JP2024520588A - 細胞採取能力を強化したバイオリアクターシステム、および関連方法 - Google Patents

Abstract

【構成】本発明の細胞採取システムおよび方法は固定床構造体などの細胞閉じ込め/付着および細胞増殖を行う構造体を備えたバイオリアクターを有する。細胞採取機構によって、例えば固定床を振動または振盪するなどしてバイオリアクターを撹拌し、このバイオリアクターのフラッシュ処理および充填処理を反復するなどしてこの構造体に対して液体レベルを移動させる。塊状物や凝集物を発生することなく、細胞を分離する酵素カクテルなどの細胞分離溶液をバイオリアクターに添加する。本発明のバイオリアクターの場合、別なバイオリアクターの上流側に前培養容器を設けることが可能である。【選択図】図２B

Description

本明細書は全体としては細胞採取能力を強化したバイオリアクターシステムおよび関連方法に関する。

背景

バイオマニファクチュアリングを使用対象とする一部の高細胞密度バイオリアクターの場合、細胞閉じ込め/付着および細胞培養を促進するための構造体例えば固定床（構造化床あるいは充填式床など）を有する。固定床の素材構成は局所的な流体、熱および物質移動に影響する。多くの場合、固定床は所定のスペース内で細胞培養を最大化するために密度がきわめて高い。

一部のバイオマニファクチュアリング用途では、固定床内で増殖する細胞は増殖ステージ後にバイオリアクターからそれ自体を採取する。これは細胞採取をシードトレインとして使用して、別な（例えば産生用の）バイオリアクターに接種するための細胞を培養するケースか、あるいは細胞自体が（例えば細胞バンクを設立するか、あるいは細胞治療に使用するための）目的産生物であるケースに相当するといえる。固定床から生きた状態の細胞を採取するためには、トリプシン酵素などの化学製剤を使用することができる。なお、この化学製剤を単独で使用すると、限られた量の細胞分離が生じる。主な理由は一般的なバイオリアクター内の固定床の構成物質が密に充填されているためであり、固定床全体に化学製剤を循環させることが、また細胞採取収量の増量がさらに困難になる。

細胞もインテグリンと呼ばれている小さなケーブル状の蛋白質を介して固定床に付着する。加えて、細胞がコラーゲンやグルコサミノグリカン類などの他の蛋白質を産生し、これがネットに似た細胞外マトリックスを形成する。トリプシンなどの分離溶液を使用して構造体から細胞を分離する時でさえ、これら蛋白質によって採取細胞が塊まり、これは回収するという目的にはそぐわず、細胞収量が目的未満になる。
即ち、バイオリアクターから採取される細胞の収率を改善する方法が求められている。

概要

本発明の一つの態様は細胞の採取方法に関する。この方法では、細胞閉じ込めまたは細胞付着および細胞増殖を可能にする固定床構造体を設置し、培地によってバイオリアクターに細胞を加え、細胞を閉じ込め、および/または固定床に付着（接着）させ、このバイオリアクター内で増殖させることができる。この方法では、さらに、バイオリアクターを撹拌し、固定床構造体に対して液体レベルを移動させ、酵素カクテルを有する細胞分離溶液をバイオリアクターに導入し、固定床構造体から細胞の一部を、この細胞部分を塊状化または凝集させずに分離する。

一つの実施態様では、撹拌工程および移動工程を同時に行う。移動工程では、例えば固定床構造体の上部隣接部から固定床の下部隣接部へ液体レベルを移動させるなどによってバイオリアクターから少なくとも部分的に排液を行うことができる。移動工程では、例えば細胞分離溶液をバイオリアクターに追加するなどによって液体をバイオリアクターに添加することができ、また細胞の閉じ込め/付着および培養を行う構造体をバイオリアクターに移動させて、液体レベルの位置を移動させることができる。

移動工程に先立って液体レベルを固定床構造体より高くし、（例えば固定床構造体の上部から固定床構造体の底部へ）液体レベルを複数回（一回限りでもよい）上下させてもよい。撹拌工程では、バイオリアクターを振動させてもよい。導入工程では、インテグリンを裂開する酵素、および細胞外マトリックスを酵素カクテルとして裂開する異なる酵素を導入することができる。

本発明のさらに別な態様は細胞を採取するシステムを提供するものである。このシステムは細胞の閉じ込め/付着および培養を行う構造体、バイオリアクター内を撹拌し、かつこの構造体に対して液体レベルを移動させる細胞採取機構、およびバイオリアクターと流体連絡する細胞分離溶液を有する容器を有するバイオリアクターを備える。細胞分離溶液は一旦分離した細胞の部分に塊状物または凝集物を発生することなく細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体から細胞の一部を分離する酵素カクテルを有する。

一つの実施態様では、細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体は３Ｄプリンター固定床などの固定床を有する。細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体は例えば積層構造または螺旋構造の複数の細胞固定化層を有し、これら細胞固定層が隣接層間のスペースに直接的にあるいは間接的に接触する。細胞採取機構はバイオリアクター（特に細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体）を振動または振盪する装置および/またはポンプを有する。この細胞採取機構は細胞を採取して、別なバイオリアクターに導入する採取容器を備えることができるバイオリアクター用のドッキングステーションの一部を形成することができる。

これらの、あるいは別な実施態様では、バイオリアクターは水平面に対して傾動（ｔｉｌｔ）できるように構成して、細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体からの排液を促進することができる。細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体を内部において、あるいは外部において圧縮するコンパクターを設けることができる。酵素カクテルはインテグリンを裂開する酵素および細胞外マトリックスを裂開する異なる酵素を有する。

細胞採取装置はバイオリアクターに対して細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体を移動させて、液体レベルの位置を移動させる作動装置（アクチュエータ）を備えることができる。細胞採取機構を制御してバイオリアクターを撹拌し、かつ細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体に対して液体レベルを移動させる制御装置を設けることができる。この制御装置は酵素カクテルのバイオリアクターへの搬送を制御できる構成である。

本発明のさらに別な態様は細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体を有するバイオリアクター、このバイオリアクターを撹拌する撹拌機、細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体に対して液体レベルを移動させる作動装置（アクチュエータ）、およびバイオリアクターと流体連絡する細胞分離溶液を有する容器を備えた細胞採取システムに関する。細胞分離溶液は塊または凝集物を発生することなく細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体から細胞の一部を分離する酵素カクテルを有する。

一つの実施態様では、撹拌機は振動装置を有する。作動装置（アクチュエータ）は線形作動装置（アクチュエータ）およびポンプを備えていればよい。作動装置（アクチュエータ）および/または撹拌機を制御する制御装置を設けることも可能である。

本発明のさらに別な態様は細胞採取システムに関する。このシステムは細胞の閉じ込め/付着および増殖を行う構造体を有するバイオリアクターを備える。細胞採取機構はバイオリアクターに液体を充填し、かつこれでフラッシュ処理を行っている状態で、バイオリアクター内を撹拌できる。容器はバイオリアクターと流体連絡する細胞分離溶液を有する。

一つの実施態様では、細胞分離溶液は塊状物や凝集物を発生せずに細胞を分離する酵素カクテルを含有する。細胞採取機構はバイオリアクターに、特にバイオリアクターおよび/構造体、および/またはバイオリアクターを部分的にまたは完全に充填し（充填処理）、空にし（空処理）、およびフラッシュ処理する装置に振動エネルギーを与える装置を備えることができる。充填処理、空処理、そしてフラッシュ処理を行う装置は一つかそれ以上のポンプを備えることができる。細胞採取機構はバイオリアクター用のドッキングステーションの一部を形成することができる。

本発明のさらに別な態様は固定床バイオリアクターから細胞を分離する方法に関する。この方法では、塊状物や凝集物を発生することなく細胞分離用酵素カクテルを固定床バイオリアクターに加え；そしてバイオリアクターを振動状態で固定床バイオリアクター内の液体レベルの位置を調節する。調節工程では、例えばバイオリアクターの液体充填および液体フラッシュ処理を繰り返すなどによってバイオリアクターの液体充填および液体フラッシュ処理を実施することができる。さらに、本発明方法ではバイオリアクターからの分離細胞を別なバイオリアクターに搬送する工程を有する。加えて、本発明方法ではバイオリアクター内の固定床の傾動および/または圧縮化を実施することができる。調節工程ではバイオリアクターに対して固定床を移動させることができる。

本発明のさらに別な態様はバイオリアクター内の細胞を分離する方法に関する。この方法では、バイオリアクターの振動、傾動および排液を実施する。振動工程、傾動工程および排液工程については同時に実施することができる。

以上に加えて、本発明は細胞の採取システムにも関する。本発明システムは付着細胞増殖を行う固定床および、この固定床を圧縮し細胞の分離を促進する圧縮装置（コンパクター）を有するバイオリアクターを備える。前記バイオリアクターまたは前記固定床を振動させる振動装置を設けることもできる。前記圧縮装置は前記固定床内か前記固定床外に位置することができる。
さらに加えて、本発明は細胞の採取システムにも関する。本発明システムは付着細胞増殖を行う構造体を有する前培養容器、および、バイオリアクターを振動させて、細胞をこの構造体から分離する振動措置を有する。この前培養容器の下流側にあるバイオリアクターは、分離細胞を受け取るためである。この前培養容器から液体を送り出し、前記構造体に対して液体レベルを移動させるポンプを設けることもでき、また、振動装置と同様に前記ポンプを制御する制御装置を設けることもできる。

図１は本発明の一態様に係るバイオリアクターシステムを示す概略図である。
図２は本発明の別な態様に係るバイオリアクターシステムの実施例を示す詳細図である。な
図２Ａは振動台などの撹拌装置にバイオリアクターを接続する接続装置の実施例を示す図である。
図２Ｂは本発明に係るバイオリアクターシステムの使用例を示すフローチャートである。
図３はバイオリアクターを示す図で、液体が振動時に対応する固定床内で移動またはパルス印加を行って細胞採取を改善する方法を示す図である。
図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、および図３Ｆは本明細書に開示する発明性のある各種態様から作用効果を得ることができるバイオリアクター構成の他の各種形態を示す図である。
図４は本発明の別な態様に係るバイオリアクターシステムの別な実施態様を示す概略図である。
図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃは振動台を備えたドッキングステーションに組み込んだバイオリアクターを示す図である。
図５は機械的エネルギーを印加して固定床を排液する異なる方法を示す図である。
図６および図７は排液時にバイオリアクターを傾動させて、流体回収を促進する状態を示す図である。
図８、図９、および図１０は固定床を圧縮する圧縮装置（コンパクター）の各種実施態様を示す図である。
図１１～図１６は動的固定床を備えたバイオリアクターを示す図である。
図１７～図１９はバイオプロセシング操作の各種の制御態様の実施例を示す図である。
図２０～図２４は本発明の各種態様に従って実施する例示的な実験を示す詳細図である。

詳細な説明

本発明の一つの態様は細胞採取能力を強化したバイオリアクターに関する。図１を参照して説明すると、このバイオリアクターは固定床１４（ｆｉｘｅｄ ｂｅｄ）などの付着細胞増殖または懸濁細胞増殖用構造体などのバイオリアクター１２を備えるシステム１０によって実現できる。固定床１４は例えば構造化固定床、３Ｄプリントマトリックス、あるいは介在しているスペーサ、ビーズ、中空糸に直接接触する物質からなる一つかそれ以上のシート、または付着細胞増殖や閉じ込めによる細胞増殖を促進するその他の好適な細胞培養構造を備えていればよい（例えば以下の図３Ａ～図３Ｆの説明を参照）。固定床１４については、例えば３Ｄ多孔質モノリス、積層（例えば本明細書に援用するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．１１，１１１，４７０を参照）、垂直に配設した平行層、螺旋状や巻き線状の層や充填床（例えば本明細書に援用するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８，１３７，９５９を参照）を始めとする任意の所望形状、配向または形態で設計することができる。

さらに、システム１０はバイオリアクター１２から採取される細胞の収量を改善する細胞採取機構１６を備える。細胞採取機構１６にはバイオリアクター１２を組み込んでもよく、あるいは細胞の採取が望ましいときにのみバイオリアクターへの接続や相互作用によって細胞採取機構１６を接続し、この状態で使用してもよい。以下の記載でさらに説明するように、採取機構１６はバイオリアクター１２のドッキングステーションに組み込んでもよく、あるいは一体化システムの外部に設けてもよい。

図２に示す一つの実施例では、細胞採取機構１６はバイオリアクター１２を撹拌する第１装置１８および一つの実施例では液体化学カクテルをバイオリアクター１２に充填することによってバイオリアクター１２内の液体レベルを移動または変更する第２装置２０を備えるため、液体レベルを固定床の上部の位置に、あるいはそれより上に設定し、バイオリアクター１２から排液を行って、液体レベルを充填レベルから固定床１４の底部またはその下に下げることができる。あるいは、またはこれに加えて、第２装置２０によって固定床バイオリアクター１２の内部と外部との間で液体の一部を往復動作即ち“前後”動作させてもよい。この液体の前後動作を一つかそれ以上のポンプなどの作動装置（アクチュエータ）によって行うと、液体を部分的に排液してから、バイオリアクターに部分的に導入するさいにパルス動作を発生できる。あるいは、バイオリアクター１２の完全な排液および完全な再充填を行うことができる。このため、バイオリアクター１２には入り口２４、出口または排液口２６を設けることができ、いずれも好適なポンプ２２ａ、２２ｂ、およびベント２８に対応させることができる。バイオリアクター１２は硬質な容器で構成してもよく、あるいは使い捨て容器またはバックで構成してもよい。

第１装置１８は例えば撹拌エネルギーをバイオリアクター１２から固定床１４に印加する任意の手段で構成することができる。バイオリアクター１２のエネルギーを印加する部分については、細胞が分離するのに十分な態様で固定床１４が振動している間これと一体化していればよい。第１装置１８は例えば振動台の形を取る撹拌機、ボルテックス装置、振盪装置、あるいは機械的エネルギーをバイオリアクターに印加できる別な装置および/または固定床１４などの付着細胞増殖/細胞閉じ込めを行う構造体であればよい。第１装置１８はバイオリアクター１２に対して内部にあってもよく、あるいは外部にあってもよい。振動運動としては振動でもよく、往復動でもよく、周期動でもよく、いずれも調和動またはランダム動の形を取ることができる。周波数については２０～１００ヘルツであればよく、より具体的には５０～８０ヘルツであればよい。振幅については低くてよく、例えば０．５～５．０ｍｍ、より具体的には２～３ｍｍであればよい。

第２装置２０は例えば双方向ポンプや可逆ポンプ２２a、２２ｂなどの一つかそれ以上の液体移転装置であればよく、流体をバイオリアクター１２に送り出し、あるいはバイオリアクター１２から送り込む他の手段であってもよい。第２装置２０によって排液モード時に排液された流体を充填モード時にバイオリアクター１２に再循環させることができる。あるいは、充填モード時に未使用の流体をバイオリアクター１２に導入することができる。この第２装置２０も排液サイクル、空にするサイクル、または充填サイクルのみを行うことができ、一回限りのサイクル（例えば一回の排液または充填）を行ってもよく、複数サイクルを行ってもよい。

第２装置２０を第１装置１８と一体化すると、タンデム動作または平行動作を実施することができる。あるいは、装置１８、２０は単独装置の一部で構成してもよい。いずれの場合も、制御装置（コンピュータまたはプロセッサなど）を使用して、撹拌および液体のバイオリアクター１２への、あるいはバイオリアクター１２からの前後運動のアルゴリズムまたはプロセスを自動的に、あるいはオペレータ指令の結果として管理する。

本発明システム１０はさらに採取容器３０、廃棄物容器３２、および細胞分離溶液例えば（場合によっては、以下の記載において概略を説明する酵素カクテルを含有する）酵素を含有する細胞分離溶液を収容した供給容器３４を有する。なお、各容器はバイオリアクター１２に流体連絡する。洗浄溶液および不活性化用溶液を供給するために適宜設ける容器３６、３８、４０もバイオリアクター１２に流体連絡していればよい。例えば、供給容器３４は（３７℃に加温することができるＴｒｙｐｓｉｎ／ＰＢＳ／ＥＤＴＡなどの酵素および/または化学細胞分離溶液を供給することができ、容器３６は適宜使用する（ＰＢＳ／ＥＤＴＡなどの）洗浄溶液を供給することができ、容器３８は別な形態の適宜使用する（ＰＢＳなどの）洗浄干渉溶液を供給することができ、また容器４０は適宜使用する（ＳＴＩ血清などの）不活性化用溶液を供給することができる。これら容器（および内部の溶液）のいずれかは、あるいはすべては撹拌することができ、またバイオリアクター１２への再循環を可能にし（細胞を分離するために必要なトリプシンなどの酵素の量をバイオリアクターの公称容量よりも大きくできるからである）、場合によってはリザーバ４４への再循環を可能にする再循環ループ４２の一部を構成することができる。特に、採取容器３０は撹拌することができ、また場合に応じて温度を制御できるため、上流に設けることができる（例えば図４を参照）別なバイオリアクターに植え付けるために使用する前などにおいて採取細胞が沈降することがなくなる。本発明システム１０の場合、予め分離溶液を加熱することができ、および/または細胞分離溶液の温度を（通常は３７℃に）維持することができる。

上記システムを使用して、バイオリアクター１２に作用する撹拌をバイオリアクター１２内部の液体の動きと併用して、細胞採取を強化する。例えば本システム１０の場合、液体のパルス動または前後動を伴う外部ポンプによって分離溶液を循環させた状態で、バイオリアクター容器の振動、パルス動または振盪を行う。あるいは、（撹拌装置などによって）バイオリアクターの内部循環によって、または外部再循環－循環または潅流によって分離溶液の内部運動を惹起できる。例えば、振動は所定の周波数（６０～８０Ｈｚを含む２０～３００Ｈｚ）で行うことができ、また液体のパルス動を複数サイクル（例えば０．１～５Ｌ／分の流量で１～１０サイクル）行うことができる。

このような撹拌を行うと、バイオリアクター１２の気相付近にある液体レベルでのエネルギー転移が最大化する。例えば第２装置２０（ポンプなど）を使用することによって、バイオリアクター１２内の液体レベルを振動/振盪/撹拌作用時（バイオリアクター２の固定床１４の底部付近にある図３のＬを参照）に固定床１４にそって動的に調節する（例えば上下動など、図３の矢印を参照）ことによって、細胞がより効果的に固定床物質から分離する。この結果、バイオリアクター１２の細胞の収量または採取量が簡単な上に比較的安価な方法で改善でき、余計なコストや複雑性も必要ない。

撹拌時バイオリアクター１２の完全性を維持するために、接続装置４６を使用してバイオリアクター１２をシステム１０、特に第１装置１８に取り付けることができる。この接続装置４６は装置１８をバイオリアクター１２に連結する機械的構造を有していればよいが、バイオリアクター１２に機械的エネルギーを伝達するために十分な剛度を有している必要がある。機械的な損傷を防止するために、接続装置４６はバイオリアクター１２に正しく篏合する必要があり、存在するバイオリアクターの脆い部分（例えばｐＨおよびＤＯプローブＰなど）を維持しかつ損傷から保護する必要がある。

図２Ａに図示する実施例では、接続装置４６は環状部分４６aを有し、これの垂下部分４６ｂがバイオリアクター１２の蓋またはカバーに係合する。これら垂下部分４６ｂは（クランプ４６ｃなどによって）支持体４６ｄに解除自在に接続する。撹拌時にバイオリアクター１２の安全を維持した状態で、機械的エネルギーの伝達を可能にするようにこれら支持体４６ｄを直接装置１８に取り付ける。

一例として、本システム１０の動作を以下に示す。
バッチモード（トリプシンなどの）濃縮酵素を使用する（酵素の量はバイオリアクター１２の公称容量に等しい）；
酵素の潅流モード（入口および出口）；および
（酵素を循環させる外部ループなどを使用する）再循環。

図２Ｂのフローダイヤグラムを参照して別な態様を説明する。図２に示すシステム１０の一つの使用例では、接種/細胞増殖フェーズに続いて以下の工程を実施する。
（１）固定床内に細胞を閉じ込め、増殖させたバイオリアクターの増殖フェーズの完了後、ドレーン（ボトムラインなどで示す）を使用したバイオリアクター１２の中身を例えば廃棄物容器（図２の容器３２など）に空ける。
（２）洗浄用緩衝液を添加し、これを混合し、洗浄用緩衝液を空けることによって適宜バイオリアクター１２の洗浄する（この工程は数回、例えば１～５回行うことができ、またバイオリアクターを連続的に充填し、かつ空にすることによって潅流形態でも実施できる）。
（３）分離溶液をバイオリアクターに添加し、その液体レベルを固定床の高さ（または長さ）に設定するか、あるいはこれ以上に設定する。なお、この固定床は潜在的に予備加熱でき、また（例えば潜在的にキレーターを含有する）適正な緩衝液で希釈できる）。
（４）適宜所定の時間（例えば１～６０分）待機し、再循環ループ内の液体の温度を潜在的に８℃から３７℃に維持する。
（５）例えばバイオリアクターから溶液を排液するか、さもなければポンプを使用して溶液を取り除いて（適宜分離溶液をバイオリアクター１２に前後循環させ、固定床１４の充填および空処理（１～１０回の数サイクルで流量は０．１～５Ｌ/分に設定）を行い、適宜（再循環ループなどで）分離溶液を循環させて液体レベルを移動させる。この工程の実施時、固定床１４に対して液体レベルを移動させた状態で、（振動振盪または他の撹拌からなどの）機械的エネルギーをバイオリアクター１２に加える。溶液の排液/空処理の回数は一回でもよく、あるいは細胞の分離をより効果的に行うために充填/空処理回数を増やすことができる。
（６）細胞をバイオリアクター１２から採取する（例えばドレインラインを使用してから処理を行う）。
（７）適宜バイオリアクター１２を洗浄し、洗浄液を採取物と合わせる。
（８）適宜（血清、大豆トリプシン阻害剤などの）酵素阻害剤を採取物に添加する。

上述したように、分離酵素の容量はバイオリアクター１２の公称容量よりも大きければよい。例えば、床面積が３０ｍ^２で、古典的なトリプシン濃度が０．０２３ｍｌ/ｃｍ^２（ＣＳ／ＣＦ１０の推奨濃度１５０ｍｌ/６６００ｃｍ^２）のバイオリアクター１２の場合、バイオリアクター内に添加すべきトリプシンの量は約７Ｌである必要がある。このため、トリプシン処理は再循環モード、潅流モードまたは数回の工程（工程３～６、上記を参照）で実施する必要がある。公称容量がほぼ３Ｌの場合、トリプシン処理は２工程で実施でき、洗浄処理効果が改善する。

本発明のさらに別な態様は本発明の任意の態様に従って固定床式バイオリアクターから採取される細胞に細胞分離溶液を酵素カクテルの形態で使用することに関する。この態様では、細胞採取時に固定床に酵素カクテルを導入し、この酸素カクテルはインテグリンを裂開し、細胞外マトリックスによって高収率で細胞を分離することができる上に、トリプシンなどの酵素の単独使用の場合に発生する凝集問題が生じない。酵素カクテルの例としては（１）セリンプロテアーズ、例えばトリプシン（優先裂開：Ａｒｇ‐|‐Ｘａａ、Ｌｙｓ‐|‐Ｘａａ）；および/または（２）以下のうちの一種：（a）キモトリプシン（優先裂開：Ｌｅｕ－（‐Ｘａａ、Ｔｙｒ‐|‐Ｘａａ、Ｐｈｅ‐|‐Ｘａａ、Ｍｅｔ‐|‐Ｘａａ、Ｔｒｐ‐|‐Ｘａａ、Ｇｌｎ‐|‐Ｘａａ、Ａｓｎ‐|‐Ｘａａ；（ｂ）エラスターゼ（優先裂開：一般にＰ１に嵩張った疎水基をもつ、エラスチン、コラーゲンタイプＩＩＩおよびＩＶ、フィブロネクチンおよびイミュノグロブリンＡを始めとする蛋白質の加水分解）；（ｃ）コラゲナーゼＩ（優先裂開：α－１（Ｉ）鎖の７７５－Ｇｌｙ‐|‐Ｉｌｅ－７７６においてＮ－端子から分子の長さの約４分の３にある３重らせんの裂開、および/または（ｄ）システインプロテアーゼ（パパインなど）である。（以下の活性：トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、コラゲナーゼタイプＩを有する異なる酵素カクテルを含有する）市販例はＡｃｃｕｔａｓｅおよびＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの製品）である。ＤＮａｓｅも裂開/抗凝集剤として使用できる。

このような酵素カクテルを使用すると、塊状物や凝集物の形成がなくなり、また細胞に対する攻撃性が強すぎる単独酵素の溶液（例えば細胞の生存率を引き下げる酵素など）を使用する必要がなくなる。酵素カクテルは単独溶液の形で使用でき、あるいは酵素混合物（酵素量はバイオリアクターの公称容量に等しい）を使用するバッチモード、潅流（入口および出口）モード、または再循環モードなどでバイオリアクターに順次添加できる。

細胞採取時に使用することができるプロトコルは接種/細胞増殖フェーズに続く以下の工程を有する。
（１）廃棄物容器への（ボトムラインなどの）ドレンを使用してバイオリアクター１２を空処理する。
（２）場合に応じて、洗浄緩衝液を添加し、混合を行い、洗浄緩衝液を除去する（この工程は複数回実施してもよく、また潅流モードで実施してもよい）。
（３）酵素カクテル（酵素混合物）を含有する分離溶液をバイオリアクターに添加して、予め加熱することができる固定床の高さ（または長さ）かそれよりも上にその液体レベルを設定する。
（４）温度を２２℃から３７℃に維持した状態で、所定の時間（例えば２～３０分）待機する（この工程はバッチモードおよび再循環モードの両モードで実施できる）。
（５）溶液の液体レベルを移して、固定床を介して固定床の他端部の下かあるいはそれを超えるまで移動させるか、あるいは完全な再循環などによって液体レベルを転移させて、固定床を充填および空処理（１～１０サイクル）し、場合に応じて（再循環ループなどによって）酵素カクテルを循環し、低振幅の１０～２００Ｈｚで振動（振盪/撹拌）をバイオリアクター１２に印加し、固定床１４内部の前後方向のパルス動作によって細胞を分離する。
（６）（ドレン管を使用するなどして）バイオリアクターから細胞を採取する。
（７）バイオリアクター１２を洗浄し、採取物とともに洗浄生成物をプールする。
（８）場合に応じて、（血清、大豆トリプシン抑制剤、キレート剤、希釈剤などを使用して）採取物に酵素抑制剤を添加する。

本発明のさらに別な態様では、機械的エネルギー印加（振動式など）装置を併用した状態で、好適には上記の液体レベル転移工程前および工程時に酵素または酵素のカクテルを使用して固定床バイオリアクターから細胞を回収する。回収後または採取後に、試薬または（マイクロフルイダイザーやホモジナイザーなど）機械的作用を使用してバイオリアクターの外部で細胞の溶菌処理を行って、細胞間ウィルスまたは細胞関連ウィルスを放出する。この態様では、酵素または酵素のカクテルを振動装置と併用して細胞を固定床から回収し、第２反応装置において電気窄孔法よって移入も行う。

本発明のこれら態様いずれも、あるいはすべても単独で実施可能であり、あるいは他の形態の固定床と併用することも可能である。例えば、図３Ａおよび図３Ｂを参照して説明すると、固定床１４は図示のように螺旋状に巻いた一つかそれ以上の固定化層１２２ａを有する（付着またはその他の細胞などの）細胞用構造化固定床１２２で構成することができる。これらの一つかそれ以上の固定化層１２２ａが線形あるいは規則的な流入液（矢印Ａ）からの曲がりくねった流入チャネル（矢印Ｂ）を構成するが、余計なスペーサ層を必要としない。なお、これらスペーサ層は望ましい場合には使用可能である。このためには、図３Ｃに示すように、繊維織物かフィラメント織物からなり、流れを乱す層１２３、１２５を設ければよい。

図３Ｄに示すように、このためには、細胞固定化層１２２ａとして不織布素材を使用すればよい。液体が通過し、再び戻ることができる開口１２７を備えた網目状構造体（例えば３Ｄプリント法）として固定化層１２２ａを形成すればよく、均質性が強化し、かつ液体に気泡がある場合にはこれら気泡を剪断または分割する曲がりくねったチャネルが形成する。この機能はスペーサ層を追加しても、あるいは追加しなくても実現可能である。

構造化固定床１２２の配向については、流れが垂直流れのバイオリアクターの１２の場合（図３の実施例では下から上に）、図示以外の配向でもよい。例えば図３Ｅに示すように、水平バイオリアクター１００の場合、一つかそれ以上の水平素材層からなる構造化固定床１２２を有する第１室１２０を備えていればよい。これら一つかそれ以上の固定化層は図３Ｃおよび図３Ｄに示すように、織物素材か網目状素材で構成することができるが、図３Ｅに示すように、隣接スペーサ層１２２ｂ（なお、図示を明瞭するために垂直方向の間隔は誇張して示す）によって挟んだ一つかそれ以上の細胞固定化層１２２ａ（３つの層を示すが、任意の層数を使用できる）で構成することができる。従って、液体は側部から側部へ（左から右へ、あるいは右から左へ）流れ、（複数の）素材層（スペーサ層やその他の層）が線形や規則的な流入液（矢印Ａ）から網目状流れ（矢印Ｂ）を形成し、液体に何らかの気泡が存在する場合にはこれらを分割するチャネルを形成する。ポンプ作用は第１室１２０の流入端部に設ける撹拌装置かその他のポンプによって得ることができ、経路Ｒによって概略を示す戻り経路は流出端部に設けることができる。望む場合には、スペーサ層も細胞固定化層１２２ａの間に付設することができる。

図３Ｆを参照して説明する別な実施態様では、構造化固定床１２２は細胞が付着する層を有する、複数の相互接続ユニットまたはオブジェクト１２４ａから形成したスキャホルド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）や格子状の形態を取る三次元（３Ｄ）モノリスマトリックス１２４で構成する。マトリックス１２４は使用時に流体および細胞が流れる曲がりくねった経路を備えていればよい。一部の実施態様では、マトリックス１２４は３Ｄ配列、格子、スキャホルディング、またはスポンジの形で使用することができる。このマトリックスは使い捨て形式が好ましく、バイオプロセシング基準に従うクリーニング処置に係るコストおよび複雑さを回避することができる。

本発明のさらに別な態様では、図４を参照して説明すると、システム１００は（シードトレインなどの）前培養容器１１２としてのバイオリアクターを有し、この前培養容器は産生バイオリアクター１２８などの別な容器に接種するために使用する細胞を産生する。前培養容器１１２は図３Ａに示すように、一つかそれ以上の螺旋状層を有する構造化固定床１２２で構成することができる。あるいは、図３Ｅに示すように（流れの方向は垂直方向ではなく水平方向にある）、水平に積層した形態で設計することも可能であり、本明細書に開示する他の形態を始めとする他の公知形態で設計してもよい。

図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃに示すように、前培養容器１１２（または本明細書に開示するその他のバイオリアクター）としてのバイオリアクターについては、ドッキングステーションに１５０に対応させることができる。このドッキングステーション１５０は容器１１２を載置することができる一体型振動台１５２を備えることができる。細胞培養システムの一部を構成する液体搬送を行う一体型ポンプ１５４および搬送ライン１５６は望む場合には付加的なバイオリアクター（複数の場合もある）を使用して下流側および上流側処理（プロセシング）を行い、また場合に応じて前培養容器への細胞分離溶液の搬送を行う。

図５を参照して本発明のさらに別な態様を説明すると、システム２００は固定床２２２および撹拌装置を有するバイオリアクター２１２を備えていればよい。撹拌装置としては培養容器２１２を載置する台２４０などの外部振動装置あるいはバイオリアクター２１２内部に載置する内部振動装置２５０のいずれか、あるいは両者を有するものを使用して、振動を固定床２２２に伝達することができる。一般に固定床２２２は疎水性素材で形成するため、細胞採取時に液体を保持する傾向がある。細胞採取時バイオリアクター２１２の排液前、排液中または排液後に振動を印加すると、固定床２２２内部に液体がある場合には、これが放出され、捕捉された液体内に細胞が残存している場合にはこれも回収できるので、回収率がさらに向上する。

図６および図７を参照して説明する本発明のさらに別な態様はバイオリアクター３１０、特にバイオリアクターの固定床３２２を傾動（ｔｉｌｔｉｎｇ ｏｒ ｓｌａｎｔｉｎｇ）させて、採取時の液体回収を強化する技術思想に関する。固定床３２２を傾動させると、重力が垂直方向に働き、抗力（Ｆ_Ｄｒａｇ）の大きさが小さくなる。液量に加わる重力の大きさが同じであるが、残留Ｆ_Ｄｒａｇが小さくなり、重力の大きさは抗力Ｆ_Ｄｒａｇより大きくなる。所定量の液体が（不織織物などの）細胞固定化層３２２aから流出し、スペーサ層３２２ｂ（例えばメッシュ－矢印Ｅを参照）に流入する。メッシュスペーサ層３２２ｂ内では、加わる抗力が最小化（最終的にはゼロになる）し、スペーサ層全体にそって所定量の液体が流れる。図７に示すように、水平面Ｈに対する傾動角度αは例えば３０～４５度であればよい。傾動については、固定床３２２を有するバイオリアクター３１２全体を傾動させればよく、あるいは固定床３２２のみを傾動させる場合には、バイオリアクター３１２内部で行えばよい。

細胞採取を改善する本発明のさらに別な態様では、固定床を圧縮するか、あるいは圧密（ｃｏｍｐａｃｔｉｎｇ）する。図８を参照して説明すると、バイオリアクターの固定床４２２を内部圧密装置に対応させて、固定床を圧密すればよい。一つの実施例では、圧密装置はラジアル方向において相対的に動作できる交互に篏合した部材（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｅｒｓ）４５２、４５４を備えた円筒壁４５０で構成することができる。図示例では、円筒壁４５０は固定床４２２の内部にあるが、外部にあってもよい。

圧密装置はさらに固定床に対して動作を行って、圧密力をこれに加える作動装置を有する。この作動装置は駆動装置４６２（モータまたはハンドクランクを有することができる）に接続して、部材４５２、４５４に係合して、ラジアル方向運動を発生するリンク装置４６０を備えていればよい。固定床４２２の位置を固定すると、固定床４２２に圧縮作用または圧密作用が加わって、（振動の結果としてまたは分離溶液の導入の結果として、あるいは両方の結果として）分離細胞を含有する保持液体がある場合にはこれが強制的に放出される。この絞り出しを必要に応じて繰り返すと、液体の放出を最大化することができる。

図９は固定床５２２を圧縮する構成の別な態様を示す図である。この構成では、直線運動作動装置を備えることができる伸縮部材５５６に接続した対向部材５５２、５５４を備えていればよい。この伸縮部材５５６はバイオリアクター５１２の内壁５５８を通過することができる。作動すると、対向部材５５２、５５４が固定床５２２を外向きに押し出し、バイオリアクター５１２の外壁５６２の結果としてこれを絞り出す。

図１０にさらに別な態様を示す。この態様では、例えば（直線状でもよく、あるいは湾曲してもよい）回転可能な部材６５６などの内部作動装置に接続した固定床６２２内に対向部材６５２、６５４を設けることができる。部材６５６を作動し、これが回転すると、部材６５２、６５４に力が作用し２つの部材が離れ、この結果固定床６２２を圧縮し、内部の液体が放出する。

本発明のさらに別な態様では、バイオリアクター７００は容器７１２を有し、流体培地に接続する細胞を培養または増殖する固定床７１４を備えていればよい。液体レベルを変更するために、固定床７１４は容器７１２に対して移動することができる。図１１および図１２に例示するように、容器７１２は第１位置において所定容量の流体および固定床７１４を受け取る主体部分７１２ａおよび第２位置において所定容量の流体の一部（液体培地Ｍ）および固定床を受け取る補助部分７１２ｂで構成することができる（なおここでの用語“主体”および“補助”は容器のそれぞれの部分の形状や大きさに関係せず、また図示の実施態様では補助部分は小さく円筒形であるが、主体部分は大きく立体形である）。

容器７１２の補助部分７１２ｂは固定床７１４を受け取り、かつ容器７１２の主体部分７１２ａに移動する構成であればよい。従って、図１３に示すように、固定床７１４を有する補助部分７１２ｂを容器７１２の主体部分７１２ａに下げることができるため、固定床７１４（高さＨ２）を介して流体が流れ、固定床７１４の上にある補助部分７１２ｂの（高さＨ１が形成する）一部に流入する（従って容器７１２の全容積を変更できる）。次に、動作を逆にすると、流体が固定床７１４に逆流し、容器７１２の主体部分７１２ａに流入する。上下動については線状作動装置などの作動装置７１６を使用して実施することができる。

このように構成すると、固定床７１４は動作時ずっと浸水したままであり、発生した流れの作用によって流体（培地）が固定床７１４を前後に通るため、細胞生存性および増殖を改善することができる。（垂直方向などの）相対運動の速度は固定床７１４に目的の流れが発生するように制御することができる。なお、この流れは部分的には構成の多孔度または密度に依存する。流量のバラツキについても、バイオプロセスの性質（例えば細胞採取時の均質な細胞循環を保証する高い流量や剪断に弱い細胞を保護する低い流量）に応じて制御することができる。いずれの場合も、循環を使用することなく、例えば内部撹拌装置によって目的の流れを発生し、容器全体に流体を行き渡すことができ、容器７１２に対する固定床７１４の作動は必要ない。

図１４は容器７１２の補助部分７１２ｂの位置を主体部分７１２ａに対して固定したままに置く構成を示す概略図である。この構成では、固定床７１４は補助部分７１２ｂ内の位置間で移動する（なお、第１位置即ち下がった位置７１４´は図１４の左側にあり、そして第２位置即ち上がった位置７１４´´は右側にあり、同じまたは異なる補助部分（複数の場合もある）７１２ｂを表す）。固定床７１４の昇降を行う作動装置とともに蓋またはカバー７１８を設けることもでき、作動装置は容器７１２の内部にあってもよく、外部にあってもよい。

いずれの場合も、第１位置から固定床７１４を補助部分７１２ｂ内で持ち上げることができるため、その経路内の流体が補助部分に流れることになる。なお、流量が比較的小さいため、図１５の右手側に示すように、流体の一部が補助部分７１２ｂ内の前に空処理したスペース内に流入する。容器７１２の部分７１２ａおよび７１２ｂが接続する結果、流体が最終的に平衡に達し、この過程で固定床７１２を流体が通過する。次に、矢印Ａで示すように固定床７１４の動作を逆にし、補助部分７１２ｂ内を移動できるようにすると、固定床の前にある流体がこの動作時に補助部分を通過する。この動作を繰り返し、速度を調節すると、目的量の流体（液体培地Ｍ）が流れ、細胞培養を促進し、かつ細胞生存性を強化できる。

上記補助部分７１２ｂは、可動式であっても、あるいは非可動式であっても固定床を受け取ることができる円筒形で中空の、全体として剛性を示す素材で形成することができる。図１５および図１６を参照して説明すると、容器の補助部分７１２ｂは折り畳み可能か、あるいは可撓性を示す素材で形成することができる。このように、図１６に示すように、補助部分７１２ｂは伸縮性であり、複数の（一緒にはまり込むスライディングチューブなどの）伸縮部を有するため、固定床７１４を折り畳み、容器の主体部分７１２ａの流体内で動かすることができ（位置７１２ｂｖｓ７１２ｂ´に留意）、またこの動きによって主体部分から引き込まれた流体を収めることも可能になる。図１６に（蛇腹やアコーディオンなどのように）可撓性の補助部分７１２ｂが、固定床７１４が補助部分７１２ｂとともに動いている間に折りたたまれる状態を示す。

図１７にバイオリアクター８０２のドッキングステーション８００を示す。このドッキングステーション８００は実施中のバイオプロセシング操作に対応する各種のパラメータを表示するディスプレー８０６を有するとともに、入力を行ってバイオプロセシング操作の各種態様を制御する制御装置８０４を備えることができる。例えば、ドッキングステーション８００は導管によって接続したポンプ８１０に対応する各種の補助容器８０８を備えることができる。この制御装置８０４によってこれらポンプを制御し、バイオリアクター８０２への流体やこれからの流体の流れを制御するだけでなく、内部の撹拌装置（図示省略）を制御するなどしてバイオリアクター内の流体の混合を制御することができる。なお、撹拌装置の駆動装置はドッキングステーション８００の一部を構成することができる。

図１８に示すように、ドッキングステーション８００は採取モジュール８０１に対応していればよく、このモジュールは図示のように振動台８１２の形を取る外部撹拌装置を有する。図示のように、バイオリアクター８０２はドッキングステーション８００から振動台８１２まで移動でき、本明細書の教示に従って細胞採取を補助することができる。振動台８１２は独立制御してもよく、あるいは制御装置８０４によって制御してもよく、ドッキングステーション８００に一体的に形成することができる。

図１９を参照して説明すると、ドッキングステーション８００に対応する制御装置８０４を使用して、細胞の採取操作を制御することができる。例えば、一旦目的の細胞密度に達した後は、細胞採取マニホルド８１３はバイオリアクターに接続しても良い。バイオリアクター８０２を空処理し、容器８１４からの緩衝液で洗浄してから、酵素カクテルを対応する容器８１６などから導入すればよい。バイオリアクター８０２への、またこれへの流体のポンプ供給については、同様に制御装置８０４によって制御することができるドッキングステーション８００に対応するポンプ８１０を使用して実施すればよい。

次に、バイオリアクター８０２を撹拌装置または振動台８１２に移せばよい。振動は採取物を好適な容器８１８に移した時点で終了すればよい。複数回の洗浄については、制御装置８０４を使用することによってドッキングステーション８００に対応し、かつマニホルド８１３に接続するポンプ８１０を使用してバイオリアクター８０２への流体を送り込み、あるいはこれからの流体の送り出しを制御するなどして終了すればよい。このようにして、（本明細書に開示するプロセスなどの）細胞増殖/採取プロセス全体を制御装置８０４によって制御することができる。

実験を行って、本発明に係る細胞採取技術における細胞生存性を評価した。すべての実験において凍結保存細胞バンク（１８Ｈ００３、ＥＣＡＣＣ）から入手した付着ＨＥＫ２９３細胞を使用した。５％牛胎児血清を追加補給したＤＭＥＭ（４．５ｇ/Ｌグルコース）中でプラスチックフラットウェア/バイオリアクター培養を行った。すべての条件において濃度２０，０００～２５，０００細胞/ｃｍ^２で接種を行った。バイオリアクター中で細胞培養を行う前に、必要な接種源を得るためにＴ－フラスコ/複数のプラスチック容器内で細胞を前培養した。３～４日毎に継代培養を行った（中間指数関数増殖フェーズ）。

スケール－Ｘハイドロ（２．４ｍ^２）、カーボ１０ｍ^２および３０ｍ^２バイオリアクターに細胞を接種し、再循環ループ（０．１７ｍＬ／ｃｍ^２）を使用する培地培養を開始する前にバッチモードで細胞を４時間維持した。バイオリアクター培養条件を表１に詳しく記載する。

培地および固定床のサンプルを（サンプリングキャリヤによって）毎日取り込み、それぞれサンプリングキャリヤのグルコースプロファイル/ラクトースプロファイルおよび直接細胞係数によって細胞増殖を評価した。

膨張４日～６日後にバイオリアクターからの採取を実施した。採取に先立って、バイオリアクターを空処理し、予め３７℃に加熱した、５ｍＭのＥＤＴＡ含有ＤＰＢＳ溶液（ＤＰＢＳ－ＥＤＴＡ）で洗浄した。次に、予め３７℃に加熱した分離溶液をバイオリアクターに添加し、撹拌しつつ（０．５ｃｍ/秒）かつ温度制御（３７℃）しつつ２０分～２５分接種を行った。次に、バイオリアクターを採取モジュールに移し、振動を行うと同時に容器排液を行った。振動周波数および振動時間については各種の組み合わせを利用した。詳細を図２２に示す。

場合に応じて、初回採取後に酵素溶液を使用して複数回洗浄を行った。ただしいずれの場合も採取にＤＰＢＳ－ＥＤＴＡでバイオリアクターを洗浄した。場合に応じて、一部の洗浄工程時に、あるいは全洗浄工程時に振動を加えた。固定床キャリヤおよび上澄み液のサンプルを採取プロセスの各工程時に取り込み、採取効率および細胞生存性を求めた。本実施例では２種類の酵素溶液を試験した。即ち、ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭＳｅｌｅｃｔ、１Ｘまたは５Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）のいずれか、およびＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ＸまたはＤＰＢＳ－ＥＤＴＡ１：３希釈のいずれかを使用した。

細胞採取プロトコルの概要を図２０に示す。端的に説明すると、（１）再循環構成における対応する容器８０３からの培地を使用し、バイオリアクター８０２内で４日～６日間細胞を膨張させた。採取日に、（２）容器８１４からの緩衝液を使用してバイオリアクター８０２を洗浄してから、対応する廃棄物容器８１５に容器８１６からの酵素溶液を充填し、２０分～２５分間接種を行った（３）。次に、バイオリアクター８０２を排液して内容物を採取容器８１８に移すと同時に、振動を行った（４）。最後に、緩衝液８１４を使用して洗浄を行い、細胞回収を容易にした（５）。図示から理解できるように、工程１～３はバイオリアクター８０２を制御装置８００に設置した状態で実施した。工程４および５はバイオリアクター８０２を採取モジュール８０１に設置した状態で行った。

血球計算器を使用するトリパンブルー染料排除方法によって採取細胞における細胞密度および細胞生存性を測定した。細胞溶菌（スケールＸ細胞計数キット、Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってサンプリングキャリヤによるバイオマス評価を行った後、クリスタルバイオレット染色、および血球計算器による細胞核計数を行った。固定床繊維による細胞核計数を使用して、バイオリアクター内部の全細胞数を評価した。細胞採取後、バイオリアクターを解体し、固定床の一部を代表的な位置から取り込み、固定床に残留する細胞密度を評価した。

スケール－Ｘハイドロ（ｎ＝５）、カーボ１０（ｎ＝１）およびカーボ３０（ｎ＝１）バイオリアクターから採取した細胞をＴ－フラスコに接種し、第１経路による平板効率、細胞形態および細胞回収を評価した。プラスチックフラットウェアから採取した細胞を対照として集団倍加時間（ＰＤＴ）および細胞形態を評価した。ある一つの場合には、スケール－Ｘハイドロバイオリアクターから採取した細胞を使用して、第２ハイドロを接種し、“固定床対固定床”シードトレインの概念実証を行った。ハイドロ採取細胞を使用する接種条件は前記と同じであった。

第１フェーズにおいて、分離溶液としてＴｒｙｐＬＥ １Ｘおよび５Ｘを使用して試験を行った。なお、これら試験条件では、細胞が大きな凝集物部分とともに放出され、細胞の全体回収に影響を及ぼす傾向が認められた（データ省略）。対照的に、Ａｃｃｕｍａｘを使用すると、試験条件下単独の細胞懸濁液が発生することが認められた。従って、本明細書に記載するすべての実験は１Ｘか、あるいは１：３溶液に希釈したＡｃｃｕｍａｘを使用して行った。

上記のスケール－Ｘハイドロの標準バージョンを使用して細胞採取実験を５回行った。すべての実験では、本明細書の材料および方法の項で説明したように、Ａｃｃｕｍａｘ接種を行った後に、採取工程を実施し、次に洗浄工程を数回実施した。異なる採取方法を評価した結果、いずれも５０～７０Ｈｚの変動幅で、１回の採取サイクルの後にＡｃｃｕｍａｘを使用した２回洗浄サイクルを行うことが最も効率の高い細胞回収であることが判明した（図２２）。ＤＰＢＳ－ＥＤＴＡを用いる洗浄工程を数回追加すると、適度な細胞の追加放出が可能になった。洗浄時に振動を加えると、細胞回収量がさらに増えた。

すべての実験において、採取の前後のサンプリングキャリヤを分析した結果、細胞の９０％以上が固定床素材から分離したことが判明した（図２１および図２２）。細胞懸濁液単体の形でスケール－Ｘハイドロバイオリアクターから合計で２．７～５．１×１０^９の細胞を採取できた。いずれも５０～７０Ｈｚの変動幅で、Ａｃｃｕｍａｘを使用した後にＡｃｃｕｍａｘを使用した２回の洗浄サイクルを行った場合には、個別の細胞採取率が最高になった。中間指数関数増殖フェーズ（２００～３００×１０^３細胞/ｃｍ^２）および合流（４００～５００×１０^３細胞/ｃｍ^２）に近い状態の両者でバイオリアクターから細胞を採取でき、これは採取時に細胞数を最適化することは最も高い採取収率を実現するために重要であることを示す。特に、プラスチックフラットウェアでの細胞採取は一般に２００×１０^３細胞/ｃｍ^２の細胞密度で行われているため、より高い密度の細胞採取を可能にする固定床バイオリアクターの作用効果が際立つ所以である。

ハイドロスケールでの概念実証および最適化に続いて、カルボ１０（ｎ＝１）および３０バイオリアクター（ｎ＝１）への拡張可能性を検討するために細胞採取の追加実験を行った。いずれの採取でも、固定床素材からの細胞分離率は＞９８％であった。個別細胞懸濁液の形でスケール－Ｘカーボ３０から５１×１０^９もの細胞を回収した。これは８，５００細胞/ｃｍ^２でのスケール－Ｘニトロ６００の接種には十分な細胞数であった。ハイドロ実験に示すように、４５０×１０^３細胞/ｃｍ^２までの細胞密度を効率よく採取でき、これは１０，０００細胞/ｃｍ^２でニトロ６００を接種できる能力に相当する。特に、２回のカーボ実験では、手動で上下反転を行い、バイオリアクター排液を促進し、スケール－Ｘハイドロデータと比較対照した。この反転を行わないフル採取では、本実験で示したよりも２回余計な洗浄工程（合計では５回の洗浄）が必要になると考えられる。

本研究（ハイドロ、カーボ１０および３０）のために行った全実験では、採取した細胞はすぐれた生存性を示した（８４～９６％、図２１および図２２）。希釈Ａｃｃｕｍａｘを使用した実験ランでは、回収懸濁液に凝集物は認められなかった。

すべてのスケールで回収した細胞を使用して再播種実験を行った。結果は（Ｔ－フラスコから再播種した対照細胞での２９～３９時間に匹敵する、図２３）２９～３７時間のＰＤＴ使用Ｔ－フラスコでのすぐれた再播種であることを示す。あるケースでは、スケール－Ｘハイドロから採取した細胞を使用して、第２ハイドロを接種した。この場合、適正な増殖が認められた（図２４）。次に、第２ハイドロから細胞を採取できた。これは固定床対固定床接種トレインの概念を実証するものである。

以上の結果はスケール－Ｘカーボ３０ｍ^２からの採取物は１０，０００ＨＥＫ２９３細胞/ｃｍ^２でのスケール－Ｘニトロ６００ｍ^２の接種に十分であることを実証している。重要なことは、スケール－Ｘカーボ３０は１２の４０層プラスチックフラットウェア容器に相当するものであることである。この容器の場合、一般に大型のインキュベーター、自動式マニピュレータやシェーカーなどの専用装置を使用して運転を行う。プラスチックフラットウェアを使用するシードトレインとスケール－Ｘカーボを比較する単純な評価でも後者の場合、設置面積は劇的に小さくなる（９５％）。

本研究の試験条件では、Ａｃｃｕｍａｘでは適正な細胞回収率を得るためには洗浄を複数回行う必要がある。洗浄を複数回行う必要があるにも拘わらず、酵素の全使用量は従来のプラスチックフラットウェアプロセスよりも少量で済む（スケール－Ｘカーボ３０ｍ^２の場合９．０Ｌで済むが、１２×ＣＦ４０の場合は９．６Ｌである）。さらに、最適化を行なった表面当りの酵素量も小さく抑えることができる。

採取容量を考慮すると、スケール－Ｘ３０ｃｍ２の場合接種細胞密度を高くでき、接種容量を小さく抑えることができる。即ち１５Ｌ（３Ｌを三回採取し、３Ｌを二回洗浄）に対して従来のフラットウェア１２ＣＦ－４０では２８．８Ｌである（以下の推奨容量：２０ｍｌ酵素＋２５ｍｌの培地および層当りの洗浄量１５ｍｌに留意）。

スケール－Ｘバイオリアクターの場合、閉鎖システム内で一人のオペレータによって２時間以内で採取を実施できるが、複数のＣＦ－４０から細胞を採取する場合、ＬＡＦに従って２人以上のオペレータを必要とし、無菌接続を必要する。

以上の初期評価はスケール－Ｘカーボを使用するシードトレイン発生のコストが大幅に低下することを明示するが、コストモデル化をより完全にすると、仕事量、全操作面積、無菌リスク、培地利用などによるより大きな差異化を図ることができる。

以下に、本発明に関する各項目、あるいは任意の構成で併用する項目を記載する。

［項目１］
細胞の閉じ込めまたは細胞付着および細胞増殖を可能にする固定床構造体を有するバイオリアクターを設け、
培地を介して前記バイオリアクターに細胞を添加し、
これら細胞を前記固定床構造体に閉じ込めおよび/または付着させて、前記バイオリアクター内で増殖させ、
酵素カクテルを含有する細胞分離液を前記バイオリアクターに導入し、
前記バイオリアクターの一部を撹拌し、そして
前記固定床構造体に対して前記細胞分離溶液の液体レベルを移動させて、
細胞の実質的部分に塊状物や凝集物を発生することなくこの細胞の実質的部分を前記固定床構造体から分離する
ことを特徴とする細胞採取方法。

［項目２］
前記撹拌工程および移動工程を同時に行う項目１に記載の方法。

［項目３］
前記移動工程において、前記細胞分離溶液を前記バイオリアクターから少なくとも部分的に排液する項目１または項目２に記載の方法。

［項目４］
前記移動工程において、前記液体レベルを前記固定床構造体の上部の上またはこの上部に近接する部分から前記固定床構造体の底部の下またはこの底部に近接する部分に移動させる項目１～３のいずれか一項に記載の方法。

［項目５］
前記移動工程において、流体を前記バイオリアクターに添加する項目１～４のいずれか一項に記載の方法。

［項目６］
前記添加工程において、細胞分離溶液を前記バイオリアクターに追加添加する項目１～５のいずれか一項に記載の方法。

［項目７］
前記移動工程に先立って、前記液体レベルを前記固定床構造体の上に設定する項目１～６のいずれか一項に記載の方法。

［項目８］
前記移動工程において、前記液体レベルを複数回上下させる項目１～７のいずれか一項に記載の方法。

［項目９］
前記撹拌工程において、２０～３００ヘルツの周波数および０．５～５ｍｍの振幅で前記固定床構造体を直接的または間接的に振動させる項目１～８のいずれか一項に記載の方法。

［項目１０］
前記導入工程において、インテグリンを裂開する酵素および細胞外マトリックスを裂開する異なる酵素を酵素カクテルとして導入する項目１～９のいずれか一項に記載の方法。

［項目１１］
細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体を備えたバイオリアクター、
前記バイオリアクターを撹拌しかつ前記構造体に対して液体レベルを移動させる細胞採取機構、および
前記バイオリアクターに流体連絡する細胞分離溶液を含有する容器、を有し、この細胞分離溶液は、塊状物や凝集物を発生することなく、細胞閉じ込め/細胞付着を行う前記構造体から細胞を分離する酵素カクテルを有する
ことを特徴とする細胞採取システム。

［項目１２］
前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体が３Ｄプリント固定床などの固定床を有する項目１１に記載のシステム。

［項目１３］
前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体が積層形状または螺旋形状の複数の細胞固定層を有する固定床を有し、これら細胞固定層が隣接層間のスペースに直接的に、あるいは間接的に接触する項目１１又は１２に記載のシステム。

［項目１４］
前記細胞採取機構が前記バイオリアクターを振動または振盪させる装置を有する項目１１～１３のいずれか一項に記載のシステム。

［項目１５］
前記細胞採取機構が前記液体レベルを移動させるポンプを有する項目１１～１４のいずれか一項に記載のシステム。

［項目１６］
前記細胞採取機構が前記バイオリアクター、特に前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体に振動エネルギーを印加する装置を有する項目１１～１５のいずれか一項に記載のシステム。

［項目１７］
前記細胞採取機構が前記バイオリアクターのドッキングステーションの一部を形成する項目１１～１６のいずれか一項に記載のシステム。

［項目１８］
前記バイオリアクターが別なバイオリアクターに導入する細胞を採取する採取容器を有する項目１１～１７のいずれか一項に記載のシステム。

［項目１９］
前記バイオリアクターが水平面に対して傾動して、前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体からの排液を促進する項目１１～１８のいずれか一項に記載のシステム。

［項目２０］
さらに前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体を内部的にあるいは外部的に圧縮するコンパクターを有する項目１１～１９のいずれか一項に記載のシステム。

［項目２１］
前記酵素カクテルがインテグリンを裂開する酵素および細胞外マトリックスを裂開する異なる酵素を含有する項目１１～２０のいずれか一項に記載のシステム。

［項目２２］
前記細胞採取装置が前記バイオリアクターに対して前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体を移動させて、前記液体レベルを移動させる作動装置を有する項目１１～２１のいずれか一項に記載のシステム。

［項目２３］
さらに前記細胞採取機構を制御して、前記バイオリアクターを撹拌し、前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体に対して液体レベルを移動させる制御装置を有する項目１１～２２のいずれか一項に記載のシステム。

［項目２４］
前記制御装置によって前記酵素カクテルの前記バイオリアクターへの搬送を制御する構成の項目１１～２３のいずれか一項に記載のシステム。

［項目２５］
細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体を有するバイオリアクター、
このバイオリアクターを撹拌する構成の撹拌装置、
前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体に対して液体レベルを移動させる作動装置、および
前記バイオリアクターに流体連絡する細胞分離溶液を含有する容器を有し、この細胞分離溶液が塊状物や凝集物を発生することなく細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体から細胞を分離する酵素カクテルを含有する
ことを特徴とする細胞採取システム。

［項目２６］
前記撹拌装置が振動装置を有する項目２５に記載のシステム。

［項目２７］
前記作動装置が線形作動装置を有する項目２５～２７のいずれか一項に記載のシステム。

［項目２８］
前記作動装置がポンプを有する項目２５～２７のいずれか一項に記載のシステム。

［項目２９］
さらに前記作動装置を制御する制御装置を有する項目２５～２８のいずれか一項に記載のシステム。

［項目３０］
細胞閉じ込め/細胞接着および細胞増殖を行う構造体を有するバイオリアクター、
このバイオリアクターを液体で充填処理およびフラッシュ処理を行っている状態で、前記バイオリアクターを撹拌する構成の細胞採取機構、および
前記バイオリアクターに流体連絡する細胞分離溶液を含有する容器を有する
ことを特徴とする細胞採取システム。

［項目３１］
前記細胞分離溶液が塊状物や凝集物を発生せずに細胞を分離する酵素カクテルを含有する項目３０に記載のシステム。

［項目３２］
前記細胞採取機構が前記バイオリアクターを撹拌または振盪する装置を有する項目３０または３１に記載のシステム。

［項目３３］
前記細胞採取機構が前記バイオリアクターの部分的な、または完全な充填処理、空処理およびフラッシュ処理を行う装置を有する項目３０～３２のいずれか一項に記載のシステム。

［項目３４］
前記の充填処理、空処理およびフラッシュ処理を行う装置が一つかそれ以上のポンプを有する項目３３に記載のシステム。

［項目３５］
前記細胞採取機構が前記バイオリアクターに、特に前記の細胞閉じ込め/細胞接着および細胞増殖を行う構造体に振動エネルギーを印加する装置を有する項目３０～３４のいずれか一項に記載のシステム。

［項目３６］
前記細胞採取機構が前記バイオリアクターのドッキングステーションの一部を形成する項目３０～３５のいずれか一項に記載のシステム。

［項目３７］
塊状物や凝集物を発生することなく細胞の分離を行う酵素カクテルを固定床バイオリアクターに添加し、そして
このバイオリアクターが振動する状態で前記固定床バイオリアクター内の液体レベルの位置を調節する
ことを特徴とする固定床バイオリアクターから細胞を分離する方法。

［項目３８］
前記調節工程において、液体を使用して前記バイオリアクターを充填処理およびフラッシュ処理する項目３７に記載の方法。

［項目３９］
前記調節工程において、液体を使用して前記バイオリアクターを繰り返し充填処理およびフラッシュ処理する項目３６又は３７に記載の方法。

［項目４０］
さらに前記バイオリアクターから別なバイオリアクターに分離細胞を搬送する工程を有する項目３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

［項目４１］
さらに前記バイオリアクターを傾動させる工程を有する項目３７～４０のいずれか一項に記載の方法。

[項目４２]
さらに前記バイオリアクター内で固定床を圧縮する工程を有する項目３７～４１のいずれか一項に記載の方法。

[項目４３]
前記調節工程において、前記固定床を前記バイオリアクターに対して移動させる項目３７～４２のいずれか一項に記載の方法。

[項目４４]
バイオリアクターを振動させ、そして
このバイオリアクターを傾動させ、かつ排液する
ことを特徴とするバイオリアクター内で細胞を分離する方法。

[項目４５]
前記振動する工程、前記傾動する工程、および前記排液する工程を同時に行う項目４４に記載の方法。

[項目４６]
付着細胞増殖を行う固定床を有するバイオリアクター、および
この固定床を圧縮する圧縮装置を有する
ことを特徴とする細胞採取システム。

［項目４７］
さらに前記バイオリアクターまたは前記固定床を振動させる振動装置を有する項目４６に記載のシステム。

［項目４８］
前記圧縮装置を前記固定床内か前記固定床外に設ける項目４６または４７に記載のシステム。

［項目４９］
付着細胞増殖を行う構造体を有する前培養容器、
バイオリアクターを振動させて、細胞をこの構造体から分離する振動装置、および
前記前培養容器の下流側にあり、分離細胞を受け取るバイオリアクターを有する
ことを特徴とする細胞採取システム。

［項目５０］
液体を前記前培養容器に送り込むか、あるいはこの前培養容器から送り出して前記構造体に対して液体レベルを移動させるポンプをさらに有する項目４９に記載のシステム。

［項目５１］
さらに前記ポンプを制御する制御装置を有する項目５０に記載のシステム。

[項目５２]
前記制御装置が前記振動装置を制御する項目５１に記載のシステム。

本明細書に使用する各用語を定義する。
単数表現や限定表現は特に逆のことを明示しない限り、単数または複数を意味する。例えば、“ある一つの区分”は一つの区分か、あるいは１つ以上の区分を指す。

本明細書で使用するパラメータ、量、時間的期間などの測定可能な値の前にある“約”、“実質的に”、“全体として”または“およそ”は±２０％またはそれ以下、好適には±１０％またはそれ以下、より好適には±５％またはそれ以下、いっそう好適には±１％またはそれ以下、よりいっそう好適には±０．１％またはそれ以下を意味する。ただし、このような変動幅が本発明の実施に適性をもつ限りである。なお、“約”で修飾された値はそれ自体が具体的に本明細書に開示した値である。

本明細書で使用する“有する”あるいは“備える”などは“もつ”、“含む”や“含有”するなどの述語と同義であり、以降に続くものの存在を具体的に示す包括的な、あるいは制約のない述語である。例えば“成分は含有する”という表現は付加的な上に記載していない、いずれも公知な成分、特徴的な機能、要素、部材の存在を排除するものではない。

好適な実施態様を示し、説明してきたが、これら実施態様はいずれも例示のみを目的とする。当業者ならば、本発明から逸脱することなく多くの変更や置換を実施できるはずである。また、本発明を実施するさいに本明細書に記載した本発明の実施態様に各種の選択肢を採用できるはずである。本明細書冒頭の特許請求の範囲は適用可能な法律に従う保護の範囲を定義し、これによって請求項およびこれに準じる項目の範囲内にある方法および構造をカバーするものである。

Claims (52)

1. 細胞の閉じ込めまたは細胞付着および細胞増殖を可能にする固定床構造体を有するバイオリアクターを設け、
   培地を介して前記バイオリアクターに細胞を添加し、
   これら細胞を前記固定床構造体に閉じ込めおよび/または付着させて、前記バイオリアクター内で増殖させ、
   酵素カクテルを含有する細胞分離液を前記バイオリアクターに導入し、
   前記バイオリアクターの一部を撹拌し、そして
   前記固定床構造体に対して前記細胞分離溶液の液体レベルを移動させて、
   細胞の実質的部分に塊状物や凝集物を発生することなくこの細胞の実質的部分を前記固定床構造体から分離する
   ことを特徴とする細胞採取方法。
   
2. 前記撹拌工程および移動工程を同時に行う請求項１に記載の方法。
   
3. 前記移動工程において、前記細胞分離溶液を前記バイオリアクターから少なくとも部分的に排液する請求項１または請求項２に記載の方法。
   
4. 前記移動工程において、前記液体レベルを前記固定床構造体の上部の上またはこの上部に近接する部分から前記固定床構造体の底部の下またはこの底部に近接する部分に移動させる請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
   
5. 前記移動工程において、流体を前記バイオリアクターに添加する請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
   
6. 前記添加工程において、細胞分離溶液を前記バイオリアクターに追加添加する請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
   
7. 前記移動工程に先立って、前記液体レベルを前記固定床構造体の上に設定する請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
   
8. 前記移動工程において、前記液体レベルを複数回上下させる請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
   
9. 前記撹拌工程において、約２０～約３００ヘルツの周波数および約０．５～約５ｍｍの振幅で前記固定床構造体を直接的または間接的に振動させる請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
   
10. 前記導入工程において、インテグリンを裂開する酵素および細胞外マトリックスを裂開する異なる酵素を酵素カクテルとして導入する請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
    
11. 細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体を備えたバイオリアクター、
    前記バイオリアクターを撹拌しかつ前記構造体に対して液体レベルを移動させる細胞採取機構、および
    前記バイオリアクターに流体連絡する細胞分離溶液を含有する容器、を有し、この細胞分離溶液は、塊状物や凝集物を発生することなく、細胞閉じ込め/細胞付着を行う前記構造体から細胞を分離する酵素カクテルを有する
    ことを特徴とする細胞採取システム。
    
12. 前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体が３Ｄプリント固定床などの固定床を有する請求項１１に記載のシステム。
    
13. 前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体が積層形状または螺旋形状の複数の細胞固定層を有する固定床を有し、これら細胞固定層が隣接層間のスペースに直接的に、あるいは間接的に接触する請求項１１に記載のシステム。
    
14. 前記細胞採取機構が前記バイオリアクターを振動または振盪させる装置を有する請求項１１～１３のいずれか一項に記載のシステム。
    
15. 前記細胞採取機構が前記液体レベルを移動させるポンプを有する請求項１１～１４のいずれか一項に記載のシステム。
    
16. 前記細胞採取機構が前記バイオリアクター、特に前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体に振動エネルギーを印加する装置を有する請求項１１～１５のいずれか一項に記載のシステム。
    
17. 前記細胞採取機構が前記バイオリアクターのドッキングステーションの一部を形成する請求項１１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
    
18. 前記バイオリアクターが別なバイオリアクターに導入する細胞を採取する採取容器を有する請求項１１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
    
19. 前記バイオリアクターが水平面に対して傾動して、前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体からの排液を促進する請求項１１～１８のいずれか一項に記載のシステム。
    
20. さらに前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体を内部的にあるいは外部的に圧縮するコンパクターを有する請求項１１～１９のいずれか一項に記載のシステム。
    
21. 前記酵素カクテルがインテグリンを裂開する酵素および細胞外マトリックスを裂開する異なる酵素を含有する請求項１１～２０のいずれか一項に記載のシステム。
    
22. 前記細胞採取装置が前記バイオリアクターに対して前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体を移動させて、前記液体レベルを移動させる作動装置を有する請求項１１～２１のいずれか一項に記載のシステム。
    
23. さらに前記細胞採取機構を制御して、前記バイオリアクターを撹拌し、前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体に対して液体レベルを移動させる制御装置を有する請求項１１～２２のいずれか一項に記載のシステム。
    
24. 前記制御装置によって前記酵素カクテルの前記バイオリアクターへの搬送を制御する構成の請求項１１～２３のいずれか一項に記載のシステム。
    
25. 細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体を有するバイオリアクター、
    このバイオリアクターを撹拌する構成の撹拌装置、
    前記の細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体に対して液体レベルを移動させる作動装置、および
    前記バイオリアクターに流体連絡する細胞分離溶液を含有する容器を有し、この細胞分離溶液が塊状物や凝集物を発生することなく細胞閉じ込め/細胞付着および細胞増殖を行う構造体から細胞を分離する酵素カクテルを含有する
    ことを特徴とする細胞採取システム。
    
26. 前記撹拌装置が振動装置を有する請求項２５に記載のシステム。
    
27. 前記作動装置が線形作動装置を有する請求項２５または請求項２６に記載のシステム。
    
28. 前記作動装置がポンプを有する請求項２５または請求項２６のいずれか一項に記載のシステム。
    
29. さらに前記作動装置を制御する制御装置を有する請求項２５～２８のいずれか一項に記載のシステム。
    
30. 細胞閉じ込め/細胞接着および細胞増殖を行う構造体を有するバイオリアクター、
    このバイオリアクターを液体で充填処理およびフラッシュ処理を行っている状態で、前記バイオリアクターを撹拌する構成の細胞採取機構、および
    前記バイオリアクターに流体連絡する細胞分離溶液を含有する容器を有する
    ことを特徴とする細胞採取システム。
    
31. 前記細胞分離溶液が塊状物や凝集物を発生せずに細胞を分離する酵素カクテルを含有する請求項３０に記載のシステム。
    
32. 前記細胞採取機構が前記バイオリアクターを撹拌または振盪する装置を有する請求項３０または３１に記載のシステム。
    
33. 前記細胞採取機構が前記バイオリアクターの部分的な、または完全な充填処理、空処理およびフラッシュ処理を行う装置を有する請求項３０～３２のいずれか一項に記載のシステム。
    
34. 前記の充填処理、空処理およびフラッシュ処理を行う装置が一つかそれ以上のポンプを有する請求項３０～３３のいずれか一項に記載のシステム。
    
35. 前記細胞採取機構が前記バイオリアクターに、特に前記の細胞閉じ込め/細胞接着および細胞増殖を行う構造体に振動エネルギーを印加する装置を有する請求項３０～３４のいずれか一項に記載のシステム。
    
36. 前記細胞採取機構が前記バイオリアクターのドッキングステーションの一部を形成する請求項３０～３５のいずれか一項に記載のシステム。
    
37. 塊状物や凝集物を発生することなく細胞の分離を行う酵素カクテルを固定床バイオリアクターに添加し、そして
    このバイオリアクターが振動する状態で前記固定床バイオリアクター内の液体レベルの位置を調節する
    ことを特徴とする固定床バイオリアクターから細胞を分離する方法。
    
38. 前記調節工程において、液体を使用して前記バイオリアクターを充填処理およびフラッシュ処理する請求項３７に記載の方法。
    
39. 前記調節工程において、液体を使用して前記バイオリアクターを繰り返し充填処理およびフラッシュ処理する請求項３７に記載の方法。
    
40. さらに前記バイオリアクターから別なバイオリアクターに分離細胞を搬送する工程を有する請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
    
41. さらに前記バイオリアクターを傾動させる工程を有する請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。
    
42. さらに前記バイオリアクター内で固定床を圧縮する工程を有する請求項３７～４１のいずれか一項に記載の方法。
    
43. 前記調節工程において、前記固定床を前記バイオリアクターに対して移動させる請求項３７～４２のいずれか一項に記載の方法。
    
44. バイオリアクターを振動させ、そして
    このバイオリアクターを傾動させ、かつ排液する
    ことを特徴とするバイオリアクター内で細胞を分離する方法。
    
45. 前記振動する工程、前記傾動する工程、および前記排液する工程を同時に行う請求項４４に記載の方法。
    
46. 付着細胞増殖を行う固定床を有するバイオリアクター、および
    この固定床を圧縮する圧縮装置を有する
    ことを特徴とする細胞採取システム。
    
47. さらに前記バイオリアクターまたは前記固定床を振動させる振動装置を有する請求項４６に記載のシステム。
    
48. 前記圧縮装置を前記固定床内か前記固定床外に設ける請求項４６または請求項４７に記載のシステム。
    
49. 付着細胞増殖を行う構造体を有する前培養容器、
    バイオリアクターを振動させて、細胞をこの構造体から分離する振動装置、および
    前記前培養容器の下流側にあり、分離細胞を受け取るバイオリアクターを有する
    ことを特徴とする細胞採取システム。
    
50. 液体を前記前培養容器に送り込むか、あるいはこの前培養容器から送り出して前記構造体に対して液体レベルを移動させるポンプをさらに有する請求項４９に記載のシステム。
    
51. さらに前記ポンプを制御する制御装置を有する請求項５０に記載のシステム。
    
52. 前記制御装置が前記振動装置を制御する請求項５１に記載のシステム。

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