JP3655558B2 - 生体細胞観察方法とその装置 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
この発明は、血管細胞に適する生体細胞観察方法とその装置に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、例えば、血管細胞の動脈硬化の発生メカニズムや血管内壁面にコルステロール等が付着する発生メカニズムの究明手段は、単独で培養した血管細胞に対して、例えば、酸素濃度の変化や機械的なストレス等人工的に環境変化を作り出し、複合ストレスを血管細胞に与えることで発生メカニズムの原因を探るようにしている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
発生メカニズムの原因究明は、実験室で行なわれるようになるが、実際の人体の血管にあっては、順次枝分かれしながら手、足、脳の末端まで張りめぐらされ、内側と外側では血管細胞内の溶存酸素濃度が異なるようになる点、また、枝分かれした2叉部にあっては、血管細胞のストレス要因となる複雑な血液の乱れが発生している等、生体内の環境条件とは明らかに異なる条件下で行なわれているのが現状である。このために正確な実験データとはなりにくい面があった。
【0004】
この場合、直接人体の血管細胞を長期間にわたって観察できれば発生メカニズムの正確なデータが得られるようになるが、人体を実験として使用することは現実問題として不可能である。
【0005】
そこで、この発明は、生体の環境条件に近い状態で生体細胞の観察が実験室において容易に行なえるようにした生体細胞観察方法とその装置を提供することを目的としている。
【0006】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、この発明の請求項1にあっては、透過性の隔膜によって仕切られた第1室と第2室とを作り、その第1室の隔膜上に生体細胞を形成し、生体細胞が形成された前記第1室内に溶存酸素濃度の高い培養液を、第2室内に溶存酸素濃度の低い培養液をそれぞれ循環させ、その内の少なくともいずれか一方の培養液を乱流の状態で循環させながら観察を行なうことを特徴とする。
【0007】
これにより、隔膜上に生体細胞が形成された第1室は、例えば、隔膜を介して生体細胞内側が溶存酸素濃度が高く、以下、外側へ向かうに従い溶存酸素が低くなる、いわゆる生体内の血管細胞と同じ酸素濃度勾配が確保された環境条件が得られる一方、乱流の状態で流れる培養液は、生体の血液と同じ流れが再現されることで、生体に近づいた条件下での生体細胞の観察が行なえる。この結果、正確な観察データが得られるようになる。
【0008】
また、この発明の請求項2によれば、透過性の隔膜によって仕切られる溶存酸素濃度の異なる培養液の少なくともいずれか一方が乱流の状態で流れる第1室及び第2室とを有する生体細胞観察部と、生体細胞観察部の第1室と接続連通し培養液を所定の溶存酸素濃度に維持する第1の培養液貯留装置と、第2室と接続連通し培養液を所定の溶存酸素濃度に維持する第2の培養液貯留装置と、所定の溶存酸素濃度に維持された第1の培養液貯留装置の培養液を前記第1室内へ送り出した後、再び第1の培養液貯留装置へ戻す第1循環ポンプと、所定の溶存酸素濃度に維持された第2の培養液貯留装置の培養液を前記第2室内へ送り出した後、再び第2の培養液貯留装置へ戻す第2循環ポンプとから成ることを特徴とする。
【0009】
これにより、生体細胞を形成した隔膜を介して第1室内に溶存酸素濃度の高い培養液を、第2室に溶存酸素濃度の低い培養液をそれぞれ循環させることで、生体内の血管細胞と同じ酸素濃度勾配が確保された環境条件が作り出せる。また、乱流の状態で流れる培養液は、生体の血液と同じ流れが再現されることで、生体に近づいた条件下で観察が行なえる観察装置の提供ができる。
【0010】
また、この発明の請求項3によれば、生体細胞観察部の第1室に、隔膜上面に生体細胞が形成されると共に培養液を隔膜へ向けて送り出す供給管と、隔膜に当たった培養液を隔膜に沿って外周へ向け誘導案内する誘導案内板とを備えるようにすることを特徴とする。
【0011】
これにより、供給管から送り出された培養液は隔膜に当ることで人体の血液と同じように例えば、枝分かれした血管の2叉部に当る同一環境条件の乱流が得られるようになる。一方、隔膜に当たった新鮮な乱流の培養液は、拡散することなく誘導案内板によって隔膜上の生体細胞と長く確実に接触し合い確実にストレスを与えることが可能となる。
【0012】
また、この発明の請求項4によれば、生体細胞観察部の底面に、下方から第1室内を観察する生体細胞観察窓を備えていることを特徴とする。
【0013】
これにより、生体細胞観察窓の下から顕微鏡によって生体細胞の動きを24時間自由に観察することが可能となる。
【0014】
また、この発明の請求項5によれば、第1循環ポンプと第2循環ポンプを、培養液を吐出する吐出ポンプ部と吐出ポンプ部で吐出された同一吐出量の培養液を吸込む吸込ポンプ部とで構成することを特徴とする。
【0015】
これにより、例えば、第1,第2循環ポンプの作動時において、吐出ポンプ部によって吐出された同一の吐出量だけ吸込ポンプによって吸込むため、培養液が第1室と第2室とを仕切る隔膜上を流れる時に、第1室及び第2室の圧力差がなくなる結果、隔膜上に形成された生体細胞の剥離がなくなり安定した観察が長期間にわたって確実に行なえると共に、隔膜を介して酸素の自然な行き来が行なわれるようになる。
【0016】
【発明の実施の形態】
以下、図1乃至図4の図面を参照しながらこの発明の実施の形態について具体的に説明する。
【0017】
図1はこの発明に係る生体細胞観察装置1を示している。生体細胞観察装置1は、ベース3上に載置セットされた生体細胞観察部5と、第1,第2の培養液貯留装置7,9と、第1,第2循環ポンプ11,13とで構成されている。
【0018】
ベース3はステンレスの材質で帯板状に作られていて、ベース3を持ち上げることで装置全体の持ち運びが可能となっている。
【0019】
生体細胞観察部5は、上部ケース15と下部ケース17と観察室となるチャンバケース19とを有している。下部ケース17は、底部が透明板によって閉塞された開口窓21となっていて、前記ベース3に設けられた生体細胞観察窓23の窓枠25に固定支持され、第2取入口27と第2取出口29とを有している。
【0020】
チャンバケース19は、フランジ部19aを有する上方が開放された円筒状に作られていて、底面は薄いフィルム状の透過膜で作られた隔膜31となっている。
【0021】
上部ケース15は、前記下部ケース17とでチャンバケース19を固定支持する支持部材として機能し、第1取入口33と第1取出口35とを有している。上部ケース15には下部ケース17の上端縁に支持されたチャンバケース19のフランジ部19aを上から押えつける押えフランジ37を有している。押えフランジ37は、下部ケース17のケース周面に設けられたねじ部17aと螺合し合う締結キャップ39によって上部ケース15、下部ケース17及びチャンバケース19の三者が一体に固定支持されることで、隔膜31を介して第1室41と第2室43が作られるようになっている。
【0022】
締結キャップ39は、図1鎖線で示すように螺合を弛めることで上部ケース15及びチャンバケース19の取外しが可能となり、チャンバケース19の交換が支障なく行なえるようになっている。
【0023】
第1,第2室41,43は、Oリング等のシール部材45によって水密状態に仕切られると共に、隔膜31で仕切られた上位側となるチャンバケース19の内側が前記した第1室41、下位側となる外側が前記した第2室43となっている。
【0024】
第1室41は、前記第1取入口33及び第1取出口35と、第2室43は、前記第2取入口27及び第2取出口29とそれぞれ接続連通している。
【0025】
第1室41には、第1取入口33からの培養液47を隔膜31へ向けて送り出し隔膜31へ当てることで乱流を作り出す供給管49と、隔膜31に当たった培養液47を隔膜31に沿って外周へ向け誘導案内する誘導案内板51とを備えている。
【0026】
この場合、隔膜31と対向し合う前記誘導案内板51の案内面51aを中心から外周へ向かって上昇するテーパ面としてもよい。
【0027】
第1,第2の培養液貯留装置7,9は、図3に示すようにベース3の上面に並列に配置されていて、第1の培養液貯留装置7は生体細胞観察部5の第1室41用、第2の培養液貯留装置9は生体細胞観察部5の第2室43用となっている。
【0028】
第1の培養液貯留装置7は、図1に示すように循環用入口53及び循環用出口55とを有する貯留タンク57内に、培養液47と溶存酸素検出センサ59と撹拌子61とを備え、その外に、フィルタ63を介して大気中から酸素を取入れる大気取入口65とを有している。
【0029】
培養液47は、溶存酸素濃度が大気と平衡状態にある濃度で、主成分はおもにリポタンパクと白血球とを含んでいる。
【0030】
溶存酸素検出センサ59は、培養液47の溶存酸素濃度を大気と平衡状態となるよう監視するものである。具体的には、溶存酸素検出センサ59により溶存酸素濃度を酸素分圧として監視し、その検出値に基づき図外の吸引装置を作動して吸引口67から吸引を行ない、大気取入口65から空気を取入れることで、培養液47内の酸素分圧が約20%となるよう制御管理されるようになっている。
【0031】
撹拌子61は、貯留タンク57の底部にセットされた駆動モータ69によって磁石71が回転することで、磁石71の磁力により回転力が与えられ内部の培養液47を撹拌するよう機能する。
【0032】
第1循環ポンプ11は、培養液47を吐出する吐出ポンプ部73と吐出ポンプ部73で吐出された同一吐出量の培養液47を吸込む吸込ポンプ部79とで構成され、この実施形態では、一方が吐出ポンプ部73になると、他方が吸込ポンプ部79とに交互に切換わるダイヤフラムポンプとなっている。
【0033】
即ち、左右一対のダイヤフラム81,81によって独立した第1ポンプ室83と第2ポンプ室84が形成され、第1,第2ポンプ室83,84のポンプ取入口85,85とポンプ取出口87,87には、ポンプ取入口85からポンプ取出口87へのみ流れを許す一方向弁89,89がそれぞれ設けられている。
【0034】
ダイヤフラム81は、駆動モータ91からの回転動力が偏心カム軸93によって駆動リンク95が図1矢印のように往復運動が与えられることで、例えば、第1ポンプ室83内が圧縮されることで第1ポンプ室83が吐出ポンプ部73として機能するようになる。同時に第2ポンプ室84内が拡大することで第2ポンプ室84が吸込ポンプ部79として機能し、第1,第2ポンプ室83,84のいずれか一方が吐出ポンプ部になると、他方が吸込ポンプ部となる形状となっている。
【0035】
一方、第2の培養液貯留装置9は、図2に示すように循環用入口53a及び循環用出口55aとを有する貯留タンク57a内に、培養液47aと溶存酸素検出センサ59aと撹拌子61aとを備え、その外に、フィルタ63aを介して大気中から酸素を取入れる大気取入口65aとを有している。
【0036】
培養液47aは、溶存酸素濃度が大気と平衡状態にある濃度より十分低い濃度で、主成分はおもにリポタンパクを含んでいる。
【0037】
溶存酸素検出センサ59aは、培養液47aの溶存酸素濃度を大気と平衡状態にある濃度より十分低い濃度となるよう監視するものである。具体的には、溶存酸素検出センサ59aにより溶存酸素濃度を酸素分圧として監視し、その検出値に基づき図外の吸引装置を作動して吸引口67aから吸引を行ない、ガス取入口65aから低い酸素濃度のガスを取入れることで、培養液47a内の酸素分圧が約5%となるよう制御管理されるようになっている。
【0038】
撹拌子61aは、貯留タンク57aの底部にセットされた駆動モータ69aによって磁石71aが回転することで、磁石71aの磁力により回転力が与えられ内部の培養液47aを撹拌するよう機能する。
【0039】
第2循環ポンプ13は、培養液47aを吐出する吐出ポンプ部73aと吐出ポンプ部73aで吐出された同一吐出量の培養液を吸込む吸込ポンプ部79aとで構成され、この実施形態では、一方が吐出ポンプ部73aになると、他方が吸込ポンプ部79aとに交互に切換わるダイヤフラムポンプとなっている。
【0040】
即ち、左右一対のダイヤフラム81a,81aによって独立した第1ポンプ室83aと第2ポンプ室84aが形成され、第1,第2ポンプ室83a,84aのポンプ取入口85a,85aとポンプ取出口87a,87aには、ポンプ取入口85aからポンプ取出口87aへのみ流れを許す一方向弁89a,89aがそれぞれ設けられている。
【0041】
ダイヤフラム81aは、駆動モータ91aからの回転動力が偏心カム軸93aによって駆動リンク95aが図2矢印のように往復運動が与えられることで、例えば、第1ポンプ室83a内が圧縮されることで第1ポンプ室83aが吐出ポンプ部73aとして機能するようになる。同時に第2ポンプ室84内が拡大することで第2ポンプ室84aが吸込ポンプ部79aとして機能し、第1,第2ポンプ室83a,84aのいずれか一方が吐出ポンプ部になると、他方が吸込ポンプ部となる形状となっている。
【0042】
第1,第2ポンプ室83a,84aのポンプ取入口85a,85aは、第2の培養液貯留装置9の循環用出口55a及び第2室43の第2取出口29と、ポンプ取出口87a,87aは前記第2室43の第2取入口27及び第2の培養液貯留装置9の循環用入口53aとシリコン製のゴムチューブ101を介してそれぞれ接続連通している。
【0043】
シリコン製のゴムチューブ99,101は、チャンバケース19を交換する際に上部ケース15を下部ケース17から取外す際に、自由に屈曲することで、上部ケース15の取外しに何等支障が起きないようになっている。
【0044】
なお、シリコン製のゴムチューブ99,101には三方弁103が設けられている。この三方弁103は、初期作動時に第1,第2循環ポンプ11,13を作動しながら弁体103aを開とすることで、チューブ99,101内及び第1,第2室41,43内のガスを外へ排出するよう機能する。
【0045】
次に、装置を使って生体細胞の観察方法について説明する。まず、図4に示すように隔膜31上面に生体細胞となる血管細胞Wを形成したチャンバケース19をセットする。次に、第1,第2循環ポンプ11,13を駆動し、第1,第2の培養液貯留装置7,9の溶存酸素濃度の異なる培養液47,47aを生体細胞観察部5の第1室41と第2室43内をそれぞれ通過させる。この時、第1室41内に乱流が作られると共に、再び第1,第2循環ポンプ11,13へ戻るよう循環させながら観察を行なう。
【0046】
この場合、血管細胞Wは内側が内皮細胞、外側となる隔膜31と接触し合う側が平滑筋細胞となっていて、内皮細胞は乱流によるストレスの要因で機能変化をもたらし血管壁に病変形成に大きく関与する生理活性分子が生れる。例えば、血流中の白血球を減速して内皮細胞表面に接着させる細胞間接着因子を発現させたりあるいは細胞マトリックス内に取り込まれたマクロファージを分化させて異物取り込みの能力亢進や増殖させるマクロフージコロニー刺激因子や顆粒球マクロファージコロニー刺激因子が産生される。
【0047】
一方、平滑筋細胞は、溶存酸素濃度、特に、低濃度溶存酸素環境によるストレスの要因で機能変化をもたらし、病変形成に大きく関与する多様な生理活性分子が生れる。例えば、低濃度溶存酸素下において、内皮細胞に接着した白血球を平滑筋とコラーゲンとで形成された血管壁細胞マトリックス内へ移動させる因子を発現させたり、あるいは、血管壁内に取り込まれた白血球の遊走を抑制して、その場にとどめる働らきを持つ因子が産生されるようになる。
【0048】
この観察時において、隔膜31上面に血管細胞Wが形成された第1室41内には、溶存酸素濃度の高い培養液が、第2室43内には、溶存酸素濃度の低い培養液がそれぞれ循環する。この培養液の循環時において、吐出ポンプ部73と吸込ポンプ部79とにより第1,第2室41,43に圧力差が発生することがなくなり、血管細胞Wの剥離は起きない。
【0049】
また、血管細胞Wの内側が酸素濃度が高く、外へ行くほど酸素濃度が低くなる生体内の血管細胞と同じ酸素濃度勾配の環境条件が作り出せる。と同時に、培養液47が隔膜31に当ることで乱流が作られ、乱流は、誘導案内板51によって拡散することなく血管細胞Wに確実にストレスを与えることが可能になるため、生体に近づいた血管細胞Wの観察が正確に行なえるようになる。
【0050】
一方、ベース3を持って図外の顕微鏡に生体細胞観察窓23をセットすることで24時間顕微鏡による血管細胞Wの観察が可能となる。
【0051】
【発明の効果】
以上のように請求項1の発明あっては、生体内と同じ環境条件下での生体細胞の観察を行なうことができるため、正確な観察データが得られる。
【0052】
また、請求項2の発明にあっては、生体細胞の内側を溶存酸素濃度が高く、外側へいくにしたがって溶存酸素濃度が低くなる生体内の血管細胞と同じ酸素濃度勾配の環境条件が作り出せる。また、乱流によって人体の血液と同じ流れを再現できる。
【0053】
また、請求項3の発明にあっては、誘導案内板によって乱流を拡散させることなく確実に作用させ生体細胞に確実にストレスを与えることができる。
【0054】
また、請求項4の発明にあっては、生体細胞観察窓から顕微鏡によって生体細胞の動きを24時間自由に観察することができる。
【0055】
また、請求項5の発明にあっては、第1室と第2室の圧力差をなくすことができるため、生体細胞の剥離がなくなり、安定した観察が長期間にわたって確実に行なえるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図1】この発明にかかる生体細胞観察装置の第1室側の培養液の流れを示した概要説明図。
【図2】生体細胞観察装置の第2室側の培養液の流れを示した概要説明図。
【図3】生体細胞観察装置の概要平面図。
【図4】生体細胞観察部の拡大説明図。
【符号の説明】
3 ベース
5 生体細胞観察部
7,9 第1,第2の培養液貯留装置
11,13 第1,第2循環ポンプ
23 生体細胞観察窓
31 隔膜
41 第1室
43 第2室
47,47a 培養液
49 供給管
51 誘導案内板
73 吐出ポンプ部
79 吸込ポンプ部
Claims (5)
- 透過性の隔膜によって仕切られた第1室と第2室とを作り、その第1室の隔膜上に生体細胞を形成し、生体細胞が形成された前記第1室内に溶存酸素濃度の高い培養液を、第2室内に溶存酸素濃度の低い培養液をそれぞれ循環させ、その内の少なくともいずれか一方の培養液を乱流の状態で循環させながら観察を行なうことを特徴とする生体細胞観察方法。
- 透過性の隔膜によって仕切られる溶存酸素濃度の異なる培養液の少なくともいずれか一方が乱流の状態で流れる第1室及び第2室とを有する生体細胞観察部と、生体細胞観察部の第1室と接続連通し培養液を所定の溶存酸素濃度に維持する第1の培養液貯留装置と、第2室と接続連通し培養液を所定の溶存酸素濃度に維持する第2の培養液貯留装置と、所定の溶存酸素濃度に維持された第1の培養液貯留装置の培養液を前記第1室内へ送り出した後、再び第1の培養液貯留装置へ戻す第1循環ポンプと、所定の溶存酸素濃度に維持された第2の培養液貯留装置の培養液を前記第2室内へ送り出した後、再び第2の培養液貯留装置へ戻す第2循環ポンプとから成ることを特徴とする生体細胞観察装置。
- 生体細胞観察部の第1室は、隔膜上面に生体細胞が形成されると共に培養液を隔膜へ向けて送り出す供給管と、隔膜に当たった培養液を隔膜に沿って外周へ向け誘導案内する誘導案内板とを備えていることを特徴とする請求項2記載の生体細胞観察装置。
- 生体細胞観察部の底面に、下方から第1室内を観察する生体細胞観察窓を備えていることを特徴とする請求項2又は3のいずれかに記載の生体細胞観察装置。
- 第1循環ポンプと第2循環ポンプは、培養液を吐出する吐出ポンプ部と吐出ポンプ部で吐出された同一吐出量の培養液を吸込む吸込ポンプ部とで構成されていることを特徴とする請求項2記載の生体細胞観察装置。
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