、例えば、温度３７℃、二酸化炭素５％で且つ、環境光Ｌが遮断された暗室状態で光毒性の影響を受けずに培養されている。
【００６５】
また、ＰＣ１２０は、培養液タンクヒータ９２及び攪拌ユニット７２を制御して、培養液タンク７５内の培養液Ｗを所定温度（例えば、３７℃）より高めであって組成を傷めない程度に加温すると共に、所定濃度（例えば、５％）の二酸化炭素濃度を溶け込ませる。更に、ＰＣ１２０は、筒形状ヒータ１８２を温度制御して、分注ノズル１８１を所定温度（例えば、３７℃）より高めに加温する。
つまり、９６穴マイクロブレート１５０までの間の冷却作用を考慮して、高めの温度に設定されている。
【００６６】
ここで、細胞Ａの特徴量検出を行なう場合には、筐体カバー搬送手段により筐体カバー１７０を筐体１４１の周囲から移動させる。次いで、顕微鏡ステージを走査しながら、透過光源１１１より励起光を照射し、細胞Ａから発せられた蛍光を対物レンズ１１０で検出することにより、細胞Ａの蛍光強度を検出することができる。また、細胞Ａの細胞画像を検出することも可能である。
細胞Ａの特徴量検出後、筐体カバー搬送手段により筐体カバー１７０を移動させて筐体１４１の周囲を覆う。こうすることで、特徴量検出以外、細胞Ａを環境光Ｌから遮光して光毒性の影響を低減させるので、細胞Ａの負担が減り長期的な細胞培養を確実に行なうことができる。
【００６７】
また、細胞Ａの培養中において、培養液Ｗの劣化状態に応じて、培養液Ｗを補充又は交換することが可能である。即ち、判別部６０は、対物レンズ１１０から送られてきた培養液Ｗの自家蛍光強度が予め設定された閾値以上の値となり、培養液Ｗが劣化していると判断した場合には、分注ユニット１８０を作動させる。分注ユニット１８０は、ＰＣ１２０からの信号を受けると、分注ノズル１８１を培養液タンク７５に移動させ、内部に培養液Ｗを吸引する。吸引後、分注ノズル１８１を９６穴マイクロプレート１５０の穴１５２に移動させ、吸引した培養液Ｗを吐出して補充する。これにより、穴１５２内に劣化していない新たな培養液Ｗが混ざるので、全体的に培養液Ｗの劣化が緩和する。
また、培養液Ｗが著しく劣化していると判断した場合には、培養液Ｗを交換することも可能である。即ち、分注ノズル１８１により、穴１５２内の劣化している培養液Ｗを培養液排出タンク１４５に排出した後、培養液タンク７５から新たな培養液Ｗを吐出する。
なお、培養液Ｗは、分注ノズル１８１によって吸引され移動している間、筒形状ヒータ１８２によって加温されているので、各穴１５２に吐出される直前まで、培養液タンク７５内に保持されていたときの所定温度が維持されている。従って、細胞Ａの温度による負担を減らすことができる。
【００６８】
また、９６穴マイクロプレート１５０の各穴１５２内に異なる数の細胞Ａを培養したり、異なる種類の細胞Ａを培養する場合、培養液Ｗの劣化速度が異なるが、本実施形態においては、各穴１５２毎に培養液Ｗの劣化を検出すると共に、培養液Ｗを各穴１５２毎に選択的に補充又は交換することが可能である。つまり、細胞間相互作用物質を安易に入れ替えてしまうことを防止することができる。
【００６９】
この細胞培養検出装置１４０においては、筐体１４１内で細胞Ａの負担を低減して長期間の培養を行なうことができる。特に、９６穴マイクロプレート１５０の各穴１５２内で異なる数の細胞Ａや、異なる種類の細胞Ａを長期間培養することができるので、リアルタイムで、細胞数、細胞種類による経時的変化や、培養過程で生じる変化等を容易に検出することができると共に、常に活性化（安定化）した培養細胞の挙動を正確に検出することができる。
【００７０】
なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の変更を加えることが可能である。
なお、第１実施形態においては、培養液タンク内に保持されている培養液の二酸化炭素濃度を均一にするため、攪拌ユニットを採用したが、これに限られず、二酸化炭素濃度を均一にする構成であれば構わない。例えば、培養液タンク全体を揺動して攪拌する揺動攪拌方式や、超音波の照射によって攪拌する超音波攪拌方式等の攪拌方式を採用しても良い。
【００７１】
更に、判別部が、培養液が劣化していると判断したときに、培養液交換手段を作動させて、培養液の補充又は交換を行なったが、警報を発するように構成しても構わない。
即ち、図１０に示すように、判別部６０は、培養液Ｗが劣化していると判断したときに、警報を発するブザー（報知手段）６１を有している。これにより、例えば、観察者は、ブザー６１が鳴ったことを受けて、培養液Ｗが劣化したことを正確且つ容易に知ることができるので、培養液Ｗの交換等の必要な処理を効率良く行なうことができる。
なお、第１実施形態の細胞培養検出装置１に上記ブザー６１を同時に配設した構成にしても構わない。
【００７２】
また、上記第３実施形態においては、光遮断手段として、筐体カバーを採用したが、これに限られず、例えば、９６穴マイクロプレートのみを覆って環境光から遮断する構成にしても構わない。
また、培養液の乾燥蒸発を防止するため、筐体内部を高湿度に維持するようにしても良い。また、筐体内部を滅菌環境にしても良く、外部からの空気の流入個所にヘパフィルタを設けても良い。
【００７３】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る細胞培養検出装置によれば、培養手段により、細胞を培養容器内で所定の培養条件を維持しながら培養を行なえると共に、培養しながら検出手段により細胞の特徴量検出を行なえる。また、光遮断手段により培養容器を環境光から遮断するので、光照射による光毒性の影響を低減でき、生細胞にかかる負担を低減することができる。従って、細胞を培養容器内で確実に長期間培養することができ、培養中の細胞から蛍光強度等の特徴量を正確且つリアルタイムに測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る細胞培養検出装置の第１実施形態を示す構成図である。
【図２】図１に示す細胞培養検出装置の培養容器を筐体に設置した状態を示す斜視図である。
【図３】細胞の特徴量検出を行なっている状態を示す断面図である。
【図４】培養容器と光遮断手段との関係を示す図であって、（ａ）は培養容器及び遮光ユニットの側面図、（ｂ）は（ａ）の矢視Ｂ−Ｂ図である。
【図５】培養容器を遮光ユニット内に収容した状態を示す断面図である。
【図６】培養液の自家蛍光量を測定している状態を示す断面図である。
【図７】本発明に係る細胞培養検出装置の第２実施形態での培養容器と光遮断手段との関係を示す図であって、（ａ）は培養容器及び遮光ユニットの側面図、（ｂ）は（ａ）の矢視Ｃ−Ｃ図である。
【図８】本発明に係る細胞培養検出装置の第３実施形態を示す構成図である。
【図９】図８に示す９６穴マイクロプレートを示す図であって、（ａ）は断面図、（ｂ）は（ａ）の矢視Ｄ−Ｄ図である。
【図１０】本発明に係る細胞培養検出装置の判別部の変形例を示す図である。
【符号の説明】
Ａ 細胞
Ｌ 環境光
Ｗ 培養液
１、１４０ 細胞培養検出装置
１０ 培養容器
２０、１６０ 培養手段
３０ 検出手段
４０、１３０ 光遮断手段
４１、１３１ 遮光ユニット
４２ 培養容器搬送手段
５０ 測定手段
６０ 判別部（判別手段）
６１ ブザー（報知手段）
７１ シリンジピストンポンプ（無脈動循環ポンプ、循環ポンプ）
７２ 攪拌ユニット
７３、１４４ 温度センサ
９０ 加温手段
９１ 筒形状ヒータ（配管加温ユニット）
９２ 培養液タンクヒータ（培養液加温ユニット）
９３ 培養容器加温ユニット
１２５ 培養液交換手段
１３２ 遮光ユニット搬送手段
１４３ 加温ヒータ（培養容器加温ユニット）
１４９ 筐体加温ヒータ（培養液加温ユニット）
１５０ ９６穴マイクロプレート（培養容器）
１７０ 筐体カバー（光遮断手段）
１８２ 筒形状ヒータ（培養液加温ユニット）
Claims (10)
- 細胞を培養液と共に収容する培養容器と、
前記細胞を所定の培養条件で培養する培養手段と、
培養中の前記細胞から該細胞の特徴量を検出する検出手段と、
前記特徴量を検出しないときに、前記培養容器を環境光から遮断する光遮断手段とを備えていることを特徴とする細胞培養検出装置。 - 請求項１に記載の細胞培養検出装置において、
前記光遮断手段が、前記培養容器の周囲を遮光する遮光ユニットと、
前記培養容器を前記遮光ユニットの内部に搬送する培養容器搬送手段とを備えていることを特徴とする細胞培養検出装置。 - 請求項１に記載の細胞培養検出装置において、
前記光遮断手段が、前記培養容器の周囲を遮光する遮光ユニットと、
該遮光ユニットを前記培養容器の周囲に搬送する遮光ユニット搬送手段とを備えていることを特徴とする細胞培養検出装置。 - 請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞培養検出装置において、
前記培養手段が、前記培養液を循環する循環ポンプと、
前記培養液を攪拌して、該培養液内の二酸化炭素を所定濃度に維持する攪拌ユニットと、
前記培養液の温度を制御する培養液加温ユニットとを備えていることを特徴とする細胞培養検出装置。 - 請求項４に記載の細胞培養検出装置において、
前記循環ポンプが、圧力変動を発生せずに前記培養液を送液する無脈動循環ポンプであることを特徴とする細胞培養検出装置。 - 細胞を培養液と共に収容する培養容器と、
前記細胞を所定の培養条件で培養する培養手段と、
培養中の前記細胞から該細胞の特徴量を検出する検出手段とを備え、
前記培養手段が、前記培養容器の温度を測定する温度センサと、前記培養容器を加温する培養容器加温ユニット若しくは前記培養容器内に前記培養液を供給又は排出する配管を加温する配管加温ユニット若しくは前記培養液を加温する培養液加温ユニットの少なくともいずれか１つを有する加温手段とを有し、
前記温度センサで測定した温度に基づいて前記加温手段を所定温度になるよう温度制御することを特徴とする細胞培養検出装置。 - 細胞を培養液と共に収容する培養容器と、
前記細胞を所定の培養条件で培養する培養手段と、
培養中の前記細胞から該細胞の特徴量を検出する検出手段とを備え、
前記培養手段が、前記培養容器の温度を測定する温度センサと、前記培養容器を加温する培養容器加温ユニットとを有し、
該培養容器加温ユニットが、前記温度センサで測定した温度に基づいて温風を前記培養容器の外表面に向けて送風することを特徴とする細胞培養検出装置。 - 請求項１から６にいずれか１項に記載の細胞培養検出装置において、
前記培養液の自家蛍光量を測定する測定手段と、
該測定手段による測定結果に基づいて、前記培養液が劣化しているか否かを判別する判別手段とを備えていること特徴とする細胞培養検出装置。 - 請求項８に記載の細胞培養検出装置において、
前記判別手段が、前記培養液が劣化していると判断したときに、自動的に該培養液を交換又は補充する培養液交換手段を備えていること特徴とする細胞培養検出装置。 - 請求項８又は９に記載の細胞培養検出装置において、
前記判別手段が、前記培養液が劣化していると判断したときに、警報を発する報知手段を備えていること特徴とする細胞培養検出装置。
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- 2003-06-02 JP JP2003156795A patent/JP2004357523A/ja not_active Withdrawn
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