JPS6231908B2

JPS6231908B2 -

Info

Publication number: JPS6231908B2
Application number: JP53137786A
Authority: JP
Inventors: Shinroku Sogi; Masao Izawa; Shinichiro Hatsutori; Ikuo Tawara; Daizo Shinohara; Sachiko Tachikawa
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1978-11-10
Filing date: 1978-11-10
Publication date: 1987-07-10
Also published as: DE2945339C2; US4339537A; DE2945339A1; JPS5564795A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は生体組織または細胞の培養方法および
装置に関するものである。

従来、ふ卵器中でのガス培養技術、すなわち、
特定のガス雰囲気中における培養技術の発達に伴
ない、種々の培養手法が提案されている。例え
ば、特開昭51−41489号公報に記載されているよ
うに、特定のガス雰囲気に保たれたふ卵器中に、
通気性および液不透性のテフロンチユーブを巻回
して配置し、該テフロンチユーブ内に培養すべき
細胞を付着せしめて培養液を流すことにより着床
増殖させるものや、あるいは特開昭49−50180号
公報に記載されているように、垂直に配置された
多数のデイスクを水平方向に離間して配置した増
殖装置を用い、該増殖装置内に前記デイスクの一
部が浸るように少量の培養液を収容すると共に、
前記複数のデイスクにそれぞれ増殖すべき細胞を
付着せしめ、該複数のデイスクを所定の速度で回
転させながら、細胞を着床増殖させるものがあ
る。

しかし、上記のいずれの培養手法においても、
一世代の培養によつて着床面全面に増殖させるも
のであり、しかも着床面の総面積が大きいため、
細胞植込み時に比較的多量の細胞を必要とする
が、この多量の細胞は予じめ培養により準備する
必要があり、きわめて面倒となる欠点がある。ま
た、上記手法をそれぞれ実施する装置においては
構造が複雑かつ大形であると共に、その制御が煩
雑であり、また細胞を着床させる部分の滅菌が困
難である等の欠点がある。

また、他の従来の培養手法として、第１図に示
すような回転培養手法も提案されている。第１図
に示す線図を第２図に示す培養操作のブロツク線
図を参照しながら説明する。先ず培養の種になる
細胞を、クリーンベンチ１内で数本の培養瓶２
ａ，２ｂ，……に培養液と共に、分注・封入す
る。次にこれらの培養瓶２ａ，２ｂ，……を特定
のガス雰囲気に保たれたふ卵器３に移送し、ふ卵
器中において、それぞれ一対のローラー４ａ，４
ｂを介して回転させながら移送する。これによ
り、培養瓶２ａ，２ｂ，……内に収容された細胞
は、培養液と回転撹拌されながら培養瓶２ａ，２
ｂ，……の内壁に付着し増殖していく。ふ卵器３
中で、所定の増殖が完了した後、培養瓶２ａ，２
ｂ，……は再びクリーンベンチ１内に移送され、
こゝで増殖した細胞を新たな培養瓶に植換える。

増殖した細胞を新たな培養瓶に植換えるには、
先ず、所定の増殖を完了した培養瓶２ａ，２ｂ，
……内の培養液を廃棄し、緩衝液を注入して培養
瓶内壁に着床増殖した細胞を洗浄する。次に、緩
衝液を廃棄し、トリプシン等の酵素液を注入し
て、着床増殖した細胞を剥離し易い状態にする。
その後、酵素液を廃棄し、新たな培養液を注入し
てピペツトによる吸引、吐出等により剥離、単個
化し、増殖した細胞を培養液中に撹拌浮遊させて
から、この細胞浮遊液を新たな培養瓶に注入す
る。

第１図に示す培養手法においては、上述したよ
うな植換および回転培養を繰り返し行なうことに
より、所望量の細胞を得るものであるが、細胞の
植換えは、増殖を完了した培養瓶よりも容量の大
きな培養瓶に細胞浮遊液を入れ換えるか、または
前回の培養瓶と同等の容量の培養瓶を複数本用意
し、これらの瓶に細胞浮遊液を定量ずつ分注する
必要がある。このため、かゝる手法では、培養操
作が面倒であり、かつ植換え時において細胞が汚
染される恐れがある。また、増殖すべき細胞をク
リーンベンチ１とふ卵器３との間で循環させる必
要があるため、装置が大形となる欠点がある。

本発明の目的は、上述した従来の種々の欠点を
除去し、培養すべき種となる少量の生体組織また
は細胞を、汚染されることなく簡単な操作によつ
て効率的に多量に増殖できる培養方法を提供せん
とするにある。

本発明生体組織または細胞の培養方法は、所定
の着床面を有する培養槽内に、着床面の一部が浸
るように生体組織または細胞を所定倍率の培養液
と共に注入して増殖させた後、該増殖した生体組
織または細胞を着床面から剥離し、前記培養槽内
において増殖の割合に応じた培養液中に浮遊させ
る工程を繰り返して順次に増殖させることを特徴
とするものである。

更に、本発明の目的は、培養すべき生体組織ま
たは細胞を、小形かつ簡単な構造で、しかも簡単
な制御および操作によつて効率的に増殖し得るよ
うに適切に構成配置した培養装置を提供せんとす
るにある。

本発明生体組織または細胞の培養装置は、上下
方向に互いに離間してほぼ水平に配置された回転
可能な複数の着床板を具える培養槽と、この培養
槽の上方および下方においてそれぞれ連結して設
けられ、増殖すべき生体組織または細胞、培養
液、緩衝液、酵素液等の所定の液を選択的に注入
および廃棄する液供給手段および液廃棄手段と、
前記着床板を生体組織または細胞の増殖過程にお
いて適宜回転させる駆動手段とを具え、所定の倍
率の培養液と共に前記培養槽内の所定レベルまで
注入された増殖すべき生体組織または細胞を、所
定レベル内の着床板において着床増殖させた後、
該着床増殖した生体組織または細胞を着床板の回
転により前記培養槽内において着床板から剥離さ
せ、増殖の割合に応じた培養液中に浮遊させるこ
とにより、繰り返し順次に着床増殖し得るよう構
成したことを特徴とするものである。

以下図面を参照して本発明を詳細に説明する。

第３図は本発明培養方法の一例の工程を示す線
図であり、第４図は同じくブロツク線図である。
培養すべき生体組織または細胞（以下単に細胞と
いう）は、一般には培養瓶１０内に培養液と共に
収容されている。本例では、先ずこの培養瓶１０
をクリーンベンチ１１内で開封し、培養瓶１０内
の古くなつた培養液を廃棄した後、緩衝液で洗浄
処理する。その後、トリプシンによる酵素処理を
行なうことにより、培養瓶１０の内壁に着床して
いる細胞を剥離し易い状態とする。次に、トリプ
シンを廃棄した後、廃棄した培養液とほゞ同量の
新たな培養液を注入し、ピペツト１２で撹拌して
細胞を剥離単個化させ、培養液中に浮遊させる。
その後、この細胞浮遊液を所定の量ずつ数本の他
の培養瓶に分注してから、その１本の培養瓶中に
更に新たな培養液を注入して所定の細胞濃度に希
釈する。次に、このように所定の細胞濃度に希釈
された細胞浮遊液（サンプル液）を培養槽１３内
に注入する。

培養槽１３は所定の着床面を有し、内部は特定
のガス雰囲気、本例ではCO₂：５％、空気：95
％、湿度：100％、温度：37℃に保たれている。
また、培養槽１３には、前記サンプル液や培養液
１４、緩衝液１５、酵素液１６を選択的に注入す
る注入口１７と、これらの液を選択的に廃棄する
廃液口１８が設けられている。

本発明においては、前記サンプル液の量を、着
床面の一部に浸る量として注入口１７から注入
し、撹拌後または直ちに静置培養する。培養槽１
３内での着床面の一部における細胞の着床増殖状
態は、顕微鏡等の増殖検出装置１９によつて検出
される。着床面において所定の増殖が完了したこ
とを検出装置１９によつて検出してから、培養槽
１３内の古くなつた培養液を廃液口１８から廃棄
する。その後、緩衝液１５を注入して、着床面に
おいて増殖した細胞を洗浄し、緩衝液を廃棄して
から、酵素液１６を注入して着床している細胞を
着床面から剥離し易い状態にする。次に、酵素液
を廃棄し、新たな培養液１４を注入して撹拌し、
細胞を剥離単個化して培養液中に浮遊させる。な
お、細胞と培養液との撹拌は、例えば、培養槽１
３内において着床面を回転または振動させること
により行なうことができる。また、新たに注入す
る培養液１４の量は、増殖された細胞が、最初に
注入した細胞濃度をほゞ同程度の濃度となる量と
し、撹拌中またはその前後においてこの量となれ
ばよい。

以後、増殖した細胞に対して、上述した静置培
養→増殖検出→培養液廃棄→緩衝液処理→酵素処
理→培養液注入→撹拌の順次の工程を同一培養槽
１３内において繰り返し行なうことにより、最初
に注入した細胞を継代培養して多量の増殖細胞を
得ることができる。

このように本発明方法においては、人為的な植
換え操作を行なうことなく１つの培養槽内におい
て所望量の継代培養ができ、したがつて種となる
細胞も極めて少量で足りると共に、汚染等の恐れ
もない。また、同一培養槽内で種々の処理を行な
うものであるから、均質な増殖細胞を得ることが
でき、また操作も比較的簡単となる。

なお、本発明方法においては、増殖すべき細胞
を培養槽内で着床面を若干移動しながら培養して
もよい。また、増殖した細胞を培養液により所定
の濃度に希釈した後、この細胞浮遊液を廃液口１
８および注入口１７を経て環流させてもよい。こ
のようにすれば、増殖された細胞と培養液とが更
に確実に撹拌されるから、PH値の均一な細胞浮遊
液を得ることができ、均質な増殖細胞を得ること
ができる。また、本発明方法においては、所定の
着床面全部に細胞が着床増殖した時点であるいは
細胞が所望の量に増殖した時点で継代培養を終了
するが、このときの細胞は、上記と同様の処理工
程によつて廃液口１８から取り出すことができ
る。

第５図は本発明培養装置の要部の一例の構成を
一部切り欠いて示す外観斜視図、第６図および第
７図はそれぞれ第５図に示す装置に用いる培養槽
の一例の構成を示す断面斜視図および断面図であ
る。培養槽３０はステンレスで構成され、その内
部には上下方向に図示しないスペーサーを介して
互いに離間して水平方向に配置された回転可能な
複数（本例では64枚）の円盤状の着床板３１を具
える。この着床板はチタン、テフロン、硬質ガラ
ス等より成り、駆動軸３２に着脱自在に連結さ
れ、モーター３３の駆動により一体に回転する。
培養槽３０の上方部には、液供給口３５、雰囲気
制御口３６、脱気口３７および滅菌口３８が設け
られている。液供給口３５は、培養すべき初期の
細胞を培養液によつて所定の濃度に希釈したサン
プル液および培養液槽４１、緩衝液槽４２、酵素
液槽４３にそれぞれ収容された薬液を選択的に培
養槽３０内に注入する。サンプル液の注入は、図
示しないセルフシール機構（例えばゴム栓等）お
よび予熱装置４４を経て行なわれ、また各液槽４
１，４２，４３に収容された薬液は、それぞれポ
ンプ４５，４６，４７、図示しない弁およびフイ
ルターおよび前記予熱装置４４を経て注入され
る。雰囲気制御口３６は、図示しないフイルター
および弁を経てCO₂ボンベ５０に連結され、培養
槽３０内に注入された培養液のPHを一定に保つた
め、CO₂と空気とを適宜混合して（CO₂：５％、
空気：95％）注入する。脱気口３７は、後述する
滅菌後の残留気体が培養時の供給気を図示しない
弁およびフイルターを経て脱気する。滅菌口３８
は、図示しないフイルターおよび弁を経て、エチ
レンオキサイドガス発生器等の滅菌装置に連結さ
れ、培養操作を開始する前に、培養槽３０等の細
胞が触れる部分を滅菌する。

一方、培養槽３０の底板３０ａには、廃液口５
１が設けられ、培養過程において培養槽３０内に
注入された液をポンプ５２および弁５３を経て選
択的に廃棄または回収すると共に、所定増殖後の
細胞浮遊液をポンプ５２、弁５４予熱装置４４お
よび液注入口３５を経て培養槽３０内に環流させ
る。

上述した培養槽３０は、その側板３０ｂ内に図
示しないヒーターを具え、温度コントローラ５５
の制御のもとに、所定の槽内温度（37℃）に保た
れている。また、廃液口５２と液注入口３５との
間の環流通路には所定増殖後の細胞浮遊液の培養
密度を光電的または画像情報処理的に検出するた
めの観察部５６が設けられている。更に、図示し
ないが、本例に示す培養装置には、培養槽３０内
の着床板３１上において、細胞の増殖状態を観察
するための増殖検出装置および培養槽３０内のガ
ス雰囲気、湿度ならびに培養液のPHを制御するた
めの検出装置が設けられていると共に、これらの
検出装置および前記観察部５６からの情報に基
き、各弁を開閉して培養工程を制御するミニコン
ピユーター等の制御装置を具える。なお、前記増
殖検出装置は、例えば正立型顕微鏡の対物レンズ
を培養槽３０内に挿脱自在に設けることによつて
構成することができる。

以下、第５図〜第７図に示す培養装置による細
胞の培養手法の一例を順次に説明する。

(i) 滅菌装置以外の弁をすべて閉鎖して、該装置
を作動させる。

(ii) 適当時間滅菌後、残留気を脱気口３７から脱
気させる（エチレンオキサイドガス滅菌の場
合）。

(iii) 種となる微量の細胞を含む初期のサンプル液
を液注入口３５から培養槽３０内に注入する。

(iv) 注入したサンプル液内の細胞を所定の増殖倍
率（以下、これを４倍として説明する）の細胞
数までに増殖するに充分な培養液を、培養液槽
４１からポンプ４５、弁、フイルター、予熱装
置４４および液注入口３５を経て注入する。な
お、本例では、このときの培養液は最下段の一
枚の着床板３１を浸漬するに充分な量であり、
種となる細胞量は該着床板３１の上面のほぼ1/
４の面積が単一層で覆われる量とする。したが
つて、この場合には一枚の着床板３１の上面に
細胞が密に単一層を形成したとき培養が完了す
ることになる。

(v) モーター３３を駆動して着床３１を回転さ
せ、細胞を培養液中に均等に分布させる。

(vi) 培養槽３０内のガス雰囲気、温度、湿度なら
びに培養液中のPHを適度に保ちながら静置培養
し、細胞が最下段の着床板３１の上面一杯に着
床増殖するまで待つ。なお、着床板３１の下面
には細胞はほとんど着床しないと共に、培養槽
３０は着床しにくい材質であるからその底板３
０ａおよび側板３０ｂには、細胞はほとんど着
床しない。

(vii) 増殖検出装置によつて着床板一杯に増殖され
たことを検出する。

(viii) 古い培養液を廃液口５１、ポンプ５２、弁５
３を経て廃棄する。

(ix) 緩衝液槽４２からポンプ４６、弁、フイルタ
ー予熱装置４４および液注入口３５を経て緩衝
液を注入し、着床増殖した細胞を洗浄して、こ
の液を上記(viii)と同じ通路を経て廃棄する。

(x) 酵素液槽４３からポンプ４７、弁、フイルタ
ー、予熱装置４４および液注入口３５を経て酵
素液（例えばトリプシン）を注入し、着床増殖
した細胞を着床板から剥離し易い状態とし、こ
の液を上記(viii)と同じ通路を経て廃棄する。

() 培養槽４１から上記(iv)と同じ通路を経て
培養槽３０内に培養液を注入すると共に、モー
ター３３を駆動して着床板３１を高速回転さ
せ、着床した細胞を着床板から剥離して撹拌
し、細胞を培養液中に単個化して浮遊させる。
なお、このときの培養液の量は、増殖倍率を４
倍としたから、上記(viii)において廃棄した培養液
の量の４倍とし、４倍の量の培養液を注入して
から撹拌してもよいし、これよりも少ない量で
撹拌した後に残りの量の培養液を注入してもよ
い。

() 培養槽３０内の細胞浮遊液を、廃液口５
１、ポンプ５２、弁５４、予熱装置４４および
液注入口３５を経て環流させる。

() 上記(vi)〜（）の工程を順次に繰り返
し行ない、64枚の着床板全部の上面に細胞を着
床増殖させる。

() 上記(viii)〜（）の工程を行ない、所定
の量に増殖した細胞浮遊液（本例では初期の細
胞量の256倍）を、上記(viii)と同じ通路を経て回
収する。なお、この場合の培養液の量は、増殖
率がほぼ１倍に対応する量とする。

上述した実施例によれば、増殖後の細胞浮遊液
を環流させているから、撹拌がより確実となり、
培養液のPHにむらがなくなる。また、滅菌装置と
して、エチレンオキサイドガス発生器等を用いて
いるから、滅菌が手軽に行なえる利点がある。

このように、本発明装置によれば、１つの培養
槽内で細胞を順次に増殖させるものであるから、
所望の継代培養ができると共に小形かつ簡単に構
成することができる。したがつて、１台の装置で
少量の細胞から多量の細胞を連続して得ることが
できると共に、制御も比較的簡単となり、容易に
自動化できる。また、順次に増殖させる過程にお
いて、細胞を培養槽外部に移送することがないか
ら、汚染の心配もなく、均質な細胞を得ることが
できる。

なお、本発明装置においては複数の着床板をそ
れぞれ傘状に構成することもできる。また、細胞
の培養は着床板を低速回転させながら行なつても
よい。このようにすれば、着床板の上面に付着し
た細胞は、培養液中を撹拌回転され、常に新しい
培養液に接することになるから、増殖効果を向上
させることができる。更に、増殖した細胞を新た
な培養液中に単個化浮遊させた後は、この細胞浮
遊液を必ずしも環流させる必要はない。更にま
た、増殖倍率は４倍に限らず、２倍、８倍等所望
の倍率で増殖させることもでき、これに応じて着
床板の枚数も任意に変えることもできる。更にま
た任意の量に増殖した時点で細胞浮遊液を回収す
ることもできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来の培養方法の工程を示す線図、第
２図は同じくブロツク線図、第３図は本発明培養
方法の一例の工程を示す線図、第４図は同じくブ
ロツク線図、第５図は本発明培養装置の一例の構
成を一部切り欠いて示す外観斜視図、第６図およ
び第７図はそれぞれ第５図に示す装置に用いる培
養槽の一例の構成を示す断面斜視図および断面図
である。１３……培養槽、１４……培養液、１５……緩
衝液、１６……酵素液、１７……注入口、１８…
…廃液口、３０……培養槽、３１……着床板、３
３……モーター、３５……液注入口、４１……培
養液槽、４２……緩衝液槽、４３……酵素液槽、
５１……廃液口。

Claims

【特許請求の範囲】１所定の着床面を有する培養槽内に、着床面の
一部が浸るように生体組織または細胞を所定倍率
の培養液と共に注入して増殖させた後、該増殖し
た生体組織または細胞を着床面から剥離し、前記
培養槽内において増殖の割合に応じた培養液中に
浮遊させる工程を繰り返して順次に増殖させるこ
とを特徴とする生体組織または細胞の培養方法。２上下方向に互いに離間してほぼ水平に配置さ
れた回転可能な複数の着床板を具える培養槽と、
この培養槽の上方および下方においてそれぞれ連
結して設けられ、増殖すべき生体組織または細
胞、培養液、緩衝液、酵素液等の所定の液を選択
的に注入および廃棄する液供給手段および液廃棄
手段と、前記着床板を生体組織または細胞の増殖
過程において適宜回転させる駆動手段とを具え、所定の倍率の培養液と共に前記培養槽内の所定
レベルまで注入された増殖すべき生体組織または
細胞を、所定レベル内の着床板において着床増殖
させた後、該着床増殖した生体組織または細胞を
着床板の回転により前記培養槽内において着床板
から剥離させ、増殖の割合に応じた培養液中に浮
遊させることにより、繰り返し順次に着床増殖し
得るよう構成したことを特徴とする生体組織また
は細胞の培養装置。