WO2021038997A1 - 細胞製造装置 - Google Patents

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WO2021038997A1
WO2021038997A1 PCT/JP2020/021241 JP2020021241W WO2021038997A1 WO 2021038997 A1 WO2021038997 A1 WO 2021038997A1 JP 2020021241 W JP2020021241 W JP 2020021241W WO 2021038997 A1 WO2021038997 A1 WO 2021038997A1
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cell
culture tank
medium
plate
tank
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PCT/JP2020/021241
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伴　一訓
木下　聡
剛士 田邊
亮二 平出
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ファナック株式会社
アイ ピース，インコーポレイテッド
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    • C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material

Definitions

  • the present invention relates to a cell production apparatus, and more particularly to a cell production apparatus that simultaneously performs heating required for culturing and cooling required for a medium in a cell production plate in which a plurality of functional sites are aggregated.
  • Embryonic stem cells are stem cells established from the early cups of humans and mice, and have pluripotency that allows them to differentiate into all cells existing in the living body.
  • Human ES cells are believed to be available for cell transplantation for many diseases such as Parkinson's disease, juvenile diabetes, and leukemia.
  • ES cell transplantation has the problem of inducing rejection, similar to organ transplantation.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Induced stem cells such as iPS cells are established by introducing inducing factors such as genes into cells, and are expanded and cryopreserved.
  • inducing factors such as genes
  • GLP clinical iPS cells
  • a clean room kept very clean is required, and a high maintenance cost is required.
  • the issue was how to improve the efficiency of clean room operation methods and strive to reduce costs.
  • iPS cells are mostly produced manually, there are few engineers who can produce clinical iPS cells. There is a problem that a series of operations from the establishment of stem cells to their preservation is complicated. In clinical cell culture, it is necessary to perform three steps: confirmation of standard process (SOP: Standard Of Process), operation according to SOP, and confirmation of whether or not it was carried out according to SOP. It is very unproductive for humans to perform these steps. Since cell culture needs to be managed 24 hours a day, and stem cells are preserved for decades, there is a limit to managing them by human resources alone.
  • SOP Standard Of Process
  • a closed cell production device that does not require a highly clean clean room and can work in a normally controlled area (for example, at least one of microorganisms and fine particles in the WHO-GMP standard is grade D level or higher).
  • a normally controlled area for example, at least one of microorganisms and fine particles in the WHO-GMP standard is grade D level or higher.
  • Patent Document 3 describes a pre-introduction cell delivery path, a factor introduction device that introduces a somatic cell inducer into a pre-introduction cell to produce an inducer-introduced cell, and a somatic cell by culturing the inducer-introduced cell.
  • a somatic cell production system in which a cell production device for a cell production is packaged in one housing is disclosed.
  • Patent Document 4 discloses a cell culture container in which the culture container and the flow path are closed, and the cell culture container eccentrically holds the second container in the first container to grow the cell culture. Can be clearly observed.
  • Patent Document 5 discloses a cell culture device in which a medium storage means, a cell inoculation means, and a culture container are configured as a closed system.
  • the cell culture device determines the cell culture status from the image of the cells in the culture vessel, and executes the culture operation based on this determination, thereby reducing the labor of the operator.
  • Patent Document 6 describes a transparent conductive film heater in which the temperature of the culture solution in the culture dish is controlled to a desired temperature, for example, 37 ° C., and a Petri dish in which the culture solution in the reservoir tank is controlled to a desired temperature, for example, 5-20 ° C.
  • a cell culture apparatus including the element, a transparent conductive film heater, and a temperature control unit for controlling the temperature of the Petri dish element is disclosed. It is described that the culture solution flowing out of the reservoir tank reaches a temperature close to room temperature by passing through a flow path until it reaches the supply port of the culture dish.
  • Patent Document 7 describes a temperature control system that controls a cell culture chamber, a buffer medium reeva, a piping system, etc. to an optimum temperature (37 ° C), and a temperature that controls an external fresh medium reeva and a separating agent to about 4 ° C-8 ° C.
  • An automated cell culture apparatus comprising a control system is disclosed.
  • Patent Document 8 includes a tubular object to be cultured, a chamber for accommodating the object to be cultured, and a circulation path for circulating the culture solution inside the object to be cultured, and the object to be cultured is provided from the inside.
  • a cell / tissue culture apparatus is disclosed in which a shear stress corresponding to the flow of a culture solution is applied as a physical stimulus together with necessary nutrients.
  • Patent Document 9 discloses a cell culture apparatus including a flow path integrated plate and a base plate.
  • the flow path integrated plate includes a flow path plate forming a flow path of the culture solution and a pump unit in which a group of peristaltic pumps for supplying and discharging the culture solution is arranged, and the base plate is provided with a drive source such as a motor. ing.
  • cell culture devices that integrally configure only cell culture functions such as medium storage reservoir, medium supply / discharge channel, and cell culture container, and cell initialization, reprogramming, and direct reprogramming by introducing an inducer.
  • cell-inducing functions such as programming, differentiation conversion, differentiation induction, fate conversion, and transformation.
  • One aspect of the present disclosure includes a cell-induced culture tank having a first side and a second side and performing at least one of cell induction and culture, and a medium storage tank for storing the medium supplied to the cell-induced culture tank.
  • a cell preparation plate provided, a heating element arranged near the first side of the cell preparation plate to heat the cell induction culture tank, and a heating element arranged near the second side of the cell preparation plate to cool the medium storage tank.
  • a cell manufacturing apparatus including a cooling element for culturing.
  • Another aspect of the present disclosure is a cell-induced culture tank having a first side and a second side and performing at least one of cell induction and culture, and a medium circulation path for circulating the medium supplied to the cell induction culture tank.
  • a cell preparation plate provided with, a heating element arranged near the first side of the cell production plate to heat the cell induction culture tank, and a medium circulation path arranged near the second side of the cell production plate.
  • a cell manufacturing apparatus including a cooling element for cooling.
  • the heating element and the cooling element are arranged on the cell production plate so as to be separated from each other, sufficient heat insulating property can be provided between them. This makes it possible to simultaneously perform the heating required for culturing and the cooling required for the circulating medium even in a cell preparation plate in which a plurality of functional sites are aggregated.
  • the term "closed” in this document means that contamination sources such as microorganisms and viruses do not invade the inside of the device and cause biological contamination, and / or the fluid inside the device (cells, microorganisms, virus particles, proteins, etc.) It means that (including substances such as nucleic acids) does not leak and cause cross-contamination, and / or that even if the fluid of the donor infected with the pathogen is handled inside the device, no biohazard is generated.
  • the device in this document may be configured so that a fluid that is not a pollution source, such as carbon dioxide, nitrogen, or oxygen, enters the device or leaks to the outside of the device.
  • FIG. 1 shows the configuration of the cell manufacturing apparatus 1 in this embodiment.
  • the cell manufacturing apparatus 1 is a cell conversion apparatus having a cell-inducing function of performing cell reprogramming, reprogramming, direct reprogramming, differentiation conversion, differentiation induction, fate conversion, transformation, etc. by introducing an inducing factor.
  • a cell culture apparatus having only a cell culture function for simply culturing, expanding culture, or the like may be used.
  • the cell manufacturing apparatus 1 injects a fluid containing original cells (for example, somatic cells such as blood cells and fibroblasts, or stem cells such as ES cells and iPS cells), and the target cells (for example, stem cells and precursor cells, etc.) are injected from the original cells.
  • original cells for example, somatic cells such as blood cells and fibroblasts, or stem cells such as ES cells and iPS cells
  • the target cells for example, stem cells and precursor cells, etc.
  • the final differentiated cells are produced and the fluid containing the target cells is discharged.
  • Target cells include fibroblasts, nerve cells, retinal epithelial cells, hepatocytes, ⁇ cells, renal cells, mesenchymal stem cells, blood cells, megacariosites, T cells, chondrocytes, myocardial cells, muscle cells, and vascular cells.
  • Epithelial cells, or differentiated cells such as other somatic cells may be produced.
  • the cell manufacturing apparatus 1 is a closed system cell processing apparatus in which all the parts that should be highly clean are integrated inside, and can be used in a normal controlled area.
  • the enclosed space inside the device should be configured so as not to exchange gases, viruses, microorganisms, impurities, etc. with the outside.
  • a fluid that is not a pollution source may be interchangeable between the inside and the outside of the device by additionally providing a fluid exchange filter or the like described later in the device.
  • the cell production apparatus 1 includes a cell production plate 2 and a closed connector 3.
  • the cell production plate 2 includes a closed fluid circuit 4 shielded from the external space S, and the fluid circuit 4 has a flow path in which a plurality of functional sites are highly integrated.
  • the closed connector 3 is a connector for injecting a fluid into the fluid circuit 4 or discharging the fluid from the fluid circuit 4, and is attached to the cell production plate 2.
  • the closed connector 3 is a connector for closedly connecting the fluid circuit 4 and the fluid container to the external space S, and may be, for example, a sterile connection connector, a needleless connector, a needle connector, a heat fusing tube, or the like.
  • the needleless connector may be a split septum type or a mechanical valve type.
  • the fluid container is a syringe, a variable volume bag, or the like, and the fluid circuit 4 communicates with the fluid container when the closed connector 3 and the fluid container are connected, while the fluid is connected when the closed connector 3 and the fluid container are not connected.
  • the circuit 4 is cut off from the external space S. This can prevent biological contamination, cross-contamination, and biohazard of the fluid circuit 4.
  • the cell manufacturing apparatus 1 preferably includes a plurality of closed connectors 3 in order to allow injection or discharge of a plurality of types of fluids.
  • FIG. 2 shows an example of the cell production plate 2.
  • the cell production plate 2 includes a flat plate 20 and a lid 21.
  • the flat plate 20 can be formed of, for example, a biologically safe resin, metal, or the like.
  • the flat plate 20 is preferably molded by molding processing using a mold, for example, injection molding, compression molding, or the like, but the flat plate 20 may be molded using a 3D printer or the like.
  • As the 3D printer various modeling methods such as stereolithography, fused deposition modeling, powder sintering, and inkjet can be adopted.
  • a groove 20a is provided as a flow path for flowing a fluid on at least one of the front surface and the back surface of the flat plate 20, and a fluid circuit 4 is formed by combining a plurality of grooves 20a. Further, a portion where the width or depth of the groove 20a is relatively large is provided in a part of the fluid circuit 4, and a storage tank 20b for temporarily storing the fluid is formed.
  • the walls of the groove 20a and the storage tank 20b may be coated with poly-HEMA (poly2-hydroxyethylmethacrylate) to make the cells non-adhesive.
  • the walls of the groove 20a and the storage tank 20b may be made low in protein adsorption.
  • At least a part of the groove 20a and the storage tank 20b is preferably white or black in order to observe changes over time in fluids, cells, cell clusters, etc. with an image recognition sensor, an ultrasonic recognition sensor, or the like.
  • the lid 21 may be made of, for example, a biologically safe resin, quartz glass, or the like.
  • the lid 21 (that is, at least a part of the cell preparation plate 2) is transparent because the change with time of the fluid, cells, cell mass, etc. in the fluid circuit 4 is observed by an image recognition sensor, an ultrasonic recognition sensor, or the like. Is preferable. This observation makes it possible to move to the next cell manufacturing process at an appropriate timing.
  • the lid 21 is fixed to the flat plate 20 so as to cover the fluid circuit 4 by a biologically safe fixing method such as chemical bond, welding bond, adhesive bond or the like.
  • a silane coupling agent, plasma irradiation or the like may be used.
  • the cell preparation plate 2 is sterilized by heat sterilization, gamma ray sterilization, ultraviolet ray sterilization, electron beam sterilization, or the like to bring the fluid circuit 4 into a highly clean state.
  • FIGS. 3A-3B show an example of a method of fixing the flat plate and the lid.
  • bank portions 20c are formed in advance on both sides of the groove 20a and the storage tank 20b, the flat plate 20 is covered with a lid 21, and at least the bank portion 20c is exposed to laser light, ultrasonic waves, or the like.
  • the groove 20a and the storage tank 20b may be sealed by irradiating or applying to heat the bank portion 20c and welding the flat plate 20 and the lid 21.
  • the flat plate 20 including the groove 20a and the storage tank 20b is covered with a lid 21, and at least a portion other than the groove 20a and the storage tank 20b is heated by irradiating or applying laser light, ultrasonic waves, or the like to the flat plate 20.
  • the groove 20a and the storage tank 20b may be sealed by welding the lid 21. In this case, all the portions other than the groove 20a and the storage tank 20b are fixed, so that the fixing strength is increased.
  • the fluid circuit 4 includes at least an injection / discharge unit 10 and a cell induction culture unit 13 as a plurality of functional sites.
  • the fluid circuit 4 may include a volume variable section 11, a transfer section 12, a fluid reservoir 14, a fluid mixing section 15, a cell separation section 16, and a cell mass crushing section 17. Since these plurality of functional sites are integrated in one cell production plate 2, a manufacturing process such as closedly connecting separate parts via a tube, a pump, a connector, or the like becomes unnecessary, and the cell manufacturing apparatus 1 is manufactured. Man-hours, manufacturing costs, etc. are reduced.
  • the injection / discharge unit 10 includes an injection / discharge channel for injecting or discharging a fluid into the fluid circuit 4 via the closed connector 3.
  • the injection / discharge unit 10 preferably includes a plurality of injection / discharge channels 10a-10f.
  • the first injection / discharge channel 10a can inject or discharge a fluid or the like containing the original cells
  • the second injection / discharge channel 10b is a fluid such as a reagent for separating the original cells, an anticoagulant, or a phosphate buffered saline. Can be injected or discharged.
  • the third injection / discharge channel 10c can inject or discharge a fluid such as an inducer-introducing reagent
  • the fourth injection / discharge channel 10d is used for various media such as initialization or induction medium, trypsin alternative recombinant enzyme and the like. Fluids such as cell detachment reagent and single cell separation reagent can be injected or discharged.
  • the induction medium includes an initialization medium, a reprogramming medium, a fate conversion medium, a direct programming medium, a transdifferentiation medium, a differentiation induction medium, a transformation medium and the like.
  • the fifth injection / discharge channel 10e can discharge or inject a fluid containing cultured cells subjected to at least one of induction and culture into the fluid container 19, and the sixth injection / discharge channel 10f fluids the fluid containing the target cells. It can be discharged or injected into a container.
  • the fluid container 19 for discharging the sample may be a closed connector 3, for example, a variable volume bag connected to a heat fusing tube or the like.
  • a refrigerant such as liquid nitrogen may be supplied around the sixth injection / discharge channel 10f to freeze the fluid containing the target cells to seal the cell preparation plate.
  • the fluid container discharged from the sixth injection / discharge channel 10f via the closed connector 3 may be frozen with a refrigerant such as liquid nitrogen.
  • the variable volume unit 11 includes a physical or chemical variable volume material that stores the fluid extruded or drawn out by the injected or discharged fluid.
  • a fluid escape flow path for releasing the fluid originally contained in the fluid circuit 4 is provided, and a physical volume variable material is connected to the fluid release flow path, or a pressure valve that opens and closes at a constant pressure is provided in the fluid release flow path.
  • the physically variable volume material may be, for example, a flexible bag, a syringe, or the like.
  • the chemically variable volume material may include, for example, a fluid absorber such as soda lime or silica gel, and a fluid release agent placed in a storage tank different from the storage tank in which the fluid absorbent is placed. Due to the volume variable material, the internal pressure of the closed fluid circuit 4 becomes substantially constant, and the fluid extruded or drawn out by the injected or discharged fluid is confined in the cell production plate 2, so that it is outside the cell production plate 2. It is not necessary to let the fluid escape or take in the fluid from the outside, and the cell production plate 2 can be formed into a plate shape while maintaining the airtightness of the fluid circuit 4. Such a cell preparation plate 2 is easy for the robot to handle.
  • a fluid absorber such as soda lime or silica gel
  • a fluid release agent placed in a storage tank different from the storage tank in which the fluid absorbent is placed. Due to the volume variable material, the internal pressure of the closed fluid circuit 4 becomes substantially constant, and the fluid extruded or drawn out by the injected or discharged fluid is confined in
  • the transfer unit 12 includes a pump that transfers a fluid in the fluid circuit 4.
  • the pump may be a positive displacement pump whose flow rate can be controlled, for example, a rotary pump, a reciprocating pump, or the like.
  • a peristaltic pump is preferable.
  • a flexible tube is hermetically connected to a connector provided at the end of the flow path, and the fluid is transferred by handling the tube with a roller. Since the tube is blocked by a roller, the fluid flow is blocked when the pump is stopped, and the flow rate can be controlled.
  • a diaphragm pump is desirable as the reciprocating pump. However, in the case of a diaphragm pump, since the diaphragm does not shut off the flow path, the flow rate can be controlled by using the flow path shutoff valve together.
  • the transfer unit 12 includes a plurality of pumps P1-P8.
  • the first pump P1-the third pump P3 transfers the fluid stored in the fluid reservoirs A1-A3 at an appropriate timing
  • the fourth pump P4 and the eighth pump P8 appropriately transfer the fluid stored in the cell separation unit 16. Transfer at the right timing.
  • the fifth pump P5 transfers the fluid stored in the fluid reservoir A4 at an appropriate timing
  • the sixth pump P6-seventh pump P7 transfers the fluid stored in the cell induction culture unit 13 at an appropriate timing.
  • the rotation of the pump is used to obtain information on whether the pump is operating normally, such as whether the pump has rotated reliably or by an appropriate angle.
  • a rotary encoder capable of detecting the amount of rotation may be provided on the spindle.
  • a visual mark may be provided at the end of the rotation spindle of the pump, and the rotational movement of the mark may be directly captured by an image recognition sensor.
  • a flow rate measuring unit (not shown) may be further provided in the front stage or the rear stage of the pump.
  • the flow rate measuring unit captures, for example, a flow rate sensor provided adjacent to at least one of the flow path and the storage tank communicating with the transfer unit, or an image of a change in fluid over time in at least one of the flow path and the storage tank communicating with the transfer unit.
  • An image recognition sensor or the like that captures the image may be used.
  • the flow rate sensor can employ various measurement methods that do not adversely affect cells, such as the Karman vortex type, impeller type, and diaphragm type, and directly acquires the flow rate information of the fluid.
  • the image recognition sensor acquires flow rate information from the movement of the fluid by recognizing an image from an external camera or the like via a transparent lid 21. As the image recognition sensor, other image recognition sensors described in this document may be diverted, whereby the number of parts and the manufacturing cost can be reduced.
  • the cell-induced culture unit 13 includes a cell-induced culture tank 13a that induces and cultures cells based on the transferred fluid.
  • the cell-induced culture unit 13 includes either a medium storage tank A4 for storing the medium supplied to the cell-induced culture tank 13a and a medium circulation path 13b for circulating the medium supplied to the cell-induced culture tank 13a. It is good to be there.
  • the cell-induced culture unit 13 is not a medium circulation path 13b, but is composed of a medium supply path for supplying the medium to the cell-induced culture tank 13a and a medium discharge path for discharging the medium from the cell-induced culture tank 13a. It may be provided with a one-way route (not shown).
  • the cell induction culture tank 13a is heated to a predetermined culture temperature, for example, 37 ° C. by the heating element 40.
  • the medium storage tank A4 or the medium circulation passage 13b is cooled to a predetermined medium quality maintenance temperature, for example, 4 ° C. to 8 ° C. by the cooling element 41.
  • the cell production plate 2 has a first side and a second side, the heating element 40 is arranged near the first side of the cell production plate 2, and the cooling element 41 is located near the second side of the cell production plate 2. Be placed.
  • the first side and the second side may be the first surface and the second surface of the cell production plate 2, or may be the first edge and the second edge of the cell production plate 2.
  • the first and second sides are the anterior and posterior surfaces, apical and bottom surfaces, left and right surfaces, anterior and anterior bottom edges, anterior left and anterior right edges, anterior apical edges and the cell production plate 2.
  • the heating element 40 and the cooling element 41 are arranged on the cell production plate 2 so as to be separated from each other, so that sufficient heat insulating properties can be provided between the two. Therefore, even in the cell preparation plate 2 in which a plurality of functional sites are aggregated, it is possible to simultaneously perform the heating required for culturing and the cooling required for the circulating medium.
  • the cell induction culture tank 13a is in a closed state and does not need to be supplied with a fluid such as carbon dioxide, nitrogen, oxygen, etc., but carbon dioxide, carbon dioxide, is supplied to at least one of the cell induction culture tank 13a and the medium circulation path 13b.
  • a fluid exchange filter for exchanging fluids such as nitrogen and oxygen inside and outside the apparatus may be further provided.
  • the cell induction culture tank 13a may be a three-dimensional culture tank for performing cell suspension culture, but may also be a two-dimensional culture tank for performing adhesive culture.
  • the cell induction culture tank 13a may be coated with a cell adhesion coating agent such as matrigel, collagen, polylysine, fibronectin, vitronectin, gelatin, and laminin, laminin fragment, or hollow threads. It may be filled.
  • a cell adhesion coating agent such as matrigel, collagen, polylysine, fibronectin, vitronectin, gelatin, and laminin, laminin fragment, or hollow threads. It may be filled.
  • FIGS. 4A-4B show an example of the cell induction culture tank 13a and the heating element 40.
  • the cell-induced culture tank 13a may integrally include a culture tank 30 and a medium tank 31 for supplying a medium to the culture tank 30.
  • the cell-induced culture tank 13a is provided with a specific component permeation member 32, for example, a semipermeable membrane, which allows only specific components to flow between the culture tank 30 and the medium tank 31.
  • the specific component permeation member 32 permeates specific components such as various media, cell adhesion coating agents, and cell detachment reagents.
  • the culture tank 30 is composed of the culture tank frame 30a, the culture side mesh 30b, the culture side sealing member 30c-30d, and the cover frame 30e
  • the medium tank 31 is the medium tank frame 31a and the medium side.
  • the heating element 40 is, for example, a glass heater, and includes a transparent plate arranged in the cell induction culture tank 13a and a transparent conductive film fixed to the transparent plate.
  • the heating element 40 may be composed of a transparent lid 21 that covers the flat plate 20 of the cell production plate 2 and a transparent conductive film that is fixed to the lid 21.
  • the culture tank 30 and the medium tank 31 are close to each other.
  • the medium supplied to the cell-induced culture tank 13a is heated by the heating element 40, but the deterioration of the medium is promoted by the heating. Therefore, when the medium is circulated, the medium is cooled by cooling the medium circulation path 13b. Suppresses the deterioration of the culture medium.
  • FIG. 5 shows an example of the medium circulation path 13b and the cooling element 41.
  • the heat dissipation efficiency of the medium can be further improved.
  • a heat insulating material (not shown) between the cell-induced culture tank 13a and the flow path concentration portion 42.
  • a fiber-based heat insulating material, a foamed plastic-based heat insulating material, and the like may be further provided.
  • the cell production plate 2 when a base plate that is detachably connected to the cell production plate 2 is provided, the cell production plate 2 can be made disposable and the base plate can be reused. Therefore, the cooling element 41 can be placed on the base plate side. By arranging in, the cooling element 41 can be reused.
  • the cooling element 41 may be, for example, a Peltier element having a cooling side and a heat generating side, and further includes a heat conductive member (for example, a highly heat conductive copper wire) that conducts heat generated on the heat generating side of the cooling element 41 to the heating element 40. By providing it, it is possible to effectively utilize the heat.
  • a heat conductive member for example, a highly heat conductive copper wire
  • the cell-induced culture unit 13 may further include a pH measuring unit 13c for measuring the pH value of the medium used.
  • the pH measuring unit 13c is preferably provided in the medium circulation channel 13b or the cell induction culture tank 13a in order to measure the pH value of the medium used.
  • the pH measuring unit 13c may be, for example, an image recognition sensor, an electrode measuring sensor, or the like.
  • the image recognition sensor measures the pH value with an external camera or the like through a transparent lid.
  • the electrode measurement sensor measures the pH value by the glass electrode method.
  • hue can be accurately detected by making at least a part of the medium circulation path 13b or the cell-induced culture tank 13a (for example, the bottom surface of the hue measurement site) white.
  • illumination is applied from at least one of the front, the peripheral direction (for example, the direction orthogonal to the observation surface), and the rear of the cell induction culture tank 13a. It is preferable that the portion is further provided.
  • the lighting unit may include, for example, LED lighting, and may be embedded inside the cell production plate 2, or the cell induction culture tank 13a may be provided outside the cell production plate 2 so as to be more convex than the cell production plate 2.
  • the culture tank 30 may be covered with a transparent member that allows light to pass through so that the illumination reaches the cells.
  • the fluid storage unit 14 includes a storage tank for storing fluid to be injected into the fluid circuit 4 or discharged to the outside of the fluid circuit 4.
  • the fluid storage unit 14 includes a plurality of storage tanks A1-A4.
  • the storage tanks A1-A4 are formed as locations where the width or depth of the flow path is relatively large, and enable various fluids to be used in a predetermined amount at an appropriate timing.
  • the first storage tank A1 stores a fluid or the like containing the original cells
  • the second storage tank A2 stores a fluid such as a reagent for separating the original cells, an anticoagulant, or a phosphate buffered saline, and a third.
  • the storage tank A3 stores fluids such as an inducer-introducing reagent
  • the fourth storage tank A4 stores fluids such as various media, cell adhesion coating agents, and cell detachment reagents. It may be provided with a storage tank for storing a fluid or the like containing a target cell.
  • the fluid mixing unit 15 is provided with a mixing flow path for mixing a plurality of fluids that are immiscible with each other.
  • the mixing flow path preferably includes a fluid mixing flow path and a mixed flow generation path.
  • the fluid multiphase flow path is a flow path for merging mutually immiscible fluids into one flow path
  • the mixed flow generation path is a flow path for generating a mixed flow in the merged fluid.
  • the mixed flow generation path may be a spiral flow path penetrating from the front surface to the back surface of the flat plate. In order to return the fluid from the back surface to the front surface of the flat plate, two spiral flow paths penetrating the flat plate are provided, and a communication passage for fluid communication between these spiral flow paths is provided on the back surface of the flat plate.
  • the cell separation unit 16 includes separation tanks D1-D2 for separating cells or cell clusters.
  • the separation tank D1-D2 is a savings reservoir tank formed by relatively increasing the width or depth of the flow path, the fluid is first separation tank D1 containing only the original cells from a fluid containing the original cell
  • the second separation tank D2 separates from other cell clusters by precipitating only a relatively large cell mass.
  • a reagent for separating the original cells panning, magnetic cell separation (MACS), flow cytometry and the like can be used.
  • the cell mass crushing unit 17 is provided with a crushing flow path for further crushing the separated cell mass (mass of one or more cells).
  • the crushed flow path has a relatively small flow path area as compared with the upstream flow path, and is preferably meandering. By meandering the flow path, a latent flow is generated, and shear stress is applied to the cell mass to decompose the large cell mass into small cell masses.
  • a subsurface current is, for example, a flow that causes a swirl, a turbulent flow, a backflow, a flow that causes a part having a different flow speed, a flow that causes a shearing force, and a flow that causes a part where a flow having a different traveling direction collides. Say one of.
  • the cell production apparatus 1 further includes a base plate that is detachably connected to the cell production plate 2.
  • 6A-6B show an example of a base plate.
  • the base plate 5 controls the fluid, temperature, etc. of the cell production plate 2.
  • the cell preparation plate 2 is arranged so as to face the dangerous area side 70 on which the robot or the like acts, while the base plate 5 faces the safe area side 71 opposite to the dangerous area side 70. Be placed. From the viewpoint of preventing biological contamination, the cell production plate 2 may be disposable and the base plate 5 may be reused. Further, the cell manufacturing apparatus 1 is configured to be maintainable from the safety area side 71. When the cell manufacturing apparatus 1 is provided with such a two-sided structure, a robot or the like can be involved with a plurality of cell manufacturing apparatus 1 on a one-to-many basis.
  • the cell manufacturing apparatus 1 may further include a positioning member 72 and a plate sealing member 73 on the connecting surface between the cell production plate 2 and the base plate 5.
  • the positioning member 72 may be a convex portion or a concave portion that fits each other, and positions the connection position between the cell production plate 2 and the base plate 5.
  • the plate sealing member 73 may be a gasket, packing, or the like attached to the outer periphery of the connecting surface.
  • the drive unit 74 includes, for example, a motor that drives a peristaltic pump. Further, it is preferable that the connecting surface between the cell production plate 2 and the base plate 5 is provided with an electric contact 75 for supplying electric power to an electric element arranged on the cell production plate 2, such as a heating element, a cooling element, and a flow rate sensor.
  • the heating element 40 and the cooling element 41 are arranged on the cell production plate 2 so as to be separated from each other, sufficient heat insulating properties can be provided between them. This makes it possible to simultaneously perform the heating (heating and heat retention) required for culturing and the cooling required for the circulating medium even in the cell preparation plate 2 in which a plurality of functional sites are aggregated.

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Abstract

細胞製造装置は、第１側及び第２側を有し、細胞の誘導及び培養の少なくとも一方を行う細胞誘導培養槽と細胞誘導培養槽に供給される培地を貯溜する培地貯溜槽とを備える細胞作製プレートと、細胞作製プレートの第１側近傍に配置されていて細胞誘導培養槽を加温する加温素子と、細胞作製プレートの第２側近傍に配置されていて培地貯溜槽を冷却する冷却素子と、を備える。

Description

細胞製造装置
　本発明は、細胞製造装置に関し、特に複数の機能部位を集約した細胞作製プレートにおいて培養に必要な加温と培地に必要な冷却を同時に行う細胞製造装置に関する。
　胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期杯から樹立された幹細胞であり、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植法に利用可能であると考えられている。しかし、ＥＳ細胞の移植は、臓器移植と同様に、拒絶反応を惹起するという問題がある。また、ヒト杯を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては、倫理的見地から反対意見が多い。
　これに対し、京都大学山中伸弥教授は、４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功し、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１参照。）。ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞であり、細胞移植法への利用が期待されている。
　ｉＰＳ細胞のような誘導幹細胞は、細胞に遺伝子等の誘導因子を導入することによって樹立され、拡大培養、凍結保存される。しかし、例えば臨床用ｉＰＳ細胞（ＧＬＰ，ＧＭＰグレード）等を作製するには、非常に綺麗に保たれたクリーンルームを必要とし、高額な維持コストが掛かる。産業化のためには、クリーンルームの運用方法をいかに効率化してコスト削減に努めるかが課題になっていた。
　またｉＰＳ細胞の作製は手作業によるところが大きいが、臨床用ｉＰＳ細胞を作製できる技術者は少ない。幹細胞の樹立から保存までの一連の作業が複雑であるという問題がある。臨床用の細胞培養では、標準的な工程（ＳＯＰ：Standard Of Process）の確認と、ＳＯＰに従った操作と、ＳＯＰ通りに実施されたか否かの確認、という３つのステップを行う必要があり、これらステップを人が行う事は非常に非生産的である。細胞培養は２４時間毎日管理する必要があり、幹細胞の保存は何十年にも及ぶため、人材だけで管理するのは限界があった。
　そこで、高度に清浄なクリーンルームを不要とし、通常管理区域（例えばＷＨＯ－ＧＭＰ規格において微生物及び微粒子の少なくとも一方がグレードＤレベル又はそれ以上）で作業可能な閉鎖系の細胞製造装置が開発されてきた（例えば、特許文献２参照。）。また人材も排除して複雑な細胞製造工程を自動化するため、細胞製造を補助するロボットを備えた細胞製造システムも開発されている。斯かる細胞製造装置に関する先行技術としては、次の文献が公知である。
　特許文献３には、導入前細胞送液路と、導入前細胞に体細胞誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、誘導因子導入細胞を培養して体細胞を作製する細胞作製装置と、を１つの筐体内にパッケージ化した体細胞製造システムが開示されている。
　特許文献４には、培養容器及び流路を閉鎖系にした細胞培養容器が開示されており、細胞培養容器が第一容器内に第二容器を偏心して保持することにより、細胞培養の育成状態が明瞭に観察できる。
　特許文献５には、培地貯溜手段、細胞接種手段、及び培養容器が閉鎖系で構成された細胞培養装置が開示されている。細胞培養装置は、培養容器内の細胞の画像から細胞の培養状況を判定し、この判定に基づき培養操作を実行することにより、操作者の労力を軽減している。
　特許文献６には、培養皿内の培養液温度を所望温度、例えば３７℃に制御される透明導電膜ヒータと、リザーバタンク内の培養液を所望温度、例えば５－２０℃に制御されるペルチェ素子と、透明導電膜ヒータ及びペルチェ素子の温度を制御する温度制御部と、を備えた細胞培養装置が開示されている。リザーバタンクから流出した培養液は、培養皿の供給口に到達するまでの流路を通過することによって常温に近い温度となることが記載されている。
　特許文献７には、細胞培養チャンバ、バッファー培地レザーバ、配管システム等を最適温度（３７℃）に制御する温度制御システムと、外部新鮮培地レザーバ及び分離剤を約４℃－８℃に制御する温度制御システムと、を備えた自動細胞培養装置が開示されている。
　特許文献８には、筒状に形成された被培養物と、被培養物を収容するチャンバと、被培養物の内側に培養液を循環させる循環路と、を備え、被培養物に内側から必要な養分と共に物理的刺激として培養液の流れに応じたせん断応力を付与した細胞・組織培養装置が開示されている。
　特許文献９には、流路一体プレート及びベースプレートを備えた細胞培養装置が開示されている。流路一体プレートは、培養液の流路を形成した流路プレートと、培養液の供給及び排出を行うペリスタルティックポンプ群を配置したポンプ部と、を備え、ベースプレートがモータ等の駆動源を備えている。
特許第４１８３７４２号公報 特開２０１８－０１９６８５号公報 国際公開第２０１８／１５４７８８号 国際公開第２０１４／０４９７０１号 国際公開第２００７／０５２７１６号 国際公開第２０１６／０９３３２１号 特表２０１７－５１３５１２号公報 特開２００２－３１５５６６号公報 特開２０１７－２２１１６６号公報
　従来の装置は、培地貯留リザーバ、培地供給排出流路、細胞培養容器といった細胞培養機能のみを一体的に構成した細胞培養装置が多く、誘導因子導入による、細胞の初期化、リプログラミング、ダイレクトリプログラミング、分化転換、分化誘導、運命転換、形質転換といった細胞誘導機能までを一体化したものは少ない。これら種々の機能部位を１つのプレート内に集約するとなると、加温（加熱及び保温）される培養部位と冷却される培地部位との間で伝熱し易くなるため、培養に必要な加温と培地に必要な冷却を同時に行うのが難しくなる。
　そこで、複数の機能部位を集約した細胞作製プレートにおいて培養に必要な加温と培地に必要な冷却とを同時に行う技術が求められている。
　本開示の一態様は、第１側及び第２側を有し、細胞の誘導及び培養の少なくとも一方を行う細胞誘導培養槽と細胞誘導培養槽に供給される培地を貯溜する培地貯溜槽とを備える細胞作製プレートと、細胞作製プレートの第１側近傍に配置されていて細胞誘導培養槽を加温する加温素子と、細胞作製プレートの第２側近傍に配置されていて培地貯溜槽を冷却する冷却素子と、を備える、細胞製造装置を提供する。
　本開示の他の態様は、第１側及び第２側を有し、細胞の誘導及び培養の少なくとも一方を行う細胞誘導培養槽と細胞誘導培養槽に供給される培地を循環する培地循環路とを備える細胞作製プレートと、細胞作製プレートの第１側近傍に配置されていて細胞誘導培養槽を加温する加温素子と、細胞作製プレートの第２側近傍に配置されていて培地循環路を冷却する冷却素子と、を備える、細胞製造装置を提供する。
　本開示の態様によれば、加温素子と冷却素子が相互に離間して細胞作製プレートに配置されるため、両者の間に十分な断熱性を持たせることができる。これにより、複数の機能部位を集約した細胞作製プレートであっても培養に必要な加温と循環する培地に必要な冷却を同時に行うことが可能になる。
一実施形態における細胞製造装置の構成図である。 細胞作製プレートの一例を示す分解斜視図である。 平板と蓋の固着方法の一例を示す拡大断面図である。 平板と蓋の固着方法の一例を示す拡大断面図である。 細胞誘導培養槽と加温素子の一例を示す分解斜視図である。 細胞誘導培養槽と加温素子の一例を示す斜視断面図である。 培地循環路と冷却素子の一例を示す拡大斜視図である。 ベースプレートの一例を示す正面斜視図である。 ベースプレートの一例を示す背面斜視図である。
　以下、添付図面を参照して本開示の実施形態を詳細に説明する。各図面において、同一又は類似の構成要素には同一又は類似の符号が付与されている。また、以下に記載する実施形態は、特許請求の範囲に記載される発明の技術的範囲及び用語の意義を限定するものではない。なお、本書における用語「閉鎖」とは、微生物、ウイルス等の汚染源が装置内部に侵入して生物学的汚染を発生しないこと、及び／又は装置内部の流体（細胞、微生物、ウイルス粒子、タンパク質、核酸等の物質を含む。）が漏出して交叉汚染を発生しないこと、及び／又は病原体に感染したドナーの流体を装置内部で取扱ってもバイオハザードを発生しないことを意味する。但し、本書における装置は、例えば二酸化炭素、窒素、酸素等の汚染源でない流体が装置内部に侵入又は装置外部へ漏出するように構成してもよい。
　図１は本実施形態における細胞製造装置１の構成を示している。細胞製造装置１は、誘導因子導入による、細胞の初期化、リプログラミング、ダイレクトリプログラミング、分化転換、分化誘導、運命転換、形質転換等を行う細胞誘導機能を備えた細胞変換装置であるが、単に培養、拡大培養等を行う細胞培養機能のみを備えた細胞培養装置でもよい。細胞製造装置１は、元細胞（例えば血液細胞、線維芽細胞等の体細胞、又はＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の幹細胞）を含む流体を注入し、元細胞から目的細胞（例えば幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞）を製造すると共に、目的細胞を含む流体を排出する。目的細胞として、線維芽細胞、神経細胞、網膜上皮細胞、肝細胞、β細胞、腎細胞、間葉系幹細胞、血液細胞、メガカリオサイト、Ｔ細胞、軟骨細胞、心筋細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、又は他の体細胞等の分化細胞を作製してもよい。細胞製造装置１は、高度にクリーンであるべき部分を全て内部に集約した閉鎖系の細胞処理装置であり、通常管理区域でも使用可能である。装置内部の閉鎖空間は、気体、ウイルス、微生物、不純物等を外部と交換しないように構成されるとよい。但し、後述の流体交換フィルタ等を装置に付加的に設けることにより、汚染源でない流体を装置内部と外部で交換可能に構成してもよい。
　図１に示すように、細胞製造装置１は細胞作製プレート２及び閉鎖式コネクタ３を備えている。細胞作製プレート２は、外部空間Ｓから遮断された閉鎖系の流体回路４を備えており、流体回路４は複数の機能部位を高度に集約した流路を備えている。閉鎖式コネクタ３は、流体回路４へ流体を注入し、又は流体回路４から流体を排出するためのコネクタであり、細胞作製プレート２に取付けられる。閉鎖式コネクタ３は、流体回路４と流体容器を外部空間Ｓに対して閉鎖的に接続するコネクタであり、例えば無菌接続コネクタ、ニードルレスコネクタ、ニードルコネクタ、熱溶断チューブ等でよい。ニードルレスコネクタは、スプリットセプタム型でもよいし、メカニカルバルブ型でもよい。流体容器とは、シリンジ、容積可変バッグ等であり、閉鎖式コネクタ３と流体容器との接続時には流体回路４が流体容器と流体連通する一方、閉鎖式コネクタ３と流体容器との非接続時には流体回路４が外部空間Ｓから遮断される。これにより、流体回路４の生物学的汚染、交叉汚染、及びバイオハザードを防止できる。複数種類の流体の注入又は排出可能にするため、細胞製造装置１は複数の閉鎖式コネクタ３を備えていることが好ましい。
　図２は細胞作製プレート２の一例を示している。図２に示すように、細胞作製プレート２は平板２０及び蓋２１を備えている。平板２０は、例えば生物学的に安全な樹脂、金属等で成形することができる。平板２０は、金型を用いた成型加工、例えば射出成形、圧縮成形等によって成型するのが好ましいが、３Ｄプリンタ等を用いて平板２０を成形してもよい。３Ｄプリンタとしては、光造形、熱溶解積層、粉末焼結、インクジェット等の種々の造形方式を採用できる。平板２０の表面及び裏面の少なくとも一方に、流体を流す流路として溝２０ａを設け、複数の溝２０ａを組み合わせることによって流体回路４を形成する。また、流体回路４の一部に、溝２０ａの幅又は深さを相対的に大きくした箇所を設け、流体を一時的に貯溜する貯溜槽２０ｂを形成する。溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂの壁面には、poly-HEMA（poly 2-hydroxyethyl methacrylate）をコーティングして細胞非接着性にしてもよい。逆に、細胞が溝２０ａ又は貯溜槽２０ｂに入り難い場合には、溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂの壁面を低タンパク吸着性にしてもよい。溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂの少なくとも一部は、流体、細胞、細胞塊等の経時変化を画像認識センサ、超音波認識センサ等によって観察するため、白色又は黒色とすることが好ましい。
　蓋２１は、例えば生物学的に安全な樹脂、石英ガラス等で形成されてもよい。蓋２１（即ち、細胞作製プレート２の少なくとも一部）は、流体回路４内の流体、細胞、細胞塊等の経時変化を画像認識センサ、超音波認識センサ等によって観察するため、透明であることが好ましい。この観察により、適切なタイミングで次の細胞製造工程に移行することが可能になる。蓋２１は、流体回路４を外部空間から遮断するため、生物学的に安全な固着方法、例えば化学結合、溶着結合、接着結合等によって流体回路４を覆うように平板２０に固着される。化学結合としては、シランカップリング剤、プラズマ照射等を用いてもよい。また溶着結合としては、レーザ溶着、超音波溶着等を用いてよく、接着結合としては、紫外線硬化接着剤等を用いてもよい。平板２０と蓋２１の固着後に、細胞作製プレート２に対して殺菌処理、例えば加熱滅菌、ガンマ線滅菌、紫外線滅菌、電子線滅菌等を施し、流体回路４を高度にクリーンな状態にする。
　図３Ａ－図３Ｂは平板と蓋の固着方法の一例を示している。流体回路４を外部空間から遮断するため、溝２０ａと貯溜槽２０ｂの両側に土手部２０ｃを予め形成しておき、平板２０を蓋２１で覆い、少なくとも土手部２０ｃにレーザ光、超音波等を照射または印加して土手部２０ｃを加熱し、平板２０と蓋２１を溶着することによって溝２０ａと貯溜槽２０ｂを密封してもよい。或いは、溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂを含む平板２０に対して蓋２１をして、少なくとも溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂ以外の部分をレーザ光、超音波等を照射または印加して加熱し、平板２０と蓋２１を溶着することによって溝２０ａと貯溜槽２０ｂを密封してもよい。この場合、溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂ以外の部分が全て固着されるため、固着強度が高まる。
　図１を再び参照すると、流体回路４は、複数の機能部位として、注入排出部１０及び細胞誘導培養部１３を少なくとも備えている。流体回路４は、所望により、容積可変部１１、移送部１２、流体溜め部１４、流体混合部１５、細胞分離部１６、及び細胞塊破砕部１７を備えていてもよい。これら複数の機能部位が１つの細胞作製プレート２内に集約されるため、別個の部品をチューブ、ポンプ、コネクタ等を介して閉鎖的に接続するといった製造工程が不要となり、細胞製造装置１の製造工数、製造コスト等が削減される。
　注入排出部１０は、閉鎖式コネクタ３を介して流体を流体回路４内に注入又は排出する注入排出チャネルを備えている。複数種類の流体を注入又は排出可能にするため、注入排出部１０は複数の注入排出チャネル１０ａ－１０ｆを備えていることが好ましい。例えば、第１注入排出チャネル１０ａは元細胞を含む流体等を注入又は排出可能であり、第２注入排出チャネル１０ｂは、元細胞分離用試薬、抗凝固剤、リン酸緩衝生理食塩水等の流体を注入又は排出可能である。また第３注入排出チャネル１０ｃは誘導因子導入試薬等の流体を注入又は排出可能であり、第４注入排出チャネル１０ｄは、初期化用又は誘導用培地等の種々の培地、トリプシン代替組替え酵素等の細胞剥離試薬、シングルセル分離試薬等の流体を注入又は排出可能である。誘導用培地は、初期化用培地、リプログラミング用培地、運命転換用培地、ダイレクトプログラミング用培地、分化転換用培地、分化誘導用培地、形質転換用培地等を含む。さらに第５注入排出チャネル１０ｅは誘導及び培養の少なくとも一方を施した培養細胞を含む流体をサンプルとして流体容器１９に排出又は注入可能であり、第６注入排出チャネル１０ｆは目的細胞を含む流体を流体容器に排出又は注入可能である。サンプル排出用の流体容器１９は、閉鎖式コネクタ３、例えば熱溶断チューブに接続する容積可変バッグ等でよい。また、目的細胞を含む流体を排出する際に、第６注入排出チャネル１０ｆの周囲に液体窒素等の冷媒を供給し、目的細胞を含む流体を凍結させて細胞作製プレートをシーリングしてもよいし、又は第６注入排出チャネル１０ｆから閉鎖式コネクタ３を介して排出した流体容器を液体窒素等の冷媒で凍結してもよい。
　容積可変部１１は、注入又は排出した流体によって押出又は引出される流体を貯溜する物理的又は化学的な容積可変材を備えている。流体回路４内に元々入っていた流体を逃がす流体逃がし流路を設け、流体逃がし流路に物理的な容積可変材を接続するか、又は流体逃がし流路に一定の圧力で開閉する圧力弁を設けて貯溜槽に化学的な容積可変材を留置することにより、流体回路４の密閉性を保ちながら流体の移動を可能にする。物理的な容積可変材は、例えば柔軟性バッグ、シリンジ等でよい。化学的な容積可変材は、例えばソーダ石灰、シリカゲル等の流体吸収剤と、流体吸収剤を留置する貯溜槽とは別の貯溜槽に留置した流体放出剤と、を含んでいてよい。容積可変材により、閉鎖された流体回路４の内圧が概ね一定になると共に、注入又は排出した流体によって押出又は引出される流体が細胞作製プレート２内に閉じ込められるため、細胞作製プレート２の外部に流体を逃がしたり又は外部から流体を取込んだりする必要がなく、流体回路４の密閉性を保ちながら細胞作製プレート２をプレート状に形成することが可能になる。このような細胞作製プレート２はロボットにとって取扱い易い。
　移送部１２は、流体回路４内で流体を移送するポンプを備えている。ポンプは、流量制御可能な容積式ポンプ、例えば回転ポンプ、往復ポンプ等でよい。回転ポンプとしては、ペリスタルティックポンプが好ましい。ペリスタルティックポンプの場合、流路の端部に設けたコネクタに柔軟性チューブを密閉接続し、チューブをローラで扱くことによって流体を移送する。チューブはローラで遮断されているので、ポンプ停止時は、流体の流れが遮断され、流量制御が可能となる。また往復ポンプとしては、ダイヤフラムポンプが望ましい。但しダイヤフラムポンプの場合、ダイヤフラムが流路を遮断しないため、流路遮断弁を併用することにより、流量制御が可能になる。
　適切なタイミングで適切な機能部位に流体を移送するため、移送部１２は複数のポンプＰ１－Ｐ８を備えていることが好ましい。例えば、第１ポンプＰ１－第３ポンプＰ３は流体溜め部Ａ１－Ａ３に貯溜する流体を適切なタイミングで移送し、第４ポンプＰ４及び第８ポンプＰ８は細胞分離部１６に貯溜する流体を適切なタイミングで移送する。第５ポンプＰ５は流体溜め部Ａ４に貯溜する流体を適切なタイミングで移送し、第６ポンプＰ６－第７ポンプＰ７は細胞誘導培養部１３に貯溜する流体を適切なタイミングで移送する。ポンプとして例えばペリスタルティックポンプを使用する場合、ポンプが確実に回転したか、または適切な角度だけ回転したか等、ポンプが正常に作動しているか否かの情報を取得するために、ポンプの回転主軸に回転量を検知できるロータリーエンコーダを備えてもよい。または、例えばポンプの回転主軸端部に視覚的な目印を設けておき、画像認識センサによって目印の回転運動を画像で直接捉えてもよい。ポンプによる移送が確実に行われていることを確認するため、ポンプの前段又は後段に流量計測部（図示せず）をさらに備えていてもよい。流量計測部は、例えば移送部に連通する流路及び貯溜槽の少なくとも一方に隣接して設けた流量センサ、又は移送部に連通する流路及び貯溜槽の少なくとも一方における流体の経時変化を画像に捉える画像認識センサ等でよい。流量センサは、例えばカルマン渦式、羽根車式、ダイヤフラム式等、細胞に悪影響を及ぼさない種々の計測方式を採用でき、直接流体の流量情報を取得する。画像認識センサは、透明な蓋２１を介して外部カメラ等から画像認識することによって流体の動きから流量情報を取得する。画像認識センサは、本書に記載の他の画像認識センサを流用してもよく、これにより部品点数及び製造コストを低減できる。
　細胞誘導培養部１３は、移送した流体に基づき細胞の誘導及び培養の少なくとも一方を行う細胞誘導培養槽１３ａを備えている。細胞誘導培養部１３は、細胞誘導培養槽１３ａに供給される培地を貯溜する培地貯溜槽Ａ４、及び細胞誘導培養槽１３ａに供給される培地を循環する培地循環路１３ｂのいずれか一方を備えているとよい。前者の場合、細胞誘導培養部１３は、培地循環路１３ｂではなく、細胞誘導培養槽１３ａに培地を供給する培地供給路と、細胞誘導培養槽１３ａから培地を排出する培地排出路とで構成した一方通行路（図示せず）を備えていてもよい。細胞誘導培養槽１３ａは、加温素子４０によって所定の培養温度、例えば３７℃に加温される。培地貯溜槽Ａ４又は培地循環路１３ｂは、冷却素子４１によって所定の培地品質保持温度、例えば４℃－８℃に冷却される。細胞作製プレート２は第１側及び第２側を有しており、加温素子４０は細胞作製プレート２の第１側近傍に配置され、冷却素子４１は細胞作製プレート２の第２側近傍に配置される。第１側及び第２側とは、細胞作製プレート２の第１面及び第２面でもよいし、又は細胞作製プレート２の第１縁及び第２縁でもよい。例えば第１側及び第２側は、細胞作製プレート２の前面及び後面、頂面及び底面、左側面及び右側面、前頂縁及び前底縁、前左側縁及び前右側縁、前頂縁及び後底縁、前左側縁及び後右側縁等を含む。従って、例えば加温素子４０が細胞作製プレート２の前面近傍に配置され且つ冷却素子４１が細胞作製プレート２の後面近傍に配置される態様や、加温素子４０が細胞作製プレート２の前頂縁近傍に配置され且つ冷却素子４１が細胞作製プレート２の後底縁近傍に配置される態様等を含む。これにより、加温素子４０と冷却素子４１が相互に離間して細胞作製プレート２に配置されるため、両者の間に十分な断熱性を持たせることができる。従って、複数の機能部位を集約した細胞作製プレート２であっても培養に必要な加温と循環する培地に必要な冷却を同時に行うことが可能になる。
　細胞誘導培養槽１３ａは、密閉された状態であり、二酸化炭素、窒素、酸素等の流体を供給されなくてもよいが、細胞誘導培養槽１３ａ及び培地循環路１３ｂの少なくとも一方に、二酸化炭素、窒素、酸素等の流体を装置内部と外部で交換する流体交換フィルタをさらに備えていてもよい。また、細胞誘導培養槽１３ａは、細胞浮遊培養を行う三次元培養槽でよいが、接着培養を行う二次元培養槽でもよい。接着培養のため、細胞誘導培養槽１３ａは、マトリゲル、コラーゲン、ポリリジン、フィブロネクチン、ヴィトロネクチン、ゼラチン、及びラミニン、ラミニンフラグメント等の細胞接着用コーティング剤でコーティングされてもよいし、又は中空糸を充填されていてもよい。
　図４Ａ－図４Ｂは細胞誘導培養槽１３ａと加温素子４０の一例を示している。細胞誘導培養槽１３ａは、培養槽３０と、培養槽３０に培地を供給する培地槽３１と、を一体的に備えていてもよい。この場合、細胞誘導培養槽１３ａは、培養槽３０と培地槽３１との間に特定成分のみの行き来を許容する特定成分透過部材３２、例えば半透膜を備えていることが好ましい。特定成分透過部材３２は、例えば種々の培地、細胞接着用コーティング剤、細胞剥離用試薬等の特定成分を透過する。本例では、培養槽３０が、培養槽フレーム３０ａ、培養側メッシュ３０ｂ、培養側封止部材３０ｃ－３０ｄ、及びカバーフレーム３０ｅによって構成されており、培地槽３１が、培地槽フレーム３１ａ、培地側メッシュ３１ｂ、培地側封止部材３１ｃによって構成されているが、培養槽３０及び培地槽３１の構成要素は細胞作製プレート２に一体的に形成されていてもよい。加温素子４０は、例えばガラスヒータであり、細胞誘導培養槽１３ａに配置される透明板と、透明板に固着された透明導電膜と、を備えている。代替実施形態として、加温素子４０は、細胞作製プレート２の平板２０を覆う透明な蓋２１と、蓋２１に固着された透明導電膜と、で構成してもよい。加温素子４０から発生する熱を培養槽３０と培地槽３１に伝熱し易くするため、培養槽３０と培地槽３１は近接していることが好ましい。細胞誘導培養槽１３ａに供給された培地は加温素子４０によって加温されるが、加温によって培地の劣化が促進するため、培地を循環させるに当たり、培地循環路１３ｂを冷却することにより、培地の劣化が進むのを抑制する。
　図５は培地循環路１３ｂと冷却素子４１の一例を示している。培地循環路１３ｂの少なくとも一部に、細胞作製プレート２の単位面積当たりの流路面積を相対的に大きくした流路集中部４２、例えばＳ字コーナーを繰返した流路を設け、流路集中部４２を冷却素子４１で冷却することにより、培地の放熱効率を一層高めることができる。さらに、加温される細胞誘導培養槽１３ａと冷却される培地循環路１３ｂとの間を断熱するため、細胞誘導培養槽１３ａと流路集中部４２との間に断熱材（図示せず）、例えば繊維系断熱材、発砲プラスチック系断熱材等をさらに備えていてもよい。これにより、複数の機能部位を集約した細胞作製プレート２であっても培養に必要な加温と循環する培地に必要な冷却を同時に行うことが可能になる。加えて、後述するように、細胞作製プレート２に着脱可能に連結するベースプレートを設ける場合、細胞作製プレート２を使い捨て可能とし、ベースプレートを使い回し可能とすることができるため、冷却素子４１をベースプレート側に配置することにより、冷却素子４１の再利用が可能になる。冷却素子４１は、例えば冷却側及び発熱側を備えるペルチェ素子でよく、冷却素子４１の発熱側で発生する熱を加温素子４０に伝導する熱伝導部材（例えば、高熱伝導の銅線）をさらに備えることにより、熱を有効利用することも可能である。
　図１を再び参照すると、細胞誘導培養部１３は、使用した培地のｐＨ値を測定するｐＨ測定部１３ｃをさらに備えていてもよい。ｐＨ測定部１３ｃは、使用した培地のｐＨ値を測定するため、培地循環路１３ｂ又は細胞誘導培養槽１３ａに設けることが好ましい。ｐＨ測定部１３ｃは、例えば画像認識センサ、電極計測センサ等でよい。画像認識センサはｐＨ値を透明な蓋を介して外部カメラ等で色相計測する。電極計測センサはガラス電極法によってｐＨ値を計測する。色相計測の場合、培地循環路１３ｂ又は細胞誘導培養槽１３ａの少なくとも一部（例えば、色相計測箇所の底面等）を白色とすることにより、色相を正確に検出できるようになる。このｐＨ値により、培地の状態を定量的に把握することが可能になる。また、画像上の細胞の像の輪郭を鮮明にするため、細胞誘導培養槽１３ａの前方、周囲方向（例えば、観察面と直交する方向）、及び後方のうちの少なくとも１つから照明を当てる照明部をさらに備えていることが好ましい。照明部は、例えばＬＥＤ照明等を含み、細胞作製プレート２の内部に埋め込むか、又は細胞誘導培養槽１３ａを細胞作製プレート２よりも凸状にして細胞作製プレート２の外部に設けてもよい。照明が細胞に到達するように、培養槽３０は光を通す透明部材で覆われていてもよい。
　流体溜め部１４は、流体回路４内に注入又は流体回路４外へ排出すべき流体を貯溜する貯溜槽を備えている。複数種類の流体を貯溜可能にするため、流体溜め部１４は複数の貯溜槽Ａ１－Ａ４を備えていることが好ましい。貯溜槽Ａ１－Ａ４は、流路の幅又は深さを相対的に大きくした箇所として形成され、種々の流体を適切なタイミングで所定量だけ利用するのを可能にする。例えば、第１貯溜槽Ａ１は元細胞を含む流体等を貯溜し、第２貯溜槽Ａ２は、元細胞分離用試薬、抗凝固剤、リン酸緩衝生理食塩水等の流体を貯溜し、第３貯溜槽Ａ３は誘導因子導入試薬等の流体を貯溜し、第４貯溜槽Ａ４は種々の培地、細胞接着用コーティング剤、細胞剥離用試薬等の流体を貯溜する。目的細胞を含む流体等を貯溜する貯溜槽を備えていてもよい。
　流体混合部１５は、相互に不混和な複数の流体を混合する混合流路を備えている。混合流路は、流体合流路及び混合流発生路を備えていることが好ましい。流体合流路は相互に不混和な流体を１本の流路に合流させる流路であり、混合流発生路は合流した流体に混合流を発生させる流路である。例えば混合流発生路は、平板の表面から裏面へ向かって貫通する螺旋流路でよい。平板の裏面から表面へ流体を戻すため、平板を貫通する２つの螺旋流路を設け、平板の裏面にはこれら螺旋流路間を流体連通する連通路を設ける。
　細胞分離部１６は、細胞又は細胞塊を分離する分離槽Ｄ１－Ｄ２を備えている。例えば、分離槽Ｄ１－Ｄ２は、流路の幅又は深さを相対的に大きくして形成された貯溜槽であり、第１分離槽Ｄ１は元細胞を含む流体から元細胞のみを含む流体に分離し、第２分離槽Ｄ２は比較的大きな細胞塊のみを沈降させることで、それ以外の細胞塊と分離する。元細胞の分離方法としては、元細胞分離用試薬、パニング、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）、フローサイトメトリー等を用いることができる。
　細胞塊破砕部１７は、分離した細胞塊（１以上の細胞の塊）をさらに破砕する破砕流路を備えている。破砕流路は、上流流路と比べて相対的に小さい流路面積を有し、蛇行することが好ましい。流路を蛇行させることにより、潜流を発生させ、細胞塊に剪断応力を加えて大きく成長した細胞塊を小さな細胞塊に分解する。潜流とは、例えば、渦巻きを生じさせる流れ、乱流、逆流、流れの速さの異なる部分を生じさせる流れ、剪断力を生じさせる流れ、及び進行方向の異なる流れが衝突する部分を生じさせる流れのいずれかをいう。
　細胞製造装置１は、細胞作製プレート２に着脱可能に連結するベースプレートをさらに備えていることが好ましい。図６Ａ－図６Ｂはベースプレートの一例を示している。ベースプレート５は、細胞作製プレート２の流体制御、温度制御等を行う。細胞作製プレート２はロボット等が作用を及ぼす危険領域側７０の方を向くように配置されるのに対し、ベースプレート５は危険領域側７０とは反対側の安全領域側７１の方を向くように配置される。生物学的汚染防止の観点から、細胞作製プレート２を使い捨て可能とし、ベースプレート５を使い回し可能としてもよい。また、細胞製造装置１は安全領域側７１からメンテナンス可能に構成する。細胞製造装置１がこのような二面的構造を備えることにより、ロボット等が複数の細胞製造装置１に対して１対多で関わり合えるようになる。
　細胞製造装置１は、細胞作製プレート２とベースプレート５の連結面に、位置決め部材７２及びプレート封止部材７３をさらに備えていてもよい。位置決め部材７２は、相互に嵌合する凸部及び凹部でよく、細胞作製プレート２とベースプレート５との連結位置を位置決めする。プレート封止部材７３は、連結面外周に取付けたガスケット、パッキン等でよく、細胞作製プレート２とベースプレート５を連結することにより、プレート封止部材７３の内側が外部空間から遮断され、細胞作製プレート２の裏面からのガス透過が抑制される。ベースプレート５は、移送部１２を駆動する駆動部７４を備えている。駆動部７４は、例えばペリスタルティックポンプを駆動するモータを備えている。さらに、細胞作製プレート２とベースプレート５の連結面に、細胞作製プレート２に配置する電気素子、例えば加温素子、冷却素子、流量センサ等に電力供給する電気接点７５を備えていることが好ましい。
　以上の実施形態によれば、加温素子４０と冷却素子４１が相互に離間して細胞作製プレート２に配置されるため、両者の間に十分な断熱性を持たせることができる。これにより、複数の機能部位を集約した細胞作製プレート２であっても培養に必要な加温（加熱及び保温）と循環する培地に必要な冷却を同時に行うことが可能になる。
　本明細書において種々の実施形態について説明したが、本発明は、前述した種々の実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲に記載された範囲内において種々の変更を行えることを認識されたい。
　１　　細胞製造装置
　２　　細胞作製プレート
　３　　閉鎖式コネクタ
　４　　流体回路
　５　　ベースプレート
　１０　　注入排出部
　１０ａ－１０ｆ　　第１－第６注入排出チャネル
　１１　　容積可変部
　１２　　移送部
　１３　　細胞誘導培養部
　１３ａ　　細胞誘導培養槽
　１３ｂ　　培地循環路
　１３ｃ　　ｐＨ測定部
　１４　　流体溜め部
　１５　　流体混合部
　１６　　細胞分離部
　１７　　細胞塊破砕部
　１９　　流体容器
　２０　　平板
　２０ａ　　溝
　２０ｂ　　貯溜槽
　２０ｃ　　土手部
　２１　　蓋
　２１ａ　　表蓋
　２１ｂ　　裏蓋
　３０　　培養槽
　３０ａ　　培養槽フレーム
　３０ｂ　　培養側メッシュ
　３０ｃ－３０ｄ　　培養側封止部材
　３０ｅ　　カバーフレーム
　３１　　培地槽
　３１ａ　　培地槽フレーム
　３１ｂ　　培地側メッシュ
　３１ｃ　　培地側封止部材
　３２　　特定成分透過部材
　４０　　加温素子
　４１　　冷却素子
　４２　　流路集中部
　７０　　危険領域側
　７１　　安全領域側
　７２　　位置決め部材
　７３　　プレート封止部材
　７４　　駆動部
　７５　　電気接点
　Ａ１－Ａ４　　第１－第４貯溜槽
　Ｄ１－Ｄ２　　第１－第２分離槽
　Ｐ１－Ｐ８　　第１－第８ポンプ
　Ｓ　　外部空間

Claims (15)

  1. 　第１側及び第２側を有し、細胞の誘導及び培養の少なくとも一方を行う細胞誘導培養槽と前記細胞誘導培養槽に供給される培地を貯溜する培地貯溜槽とを備える細胞作製プレートと、
    　前記細胞作製プレートの前記第１側近傍に配置されていて前記細胞誘導培養槽を加温する加温素子と、
    　前記細胞作製プレートの前記第２側近傍に配置されていて前記培地貯溜槽を冷却する冷却素子と、
    　を備える、細胞製造装置。
  2. 　第１側及び第２側を有し、細胞の誘導及び培養の少なくとも一方を行う細胞誘導培養槽と前記細胞誘導培養槽に供給される培地を循環する培地循環路とを備える細胞作製プレートと、
    　前記細胞作製プレートの前記第１側近傍に配置されていて前記細胞誘導培養槽を加温する加温素子と、
    　前記細胞作製プレートの前記第２側近傍に配置されていて前記培地循環路を冷却する冷却素子と、
    　を備える、細胞製造装置。
  3. 　前記第１側及び前記第２側は、前記細胞作製プレートの第１面及び第２面であるか、又は前記細胞作製プレートの第１縁及び第２縁である、請求項１又は２に記載の細胞製造装置。
  4. 　前記培地循環路は前記細胞作製プレートの単位面積当たりの流路面積を相対的に大きくした流路集中部を備えており、前記冷却素子が前記流路集中部を冷却する、請求項２に記載の細胞製造装置。
  5. 　前記細胞誘導培養槽と前記流路集中部との間に断熱材をさらに備える、請求項４に記載の細胞製造装置。
  6. 　前記細胞誘導培養槽は、細胞浮遊培養を行う三次元培養槽であるか、又は接着培養を行う二次元培養槽である、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
  7. 　前記細胞誘導培養槽は、培養槽と、前記培地を前記培養槽に供給する培地槽と、を一体的に備えており、前記培養槽と前記培地槽が近接している、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
  8. 　前記細胞誘導培養槽は前記培養槽と前記培地槽との間で特定成分の行き来を許容する特定成分透過部材をさらに備える、請求項７に記載の細胞製造装置。
  9. 　前記特定成分透過部材は前記培地の行き来を許容する、請求項８に記載の細胞製造装置。
  10. 　前記加温素子は、前記細胞誘導培養槽に配置される透明板と、前記透明板に固着された透明導電膜と、を備える、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
  11. 　前記冷却素子は冷却側及び発熱側を備えるペルチェ素子であり、前記冷却素子の前記発熱側で発生する熱を前記加温素子に伝導する熱伝導部材をさらに備える、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
  12. 　前記細胞作製プレートに着脱可能に連結するベースプレートをさらに備え、前記冷却素子が前記ベースプレートに配置されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
  13. 　前記細胞誘導培養槽の前方、周囲方向、及び後方のうちの少なくとも１つから照明を当てる照明部をさらに備える、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
  14. 　前記細胞誘導培養槽又は前記細胞誘導培養槽に供給される培地を循環する培地循環路は、使用した前記培地のｐＨ値を測定するｐＨ測定部を備える、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
  15. 　前記細胞誘導培養槽又は前記細胞誘導培養槽に供給される培地を循環する培地循環路の少なくとも一部が白色又は黒色である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
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