CN103614339B - 一种细胞分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞分离方法,采用垂直分布的多张滤膜对样本进行分级过滤,其中,所述滤膜的滤孔孔径为4μm‑50μm,滤孔孔径由上至下依次减小。本发明通过孔径逐渐减小的多级滤膜对样本进行梯度过滤,能够对不同尺寸的各类细胞保持较好的截留率,尤其是用来分离肿瘤细胞时,可针对富集到的不同尺寸肿瘤细胞选择不同的检测方式。采用多层滤膜还能够有效避免滤膜堵塞而影响细胞分离效率的问题。

Description

一种细胞分离方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种利用多层滤膜对细胞进行过滤的细胞分离方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞,是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因。近年来,随着检测技术的不断改进,CTCs检测作为一种新型的非侵入性诊断工具,在早期发现患者术后复发与远处转移、评估疗效与预后等方面的应用价值已成为临床研究的热点。
由于CTCs在外周血中的数量极少,通常需在约1亿个白细胞和500亿个红细胞中寻找仅有的数个肿瘤细胞,因此为了提高CTCs的检出率,通常需在检测前行CTCs富集,即将CTCs从血液或其他样本中分离出来。目前CTCs的富集方法按其原理主要分为免疫磁性分离法和基于CTCs的物理性质的富集法。其中,基于CTCs的物理性质的富集法主要由密度梯度离心法和过滤法。
密度梯度离心法是目前实验室常用的一种富集肿瘤细胞的方法,可从外周血中分离单个核细胞(包括CTCs),设备要求不高,方法较为简单,但该方法缺乏特异性,易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失。
过滤法是基于肿瘤细胞大小的分离法(isolation by size of epithelialtumor cells,ISET),主要根据肿瘤细胞与正常细胞的大小不同来分离肿瘤细胞。这种通过物理方法分离的细胞形态保存完整,表面的各种抗原或分子标记均无破坏,不影响细胞的特性,为后续的检测提供了良好的条件,且该方法设备技术要求不高,过程易于掌握。
关于采用滤膜过滤来进行CTCs细胞富集这种方法,科学家及学者进行了广泛的研究,但是现有的很多实验的研究都是基于一张滤膜和同一尺寸孔径进行分离,这样会导致特定尺寸细胞的丢失;当标本质量较差时,还容易发生滤膜堵塞,影响分离效果。
发明内容
为此,本发明的目的在于提供一种对各尺寸的细胞都能够进行分离的细胞分离方法。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种细胞分离方法,采用垂直分布的多张滤膜对样本进行分级过滤,其中,所述滤膜的滤孔孔径为4μm-50μm,滤孔孔径由上至下依次减小。
可选地,根据本发明的细胞分离方法,所述多张为至少两张。
可选地,根据本发明的细胞分离方法,所述相邻两张滤膜之间的间距为5μm-20cm。
可选地,根据本发明的细胞分离方法,所述滤膜的面积为0.5mm2-5mm2
可选地,本发明所述的细胞分离方法,所述滤膜的厚度为2μm-1mm。
可选地,根据本发明的细胞分离方法,所述每个滤膜含有1000-100000个滤孔。
可选地,根据本发明的细胞分离方法,所述滤膜为派瑞林薄膜或聚合物薄膜。
可选地,根据本发明的细胞分离方法,所述细胞为肿瘤细胞。
本发明通过孔径逐渐减小的多级滤膜对样本进行梯度过滤,能够对不同尺寸的各类细胞保持较好的截留率,尤其是用来分离肿瘤细胞时,可针对富集到的不同尺寸肿瘤细胞选择不同的检测方式。采用多层滤膜还能够有效避免滤膜堵塞而影响细胞分离效率的问题。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述,各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的,而并不认为是对本发明的限制。在附图中:
图1为本发明一个实施例中滤膜分布的示意图;以及
图2为实现本发明细胞分离方法的一种滤器的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步的描述。
本发明提供了一种细胞分离方法,采用垂直分布的多张滤膜对样本进行分级过滤,其中,所述滤膜的滤孔孔径为4μm-50μm,滤孔孔径由上至下依次减小。所述滤膜的数量至少为两张,可以理解的是,其数量可根据样本的情况进行调整。
图1示出了本发明一个实施例中滤膜分布的示意图,该实施例中采用了4张滤膜对样品进行过滤。如图1所示,4张滤膜垂直分布,按照自上而下的顺序依次为第一滤膜110,第二滤膜120,第三滤膜130和第四滤膜140,每个滤膜上都分布有多个滤孔200。所述滤孔200的孔径按照第一滤膜110至第四滤膜140的顺序依次递减。全血或特定的血样由上至下依次经过四层滤膜的过滤,最后变成废液排出。由于滤膜的孔径依次减小,该4层滤膜对细胞形成梯度过滤,每层滤膜上都富集有特定尺寸的细胞,实现对不同尺寸的各类细胞保持较好的截留率。尤其是用来分离肿瘤细胞时,可针对富集到的不同尺寸肿瘤细胞选择不同的检测方式。例如,较大尺寸细胞可用于光学染色,中等大小细胞用于免疫组化染色,较小细胞可用于分子生物学鉴定,从而满足不同的检测需求。样本质量差时,采用单层滤膜进行过滤时易导致滤膜堵塞,进而影响过滤的效果,采用多层滤膜还能够有效避免该种情况的发生。
采用上述多张滤膜进行过滤时,可将多张滤膜设置在一容积管内,制成滤器,过滤完成后将滤膜从容积管中取出,进行后续处理即可。图2中示出了实现本发明分离方法的滤器的一种分解结构示意图,其中,图中仅示意性地示出了一张滤膜。如图2中所示,所述滤器包括容积管300,所述容积管300内部中空,在所述容积管300内设置有滤膜100,所述滤膜100通过膜托800固定在所述容积管300内。所述膜托上设置有能够让样本流出的通道,而且其能够从所述容积管内取出,以在过滤完成后能够将其上的滤膜取下。所述容积管300的上端部连接有上塞体400。所述上塞体400通过容积管上端部的开口伸入所述容积管内与容积管连接,所述上塞体400沿其轴向设置有通孔,使得待分离样本由此通孔进入容积管内。在所述容积管300的下端部连接扣盖500,所述扣盖500的下部具有开口,所述膜托800的一部分穿过该开口后与一下塞体600连接,所述下塞体600的底部设置有出液口。待分离的样本经由上塞体的通孔进入容积管内,由滤膜拦截细胞后经下塞体的出液口排出。将滤膜上得到的目标细胞进行常规染色和漂洗处理后,将扣盖从容积管上卸下,将滤膜从膜托上取下进行干燥封片(封片,即,将滤膜封固保存于载玻片与盖玻片之间,使之不与空气发生接触,利于保存及后续的观察),即可进行下一步的观察或检测。还可以在膜托与扣盖接触处加装密封垫,以保证两者连接的密封性,防止样本而密封不好而发生泄露。
本发明滤器中所用的滤膜的厚度可以根据实际样品的情况进行调整,一般厚度为2μm-1mm。由于滤膜厚度较薄,如果待分离的样品较为粘稠或进样速度较快时,会对滤膜造成一定的冲击力。为了防止冲击力过大引起滤膜破损,本发明所述滤器中,在所述滤膜100与所述膜托800之间设置有过滤塞700。所述过滤塞700的面积等于或略大于所述滤膜2的面积。将滤膜平铺在所述过滤塞上之后,在将过滤塞固定在所述膜托上。由于过滤塞对滤膜提供支撑,即使待分离的样品对滤膜形成冲击时,也能保证滤膜不会出现破损,保证过滤的顺利进行。同时,为了保证滤膜在经受待分离样品的冲击时保持平整,还可以在所述滤膜上放置压垫8,所述压垫压在所述滤膜的边缘,能够使得样品落到滤膜上时不会使其产生皱褶而影响过滤效果。
本发明中,利用多层滤膜进行过滤时,所述相邻两张滤膜之间的间距为5μm-20cm,具体的间距可根据样本的实际情况进行设计和调整。所述滤膜的面积一般为0.5mm2-5mm2,根据过滤的实际需要,滤膜上分布的滤孔数量可以为1000-100000个。
本发明的细胞分离方法,所述滤膜为派瑞林薄膜或聚合物薄膜。其中,所述聚合物薄膜可以是诸如聚碳酸酯薄膜、聚乙烯薄膜等任何聚合物薄膜。
本发明所述的细胞分离方法,可适用于各种不同尺寸特定细胞的分离,尤其是肿瘤细胞。由于肿瘤细胞较淋巴细胞和中性粒细胞的尺寸较大,采用该种过滤方法,可将各尺寸的肿瘤细胞阻滞在滤膜上,而其他细胞被过滤掉。利用该分离方法,更可以对循环肿瘤细胞进行富集,从而对其进行进一步的研究。当然,该分离方法也同样适用于其他细胞的分离,只要样本中的细胞尺寸存在差异,通过合理设置滤膜的滤孔孔径,也可以有效地将各种尺寸的细胞依次分离出来。
相对于现有技术中利用单层滤膜进行细胞分离的方法,本发明所述细胞分离方法对各类细胞具有更好的截留效果。为了更好地说明该效果,本发明将采用单层滤膜进行过滤的效果与采用三层滤膜进行过滤的效果进行了对比试验。其中,所述单层滤膜的滤孔孔径为10μm;三层滤膜中所用的三个滤膜的滤孔孔径分别为10μm、8μm和5μm的,按照孔径由上至下依次减小的顺序将所述三个滤膜垂直设置,每相邻两个滤膜之间的间距为500μm。对比试验的结果如下表1所示。
表1单层滤膜与三层滤膜对细胞的截留率对比
PC3 SKBR-3 HT29 MDA-MB-231 Hep G2
单层滤膜 85±5% 78±7% 71±5% 50±10% 52±12%
多层滤膜 99±1% 98±2% 97±2% 96±1% 98±1%
上表中:
PC3为前列腺癌细胞系,该细胞的平均直径约16.78um。
SKBR-3为乳腺癌细胞系,该细胞的平均直径约14.76um。
HT29为结肠癌细胞系,该细胞的平均直径约12.56um。
MDA-MB-231为乳腺癌细胞系,该细胞的平均直径约10.69um。
Hep G2为肝癌细胞系,该细胞的平均直径约12.56um。
由上述表1可以看出,通过三层滤膜的梯度富集,几乎能将所有的肿瘤细胞分离出来,细胞的截留效果明显高于单层滤膜的截留效果。上述肿瘤细胞的对比试验仅为示例性说明,可以理解的是,任何具有尺寸差异的细胞均可通过本发明所述方法进行分离。
应该注意的是,上述实施例对本发明进行说明而不是对本发明进行限制,并且本领域技术人员在不脱离所附权利要求的范围的情况下可设计出替换实施例。在权利要求中,不应将位于括号之间的任何参考符号构造成对权利要求的限制。单词“包含”不排除存在未列在权利要求中的元件或步骤。单词第一、第二以及第三等的使用不表示任何顺序,可将这些单词解释为名称。

Claims (2)

1.一种采用滤膜过滤富集和分离循环肿瘤细胞的方法,其特征在于,采用垂直分布的多张滤膜对样本进行分级过滤;
所述相邻两张滤膜之间的间距为5μm-20cm,所述滤膜的面积为0.5mm2-5mm2,所述滤膜的厚度为2μm-1mm,所述每个滤膜含有1000-100000个滤孔;
其中,所述滤膜的滤孔孔径为4μm-50μm,滤孔孔径由上至下依次减小,该滤膜设置在容积管内制成滤器,
所述滤器包括:
容积管(300),所述容积管(300)内部中空,在所述容积管(300)内设置有滤膜(100);
膜托(800),所述膜托(800)固定在所述容积管(300)内,所述膜托上设置有通道,且其能从所述容积管内取出;
上塞体(400),所述上塞体(400)连接在所述容积管(300)的上端部,通过所述容积管上端部的开口伸入所述容积管内与容积管连接,并沿其轴向设置有通孔,使得待分离样本由此通孔进入容积管内;
扣盖(500),所述扣盖(500)连接在所述容积管(300)的下端部,所述扣盖(500)的下部具有开口;
下塞体(600),所述膜托(800)的一部分穿过所述扣盖(500)的下部开口后与下塞体(600)连接,所述下塞体(600)底部设置有出液口;
过滤塞(700),所述过滤塞(700)设置在所述滤膜(100)与所述膜托(800)之间,所述过滤塞(700)的面积等于或略大于所述滤膜的面积;
压垫(8),所述压垫(8)放置在所述滤膜上,所述压垫压在所述滤膜的边缘;
所述多张为至少两张;所述细胞为循环肿瘤细胞。
2.根据权利要求1的所述采用滤膜过滤富集和分离循环肿瘤细胞的方法,其特征在于:所述滤膜为聚合物薄膜。
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