DE2945339A1

DE2945339A1 - Verfahren und vorrichtung zum zuechten von biologischen substanzen

Info

Publication number: DE2945339A1
Application number: DE19792945339
Authority: DE
Inventors: Tokio Hachioji; Shinichriro Hattori; Masao Izawa; Daizo Shinohara; Shinroku Sogi; Sachiko Tachikawa; Ikuo Tawara
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1978-11-10
Filing date: 1979-11-09
Publication date: 1980-05-14
Also published as: JPS5564795A; DE2945339C2; JPS6231908B2; US4339537A

Description

PATENTANWÄLTE

WUESTHOFF-v.PECHMANN-ttEHRENS-GOETZ

PROFESSIONAL REPRBfENTATIVE* IEFORI THB EUROPEAN PATENT OFFICE MANDATAIRIS AC nt ti FREI l'oFFICB IUROfEIN DEI RREVETt

-S-

DR.-INC. FRANZ VUEtTHOFF DR. PHIL. FRIDA VUESTHOFF (1917-IJji) D1FL.-INC. CEKHAKD PULS (ijjl-lj/l) DIPU-CHEM. DR. E. FREIHERR VOM FlCMMAMN DR.-INC. DIETER IEHRENS DIFL.-INC.; DIFL.-VIRTfCH.-INC. KWFBKT 6OBTZ

D-8000 hutiCtteH SO SCHWEIGERSTRASSE 2

telefon: (089) 6610 51 tbleceamm: fbotbctfatint tblex: 514070

I.9-52 984

Anmelder:

Olympus Optical Company Limited, 43-2, 2-Chome, Hatagaya, Shibuya-Ku, Tokyo, Japan

Titel:

Verfahren und Vorrichtung zum Züchten von biologischen Substanzen.

030020/0892

DR.-I NC. HtANZ VUESTHOFi PATENTANWÄLTE , DK. PHIL. FREDA VUESTHOFP (l9I7-I9ji) WUESTHOFF - ν. PECHMANN - BEHRENS - GOETZ d,fl,.nc. ge.hard r«L, (.,,a-.,₇.) DIFU-CHEM-DK-B-FkEIHBKIt VON FBCHIIANN KBPKBSENTATIVBS IBPORB TUB BUKOFBAN FATE NT OFFICE . DK.-INC. DIETBK BEHKENS MANDATAIKBS AGREES PRES l'oFFICB BUROFBBN DES BKEVBTS DIPL.-ING.; DIrU-VIRTSCIL-INCKUFEKT COBTZ

D-8000 MONCTiEN

1 -52 984 SCHWEIGERSTRASSE 2

—————— telefon: (oJj) 66 20 ji

TELEGRAMM: PKOTICTrATBNT

Z: {24070

Beschreibung

Verfahren und Vorrichtung zum Züchten von biologischen Substanzen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten von biologischen Substanzen, beispielsweise von Geweben, Zellen, Vakzinen, Viren u.dgl.

Im Zuge der Entwicklung von Kulturverfahren mit begastem Brutschrank, also mit spezieller Gasatmosphäre, sind bisher verschiedene Züchtvorrichtungen vorgeschlagen worden. Beispielsweise ist aus der US-PS 3 948 732 ein Kulturverfahren mit Vermehrung durch Einsaat bekannt, bei dem in einem unter einer speziellen Gasatmosphäre gehaltenen Brütschrank ein Bohr aus gasdurchlässigem und flüssigkeiten undurchlässigem Folytetrafluoräthylen angeordnet ist, zu züchtende Saatzellen an der Innenfläche des Rohres aufgebracht werden und eine Nährlösung durch das Rohr hindurchgeschickt wird. In der US-Patentschrift 3 839 155 ist ein anderes Einsaat-Kulturverfahren offenbart, bei dem eine Vermehrungsvorrichtung verwendet wird, in der mehrere Scheiben senkrecht und mit waagerechtem Zwischenabstand angeordnet sind. In diese Vermehrungs-

03002Q/0892 /2

j,, 52

vorrichtung wird in kleiner Menge soviel einer NährrÖBimg eingefüllt, daß ein Teil dieser Scheiben eingetaucht ist, und an jeder der Scheiben werden zu vermehrende Zellen aufgebracht, ausgestrichen und durch Drehen der Scheiben mit einer vorgegebenen Geschwindigkeit gezüchtet.

Bei jeder der vorstehend erwähnten KuItürvorrichtungen werden jedoch Gewebe oder Zellen über der gesamten Erstreckung einer Einsaatfläche über eine Zellgeneration vermehrt, und da die gesamte FlächenerStreckung der Einsaatfläche groß iet, wird zu Anfang eine vergleichsweise große Menge Zellen benötigt. Eine solche große Menge Zellen muß jedoch durch eine vorausgehende Züchtung dargestellt werden, und eine solche Darstellung ist mit beträchtlichen Schwierigkeiten verbunden. Ferner ist eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens verwickelt im Aufbau, hat große Abmessungen und ist schwierig zu steuern. Außerdem ist das Sterilisieren des Abschnittes, wo die Zellen eingesät werden, schwierig.

Als ein weiteres herkömmliches Kulturverfahren ist ein Roller-Plaschen-Kulturverfahren vorgeschlagen worden, das durch eine schematische Zeichnung in Fig. 1 dargestellt ist und dessen Arbeitsschritte anhand eines Blockdiagramms in Fig. 2 erläutert werden. Zuerst werden an einem in sterilem Zustand gehaltenen Arbeitsplatz 1 Saatzellen und eine vorgegebene Menge einer Nährlösung in mehrere Kulturflaschen 2a, 2b, ... gegeben und die Kulturflaschen 2a, 2b mit entsprechenden Stopfen dicht verschlossen. Sodann werden die Kulturflaschen 2a, 2b, ... in einen unter einer speziellen Gasatmosphäre gehaltenen Brütschrank 3 eingesetzt und durch Entfernen der Stopfen geöffnet. Jede der Kulturflaschen 2a, 2b, ... wird auf einem Paar drehbarer Rollen 4a, 4b angeordnet und mit einer vorgegebenen Geschwindigkeit so gedreht, daß die Zellen in ihnen zusammen mit der Nährlösung gedreht und bewegt und an den Innenwänden der Kulturflaschen 2a, 2b, ... eingesät und vermehrt

030020/0892 /3

ORIGINAL INSPECTED

g' 52

werden. Nach Beendigung der im voraus festgelegten Vermehrung im Brütschrank 3 werden die Kulturflaschen 2a, 2b, ... mit den Stopfen wieder dicht verschlossen und zum Arbeitsplatz 1 zurückgebracht, wo die gezüchteten Zellen in neue KuIturflaschen erneut eingesät werden.

Um die gezüchteten Zellen in neue Kulturflaschen einsäen zu können, muß zuerst aus den Kulturflaschen 2a, 2b, ..., in denen die im voraus festgelegte Vermehrung durchgeführt wurde, die Nährlösung entfernt werden. Sodann werden die an der Innenwand der Kulturflasche 2a, 2b, ... eingesäten und gezüchteten Zellen durch Einspritzen einer Pufferlösung gewaschen. Nach dem Wegschaffen der Pufferlösung wird dann eine Enzymlösung, z.B. Trypsin o.dgl., eingespritzt, die bewirkt, daß sich die eingesäten und gezüchteten Zellen von der Flaschenwand leicht ablösen lassen. Nach dem Entfernen der Enzymlösung wird neue Nährlösung eingespritzt, die dann mittels einer Pipette wiederholt aufgesaugt und abgegeben wird, so daß die gezüchteten Zellen von der Flaschenwand gelöst und in einzelne Zellen getrennt werden, welche durch Umrühren bzw. Bewegen in der Nährlösung dispergiert werden. Die so erhaltene Zellenaufschlämmung wird in eine oder mehrere neue Kulturflaschen weiter aufgeteilt.

Bei dem in Fig. 1 dargestellten Kulturverfahren wird, wie vorstehend beschrieben, eine gewünschte Menge Zellen durch Wiederholen der Einsaat und der Roller-Züchtung erhalten. Zum Neueinsäen von Zellen ist es jedoch notwendig, die ZellenaufBchlammung umzufüllen in eine Kulturflasche von größerem Fassungsvermögen als die, mit der die gerade beendete Vermehrung durchgeführt worden ist, oder es werden mehrere Kulturflaschen von gleichem Fassungsvermögen wie die zuvor benutzte vorbereitet, in welche die Zellenaufschlämmung mit jeweils gleicher Menge eingespritzt und aufgeteilt wird. Mit einem solchen Verfahren ist daher ein Züchtungsvorgang umständlich, und es besteht die Möglichkeit, daß die Zellen beim Neueinsäen kontaminiert werden.

030020/0892 /4

- f- if 52 984

Ferner ist es notwendig, die zu züchtenden Zellen zwischen dem Arbeitsplatz 1 und dem Brütschrank 3 umlaufen zu lassen, so daß die Vorrichtung nachteilig große Abmessungen bekommt.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, die vorstehend beschriebenen verschiedenen Nachteile herkömmlicher Kulturverfahren auszuschalten und ein Verfahren zu schaffen, mit dem sich ausgehend von einer kleinen Menge Saatgeweben und -zellen in einfachen Arbeitsschritten und ohne jegliche Gefahr der Kontamination eine große Menge biologischer Gewebe und Zellen züchten läßt, sowie eine Vorrichtung zur Züchtung biologischer Substanzen, die kleine Abmessungen hat und einfach aufgebaut ist und bei einfacher Steuerung und mit einfachen Arbeitsschritten die biologischen Zellen oder Gewebe wirkungsvoll zu vermehren vermag.

Diese Aufgabe ist mit dem Verfahren gemäß Anspruch 1 und der Vorrichtung gemäß Anspruch 6 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den zugehörigen Unteransprüchen gekennzeichnet.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im folgenden anhand schematischer Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 3 ein Diagramm zur Verdeutlichung einer Ausführungsform des Kulturverfahrens gemäß der Erfindung,

Fig. 4 ein Blockdiagramm, in dem aufeinanderfolgende Arbeitsschritte des Kulturverfahrens gemäß der Erfindung dargestellt sind,

Fig. 5 eine teilweise aufgeschnittene Schrägaußenansicht einer Ausführungsform einer Züchtvorrichtung gemäß der Erfindung,

Fig. 6 eine teilweise geschnittene Schrägansicht einer Ausführungsform eines Kulturgefäßes für die Vorrichtung gemäß Fig. 5 und

Fig. 7 einen Querschnitt durch dasselbe Kulturgefäß.

030020/0892 /5

'X- ΛΟ ' 52

Bei dem in Pig. 3 und 4 dargestellten Verfahren werden die zu züchtenden biologischen Gewebe oder Zellen, nachfolgend als Zellen bezeichnet, zusammen mit einer Nährlösung in einem Kulturgefäß 10 aufbewahrt. Das beim gezeigten Beispiel als Flasche auegebildete Kulturgefäß 10 wird dann zuerst an einem in sterilem Zustand gehaltenen Arbeitsplatz 11 geöffnet, und nach dem Entfernen der alten Nährlösung aus dem Kulturgefäß 10 wird dessen Innenseite mit einer Pufferlösung bespült. Danach wird mit Trypsin eine Enzymbehandlung vorgenommen, um das Ablösen der an der Innenwand dee Kulturgefäßes 10 eingesäten Zellen zu erleichtern. Nach dem Entfernen des Trypsins wird in nahezu der gleichen Menge wie die zuvor weggeschaffte Nährlösung eine neue Nährlösung in das Kulturgefäß 10 eingespritzt und mit einer Pipette 12 bewegt, und werden die Zellen abgelöst, getrennt und in der Nährlösung dispergiert. Danach wird die Zellenaufechlämmung in je einer bestimmten Menge auf mehrere andere Kulturgefäße aufgeteilt; in eines davon wird weitere neue Nährlösung eingespritzt und die Aufschlämmung wird auf eine im voraus festgelegte Zellenkonzentration verdünnt. Sodann wird die so verdünnte Zellenaufschlämmung, die Probelösung, in ein Kulturgefäß 13 umgefüllt.

Das Kulturgefäß 13 verfügt über eine im voraus festgelegte Einsaatfläche, und in seinem Innern wird eine spezielle Gasatmosphäre aufrechterhalten, die beim gezeigten Beispiel durch einen C0₂-Anteil von 5#, Luft 95#, Feuchtigkeit 100J& und eine Temperatur von 37 *C bestimmt ist. Das KuIturgefäß 13 hat ferner einen Einlaß 17 zum wahlweisen Einspritzen oder Einleiten der schon genannten Probelösung, von Nährlösung aus einem Behälter 14, Pufferlösung aus einem Behälter 15 und Enzymlösung aus einem Behälter 16 sowie einen Auslaß 18 zum wahl weisen Entfernen bzw. Ausleiten dieser Lösungen.

Zuerst wird über den Einlaß 17 eine solche Menge der genannten Probelösung in das Kulturgefäß 13 eingespritzt, daß ein

030020/0892 /6

-y- λλ* ⁵²⁹⁸⁴

Teil der Einsaatfläche eingetaucht ist; nach dem Bewegen oder unmittelbar nach dem Einspritzen läßt man die Züchtung bei unbewegter oder stationärer Kultur beginnen. Der Einsaat- und Vermehrungszustand der Zellen an einem Teil der Einsaatfläche im Kulturgefäß 13 wird mit einer Vermehrungsstatus-Peststellvorrichtung 19, beispielsweise mit einem Mikroskop u.dgl., festgestellt. Nachdem mit der Feststellvorrichtung 19 die Beendigung einer im voraue festgelegten Vermehrung an der Einsaatfläche festgestellt worden ist, wird die im Kulturgefäß 13 benutzte Nährlösung über den Auslaß 18 entfernt. Danach wird Pufferlösung aus dem Behälter 15 eingespritzt, um die an der Einsaatfläche gezüchteten Zellen zu waschen, und dann ausgeleitet. Sodann wird aus dem Behälter 16 Enzymlösung eingespritzt, um das Ablösen der eingesäten Zellen von der Einsaatfläche zu erleichtern. Nach dem Entfernen der Enzymlösung wird ,neue Nährlösung aus dem Behälter 14 eingespritzt, und werden dann die Zellen von der Einsaatfläche abgelöst und in einzelne Zellen getrennt, die dann in der Nährlösung dispergiert werden. In diesem Falle können die Zellen und die Nährlösung bewegt werden, beispielsweise durch Drehen oder Schütteln der Einsaatfläche im Kulturgefäß 13· Die Menge der aus dem Behälter 14 neu eingespritzten Nährlösung wird so gewählt, daß die Zellenkonzentration nahezu gleich ist mit der in der anfänglichen Saatzellenaufschlämmung. Diese Zellenkonzentration kann vor, während oder nach dem Bewegen eingestellt werden.

Danach werden in demselben Kulturgefäß 13 an den vermehrten Zellen nacheinander die vorstehend beschriebenen Arbeits-Bchritte wiederholt, also Züchtung bei stationär gehaltener Kultur - Feststellung des Vermehrungsstatus - Wegschaffen der Nährlösung - Behandlung mit Pufferlösung Behandlung mit Enzym - Einspritzen von Nährlösung - Bewegen. Daraus ergibt sich für die anfänglich injizierten Zellen eine Aufeinanderfolge von Züchtungsvorgängen, mit denen sich eine starke Vermehrung der Zellen erzielen läßt.

030020/0892 /7

52

Gemäß dem beschriebenen Verfahren läßt sich also eine gewünschte Zahl aufeinanderfolgender Züchtungsvorgänge in einem einzigen Kulturgefäß durchführen, ohne daß eine künstliche Neueinsaat vorgenommen wird. Folglich genügt als "Saatgut" eine kleine Menge vpn Zellen, und es besteht keine Möglichkeit der Kontamination. Ba außerdem verschiedene Beehandlungen in ein und demselben Kulturgefäß durchgeführt werden, lassen sich homogen entwickelte Zellen erhalten, und ist der Vorgang vergleichsweise einfach.

Außerdem ist es bei dem beschriebenen Verfahren von Vorteil, wenn zur Züchtung von zu vermehrenden Zellen die Einsaatfläche im Kulturgefäß leicht bewegt wird. Daneben ist es vorteilhaft, wenn nach dem Verdünnen der vermehrten Zellen auf eine im voraus festgelegte Konzentration mittels einer Nährlösung die Zellenauf schlämmung über den Auslaß 18 und den Einlaß 17 umgewälzt wird. Auf diese Weise werden die vermehrten Zellen und die Nährlösung zwangläufiger und gleichmäßiger bewegt, so daß eine Zellenaufschlämmung mit einheitlichem p„ -Wert und somit homogen entwickelte Zellen erhalten werden können. Ferner wird bei dem beschriebenen Verfahren in dem Zeitpunkt, wo die Zellen sich über die gesamte Einsaatfläche vermehrt haben oder einen gewünschten Vermehrungsstatus erreicht haben, die sukzessive oder Kettenzüchtung gestoppt, und die Zellen können zu diesem Zeitpunkt über den Auslaß 18 entsprechend den vorstehend beschriebenen Arbeitsschritten ähnlichen Behandlungsschritten entfernt werden.

Gemäß Fig. 5, die den wesentlichen Teil einer Ausführungsform einer Zuchtvorrichtung zeigt, hat ein Kulturgefäß 30 eine Vielzahl, beim gezeigten Beispiel 64 drehbare scheibenförmige Einsaatplatten 31» die durch nicht gezeichnete Abstandsstücke mit vertikalem Zwischenabstand und waagerecht angeordnet sind. Die Einsaatplatten 31 sind mit einer Antriebswelle 32 lösbar drehfest verbunden und von einem Motor 33 drehantreibbar. An seinem oberen Teil weist das Kultur-

030020/0892 /8

52 984

gefäß 30 einen Einlaß 35 für die Flüssigkeitszufuhr auf, ein Atmosphärensteuerventil 36, einen Gasauslaß 37 und eine Sterilisiervorrichtung 38. Mit dem Einlaß 35 lassen sich wahlweise eine Probelösung einspritzen, die durch Aufschlämmen anfänglich vorhandener Zellen mit einer vorbestimmten Konzentration in einer Nährlösung hergestellt wurde, und chemische Lösungen aus einem Behälter 41 für Nährlösung, einem Behälter 42 für Pufferlösung und einem Behälter 43 für Enzymlösung. Die Probelösung wird durch eine nicht gezeichnete selbsttätige Dichtvorrichtung hindurch eingespritzt, beispielsweise durch einen Stopfen aus Kautschuk o.dgl., und durch eine Vorwärmevorrichtung 44, wogegen die chemischen Lösungen aus den Behältern 41, 42 und 43 über ein nicht gezeichnetes Ventil, einen nicht gezeichneten Filter und die Vorwärmevorrichtung 44 eingespritzt werden. Das Atmosphärensteuerventil 36 ist über einen nicht gezeichneten Filter und ein Ventil an einen Zylinder 50 für COp-Gas angeschlossen und leitet COp und Luft im richtigen Mischungsverhältnis (CO₂: 5$, Luft: 95#) ein, um die in das Kulturgefäß 30 eingespritzte Nährlösung auf einem konstanten p„-Wert zu halten. Der Gasauslaß 37 leitet das nach dem Sterilisieren zurückgebliebene Gas oder die während der Züchtung zugeführte Luft über ein nicht gezeichnetes Ventil und einen Filter aus. Die Sterilisiervorrichtung 38 ist über einen nioht gezeichneten Filter und ein Ventil an ein Sterilisiergerät, wie z.B. einen Äthylenoxidgaserzeuger, angeschlossen und dient zum Sterilisieren, vor Beginn des Züchtungsvorganges, des Teiles des Kulturgefäßes 30 o.dgl., an dem Zellen eingesät werden sollen.

Das Kulturgefäß 30 hat eine Bodenplatte 30a,an der ein Flüssigkeitsauslaß 51 ausgebildet ist, aus dem sich mittels einer Pumpe 52 und eines Ventils 53 die im Verlaufe der Züchtung in das Kulturgefäß 30 eingespritzte Lösung wahlweise ausleiten oder rückgewinnen läßt und der zusammen mit der Pumpe 52, einem Ventil 54, der Vorwärmevorrichtung 44 und dem Einlaß 35 zum Umwälzen der Zellenaufschlämmung nach Erreichen einer vorbestimmten Vermehrung dient.

030 0 20/0892

/9

-y- /l(f. 52 984

Sas Kulturgefäß 30 weist in einer Seitenwand 30b eine nicht gezeichnete Heizvorrichtung auf, die dazu dient, mit Steuerung durch ein Temperatur steuergerät 55 im Innern des Kulturgefäßes 30 eine vorbestimmte Temperatur (37 *C) zu halten. Ferner ist in einen Flüssigkeitströmungsweg zwischen der Pumpe 52 und dem Einlaß 35 für die Flüssigkeitszufuhr ein Beobachtungsgerät 56 eingebaut, mit obm sich auf fotoelektrischem Wege oder durch Verarbeiten von Bildinformationen eine Kultur- bzw. Fopulationsdichte der Zellenaufschlämmung nach einer vorbestimmten Vermehrung feststellen läßt. Im Kulturgefäß 30 sind an der Einsaatplatte 31 mehrere nicht gezeichnete Vorrichtungen angeordnet, nämlich eine Feststellvorrichtung zum Feststellen des Vermehrungsstatus der Zellen und eine Abtastvorrichtung zum Steuern der Gasatmosphäre und der Temperatur im KuI tür ge faß 30 und dee Pjj-Wertes der Nährlösung, die mit einem Steuergerät, beispielsweise mit einem Kleinrechner o.dgl., zusammenwirken, das ausgehend von Informationen, die von den genannten Feststell- oder Abtastvorrichtungen und vom Beobachtungsgerät geliefert werden, durch Betätigen der verschiedenen Ventile die Züchtungsarbeitsschritte steuert. Die Feststellvorrichtung für den Vermehrungsstatus kann von einem Objektiv beispielsweise eines vertikalen Mikroskops gebildet sein, das im Kulturgefäß 30 lösbar angeordnet ist.

Anhand eines Beispiels werden nachfolgend in der Reihenfolge ihres Ablaufes die Arbeitsschritte beim Züchten von Zellen mit der Vorrichtung gemäß Fig. 5 bis 7 beschrieben.

1) Alle Ventile, mit Ausnahem des der Sterilisiervorrichtung 38 zugeordneten Ventils, sind geschlossen; die Sterilisiervorrichtung 38 wird zum Sterilisieren des Innenraumes des Kulturgefäßes 30 betätigt.

2) Nach zeitlich ausreichender Sterilisierung wird die zurückgebliebene Luft über den Gasauslaß 37 ausgeleitet (gilt für das Sterilisieren mit Äthylenoxidgas).

/10

030020/0892

ICj^-

52

3) Über den Einlaß 35 für die Flüssigkeitszufuhr wird in das Kulturgefäß 30 eine anfängliche Probelösung eingespritzt, die eine kleine Menge Saatzellen enthält.

4) Mit der Pumpe 45, dem zugehörigen Ventil und Filter und der Vorwärmevorrichtung 44 wird aus dem Behälter 41 Nährlösung über den Einlaß 35 in einer Menge eingespritzt, die ausreichend ist, um die Zellen in der eingespritzten Probelösung sich mit einem vorbestimmten Vermehrungsfaktor entwickeln zu lassen, der, wie weiter unten erläutert, 4 beträgt. Außerdem reicht bei diesem Beispiel die Menge der Nährlösung aus, damit die unterste Einsaatplatte 31 in die Nährlösung eingetaucht ist, und ist die Menge der Saatzellen so gewählt, daß sie etwa ein Viertel der Fläche der Oberseite dieser Einsaatplatte 31 bedecken. In diesem Falle ist daher die Züchtung beendet, sobald die Zellen an der Oberseite der untersten Einsaatplatte 31 eine dicht gepackte Monoschicht bilden. Die Zellen lassen sich an der Oberseite der Einsaatplatte 31, die beispielsweise aus Titan, Polytetrafluoräthylen oder Hartglas hergestellt ist, leicht einsäen, wogegen sie sich an der Unterseite der Einsaatplatte 31 und an der Bodenplatte 30a des Kulturgefäßes 30 kaum ausstreichen lassen. Das Kulturgefäß 30 ist aus einem Werkstoff, beispielsweise rostfreiem Stahl, an dem die Zellen kaum eingesät werden können. Eine Zellenkolonie, die sich an der Unterseite der Einsaatplatte 31 und an der Bodenplatte 30a entwickelt hat, kann daher vernachlässigt werden.

5) Der Motor 33 wird eingeschaltet, um die Einsaatplatte 31 zu drehen und die Zellen in der Nährlösung gleichmäßig zu verteilen.

6) Die Züchtung bei stationär gehaltener Kultur wird durchgeführt durch Beibehalten der richtigen Gasatmosphäre, Temperatur und Feuchtigkeit im Kulturgefäß 30 und des richtigen p_H-Wertes der Nährlösung und bis sich die

030020/0892 ^¹¹

⁵²

Zellen über der gesamten Oberseite der untersten Einsaatplatte 31 angesiedelt und vermehrt haben.

7) Mit der Abtastvorrichtung für den Vermehrungsstatus wird die Vermehrung der Zellen über die gesamte Einsaatplatte 31 festgestellt.

8) Mit der Pumpe 52 und dem Ventil 53 wird über den Flüssigkeitsauslaß 51 die alte Nährlösung entfernt.

9) Mit der Pumpe 46, dem zugehörigen Ventil und Filter und der Vorwärmevorrichtung 44 wird über den Einlaß Pufferlösung aus dem entsprechenden Behälter 42 eingespritzt, um die Zellen, die sich angesiedelt und entwickelt haben, damit zu waschen. Danach wird die Lösung auf demselben Weg wie beim Arbeitsschritt (8) ausgeleitet.

10) Mit äsr Pumpe 47, dem zugehörigen Ventil und Filter und der Vorwärmevorrichtung 44 wird über den Einlaß 35 Enzymlösung, beispielsweise Trypsin, aus dem entsprechenden Behälter 43 eingespritzt, um das Ablösen der sich angesiedelt und vermehrt habenden Zellen von der Einsaatplatte 31 zu erleichtern. Danach wird die Lösung auf demselben Wege wie beim Arbeitsschritt (8) ausgeleitet.

11) Auf demselben Wege wie beim Arbeitsschritt (4) wird aus dem Behälter 41 Nährlösung in das Kulturgefäß 30 eingespritzt, während der Motor 33 eingeschaltet ist, um die Einsaatplatte 31 mit hoher Geschwindigkeit zu drehen. Dadurch werden die angesiedelten Zellen von der Einsaatplatte 31 abgelöst, bewegt, getrennt und in der Nährlösung dispergiert. In diesem Falle wird die Menge der Nährlösung auf das 4fache der im Arbeitsschritt (δ) entfernten Nährlösungsmenge erhöht, da als Vermehrungs- oder Wachstumsfaktor der Faktor 4 gewählt ist, oder die Nährlösung wird mit der 4fachen Menge eingespritzt und bewegt. Eine vorteilhafte andere Möglichkeit besteht darin, die Zellen mit einer geringeren Menge der Nährlösung zu bewegen und die Restmenge

030020/0892

/12

■Ρ

52

Nährlösung dann danach einzuspritzen. Dabei sind dann die untersten vier Einsaatplatten 31 in die Lösung eingetaucht.

12) Die Zellenaufschlämmung im KuItürgefaß 30 wird über den Flüssigkeitsauslaß 51, die Pumpe 52, das Ventil 54, die Vorwärmevorrichtung 44 und den Einlaß 35 umgewälzt.

13) Die Arbeitsschritte (6) bis (12) werden nacheinander wiederholt, wobei die Zellen an allen 64 Einsaatplatten 31 eingesät und vermehrt werden.

14) Die Arbeitsschritte (8) bis (12) werden nacheinander wiederholt, und die Zellenaufschlämmung, die eich in einem vorbestimmten Maße vermehrt hat, nämlich, beim gezeigten Beispiel, um das 256fache der anfänglichen Zellenmenge, wird auf demselben Wege rückgewonnen. Außerdem entspricht in diesem Falle die Menge der Nährlösung etwa dem Ifachen Betrag des Vermehrungsfaktors.

Gemäß dem vorstehend beschriebenen Beispiel wird die Zellenaufschlämmung nach der Vermehrung durch das Kulturgefäß 30 umgewälzt, so daß die Bewegung zwangläufiger und der p„-Wert der Nährlösung einheitlicher wird. Ferner wird als Sterilisiergerät ein Äthylenoxidgaserzeuger o.dgl. verwendet, so daß sich die Sterilisierung bequem und vorteilhaft durchführen läßt.

Mit der vorstehend beschriebenen Brutvorrichtung werden Zellen in aufeinanderfolgenden Arbeitsschritten in ein und demselben Kulturgefäß vermehrt, so daß nicht nur die aufeinanderfolgenden Entwicklungsschritte durchgeführt werden können, sondern auch die Vorrichtung mit kleinen Abmessungen und einfachem Aufbau ausbildbar ist. Folglich läßt sich mit einer einzigen Vorrichtung aus einer kleinen Menge Zellen eine große Menge Zellen kontinuierlich darstellen, wird die Steuerung vergleichsweise einfach und läßt sich auch eine Automatisierung leicht durchführen. Ferner werden die Zellen im Verlaufe der aufeinanderfolgenden Entwicklungsschritte

030020/0892 /13

'- if , 52

nicht aus dem Kulturgefäß herausgenommen, bo daß ohne Gefahr einer Kontamination homogene Zellen erhalten werden können.

Die Vorrichtung kann eine Vielzahl von Einsaatplatten aufweisen, die schirmförmig mit schräger Fläche ausgebildet sind. Daneben ist es von Vorteil, wenn die Zellen durch Drehen der Einsaatplatten mit kleiner Geschwindigkeit vermehrt werden. Durch Bewegen und Drehen in der Nährlösung können auf diese Weise die an der Oberseite der Einsaatplatten anhaftenden Zellen stets mit einer neuen Nährlösung in Berührung gebracht werden. Folglich läßt sich der Wachstumseffekt verbessern. Ferner ist es nicht immer notwendig, nach dem Trennen und Dispergieren der sich vermehrt habenden Zellen in einer neuen Nährlösung die Z eil enauf schlämmung umzuwälzen. Außerdem ist der Vermehrungsgrad nicht auf das 4fache beschränkt, sondern es kann jeder beliebige Wachstumsfaktor, wie z.B. 2, 8 o.dgl., gewählt werden, und es besteht die Möglichkeit, die Anzahl der Einsaatplatten dementsprechend zu ändern. Ferner läßt sich die Zellenaufschlämmung aus dem Kulturgefäß rückgewinnen, sobald sich die Zellen auf eine beliebig festgelegte Menge vermehrt haben.

030020/0892

-Mi -

L e e r s e i t e

Claims

DR.-INC. FRANZ VUESTHOFF PATENTANWÄLTE DR ,„,,_. FBEDA vuesthoff WUESTHOFF-v.PECHMANN-BEHRENS-GOETZ d.fl-.ng.ge.mard puls DlPL-CHIM. DR. E. PKEIHERB TON FBCHMAMM FKOFBtSlONAI. KIrKBtBNTATIVES BEFORE THE EUKOrEAN PATENT OFFICE DK.-ING. DIETER BEHRENS MANDATAIRBS AGREES PRES l'OFFICB EUROFEIN DBS BREVETS DIPL.-ING.; DIFL.-VIRTSCH.-ING. KUPEBT GOBTX D-8000 MÜNCHEN 90 1 —52 984 SCHWEIGERSTRASSE 2 ———^-— telefon: (089) 6610 ji telegramm: frotbctfatent Telex: {14070 Ansprüche

1. Verfahren zum Züchten von biologischen Substanzen, beispielsweise von Geweben, Zellen, Vakzinen, Viren u.dgl., in einem im wesentlichen geschlossenen Kulturgefäß mit einer Einsaatfläche, dadurch gekennzeichnet, daß

a) in das KuI tür ge faß (30) eine vorgegebene kleine Menge biologischer Substanzen zusammen mit einer vorgegebenen Menge einer Nährlösung so hoch eingefüllt wird, daß ein im voraus festgelegter Abschnitt der Einsaatfläche (Einsaatplatte 31 ) in die Nährlösung eingetaucht ist, in der die biologischen Substanzen dispergiert sind,

b) die biologischen Substanzen an dem eingetauchten Abschnitt der Einsaatfläche (31) vermehrt werden, wobei die Atmosphäre im Innern der Kulturgefäßes (30) in einer gewünschten Weise gesteuert wird,

c) in das Kulturgefäß (30) ein Agens eingeführt wird, das das Ablösen der vermehrten biologischen Substanzen vom eingetauchten Abschnitt der Einsaatfläche (31) erleichtert und danach ausgeleitet wird, und

d) in das Kulturgefäß (30) eine Nährlösung eingeführt wird, um die abgelösten biologischen Substanzen darin gleichmäßig zu dispergieren,

wobei die Arbeitsschritte (b), (c) und (d) nacheinander wiederholt werden und dabei die Menge der in das Kulturgefäß (30) einzuführenden Nährlösung entsprechend einem Vermehrungegrad der biolgoischen Substanzen allmählich erhöht und die Fläche des in die Aufschlämmung einzutauchenden Abschnitts der Einsaatfläche (31) allmählich vergrößert wird.

030020/0892 _/2

- 2 - 52

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Arbeitsschritten (b) und (c) die benutzte Nährlösung ausgeleitet wird und die vermehrten Substanzen mit einer Pufferlösung gewaschen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Agens zur Erleichterung des Ablösens der vermehrten Substanzen von der Einsaatfläche (31) ein Enzym verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Arbeitsschritten (c) und (d) die Einsaatfläche (31) mechanisch bewegt wird, um das Ablösen der vermehrten Substanzen von ihr zu fördern.

5 · Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Arbeitsschritten (b) und (c) der Vermehrungsstatus der biologischen Substanzen, die an der Einsaatfläche (31) gezüchtet worden sind, festgestellt wird.

6. Verrichtung zum Züchten von biologischen Substanzen, beispielsweise von Geweben, Zellen, Vakzinen, Viren u.dgl., gekennzeichnet durch ein Kulturgefäß (30), das einen im wesentlichen geschlossenen Kulturraum bildet, eine Welle (32), die im Kulturgefäß (30) um eine ungefähr vertikale Achse drehbar angeordnet ist, eine Vielzahl von scheibenähnlichen Einsaatplatten (31)» die an der Welle (32) im wesentlichen waagerecht und mit vertikalem Zwischenabstand befestigt* sind, einen Auslaß (51) am unteren Teil des Kulturgefäßes (30), einen Einlaß (35) am oberen Teil des Kulturgefäßes (30), eine Flüssigkeitaubertragungsvorrichtung zum wahlweisen Ein- und Ausleiten einer Flüssigkeit in und aus dem Kulturgefäß (30) über den Einlaß, (35) bzw. den Auslaß (51), und eine Vorrichtung (Motor 33) ?um wahlweisen Drehantreiben der Welle (.32.) und der Einsaatplatten (31) um die vertikale Achse.

030020/0892

■λ /3

- 3 - 52

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung zum Überprüfen des Zustandee der an den Einsaatplatten (31) vermehrten biologischen Substanzen vorgesehen ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung zum Umwälzen der
Flüssigkeit im Kulturgefäß (30) durch den Einlaß (35) und den Auslaß (51) vorgesehen ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwälzvorrichtung eine Pumpe (52) aufweist, deren Einlaß über ein Rohr mit dem Auslaß (31)
und der Auslaß über ein Rohr mit dem Einlaß (35) verbunden ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß eine Vorrichtung (Beobachtungsgerät 56) vorgesehen ist zum Peststellen der biologischen Substanzen, die in der durch das Rohr strömenden Nährlösung dispergiert sind.

11. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorwärmevorrichtung (44) vorgesehen ist zum Erwärmen der Flüssigkeit, die über den
Einlaß (35) in das Kulturgefäß (30) eingeleitet werden soll.

12. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturgefäß (30) aus einem Werkstoff ist, an dem sich die biologischen Substanzen schlecht einsäen lassen, und die Einsaatplatten (31) aus einem
Werkstoff sind, auf dem sich die Substanzen ohne weiteres in eine Honoschicht ausstreichen lassen.

13· Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung (38) zum Sterilisieren des Innenraumes des Kulturgefäßes (30) und der Einsaatplatten (31) vorgesehen iat.

030Ό20/&892

- 4 - 52

14. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung (Ventil 36) zum
Steuern einer Gasatmosphäre im Innern des Kulturgefäßes
(30) vorgesehen ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung (Temperatursteuergerät 55) zum Steuern der Temperatur im Innern des Kulturgefäßes (30) vorgesehen ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch g e k e η η zeichnet, daß eine Vorrichtung (Zylinder 50,
Ventil 36) zum Steuern eines p„-Wertes der Nährlösung
vorgesehen ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß am oberen Teil des Kulturgefäßes (30) ein Auslaß (37) zum Ausleiten des Gases aus dem Kulturgefäß (30) vorgesehen ist.

&3QQ20/0&92