WO2005059091A1

WO2005059091A1 - 細胞培養装置

Info

Publication number: WO2005059091A1
Application number: PCT/JP2004/018730
Authority: WO
Inventors: Tsutomu Suzuki; Hiroshi Inomata; Yoshihiro Komori; Hiroshi Tachikui; Naruo Watanabe; Satoshi Ozawa; Yuji Oka; Minoru Ueda; Yasushi Nomura; Isao Shindo
Original assignee: Hitachi Medical Corporation
Priority date: 2003-12-18
Filing date: 2004-12-15
Publication date: 2005-06-30
Also published as: CN1894397B; US7754478B2; EP1696024B1; JP5285666B2; KR20070006680A; JP2010268813A; US20070148764A1; EP1696024A4; KR101139090B1; JPWO2005059091A1; EP1696024A1; CN1894397A

Abstract

本発明は、数日から数ヶ月間にも及ぶ培養に伴う操作をコンタミネーションのリスクを極力排除して自動的に行うことができるようにすることを課題とする。保温箱手段に配置された培養器手段を保温箱から取り出すことなく、薬品供給手段を用いて新たな薬品を培養器手段に供給したり、廃液排出手段を用いて不要な廃液を培養器手段から排出したりできると共に培養状態の観察を保温箱手段内に培養器手段を収納した状態で行なうことができるので、培養中は培養器手段内に直接外気が混入することがなくなり、コンタミネーションのリスクは皆無となり、培養操作を長期間に渡って自動で行なうことが可能となる。

Description

技術分野

[0001] 本発明は、細胞を培養する細胞培養装置に係り、特に、数日から数ケ月間にも及ぶ培養に伴う操作を自動的に行うことのできる細胞培養装置に関する。背景技術

[0002] 細胞培養は、培養器内の培地の交換や、細胞密度を適正にするための再播種な明

どといった煩雑な継代プロセスが手作業により行われている。通常、これらの作業は、田

コンタミネーシヨンなどの発生を回避するため、半導体製造分野で培われたクリーン環境生成技術により大気中の浮遊微粒子濃度を抑制した比較的清浄な雰囲気で注意深く行われる。しかし、この清浄な雰囲気でもコンタミネーシヨンを回避するには十分ではなぐ培養器として通常用いられる円形シャーレで細胞を培養する場合、培地交換の際にはシャーレの蓋を持ち上げるように上方にかざして菌が混入しないよう注意を払いながら、ピぺッタをシャーレとその蓋のすきまに、かつピぺッタがシャーレの縁など周囲のものに触れないようすばやく揷入するといつたように煩雑で難しい作業を必要としていた。このような作業は、頻繁かつ日常的に行われ、通常非常に熟練した作業者が行う。

特許文献 1 : USP5, 985, 653

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0003] 上述のように培養作業は、煩雑にもかかわらず手作業で行われているのが現状であり、また、熟練作業を必要とするものであるため、容易に実施し難いものであった。

[0004] 特に、近年、再生医療用の技術開発が盛んに行われているが、組織を構築するための幹細胞の培養などといった場合、培養した細胞は被検者に移植されるので、培養中の異物混入（コンタミネーシヨン）の可能性は 0%を保証しなければならなレ、。し力、しながら、クリーン環境生成技術は、大気中の浮遊粒子濃度を抑制するものであつて、様々な規格（日本工業規格など）によって、その濃度許容値に応じクラス分類される力その環境内には様々な電気や機械類の部品が配されるのが普通であり、実質的に微粒子の数 0ケを保障することは極めて難しい。細胞培養などに要求されるコンタミネーシヨン回避のための要件は、細胞に混入する生きた菌の数を 0ケとすることであり、たとえ 1ケの微粒子であってもそれが菌であればコンタミネーシヨンを引き起こす。このように、クリーン環境生成技術はリスク低減には有効ではある力コンタミネーシヨン回避を確実化できないとレ、う課題があった。

[0005] また、複数の被検者細胞を距離的に近い、具体的には 1つの部屋で培養を行うことは、クロスコンタミネーシヨンの点でもリスクが高くなる。何らかの要因で被検者の細胞が菌類 (例えばカビ）が混入してコンタミネーシヨンをおこした場合、胞子が拡散し他の被検者細胞に伝染する可能性を捨て去ることは困難である。たとえば、 USP5, 98 5, 653 (特許文献 1)では、播種の均一化のために揺動手段が備わった培養装置を開示するが、完全に閉鎖されてはいないため、コンタミネーシヨンのリスクが残っていた。

以上のように細胞培養作業は、量産化と安全性の両立化の点で大きな課題を有していた。

[0006] この発明の目的は、数日から数ケ月間にも及ぶ培養に伴う操作をコンタミネーシヨンのリスクを極力排除して自動的に行うことのできる細胞培養装置を提供することにある課題を解決するための手段

[0007] 本発明の細胞培養装置の第 1の特徴は、細胞を培養する培養器手段と、前記培養器手段を培養に適した状態に配置する保温箱手段と、前記培養器手段を前記保温箱手段内で回動させる駆動手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段に前記保温箱手段の外側から未使用の薬品を供給する薬品供給手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段から不要な廃液などを前記保温箱手段の外側に排出する廃液排出手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段の細胞培養の状態を前記保温箱手段の外側力観察できる培養状態観察手段とを備えたことにある。

このように保温箱手段に配置された培養器手段を保温箱から取り出すことなぐ薬品供給手段を用いて新たな薬品を培養器手段に供給したり、廃液排出手段を用いて不要な廃液を培養器手段力排出したりすることができると共に培養状態の観察を保温箱手段内に培養器手段を収納した状態で行なうことができるので、培養中は培養器手段内に直接外気が混入することがなくなり、コンタミネーシヨンのリスクは皆無となり、培養操作を長期間に渡って自動で行なうことが可能となる。

[0008] 代表的には、本発明は以下の諸態様を有する。

[0009] (1) 細胞を培養する培養器手段と、前記培養器手段を培養に適した状態に配置し所定温度に保持する保温箱手段と、前記培養器手段を前記保温箱手段内で回動させる駆動手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段に前記保温箱手段の外側から未使用の薬品を供給する薬品供給手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段力不要な廃液を前記保温箱手段の外側に排出する廃液排出手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段の細胞培養の状態を前記保温箱手段の外側から観察する培養状態観察手段とを備えた、閉鎖系細胞培養装置。

[0010] (2) 前記培養器手段と前記薬品供給手段との間に、ポンプ、弁および可撓性管部材が設けられ、細胞を供給し培養し回収する、（1)の細胞培養装置。

[0011] (3) 前記培養器手段は、中央部が平滑（多少の凹凸を有していてもよい）で透明な非毒性の材料力もなる容器である、 (1)の細胞培養装置。

[0012] (4) 前記透明な非毒性の材料が、ポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートである、（3)の細胞培養装置。

[0013] (5) 前記培養状態観察手段がカメラを備えた、（1)の細胞培養装置。

[0014] (6) 前記カメラを前記培養器手段の全面にわたり走査させ、かつ、前記細胞培養器手段内のピントを光軸方向に設定可能なカメラ移動手段を備えた、 (5)の細胞培養

[0015] (7) 前記カメラの前記培養器手段上の撮影位置を記憶する記憶手段を備え、前記カメラ移動手段は前記記憶手段に記憶されたと同じ撮影位置の再現をする、 (6)の

[0016] (8) 外部を閉塞部材にて封止された細管を備え、前記細管は細胞の供給口または回収口であり、細胞を収納する容器を備え、前記容器の上部には殺菌剤含浸部材が備えられ、前記細管は前記容器内に前記殺菌剤含浸部材を貫通後挿入される（1 )、（2)、（5)のいずれかの細胞培養装置。

[0017] (9) 前記保温箱手段内に雰囲気を供給するガスボンベを備え、前記弁は前記ガスボンベのガス圧を駆動源として開閉されることを特徴とする（2)の細胞培養装置。

[0018] (10) 前記ポンプの動作時間で薬品供給手段から前記培養器手段に供給される薬品の量を決定する薬品量決定手段を有する、（2)の細胞培養装置。

[0019] (11) 前記廃液排出手段が、可撓性管部材、ポンプおよび廃液タンクからなり、そのいずれかに _PH測定部を備えた（1)の細胞培養装置。

[0020] (12) pH測定部が、 pHの変化により色が変化する物と、その物の色を読み取る受光素子を有することを特徴とする（11)の細胞培養装置。

[0021] (13) 細胞の培養手順として、細胞の供給、培養器手段の回動、薬液の供給、廃液および細胞供給回収のタイミングと内容を記憶して実行する制御手段を備えた、 (2) の細胞培養装置。

[0022] (14) 前記制御手段は前記細胞培養装置を複数稼動する場合に他の制御手段と培養情報を交換するインターフェイスを有する、 (13)の細胞培養装置。

発明の効果

[0023] 本発明によれば、数日から数ケ月間にも及ぶ培養に伴う操作をコンタミネーシヨンのリスクを極力排除して自動的に行うことができるという効果がある。

発明を実施するための最良の形態

[0024] 以下、本発明を適用してなる細胞培養装置の実施の形態について図面を参照して説明する。図 1は、本発明を適用してなる細胞培養装置の基本構成を示すブロック図である。

[0025] 培養器 1は、細胞を培養する容器であり、ポンプ 3及び可撓性管部材 2を介して未使用の薬品が注入されたリザーブタンク 4に接続されている。廃液タンク 7は、使用済みの薬品を貯めるものであり、ポンプ 6及び可撓性管部材 5を介して培養器 1に接続されている。駆動手段 8は、培養器 1を回動させるものである。カメラ 9は、培養器 1を透過した光源 10から発した光により、中の培養細胞を観察する。システムコントローラ 11は、ポンプ 3、ポンプ 6、駆動手段 8、カメラ 9、光源 10に接続され、これらポンプ 3、ポンプ 6、駆動手段 8、カメラ 9、光源 10を制御する。 [0026] 図 2は、本発明を適用してなる細胞培養装置の機構部の詳細図であり、図 1におけるシステムコントローラ 11を省いた実際の構成を示している。培養器 38は、透明な非毒性の材料、好ましくはポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートで形成されてレ、ることが望ましい。培養器 38の本体 15の表面にはガス透過膜 16が貼ってある。培養器 38の表面は、細胞が付着しやすいように親水性を持つように改質されていると良レ、。培養器 38の略中央には薬品注入のためのチューブ接続部材 19を設けられ、培地 17などの薬品を培養器 38内部に流し込む働きをする。この時、傾斜部 381が各種液体の落下の衝撃を和らげて培養細胞へのダメージを防レ、でレ、る。

[0027] 培養器 38の底面には細胞が接着してそこで培養が行なわれる。チューブ接続部材 18は細胞の老廃物が溶出し、培地中の栄養素が少なくなつた古い培地を排出する排出口である。培養器 38は、ロータ 22上に固定され、このロータ 22は下方にてカムフォロア 27にて矢印 E方向に回転できるよう、例えば、円周方向 3箇所で自在に支持される。さらに、ロータ 22の下方にはインターナルギア（図示せず）を形成し、このギァは、保温箱（フレーム） 30に固定した培養器駆動モータ 29の出力軸に勘合したピ二オン 28と嚙みあう。ケーブルドラム 25は、ロータ 22に設けられたピンチ弁 24の配線を卷く。卷き取りドラム 26は、ロータ 22が回転してもピンチ弁 24の配線を卷き取り、配線が緩むことにより、他の突起物に絡まないように自動的に配線を卷き取るようになっている。例えば、ばねを利用し定常的にケーブルに張力を与えることで実現できる。

[0028] 供給チューブ 21は、培養器 38の略中央に設けられたチューブ接続部材 19に接続されている。ガイド部材 35は、供給チューブ 21をガイドするものである。この供給チューブ 21は、ガイド部材 35の上方に設けられたチューブ固定部材 36にてフレーム 30 に固定され、このチューブ固定部材 36からチューブ接続部材 19までの間のチューブは、ガイド部材 35の内部を自由に動くようになつている。

[0029] 培地タンク 67は未使用の培地を貯留し、緩衝液タンク 68は緩衝液を貯留し、細胞剥離剤タンク 69， 70, 71は糸田胞录猜隹斉 1Jを貝宁留してレヽる。各タンク 67， 68, 69, 70, 71は、断熱箱 80内に設けられてレヽる。ピンチ弁 72， 105, 73, 74， 75は、各タンク 6 7, 68, 69， 70, 71力、らの送夜を制卸するものである。また、ピンチ弁 66は、後述する培養前細胞の注入を制御するものである。空気流入口 78, 79は、チューブ内の液溜まりを防止するために大気中の空気を導入するものであり、大気中の不純物を取り除くためのフィルタ（目の大きさは 0. 2 μ ΐη以下が望ましい）を備えている。各タンク 6 7, 68, 69， 70, 71から取り出されるチューブは、前述した供給チューブ 21に接続され、しごきポンプ 37で送液できるようになつている。しごきポンプ 37は、ローラでチューブを挟み込み、そのローラを回転することによりチューブ内の液を送り出すポンプである。

[0030] 廃液チューブ 23は、培養器 38の底面に設けられたチューブ接続部材 18に接続され、ガイド部材 99によりフレーム 30外にガイドされる。このガイド部材 99の下部には、チューブ固定部材 100が設けられており、このチューブ固定部材 100によって廃液チューブ 23は固定され、かっこのチューブ固定部材 100とチューブ接続部材 18との間では廃液チューブ 23は、自由に動くようになつている。細胞の老廃物が溶出し、培地中の栄養素が少なくなることによって生成される古い培地は、しごきポンプ 101により廃液チューブ 23を通って、廃液回収箱 98内の廃液タンク 102に貯留される。ピンチ弁 103は、廃液タンク 102への送液を制御し、ピンチ弁 104は、廃液をしごきボンプ 101で廃液タンク 102へ送液する際の送液状態を制御するものである。

[0031] シャッターモータ 50は、フレーム 30の右側面に設けられた開口部をシャッター 51 で開閉するものであり、その回転軸にシャッター 51に接続されたワイヤが卷回されている。シャッターモータ 50の回転を制御することによりシャッター 51を矢印 A方向（図面上の上下方向）に移動できるようになっている。培養前細胞を貯留する容器 52は、ホルダー部 62に支持される。ホルダー 62は、送りねじを有したモータ 63によって矢印 B方向（図面上の左右方向）に移動できるようになつている。容器 52の上面にはゴム材が設けられ、外気からカバーされている（図示略)。針 53は、細胞注入チューブ 5 6に接続され、ピぺッターアーム 55に固定されている。ピぺッタアーム 55は、軸 54に支持され、ピぺッタ回転動モータ 57により矢印 D 1方向に回転できるようになつている。回転部材 58は、軸 54と共に回転する部材であり、ピぺッタ上下動モータ 59とプーリ 60を備えている。ピぺッタ上下動モータ 59の出力軸に固定されたプーリとプーリ 60 はベルト 61により連結され、そのベルト 61の一部は軸 54と固定されている。 [0032] ピぺッタ上下動モータ 59の駆動により、軸 54は上下動作するようになっている。ピンチ弁 66は、培養前細胞をしごきポンプ 37で送液する際、送液状態を制御するものである。なお、ピぺッタアーム 55には針 39が固定されており、その一端にはエアーフィルター 40が設けられている。この針 39の機能は、容器 52が硬質のプラスチック材料で形成された場合において、内部が印圧になって細胞が吸引しにくくなるのを防止するものである。なお、培養前細胞は、しごきポンプ 37により吸引されると説明した力針 39から容器 52に空気を圧送することによって送液するようにしてもよい。

[0033] シャッターモータ 81は、フレーム 30の左側面に設けられた開口部をシャッター 82 で開閉するものであり、その回転軸にシャッター 82に接続されたワイヤが卷回されている。シャッターモータ 81の回転を制御することによりシャッター 82を矢印 F方向（図面上の上下方向）に移動できるようになつている。培養後細胞を貯留する容器 84は、ホルダー部 93に支持される。ホルダー 93は、送りねじ 95を有したモータ 94によって矢印 G方向（図面の左右方向）に移動できるようになっている。容器 84の上面にはゴム材が設けられ、外からカバーされている（図示略)。針 83は、細胞注入チューブ 84 に接続され、ピぺッタアーム 85に固定されている。ピぺッタアーム 85は、軸 87に支持され、ピぺッタ回転動モータ 88により矢印 D2方向に回転できるようになつている。回転部材 89は、軸 87と共に回転する部材であり、ピぺッタ上下動モータ 90とプーリ 91 を備えている。ピぺッタ上下動モータ 90の出力軸に固定されたプーリとプーリ 91はべノレト 92により連結され、そのベルト 92の一部は軸 87と固定されている。

[0034] ピぺッタ上下動モータ 90の駆動により、軸 87は上下動作するようになっている。ピンチ弁 103は、培養後細胞をしごきポンプ 101で送液する際、送液状態を制御するものである。なお、ピぺッタアーム 55には針 41が固定されており、一端にはエアーフィルター 42が設けられている。この針 41の機能は、容器 84が硬質のプラスチック材料で形成された場合において、内部が陽圧になって細胞が吐出しにくくなるのを防止するものである。なお、培養後細胞は、しごきポンプ 101により送液されると説明したが、培養器 38に空気を圧送することによって、送液するようにしてもよい。

[0035] 光源 34は、フレーム 30の下側からフレーム 30内に光を供給するものであり、光の出射側にフィルター 33を備えている。 CCDカメラ 31は、レンズを備えており、フレーム 30の上側に設けられた観察窓 32から培養器 38にて培養される細胞を観察したり、継代時のタイミングを判定したりするのに利用されるものである。光源 34は、画像の輝度ムラを防止するために複数の LEDをフラットに配置したタイプのものが好ましレヽ力光量が十分であるならば 1つの LEDもしくはランプで構成してもよレ、。また、フィノレター 33は、 CCDカメラ 31に入射する光量を低減するため NDフィルター、及び細胞観察に適したコントラストを得るため適当なバンドパスフィルターから構成される。このフィルタ一は、 CCDカメラ 31の前面に設けても良レ、。 NDフィルタ一は、 CCDカメラ 31の前面に、またバンドパスフィルタ一は細胞に害を与える短波長光をカットするものの場合は光源 34の前面の方が好ましレ、。ヒータ 108は、温度センサ 106からの検知温度に基づいてフレーム 30の内部を一定の温度に保つものである。ファン 65は、フレーム 30内の空気を攪拌するものである。スタンド 96, 97は、この細胞培養装置全体を床面に立設させるものである。継ぎ手 107は、二酸化炭素と窒素と酸素の割合を制御した混合気体を供給する際の不純物を除くためのフィルターを備えている。

[0036] 培養器 38の上面に貼ったガス透過膜 16は、全面を覆うように図示したが、部分的に設けてもよい。なお、培地の蒸発を防止するため、フレーム 30内部の湿度を上げた方が良いのは言うまでもなレ、。この場合、水を入れたトレーを内部に配置するのが容易かつ効果的である。培養器 38の前面をガス透過膜 16で覆わない場合には、継ぎ手 107から供給される混合気体を直接培養器 38の内部に供給するようにしてもよいし、また培地などに溶け込ませても良い。

[0037] また、フレーム 30は、概ね全体を覆う形体とした力培養器 38の周辺部分のみ覆う構造としても良レ、。すなわち、 2組のピぺッタはフレーム 30の一部として左右に設けられる場合について説明した力フレーム 30とは別個に構成して、フレーム 30の外部に 2組のピぺッタを配置するようにしても良い。

[0038] 図 3は、図 2の培養器 38の詳細構成を示す図である。図 3 (a)は図 2の培養器 38を上面から見た平面図であり、図 3 (b)はその側断面図である。図 3 (a)において、チューブ接続部材 19は、培養器 38の円中心から距離 L1だけ離れた位置に回転中心付近に設けられている。古い培地を排出するチューブ接続部材 18ゃ堰 20の位置と形状は、変形例 112， 113, 114のようにしても良レ、。変形例 112は、堰 20を省略したものであり、変形例 113は、チューブ接続部材 18が培養器 38の側面に設けられているものであり、変形例 114は、チューブ接続部材 18の開口部が培養器 38の底面に接するように設けられているものである。

[0039] 変形例 112, 114は、培養器 38の回転に伴う遠心力によって、細胞がチューブ接続部材 18の開口部以外のくぼみ部分に凝集することがあるので、この点では変形例 113が遠心力によって、細胞を培養器 38外に排出することができるので、より好ましレ、。なお、このチューブ接続部材 18の位置は、培養器 38のどこに配置してもよぐ特に限定はしない。また、距離 L1も特に限定されるものではない。但し、培養器 38の円中心と回転中心は、ずらした方が細胞の均一播種の点で好ましい。チューブ接続部材 18の位置を、たとえば培養器 38の円中心付近に配置することによつても細胞の凝集を避けることができる。

[0040] ここで回動とは、回転、偏心回転、平行移動、往復平行移動のうち少なくとも一つとこれらの組み合わせを含むものであり、特に細胞や液の攪拌や均一化に有用な動作のことである。例えば、培地や中和済み細胞剥離剤の培養器からの排出は、培養器を傾斜動作させても良い。また、培養器内の細胞の均一播種は、培養器を振動させてもよレ、。手作業による細胞培養では、培養器を 8の字の軌跡を描かせるように動作させることで均一に播種することができる。このように回転動作が最もシンプノレでかつ構成することも容易であるが、回転に限定する必要はなぐ様々な並進動作、または回転と並進動作の組み合わせで対応してもよレ、。

[0041] 図 4は、図 2の細胞培養装置の制御ブロック図の詳細を示し、複数の細胞培養装置を接続してそれをプラントイ匕した場合を示すブロック図である。図 2の細胞培養装置は、図 4では大きなブロック 127で示される。各ピンチ弁 24， 66, 72, 73, 74, 75, 7 6, 77, 103， 104、温度センサ 106、ヒータ 108、ファン 65、しごきポンプ 37， 101、容器移動モータ 94， 63、培養器駆動モータ 29、ピぺッタ上下動モータ 59、ピぺッタ回転動モータ 57、ピぺッタ上下動モータ 90、ピぺッタ回転動モータ 88、シャッターモータ 50、 81などは、それぞれ I/O 120を介してノス 121に接続される。また、 CCD カメラ 31は、画像取り込みボード 250と I/O 120を介してバス 121に接続される。ノス 121に fま、 CPU122,操作卓 123、操作器 126、メモリ 124、コンピュータネットワークドライバ 125が接続されてレ、る。

[0042] 図 4においては、コンピュータネットワークが外部に配設されており、このコンビユータネットワークに細胞培養装置 127及びこれ以外の複数の細胞培養装置 128, 129 が接続され、さらに、このコンピュータネットワークに接続された制御監視装置 130によって、これら複数の細胞培養装置 127, 128、 129がそれぞれの離れた所から監視され、制御されるようになってレ、る。制御監視装置 130は、汎用のパーソナルコンビュータで対応可能である。なお、コンピュータネットワークの場合は、双方向のデータ通信手段であれば特に限定しない。また、単に細胞培養装置の状態を離れた所から認識する目的ならば、片方向のデータ通信手段で良い。このコンピュータネットワークに接続する細胞培養装置の台数は特に限定しない。複数の細胞培養装置を利用する場合、データ通信手段により接続することにより、通常数週間もの長い時間を要す培養期間中、各細胞培養装置の状態を常に遠隔監視できるので、大規模な培養設備には好適である。

[0043] 制御監視装置 130の機能は、図 5において説明する細胞培養装置の動作を逐次監視し、異常時には外部に信号を発する機能を備えたものであり、現時点では公知の技テであるため、その詳細な説明は省略するが、監視機能は各培養装置が担ってもよレ、し、制御監視装置 130が請負ってもよい。例えば制御監視装置 130は、時分割で各細胞培養装置の動作を確認し、細胞各細胞培養装置が異常をおこした場合に、当該細胞培養装置を外部に知らしめる方法がもっとも容易である。

[0044] 図 5は細胞培養装置の動作を説明するためのフローチャートである。以下、図 1一図 5を参照して、細胞培養装置の動作を説明する。なお、図 4に示す CPU122、メモリ 124、バス 121は汎用コンピュータで用いられている技術であるので、以下それら C PU122、メモリ 124、バス 121の詳細動作は省略し、各ァクチユエータの動作のみ説明する。

[0045] ステップ S51 :「スタート」

細胞培養装置 127の動作開始であり、操作者が操作卓 123の操作器 126のスタートスイッチを押すことによってスタートする処理である。また、前述した図 4に示すように複数の細胞培養装置と制御監視装置がコンピュータネットワークに接続されている場合は、制御監視装置側でスタートスィッチを押すように構成してもよい。なお、この時点では既に培養器 38や、各タンク 67, 68, 69, 70, 71には薬品が培養装置 127にセットされている。

[0046] ステップ S52 :「培地注入」

ピンチ弁 72が開放され、しごきポンプ 37が動作して、培地タンク 67内の培地がチューブ 21を通って送液される。なお、後述するポンプ 101も同様である力 S、液量を計る手段を設けずにポンプの動作時間によって液量を決める。送液される培地は、矢印 J 1、矢印 Jの経路を通り培養器 38に流れ込み、培養器 38で培地 17となる。予め設定された量の培地が注入されたら、しごきポンプ 37の動作を停止し、ピンチ弁 72は閉じる。ここでの培地量の設定値は予めメモリ 124に記憶されている。

[0047] ステップ S53 :「容器 52の投入」

操作者が操作器の該当するスィッチを操作すると、シャッターモータ 50が動作し、シャッター 51が矢印 A方向（上昇方向）にスライドする。シャッター 51が所定量上昇した後、容器移動モータ 63が動作し、ホルダーが矢印 B方向（右方向）に移動する。この移動後、操作者は培養前細胞を入れた容器 52をホルダー 62に置く。その後、容器移動モータ 63は上記と逆方向に回転し、ホルダー 62は矢印 B方向（左方向）に移動する。シャッターモータ 50が回転し、シャッター 51は矢印 A方向（下降方向）に移動して、閉じる。

[0048] ステップ S54 :「ピぺッタを駆動させ細胞を培養器 38に移送」

容器移動モータ 63が小刻みに正逆回転し、容器 52内の細胞を懸濁する。詳細は述べないが、ホルダー 62内部に容器 52を振動させるァクチユエータを備えても良い。この動作と前後して、ピぺッタ回転動モータ 57が動作し、ピぺッタアーム 55が回転する。次にピぺッタ上下動モータ 59が動作し、ピぺッタアーム 55が下降して、容器 5 2内に針 53が揷入する。ピンチ弁 66が開放し、しごきポンプ 37が動作する。これにより、容器 52内の培養前細胞は吸いだされ、細胞は矢印 J2→J方向へチューブ 56を通つて、送液され、チューブ 21を通り、培養器 38に注入される。この注入終了後、ピンチ弁 66は閉じ、またしごきポンプ 37は停止する。

[0049] ステップ S55：「培養器をシャッフリングし、均一化'播種」モータ 28が回転し、培養器 38に注入した細胞を均一化 ·播種のため懸濁する。細胞の均一化'播種は、過度の細胞密度は細胞の変質を招く恐れがあるため、細胞培養を効率高く行うために必要な処理である。なお、培養前細胞の注入が確認された後にモータ 28が回転を始めるのではなぐ培養細胞が接着依存性細胞（固形物を認識してこの固形物に接着することにより培養する細胞）の場合、培養前細胞が培養器 38内部に注入されている最中に、モータ 28を回転させた方が良レ、。なお、ステップ S 55の次にはステップ S56に進む場合とステップ S58にジャンプする場合がある。ここではステップ S58にジャンプする場合で説明する。

[0050] ステップ S58 :「培養」

このステップでは、培養前細胞は培養に入ることになる力培養中は、温度センサ 1 06及びヒータ 108によりフレーム 30内は培養に適した温度（37°C前後）に制御されており、またファン 65によってフレーム 30内部の大気も攪拌されて、温度ムラがないようにしてある。

[0051] ステップ S56 :「培地を排出」

このステップは、ステップ S58を実行する前に適宜に実行できるステップであり、ピンチ弁 24と、ピンチ弁 104が開放され、しごきポンプ 101が動作して、培養器 38内の培地 17がチューブ 23を通って、廃液タンク 102に培地が送液 (排出）される。送液（排出）完了後、しごきポンプ 101が停止し、ピンチ弁 24と、ピンチ弁 104は閉じる。

[0052] ステップ S57 :「新しい培地を注入」

このステップも同様にステップ 6を実行する前に適宜に実行できるステップであり、ピンチ弁 72が開放し、しごきポンプ 37を動作させ、培養器 38内に新しい培地が注入される。この培地の注入後、ピンチ弁 72は閉じ、しごきポンプ 37は停止する。

[0053] ステップ S59：「継代のタイミングか？」

上記培養中において、予め時間を決めておいてもよいし、操作卓にスィッチを設けて、術者が動作を指示するようにしてもよいが、次のように画像を利用すると細胞の品質安定化に寄与する。適宜に光源 34が発光し、 CCDカメラ 31が培養器 38内で培養されている細胞の画像を取得する。培養初期段階の細胞は多くの箇所で密度が非常に低ぐ部分的に密な状態 (コロニー）を形成する場合が多い。そのコロニーを培養器駆動モータ 28の動作により CCDカメラ 31が捉え、計測する。このコロニー部分の細胞がコンフルェントに到達していなければ、引き続き培養される。コンフルェントか否かの判断は後述するステップ S60の細胞数感度と同じである。その時必要であれば、ステップ S56と S57の処理を行なってからステップ S58に進む。また、コンフルェントに到達していれば、継代のタイミングとレ、うことになり、次のステップ S60に進む

[0054] ステップ S60：「目標の細胞数か？」

CCDカメラ 31からの情報を元に細胞数をカウント又は演算する。その結果として、細胞数が予め操作者が設定した値に達していれば、ステップ S68に進み、目標細胞数に達してレ、なければ、ステップ S61に進む。

[0055] ステップ S61 :「培地を排出」

ステップ S61 ステップ S67の処理は、細胞数が予め操作者が設定した値に達していなかった場合に実行される処理である。まず、このステップでは、ピンチ弁 24とピンチ弁 104が開放され、しごきポンプ 101が動作して、培養器 38内の培地 17がチューブ 23を通って、廃液タンク 102に培地が送液 (排出）される。送液 (排出）完了後に、しごきポンプ 101が停止し、ピンチ弁 24と、ピンチ弁 104は閉じる。

[0056] ステップ S62 :「培養器を緩衝液で洗浄」

ピンチ弁 105が開放し、しごきポンプ 37が動作して、緩衝液タンク 68から緩衝液が培養器 38に注入される。注入後、ピンチ弁 105が閉じ、しごきポンプ 37が停止する。培養器駆動モータ 28が回転し、培養器 38を回動させ緩衝液を培養器底面に行き渡らせる。その後、ピンチ弁 24が開放し、しごきポンプ 101が動作して、廃液タンク 102 に培養器 38内の緩衝液を送液する。

[0057] ステップ S63 :「細胞剥離剤を注入」

ピンチ弁 73が開放され、しごきポンプ 37が動作し、細胞剥離剤タンク 69から細胞剥離剤が培養器 38に注入される。注入後、ピンチ弁 73が閉じ、しごきポンプ 37が停止する。培養器駆動モータ 28が回転し、細胞剥離剤を培養器底面に行き渡らせる。

[0058] ステップ S64 :「中和剤を注入」

ここでは中和剤を培地としている。上述の細胞剥離剤としては様々なものが利用されているが、ここでは培地には血清が含まれるものとして、この血清により中和される細胞剥離剤を想定している。従って、動作としては、上述のステップ S52と同様で、ピンチ弁 74を開放してタンク 70から中和剤が注入される。

[0059] ステップ S65：「培養器をシャッフリングし、均一化'播種」

ステップ S55と同一の処理が行なわれる。すなわち、モータ 28が回転し、培養器 38 に注入した細胞を均一化'播種のため懸濁する。そして、所定時間経過後すなわち細胞が接着した後に、次のステップ S66に進む。

[0060] ステップ S66 :「中和された細胞剥離剤を排出」

ピンチ弁 24とピンチ弁 104が開放され、しごきポンプ 101が動 102に培地が送液（排出）される。送液 (排出）完了後に、しごきポンプ 101が停止し、ピンチ弁 24と、ピンチ弁 104が閉じる。

[0061] ステップ S67 :「新しい培地注入」

ステップ S52と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁 72が開放され、しごきポンプ 37が動作して、培地タンク 67内の培地がチューブ 21を通って送液される。送液される培地は、矢印 Jl、矢印 Jの経路を通り培養器 38に流れ込み、培養器 38で培地 17となる。予め設定された量の培地が注入されたら、しごきポンプ 37の動作を停止し、ピンチ弁 72は閉じる。

[0062] ステップ S68—ステップ S71の処理は、細胞数が予め操作者が設定した値に達していた場合に実行される処理であり、上述のステップ S61—ステップ S64の処理と同じである。

[0063] ステップ S68 :「培地を排出」

ステップ S61と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁 24とピンチ弁 104が開放され、しごきポンプ 101が動作して、培養器 38内の培地 17がチューブ 23を通つて、廃液タンク 102に培地が送液 (排出）される。送液 (排出）完了後に、しごきポンプ 101が停止し、ピンチ弁 24と、ピンチ弁 104は閉じる。

[0064] ステップ S69 :「培養器を緩衝液で洗浄」

ステップ S62と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁 105が開放し、しごきポンプ 37が動作して、緩衝液タンク 68から緩衝液が培養器 38に注入される。注入後、ピンチ弁 105が閉じ、しごきポンプ 37が停止する。培養器駆動モータ 28が回転し、培養器 38を回動させ緩衝液を培養器底面に行き渡らせる。その後、ピンチ弁 24が開放し、しごきポンプ 101が動作して、廃液タンク 102に培養器 38内の緩衝液を送液する。

[0065] ステップ S70 :「細胞剥離剤を注入」

ステップ S63と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁 73が開放され、しごきポンプ 37が動作し、細胞剥離剤タンク 69から細胞剥離剤が培養器 38に注入される。注入後、ピンチ弁 73が閉じ、しごきポンプ 37が停止する。培養器駆動モータ 28 が回転し、細胞剥離剤を培養器底面に行き渡らせる。

[0066] ステップ S71 :「中和剤を注入」

ステップ S64と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁 74を開放してタンク 7 0から中和剤が注入される。そして、所定時間経過後すなわち細胞が接着した後に、次のステップ S72に進む。

[0067] ステップ S72 :「中和された細胞剥離剤を排出」

ステップ 66と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁 24とピンチ弁 104が開放され、しごきポンプ 101が動 102に培地が送液 (排出）される。送液 (排出）完了後に、しごきポンプ 101が停止し、ピンチ弁 24と、ピンチ弁 104が閉じる。

[0068] ステップ S73 :「ピぺッタを駆動させ細胞を容器に移送」

ピぺッタ回転動モータ 88が動作し、ピぺッタアーム 85を回転させる。次にピぺッタ上下動モータ 90が動作し、ピぺターアーム 85が下降して、容器 84内に針 83が挿入される。ピンチ弁 24、 103が開放し、しごきポンプ 101が動作する。これにより、培養器 38内の培養後細胞は吸いだされ、細胞は矢印 P1方向にチューブ 23を通って、送液 (移送）される。そして、チューブ 86を通り、細胞保管容器 84に注入される。

[0069] ステップ S74 :「細胞保管容器を装置外に搬出」

シャッターモータ 81が動作し、シャッター 82が上昇する。所定量上昇後、容器移動モータ 94が動作し、ホルダーが矢印 G方向に移動する。これによつて、操作者は培養された細胞が入った細胞保管容器 84を取得できる。

[0070] ステップ S75 :「終了」操作者は培養前と比較し、コンタミネーシヨンのない純粋な培養細胞が入った容器

84を取得することができる。

なお、上記ステップ S53にて、容器 52に入れた培養前細胞が骨髄液に含まれる細胞である場合、目的とする細胞以外の不要な細胞（血液関係の細胞）を取り除くために以下のステップをステップ S56とステップ S57の間に入れると良い。

ステップ S62 →ステップ S63→ステップ S64→ステップ S66

[0071] 図 6は、図 5のステップ S55の「培養器をシャッフリングし、均一化'播種」の動作の一例を示す図である。培養器 38は、この図 6 (a)に示すように正逆回転を繰り返す。例えば、正方向 1回、逆方向 1回、最後の正方向 1回の停止時にはゆっくりと停止させるようにする。すなわち、最初の加速時間と減速時間（tl， t2, t3, t4, t5)を短くすることにより、培養器 38の培地 17は激しく波打ち、懸濁状態になる。さらに、最後の動作の減速時間（t6)を長く取ることにより、培地はその慣性により円周方向に流れを継続しながら、その速度を落とし、やがて停止する。これにより細胞は均等に播かれるようになる。なお、最後の減速時間（t6)を S字曲線にしても良い。

[0072] 図 6 (b)は細胞の播種状態を示すシミュレーション結果の概略図である。色の濃い中心付近の箇所（内周部 S2)は、最後の動作 (減速時間 t6)にて、流れの接線速度が低いので比較的細胞が凝集している様子が示され、外周部 S1は、細胞が薄く播かれている様子が示されている。なお、正逆回転の繰り返し数、回転速度、角加速度 (tl , t2, t3, t4, t5, t6)は、特に限定せず、条件によって培養器 38の前面にわたり、均等に細胞を播くこともできる。しかし、例えば、上述のように中心付近に細胞を凝集する動作を故意に実現することで、その部分のみ画像観察することによりコンフノレェントのタイミング判定には都合がよくなることもある。すなわち、培養器 38の全面にわたり観察する必要がなくなり、また過度に培養することで細胞の品質を損なうことがなくなる。また、密度に応じて増殖しやすくなる細胞種を培養する場合において、このような密度制御は好適である。

[0073] 図 7は、上述の実施の形態に係る細胞培養装置の培養器 38の第 1の変形例を示す図であり、図 7 (A)は、上面から見て図を、図 7 (B)はその側面図を示す。例えば、 4つの培養器 170a— 170dをロータ 22に回転中 ' 力 S4つの培養器 170a 170dの中心となるように乗せる。この図の培養器 170a— 170dは、概ね同一の円柱形状に形成されており、各培養器 170a— 170dのチューブ接続部材 174a— 174dはチューブ 171によって接続されている。なお、図 7 (B)では、培養器 170a, 170cを省略してある。このチューブ 171は、図 2のチューブ 21と同一機能を果たすものである。チューブ接続部材 175a— 175dは、古い培地を排出するものである。ここでは、培養器 1 70a 174dは 4ケとした力特に 4ケに限定せず、 2ケ， 3ケ， 6ケと自由に選択してもよレ、。また、培養器を重ねて配置しても良い。この図 7のように培養器を複数に分けることにより、培養面積を自由に変更できる。これにより、細胞が接着系の細胞（例えば間葉系幹細胞）では、培養可能な細胞数は面積と比例関係にある場合が多ぐ細胞培養における細胞数の調整が可能となる。なお、動作は図 5の処理フローと同一であり、矢印 Mの様にシャッフリングすることにより、培養器 170a— 174d内の培地は矢印 Qの方向に最終的に流れることになつて、培養器 170a 174d内の細胞は均一に播かれることになる。

図 8は、上述の実施の形態に係る細胞培養装置の培養器 38の第 2の変形例を示す図である。細胞は培養時、その細胞種によって異なる力概ねコロニー状に増える。従って、コンフルェントになったら、より広い面積の、比較的清浄な面に播種、つまり継代することが必要である。図 8 (A)に示す培養器 167, 168, 169は、このような特性が顕著な場合の細胞培養に適用して好適な培養器の一例である。培養器 167 は、概ね円形のシャーレ構造をしており、その上面には図 2の供給チューブ 21と同じ機能の供給チューブ 182が接続される。培養器 168は、培養器 167とほぼ同じ外囲器構造をしているが、内部に培養補助板 189が 1枚設けられている。培養器 169は、培養器 167とほぼ同じ外囲器構造をしているが、内部に培養補助板 191， 192が 2 枚設けられている。この培養器 169の底面には廃液チューブ 185が接続される。各々の培養器 167， 168, 169は接続チューブ 183， 184でそれぞれ接続され、その途中に設けられたピンチ弁 186， 187, 188によって送液が制御される。こられの培養器 167, 168， 169とピンチ弁 186， 187, 188と力 S、図 2に示すロータ 22に固定される。図 8 (B)は、各培養器 167， 168， 169の回転中心軸との位置関係を示す図であり、図に示すように回転中心軸 Tより大幅にずらしてもよぐ矢印 Rにて示す方向にシャッフリングすることにより培養器 167, 168, 169内の細胞は均一に播かれることになる。

[0075] 図 8の培養器 167, 168, 169を用いた細胞培養装置の動作は、前述までの培養器と大きな差異はないが、培養器が 3ケとなり、またピンチ弁が 2ケ増えている。

[0076] 図 9は、図 8の培養器を用いた細胞培養装置の動作を説明するためのフローチヤートである。図 8の培養器を用いた動作は、図 5と動作が似ているので図 5との相違点について説明する。図 9において、図 5と同じ構成のものには同一の符号が付してあるので、その説明は省略する。

[0077] 図 5にて説明した動作は、継代時に培地を排出（ステップ S61)、培養器を緩衝液で洗浄 (ステップ S62)、細胞剥離剤を注入 (ステップ S63)、中和剤を注入 (ステップ S64)、培養器をシャッフリングし、均一ィ匕'播種 (ステップ S65)、中和された細胞剥離剤を排出（ステップ S66)、新しい培地を注入 (ステップ S67)であった。すなわち、継代時には新しい培養器に移し変えることなぐコロニー状に増えた細胞をその場所で培養器をシャッフリングすることにより均等に播種し、再度目標の細胞になるまで培養するというものであった。これに対して、図 8の培養器ではステップ S64の後に、ステツプ S90の「下段の培養器に播種」という処理を実行している。

[0078] すなわち、培養器 167でコンフルェントになると、その下の培養器 168に細胞を送液により移し変える。そして、この培養器 168でコンフルェントになると、その下の培養器 169に細胞を送液により移し変える。各々の培養器に注入する培地量は、継代毎に培地量を多くし、培養補助板での培養ができるようにする。すなわち、初回の培養において培地量は、培養器 167において培養器本体 180の底面のみ培養する量とする。 1回の継代後の培養は、培養器 168において培養補助板 189が漬力、る程度の培地量とする。これにより、細胞は培養器本体 180と、培養補助板 189の両方で培養できるようになる。 2回の継代後の培養は、培養器 197において培養補助板 190と培養補助板 191が漬かる程度の培地量とする。これにより、細胞は培養器本体 180 と、培養補助板 190と、培養補助板 191の 3枚で培養できるようになる。培養補助板が漬かる量とすることで、培養器 168は培養器 167に対して約 2倍、培養器 169は培養器 167に対して約 3倍となる。 [0079] 次に、ピンチ弁の動作を説明する。

(1)初回の培養:培地、緩衝液、細胞剥離剤、中和剤を排出する時にピンチ弁 186， 187, 188を開放する。

(2)継代 1回後の培養:培地、緩衝液、細胞剥離剤、中和剤を注入する時にピンチ弁 186を開放する。また、培地、緩衝液、細胞剥離剤、中和剤を排出する時にはピンチ弁 187, 188を開閉する。

(3)継代 2回後の培養:培地、緩衝液、細胞剥離剤、中和剤を注入する時にピンチ弁 186, 187を開放する。また、培地、緩衝液、細胞剥離剤、中和剤を排出する時にはピンチ弁 188を開閉する。

[0080] 上述の実施の形態においては、培養器の個数、各培養器の形や大きさなどは限定されるものでなくなぐ楕円や矩形としてもよぐ各々の大きさを変えてもよい。また、培養補助板の枚数も:!枚や 2枚に限定されるものではなレ、。図 8の実施の形態においては、培養器は全体的に小型化でき、しいては装置の小型化を実現することが可能である。なお、図 8におレヽて ίま、複数の鏡 278, 279, 282, 283, 284, 285力 S各培養器 167— 169間に配置されている。これらの鏡は光源 281から出射した光を CCD力メラ 280で受けるためのものである。光源 281の直前にはフィルター 286が設けられてレヽる。 CCDカメラ 280、光 ¾ 281、フイノレター 286は、ユニット 288のように一体ィ匕されており、図示を省略してある駆動機構 (例えば、モータと送りねじで構成）により矢印 V方向に移動することができるようになってレ、る。このユニット 288を矢印 V方向に移動することによって、培養器が多層構造となっていても、 CCDカメラ 280と鏡 278, 279, 282, 283, 284, 285を禾 IJ用し、横力ら培養器 167— 169の観察力 Sできるよう ίこなってレヽる。これらの鏡 278， 279, 282, 283, 284, 285fま、図 (こおレヽて横方向（ X軸方向）に移動して、培養器内を走査可能としてもよい。

[0081] 図 10は、上述の実施の形態に係る細胞培養装置の培養器 38の第 3の変形例を示す断面図である。図 10の培養器が図 8の培養器と異なる点は、継代時に新しい培養器に移し変えることなぐ図 2に示す培養器 38と同様に扱えるようにした点である。構造的には、概ね円形のシャーレ構造をしており、上面には図 2の供給チューブ 21と同じ機能の供給チューブ 197が接続されている。培養器本体 195には蓋 199が被され、その内部には培養補助板 201 , 202が 2枚設けられている。動作の概要は、図 8 と同じである力継代毎に培地量を多くし、培養補助板での培養ができるようにしてある。すなわち、初回の培養において培地量は、培養器本体 195の底面のみである。 1 回の継代後の培養は、培養補助板 201が漬かる程度の培地量とする。これにより、細胞は培養器本体 195と、培養補助板 201の両方で培養できるようになる。 2回の継代後の培養は、培養補助板 202が漬かる程度の培地量とする。これにより、細胞は培養器本体 195と、培養補助板 201と、培養補助板 202の 3枚で培養できるようになる。これによつて、図 2の培養器 38と比べて、図 8と同様に小型化を実現できる。以上の説明において、培養器の個数や各培養器の形や大きさなどは限定されるものではなぐ楕円や矩形としてもよぐ各々の大きさを種々変えてもよい。また、培養補助板の枚数も 2枚に限定されるものではない。図 10に示す実施の形態によれば、培養器を全体的に一層小型化でき、しいては装置の小型化を実現することができる。

図 11は、細胞を均一に播種する手法の一例を示す図である。この手法は、上述の実施の形態の培養器に適用することによって好適な効果を生むものである。図 11 (A )において、培養器本体 300には、培養器本体の蓋 301が設けられ、その上面側に供給用チューブ接続部材 302が設けられ、下面側に磁石 307, 308, 309, 310が設けられている。傾斜部 381は、供給用チューブ接続部材 302から供給される液体の落下の衝撃を和らげて細胞へのダメージを防ぐものである。これら磁石 307, 308 , 309, 310は、図 2におレヽてフレーム 30に固定される。球状咅才 303, 304, 305, 306は、培養器本体 300 (図 2の培養器 38と同一）の中に入れられるものであり、球状磁性材の表面に細胞に対して無毒性の高分子プラスチック、セラミック、チタンなど力 Sコーティングされたものである。培養器 300が回転するとそれに伴い球状部材 303 , 304, 305, 306も培養器本体 300内を転がり、内部の培地を攪拌するようになり、細胞の均一播種が可能になる。図 11 (B)は、培養器本体 312に培養器本体の蓋 31 3が設けられ、その上面側に供給用チューブ接続部材 314が設けら、下面側に棒状部材 315が設けられている。棒状部材 315は、培養器本体 300 (図 2の培養器 38と同一）の中に入れられるものであり、棒状の磁性材の表面に細胞に対して無毒性の高分子プラスチック、セラミック、チタンなどがコーティングされたものである。図 11 (B )の棒状部材 315を用いた場合も、図 11 (B)と同様の効果を奏する。

[0083] 図 12は、上述の実施の形態における培養器とチューブの接続方法の一例を示す図である。図 2では培養器、チューブ、リザーバタンクなどは予め接続されているものとして説明したが、ここでは途中で切断されたチューブを供給用チューブ接続部材に接続して培養している。培養器 325 (図 2の培養器 38と同一）には供給チューブ 320 と廃液チューブ 326が接続されている。それぞれのチューブ 320, 326の切断部には、例えばゴムのような柔軟材からなる栓 321， 327が揷入されている。実際に培養に入る前に、針 322， 328を有した供給チューブ 323と廃液チューブ 329を接続する。なお、金十 322， 328を刺す前に检 321 , 327をァノレコーノレなどで滅菌するとよレヽ。このようにすることにより、長いチューブが接続された培養器を装置にセットする際にチユーブの取り回しが楽になり、操作性が上がる。なお、培養前細胞を注入する際、シリンジ 324を使えば、直接培養器 325に細胞を入れることができる。また、途中で切断された供給チューブ 323と廃液チューブ 329を培養器 325に予め接続せずに、直接ゴム栓 321 , 327をチューブ接続部材に取り付けても良い。

[0084] 図 13は、上述の実施の形態における培養装置の一部の滅菌法を示す図である。この滅菌法では、培養器 38と各タンク 71 , 70, 69, 68, 67, 102と力 Sそれぞれチューブによって接続され、そのままの状態で滅菌バッグに矢印 Sに示すように丸ごと封入され、ガンマ線などからの滅菌に供するようになっている。滅菌バッグ 340は、外気との接触を防ぐ材質で作られたものであり、一般に利用されているもので良い。このように細胞に触れるものは全て滅菌することにより、培養中はチューブを外さなくてすむこと力ら、コンタミネーシヨンのリスクは皆無となる。

なお、前記図 2において 400は、光または超音波を用いた培養器 38内の液面高さを検出する液面検出手段である。ポンプやピンチ弁が動作不良を起こした場合、液面高さが設定位置から逸脱するが、このような場合外部に警報を出す。

[0085] 図 14は、本発明を適用してなる細胞培養装置の別の実施の形態に係る機構部の詳細図を示す図である。この細胞培養装置は、基本的には図 2のものと同じ構成をしている。従って、図 14において、図 2と同じ構成のものには同一の符号が付してあるので、その説明は簡略化する。 [0086] 培養器 140は、図 2の培養器 38と同様に底面には細胞が接着してそこで培養が行なわれる。培養器 140は、培養器本体と蓋部材とからなる。培養器 140は、培養中の細胞について顕微鏡などで観察できることが必要であることから透明な材質が好ましぐまた毒性のないものである必要がある。これらのことから材質としては、ポリスチレン（PS)やポリエチレンテレフタレート（PET)材が好ましい。この蓋部材には、薬品注入及び排出のための 3つの第 1ポート 141、第 2ポート 142、第 3ポート 143が設けられている。

[0087] 第 1ポート 141は、培地などの薬品や培養後の細胞の排出用ポートである。第 1ポート 142には廃液チューブ 141bが接続され、培地を排出するためのしごきポンプ 14 4, 145が配され、培地を排出できるように構成されている。第 2ポート 142は、培地などの薬品や培養前の細胞を供給するためのポートである。この第 2ポート 142には供給チューブ 142bが接続され、第 1ポート 141と同様にしごきポンプ 146, 147が配されている。第 3ポート 143は、培養器 140内部への大気吸入用ポートであり、その外側にはチューブ 143aを介してエアーフィルター 143bが接続されている。この第 3ポート 143は、培養器 140内部への空気吸入ポートであり、この目的を実現するものであれば、特にポートを備えなくてもよい。図 14の細胞培養装置では、培養器 140を保持する保持リング 148の底面側にフック 149を引つ力 4ナ、それをレバー 150及びチルトモータ 151で持ち上げることによって、培養器 140全体を傾斜するようにしている。

[0088] 培養器 140は、保温箱（インキュベータ） 160内のロータ 153に固定された保持リング 148に保持されており、このロータ 153は、保温箱 160の上部に設けられた培養器駆動モータ 29aの出力軸に連結され、矢印 E方向に回転駆動されるように構成されている。図 14は、ロータ 153が時計回り（左方向）に旋回して保持リング 148及び培養器 140が保温箱 160の左側に移動した状態を示す。従って、この状態からロータ 1 53は半時計回り（右方向）に旋回することによって、保持リング 148及び培養器 140 は図面上の手前を通過して保温箱 160の右側に移動することになる。保温箱 160は、従来のように 2重箱構造をとらずに、また気密をほとんど考慮しなくて済む簡易な方法で構成されたものである。この保温箱 160の詳細構成について後述する。

[0089] 供給チューブ 142bの一端は、培養器 140の外周付近に設けられた第 2ポート 142 に接続されている。この供給チューブ 142bは、保温箱 160内部のロータ 153上方に設けられ、ロータ 153の旋回に応じて内部を自由に動くようになつている。供給チューブ 142bの他端は、加温バッグ 170に接続されている。加温バッグ 170は、供給チューブ 142bを通過する媒体の温度を 4度から約 20度に加温するものであり、背面に加温用ヒータ 171を備えている。

なお、加温バッグ 170は、媒体の温度を上げることができれば、その形状は限定されない。チューブをスパイラル状に卷ぃたものでもよレ、。この加温バッグ 170を媒体が通過する時には、ポンプ 146、 147、ピンチ弁 147aを制御し、媒体を一時滞留させる

[0090] 培地タンク 67は、未使用の培地を貯留し、緩衝液タンク 68は緩衝液を貯留し、糸田胞剥離剤タンク 69， 70, 71は細胞剥離剤を貯留している。なお、図 15では細胞剥離剤タンク 69のみを示し、細胞剥離剤タンク 70， 71の図示を省略してある。各タンク 67, 68, 69, 70, 71は、断熱箱 80内に設けられてレヽる。断熱箱 80の佃 J面には、ベルチェ素子 109を介して外部に放熱ヒートシンク 110が、内部に吸熱ヒートシンク 111 がそれぞれ設けられていて、熱交換が行なわれ、一定温度に保持されている。ピンチ弁 72, 105, 73, 74, 75ίま、各タンク 67, 68, 69, 70, 71力ら供給チューブ 142 cへの送液を制御するものである。各タンク 67, 68, 69, 70, 71から取り出されるチユーブは、供給チューブ 142cに接続され、しごきポンプ 146, 147で送液できるようになっている。しごきポンプ 146, 147は、ローラでチューブを挟み込み、そのローラを回転することによりチューブ内の液を送り出すポンプである。しごきポンプ 146, 14 7のすぐ後には送液調整用のピンチ弁 146a, 147aが設けられている。

なお、ポンプ 144、 145が送る液量を計る手段を設けず、これらポンプの動作時間によって液量を決める。

[0091] ピンチ弁 66a, 66bは、供給チューブ 142bへの培養前細胞の注入を制御するものであり、補助供給チューブ 142dに 2個設けられている。 2個のピンチ弁 66a, 66bを並べて設けてあるのは、細胞注入後に補助供給チューブ 142dを介して外気などが流入するのを防止するためである。

[0092] 供給チューブ 142cの一端は、加温バッグ 170に接続され、他端はピンチ弁 172を介して保温箱 160内に挿入され、その端部にエアーフィルター 173が設けられてレ、る。このエアーフィルター 173、供給チューブ 142c、加温バッグ 170、供給チューブ 14 2b、第 3ポート 143、チューブ 143a、エアーフィルター 143bによって空気循環経路が形成されている。すなわち、しごきポンプ 146, 147が回転して、供給チューブ 142 b， 142c内のエアーを送出することによって、培養器 140内のエアーを循環させるようになつている。

[0093] 廃液チューブ 141bの一端は、培養器 140の外周付近に設けられた第 1ポート 141 に接続されている。この廃液チューブ 141bは、保温箱 160内部のロータ 153上方に設けられ、ロータ 153の旋回に応じて内部を自由に動くようになつている。廃液チューブ 141bは、途中で二股に分岐され、それぞれの経路を介して廃液タンク 102又は培養後細胞を貯留する容器 84に送液されるようになっている。すなわち、廃液チューブ 141bの分岐した一方は、ピンチ弁 176、ペーハー測定部 177、しごきポンプ 145、ピンチ弁 178を介して廃液タンク 102に接続され、他方はピンチ弁 174、しごきポンプ 1 44を介して廃液タンク 102又はピンチ弁 174、しごきポンプ 144、ピンチ弁 175を介して容器 84に接続されてレ、る。

[0094] 細胞の老廃物が溶出し、培地中の栄養素が少なくなることによって生成される古い培地は、しごきポンプ 144により廃液チューブ 141bを通って、廃液回収箱内の廃液タンク 102に貯留される。一方、廃液のペーハーを測定するために、古い培地は、しごきポンプ 145により廃液チューブ 141bを通って、ペーハー測定部 177を通過して、同じく廃液タンク 102に送液される。

[0095] ペーハー測定部 177は、廃液のペーハーを測定する前に、保温箱 160内に設けられた校正液タンク 161 , 162に貯留されている校正液をピンチ弁 163， 164を通過させることによってペーハーを基準値に校正し、その後に廃液を通過させてペーハー測定するものである。このペーハー測定部 177の詳細については後述する。

[0096] 培養前細胞を貯留する容器 230は、モータ 231の回転軸に対して偏心して設けられたホルダー 232に支持されている。モータ 231が回転することによって、容器 230 内の培養前細胞は十分に懸濁される。容器 230の上面にはゴム材からなるキャップ 2 33力 S設けられ、外気力、らカバーされている。キャップ 233の内部にはアルコール消毒液が染み込んだ不織布 234が設けられており、キャップ全体を覆うようにカバー 235 が設けられている。針 236は、キャップ 233及び不織布 234を介して容器 230内の管部材 238に接続され、図示していないアームに固定されており、矢印 D1方向に直線移動できるようになつている。針 237は、容器 230内に大気を供給するものであり、その端部にエアーフィルター 239を備えている。この針 237の機能は、容器 230が硬質のプラスチック材料で形成された場合において、内部が陰圧になって細胞が吸引しに《なるのを防止するものである。なお、培養前細胞は、しごきポンプ 147により吸引されるが、この針 237から容器 230内に空気を圧送することによって送液するようにしてもよい。この培養前細胞を貯留する容器 230及び針 236, 237の詳細構成については後述する。

[0097] 培養後細胞を貯留する容器 240は、図示していないホルダーに支持されている。

容器 240の上面にはゴム材からなるキャップ 241が設けられ、外気からカバーされている。キャップ 241の内部にはアルコール消毒液の染み込まれた不織布 244が設けられており、キャップ全体を覆うようにカバー 245が設けられている。針 246は、キヤップ 241及び不織布 244を介して容器 240内の侵入し、培養後細胞を送液可能になつている。針 246は、図示していないアームに固定されており、矢印 G1方向に直線移動できるようになつている。針 247は、容器 240内の空気を排出するものであり、その端部にエアーフィルター 249を備えている。この針 247の機能は、容器 240が硬質のプラスチック材料で形成された場合において、内部が陰圧になって細胞を吸引しに《なるのを防止するものである。なお、培養後細胞は、しごきポンプ 144により吸引されるが、この針 247から容器 240内の空気を排出することによって送液するようにしてもよいし、保温箱 160内に空気を圧送することによって、送液するようにしてもよい。この培養後細胞を貯留する容器 240及び針 246， 247の詳細構成については後述する。

[0098] 光源 34aは、保温箱 160の上側力保温箱 160内に光を照射するものであり、光の出射側にフィルターなどを備えている。 CCDカメラ 31aは、レンズを備えており、保温箱 160の下側に設けられた観察窓 32aから培養器 140にて培養される細胞を観察したり、継代時のタイミングを判定したりするのに利用されるものである。光源 34aは、画像の輝度ムラを防止するために複数の LEDをフラットに配置したタイプのものが好ましいが、光量が十分であるならば 1つの LEDもしくはランプで構成してもよい。また、光源 34aに配置されるフィルタ一としては、 CCDカメラ 31aに入射する光量を低減するため NDフィルター、及び細胞観察に適したコントラストを得るため適当なバンドパスフィルタ一力構成される。このフィルタ一は、 CCDカメラ 31aの前面に設けても良レ、。 NDフィルタ一は、 CCDカメラ 31aの前面に、またバンドパスフィルタ一は細胞に害を与える短波長光をカットするものの場合は光源 34aの前面の方が好ましい。光源 34a及び CCDカメラ 31aは、図 14の紙面に対して垂直な方向に移動可能に設けられている。すなわち、光源 34a及び CCDカメラ 31aは、図に対して垂直方向に延びたレーノレ 34b， 31bに対してローラ 34c, 34d, 31c, 31dを介して移動可能に設けられている。これによつて、旋回移動する培養器 140と垂直方向に移動する光源 34a 及び CCDカメラ 31aによって、培養器 140の所望の場所を観察可能な構成となっている。

[0099] ヒータ 201— 204は、保温箱 160内に設けられた温度センサ 106からの検知温度に基づいて保温箱 160の内部を一定の温度に保つものである。なお、この実施の形態では、ヒータ 201— 204には、熱拡散用の放熱板 205, 206が保温箱 160の側面に沿って設けられている。ファン 65は、保温箱 160内の空気を攪拌するものである。継ぎ手 107は、二酸化炭素と窒素と酸素の割合を制御した混合気体を供給する際の不純物を除くためのフィルターを備えている。二酸化炭素センサ 205は、保温箱 160 内の二酸化炭素を検出し、一定に保持するためのものであり、二酸化炭素ボンべ 21 0からレギユレータ 211及び電磁弁 212を介して所定量の二酸化炭素を保温箱 160 内に供給できるようにしてある。なお、この実施の形態では、二酸化炭素ボンべ 210 力、らレギユレータを介して送出される二酸化炭素ガスを用いて多連型電磁弁 213を制御して、チューブの各所に設けられたピンチ弁を制御するようにしている。

[0100] 図 15は、図 14で使用される培養器の詳細を示す図である。培養器 140は、培養器本体 140aと、蓋部材 140bと力なる。この蓋部材 140bには、薬品注入及び排出のための 3つの第 1ポート 141、第 2ポート 142及び第 3ポート 143が設けられており、それぞれのポートに廃液チューブ 141b、供給チューブ 142b及びチューブ 143aが接続されている。

[0101] 図 16は、培養器における第 1ポート 141、第 2ポート 142、第 3ポート 143の詳細を示す図である。なお、図示を明確にするため断面図のように明示している力正確な位置関係は後述する図 17に示すようになつている。第 1ポート 141は、培地などの薬品や培養後の細胞の排出用ポートである。この第 1ポート 141には、培養器 140内部に突出するよう管部材 141aが設けられる。この管部材 141aは、その先端部が培養器本体 140aの底面に触れても培地 140cを吸引できるよう斜めにカットしてある。

[0102] 第 1ポート 142の外側には廃液チューブ 141bが接続され、培地を排出するためのしごきポンプ 144， 145が配され、培地 140cを排出できるように構成されている。第 2 ポート 142は、培地 140cなどの薬品や培養前の細胞を供給するためのポートである。この第 2ポート 142の外側には供給チューブ 142bが接続され、第 1ポート 141と同様にしごきポンプ 146， 147が配されている。

[0103] 第 3ポート 143は、培養器 140内部への大気吸入用ポートであり、その外側にはチユーブ 143aを介してエアーフィルター 143bが接続されている。このエアーフィルタ一 143bは、微粒子ゃ菌などが培養器 140内部へ侵入するのを防止する役目を負い、 0. 5 μ ΐη程度の孔径を有したフィルターが内封されて構成されたものである。この孔径は、菌の侵入を完全にシャットアウトするならば 0· 2 /i mが望ましレ、。なお、チューブ 143aの先端にエアーフィルター 143bと同様のフィルターを接続し、しごきポンプにより空気を培養器 140内部に送るようにしてもよい。この場合、培養器 140内部に積極的に空気を送ることができる。

[0104] なお、この第 3ポート 143は、培養器 140内部への空気吸入ポートであり、この目的を実現するものであれば、特にポートを備えなくてもよい。例えば蓋部材の一部を切り欠き、ガス透過膜を貼り付けてもよい。また、培養器 140内部に板材を備え、底面積を増加させる構造を取ることもできる。このようにすることにより、底面に接着し単一層で増殖する接着（足場)依存性細胞の場合、増殖させる細胞数を増やすことが可能になる。

[0105] 図 17は、図 15の一部断面を示す図であり、培養器内の培地を排出する場合を示す図である。培養器 140内部に突出する管部材 141aがある方に対して、管部材 14 laがない方を相対的に上昇させ、水平面に対して角度 Θ。だけ傾斜させ、管部材 14 laから培養器 140内部の培地 140cなどの液体を吸引することにより、培養器 140の蓋部材 140bを開けずに内部の培地 140cや細胞 140dを排出することが可能になる。管部材 141aがある方に対して、管部材 20がない方を相対的に上昇させる機構は特に限定しないが、図 14の細胞培養装置では、培養器 140を保持する保持リング 1 48の底面側であって、管部材 141aが存在しない方の保持リング 148にフック 149を引つ力け、それをレバー 150及びチルトモータ 151で持ち上げることによって、培養器 140全体を傾斜するようにしている。すなわち、管部材 141aがある方に支点軸を設け、管部材 141aがない方を引き上げるような傾動動作機構によって実現してもよいし、手作業で行なうようにしても良い。

なお、前記図 2において説明したように、 400は、光または超音波を用いた培養器 1 40内の液面高さを検出する液面検出手段である。ポンプやピンチ弁が動作不良を起こした場合、液面高さが設定位置から逸脱するが、このような場合外部に警報を出す。

[0106] 図 18は、図 14の保温箱の詳細構成を示す図であり、図 18 (A)は、保温箱の内部構造を分かり易く示したものであり、図 18 (B)は保温箱の外観斜視図である。図 19 は、図 18 (A)の断熱構造の詳細を示す S-S面の断面を示す図である。この保温箱 1 60は、細胞培養用恒温槽であり、内部に培養器 140を備える。培養器 140は、培養器駆動モータ 29aの出力軸に連結されたロータ 153に取り付けられており、ロータ 15 3の旋回動作に応じて保温箱 160内を矢印 A1— A2のように旋回する。保温箱 160 は、外箱となる筐体 160aと、その内側に所定の空間を持って配置された内箱 160bと力、らなる。筐体 160a及び内箱 160bの材質は、ステンレスや ABSなどのプラスチックが好ましい。

[0107] 外箱 160aと内箱 160bとの間には、第 1の断熱材 160cと第 2の断熱材 160dが設けられている。第 1の断熱材 160cとしては、発砲ウレタンなどの比較的断熱性能の優れたものが好ましい。ただ、後述するように第 2の断熱材 160dより外側への伝熱量より、内側への伝熱量を大きくするために、発砲ウレタンであっても軟質系のものがより好ましぐかつ第 2の断熱材 160dよりも薄く形成するのが良レ、。熱拡散板 160e， 160 fは、内箱 160bの左右側面部を覆うような概ねコの字形状をしている。すなわち、保温箱 160の上下には光源 34aや CCDカメラ 31が設けられ、培養器 140の観察を行なう必要があるので、観察に必要な部分については熱拡散板 160e, 160fを設けないようにしてある。

[0108] 熱拡散板 160e， 160fの材質は、熱伝導率の高いアルミニウムや黄銅板などで構成される。この熱拡散板 160e, 160fは、第 1の断熱材 160cの左右側面を覆うように両面テープなどで接着される。さらに、この熱拡散板 160e, 160fの底面側及び側面側にはパネル型ヒータ 160g 160jが同じく両面テープなどで接着されている。第 2 の断熱材 160dを伝達して外部に漏れる熱量は、保温箱外部の漏れロスとなる。従つて、第 2の断熱材 160dは、できるだけ断熱性能を高めることが肝要であり、具体的には硬質系の発砲ウレタンや真空断熱材、例えば発砲ウレタンなどをアルミニウムパックに入れ、このパック内部を真空にし、板状にしたものなどを用いることが好ましい。この保温箱 160には、図 18 (B)に示すように同様の断熱構造をした扉 160kが蝶番 16 Omによって矢印 160ηのように開閉自在に支持されている。

[0109] 図 20は、図 14の細胞培養装置の保温箱 16の制御ブロックを示す図であり、図 4の中から説明に必要な部分を抜き出し、他は省略して示したものである。図 20において、図 4と同じ構成のものには同一の符号が付してあるので、その説明は省略する。この制御ブロックにおいて、操作卓 22は、動作スィッチや温度設定スィッチなどを備えている。制御部 11には、ヒータ 160g— 160jと、培養器駆動モータ 29aと、温度センサ 106が接続されている。温度センサ 106は、熱伝対などの公知技術を用いた温

[0110] この制御ブロックの動作を説明する。操作者は操作卓 22の動作スィッチや温度設定スィッチを操作すると、制御部 11は温度センサ 106の温度データを取り込み、設定温度と比較して、その差に応じた電力をヒータ 160g— 160jに与える。温度データの取り込みや設定温度との比較は適時行レ、、保温箱 160内部の温度が設定温度と等しいか、もしくはそれより大きくなつた場合、ヒータ 160g— 160jに与える電力を下げる。一方、温度が上昇したヒータ 160g 160jの熱量は、熱拡散板 160e， 160fを伝わり、保温箱 160の内部を暖める力第 1の断熱材 160cよりも第 2の断熱材 160d の方が伝熱量が小さいので、ヒータ 160g— 160jの熱量の多くは保温箱 160の内部を加温することに寄与する。なお、培養器駆動モータ 29aは、培養器 140内部の細胞を均等に播くために回転動作をするためのものである。

[0111] この実施の形態によれば、従来の 2重箱構造をとらずに、また気密をほとんど考慮しなくて済む簡易な方法や構成で保温箱を構成できる。また、第 1の断熱材 160cを伝わる熱量は、第 2の断熱材 160dを伝わる熱量よりも小であるようにすることにより、加温のためのエネルギーを抑制できる。また、熱拡散板 160e, 160fは、培養器 140 の培養面と垂直方向の重なる面には、切り欠きを形成することにより、培養器への直接的な輻射熱を抑えることができ、保温箱のみならず培養器内部の温度をより一定ィ匕すること力 Sできる。

[0112] 図 21及び図 22は、ペーハー測定部の詳細構成を示す図であり、図 21は、図 14の一部を拡大して示したものであり、図 22は、ペーハー測定部のセンサ部の詳細構成を示す図である。通常、ペーハー（pH)計測は、 pH指示薬（フエノールレッド）を含む細胞培養液の色の変化を目視にて判断したり、目視判断を自動で行なう装置 (特開昭 62-115297号公報に記載されたもの）などが存在している力細胞培養に関係の無い pH指示薬を細胞培養液中に入れることは、細胞培養に影響を与えるため好ましくなぐまた精度の点でも劣っていた。また、 pH電極を細胞培養液中に浸漬させてその電位差計測を行なう方法もある力 _PH電極が十分に滅菌されていないと、雑菌等のコンタミネーシヨンを起こす可能性があり、好ましくなかった。そこで、この実施の形態では、培養器力廃液タンクまでの流路の途中にフィルム状の pHセンサ膜を用いた pH測定部 177を設け、培養器 140からの廃液を利用して pH計測を行なうようにした。

[0113] 図 22に示すように、ペーハー測定部 177は、約 570 [nm]の波長の光を出射する発光素子 (LED) 177aと、約 770 [nm]の波長の光を出射する発光素子 177bと、これらの各発光素子 177a， 177bからの光であって、 pHセンサ膜 177dを透過及び反射した光を受光する光検出器 177cを備えている。

この実施の形態では、 pHセンサ膜 177dとして反射式指示薬色素フィルム FR— PR 型（フヱノールレッド）を使用する。この pHセンサ膜 177dは、 pHに応じて変色するため、その透過光及び反射光を分光計測することにより pHを求めることができる、いわゆるフィルム状の光学式化学センサである。

[0114] この pHセンサ膜 177dは、廃液チューブ 141bから分岐された廃液チューブ 141cと、廃液タンク 102に接続された廃液チューブ 141dとの間の透過部材からなるセンサホルダ 177eに設けられている。廃液チューブ 141cからの廃液は、 pHセンサ膜 177 dの保持されたセンサホルダ 177e内を通過して廃液チューブ 141dに送液される。このときに pHセンサ膜 177dは、廃液に浸漬される。廃液に浸漬された pHセンサ膜 17 7dからの透過光及び反射光を光検出器 177cで受光して、その吸光スペクトル変化を測定して、 pHを計測する。

[0115] ペーハー測定部 177で pHを計測する前に、 pHセンサ膜 177dの校正を行なう必要がある。保温箱 160内に設けられた校正液タンク 161 , 162には、校正液が貯留されているので、しごきポンプ 145によって校正液タンク 161 , 162内の校正液を廃液タンク 102に送液する。これによつて、校正液はピンチ弁 163, 164を通過し、ぺーハ一測定部 177を通過するので、 pHセンサ膜 177dは校正液によってペーハー基準値に校正される。校正後に廃液を通過させてペーハーを測定する。

[0116] ペーハーの算出は以下説明する pH値算出アルゴリズムに従って行なわれる。まず、最初のステップでは、以下の演算式（1)に基づいて、 PD喑電流、アンプや ADC のオフセット補正を行なう。

I = Iraw-Id- - - (1)

ここで、 Idは光遮断時のベースライン信号、 Irawは計測生データであり、 I, Irawは共に波長えの関数である。ここでの波長は、 l = 570nm, 2 = 770nmとする。

[0117] 次のステップでは、以下の演算式（2)， (3)に基づいて、相対透過率 T及び生の相対吸光度 Arawを算出する。

Τ=Ι/Ι2 · · · (2)

Araw =-logT= log (I2/I)…（3)

ここで、 12は、 pH校正液 2 (pH2)の I値である。従って、相対透過率 T及び相対吸光度 Araw λの関数となる。

[0118] 次のステップでは、ベースライン波長 2における吸光補正を行なう。気泡混入などにより、相対吸光度 Arawが波長えに対して非依存的に変動するので、これを補正するために、演算式 (4)に基づいて、オフピーク波長（え 2 = 780nm)の値をピーク波長（ l = 570nm)の値力減算して正味の吸光度 Aを算出する。

A=Araw( 1)-Araw(^2) ··· (4)

[0119] 次のステップでは、応答曲線の直線近似を行なう。 pHが測定範囲付近では、センサの相対吸光度 A (ベースライン補正）は pHにほぼ比例するので、直線近似することができる。そこで、演算式（5)—（7)に基づいて直線近似を行なう。 pHは以下の演算式（5)のようになる。

pH = S-A+b--- (5)

ここで、 Sは感度を示す。

ここで、 pH校正液 2の pH値は pH2なので、以下の演算式（6)になる。

pH2 = b--- (6)

また、 pH校正液 2の時は、演算式 (4)の結果は「0」となるので、

A=Araw (λΐ) = Araw (え 2) =0

pH = S-A + pH2--- (7)

となる。

[0120] 次のステップでは、以下の演算式（8)に基づいて校正 (感度 Sの算出）を行なう。

pHl = S-Al+pH2--- (8)

A1は、 pH標準液 1(ρΗ1)の A値である。なお、 pHlく pH2なら A1は負値となる。従って、感度 Sは、以下の演算式（9)のようになる。

S = (pHl-pH2) /A1…（9)

[0121] 次のステップで、未知試料の pH計測は以下の演算式（10)によって求めることができる。

ρΗ=Α· (ρΗ1-ρΗ2)/Α1+ρΗ2··· (10)

ここで、 Αは未知試料の相対吸光度である。なお、 pHlく pH2なら Aは負値となる。

[0122] 以下、実際の測定手順について説明する。

まず、標準液 1， 2の pH値を pHl, pH2とする。

このときの、ダークカレント Idを計測する。 pH校正液 2の場合の計測電流値 I2raw( λ 1)、 I2raw (え 2)を前記演算式（1)に代入すると、次のようになる。

I2(Xl)=I2raw(^l)-Id

I2( 2)=I2raw(^2)-Id

[0123] 同じぐ pH校正液 1の場合の Ilraw( λ 1)、 Ilraw( λ 2)を前記演算式（1)に代入すると、次のようになる。

Il( l)=Ilraw(^l)-Id

Il( 2)=Ilraw(^2)-Id

[0124] pH校正液 1の場合の生の相対吸光度は、前記演算式（3)に従って次のようになる

AlrawU 1) =log(I2( 1)/Ι1(λ 1))

Alraw ( λ 2) =log (12 ( λ 2) /II ( λ 2) )

ρΗ校正液 1の場合の正味の吸光度 Αは前記演算式 (4)に従って、次のようになる。

Al = Alraw (λ 1 ) -Alraw (λ 2)

[0125] 前記演算式 (6), (9)に従って検量線導出を行なう。

b = pH2

S=(pHl-pH2)/Al

[0126] 未知試料について、 Iraw(A 1)、 Iraw( 2)の計測を行い、前述と同様の手順により正味の吸光度 Aを求める

[0127] 前記演算式（7), (8)，（9)に従って pHを導出すると、次のようになる。

pH=A-S + b=A- (ρΗ1_ρΗ2)/Α1+ρΗ2

[0128] このペーハー測定部は廃液を利用しているため、培養装置内の細胞と _PHセンサが接触することもなぐまた、校正液も廃液流路に流すため、培養器へ注入することも無レ、。従って、細胞とセンサ、校正液の直接接触を回避することができ、滅菌処理問題力起こることも無レ、。また、 pH計測部を培養装置内に設けずに、廃液流路の途中に設けているので、装置の機構構造も小型簡略化することができる。

なお、図 21に示したペーハー測定部 177を設けることには限定されない。すなわち、細胞培養液の色の変化を見るようにしてもよい。この場合、前述の CCDカメラ 31をカラーカメラとし、演算してもよレヽ。なお、チューブ 141c、ピンチ弁 176、 163、 164、ポンプ 145、チューブ 141d、校正液タンク 161、 162が不要となるのは言うまでもなレ、。

[0129] 細胞培養などでは、滅菌された容器内からの培養する細胞のサンプリングといったような滅菌した容器からの細胞懸濁液などの液の抽出、また、培養液を入れた容器への培養する細胞の播種や培養液への薬剤の注入などといったような滅菌した容器への液の注入などの操作が行なわれる。このような滅菌した容器からの液の抽出や滅菌した容器への液の注入といった操作では、コンタミネーシヨンの発生を抑制する必要がある。

[0130] 例えば、滅菌した容器からの液を抽出し、その液を別の滅菌した容器に注入するとレ、つたような、物理的に一体でなレ、滅菌した容器間で細胞懸濁液や薬剤などの液を移動させる操作などにおいてコンタミネーシヨンの発生を抑制するため、クリーンベンチ内などの操作環境の清浄度の向上や作業者からの汚染の抑制などが実施されている。さらに、滅菌された容器が、クリーンベンチ内などの清浄化された環境外、つまり、微生物などの汚染物が浮遊している一般環境に置かれていた場合、クリーンベンチ内などでアルコールを噴霧して容器の外面を殺菌し、容器の栓の部分を拭いて過剰なアルコールを除くといった容器の殺菌操作を行った後、栓を外して液の抽出や注入の操作を行うことで、コンタミネーシヨンを抑制している。

[0131] このように、容器が一般環境に置かれていた場合、コンタミネーシヨンの発生を抑制するうえで容器の殺菌操作を行うことが必要であるが、アルコールを噴霧して容器の外面を殺菌し、容器の栓の部分を拭いて過剰なアルコールを除くといった後、容器の栓を外して液の抽出や注入を行うといった一連の操作を、できるだけ迅速に行うこともコンタミネーシヨンの発生を抑制するうえで必要になってくる。しかし、これら一連の操作は繁雑なものであり、これら一連の操作を迅速に行うためには熟練を必要とする。

[0132] さらに、このような一般環境に置かれた容器の殺菌操作を行レ、、滅菌した容器からの液の抽出や滅菌した容器への液の注入行うといった一連の操作は、例えば再生医療に用いる細胞の増殖などのための細胞培養など、産業的な細胞の生産における細胞培養でも行われる。このため、このような産業的な細胞の生産における細胞培養などにぉレ、て熟練した技術者が必要になることは、細胞培養のコストの増大を招く一つの要因となるため望ましくない。これらのことから、熟練した技術者でなくても、一般環境に置かれた容器からの液の抽出や容器への液の注入をコンタミネーシヨンの発生を抑制しながら行えるようにするため、容器の外面の殺菌や容器の栓を開けるとレ、つた操作なしにコンタミネーシヨンの発生を抑制する技術、つまり、容器からの液の抽出や容器への液の注入を行う際の操作を簡素化しながらコンタミネーシヨンの発生を抑制できる技術が必要とされてレ、る。

[0133] そこで、この実施の形態では、容器からの液の抽出や容器への液の注入を行う際の操作を簡素化しながらコンタミネーシヨンの発生を抑制することのできる構成として、培養前細胞を貯留する容器 230及び針 236， 237と、培養後細胞を貯留する容器 240及び針 246, 247を採用している。以下、図 23—図 30を用いてこの構成について説明する。

[0134] 図 23及び図 24は、容器 230, 240用の栓の概略構成を示す図であり、図 23 (A) は、その斜視図であり、図 23 (B)は、その断面図であり、図 24 (A)は、外部閉塞部材を外した状態で示す上面図であり、図 24 (B)は、容器用の栓の概略構成を示す底面図である。図 25は、この容器用の栓を備えた容器の一例を示す斜視図である。

[0135] 容器用の栓（キャップ） 233は、図 23及び図 24に示すように、ゴムや合成樹脂などの樹脂製であり、一方の端面力他方の端面にかけて貫通する断面円形の通路 23 3a— 233dが設けられた略円筒状に形成されている。各通路 233a— 233dの大きさはそれぞれ異なってレヽる。检 233の通路 233a— 233dは、この检 233を取り付けた容器 230, 240内への液の注入及び容器 230， 240内からの液の抽出の少なくとも一方を行う中空針 236， 237, 246, 247などの管体または細管を揷通するための通路となる。通路 233aは、栓 233の一方の端面側に形成された入口部となる。通路 23 3bは、この入口部に接続され、この入口部よりも直径が大きい収容室となり、この収容室 233bに殺菌剤含浸部材 (不織布） 234， 244が収容される。通路 233cは、この収容室 233bの底となる仕切板 233eの中央部に形成された貫通穴となる。通路 233 dは、栓 233の他方の端面側に設けられ、仕切板 233eの貫通穴 233cを介して収容室 233bと連通する出口部となる。

[0136] この実施の形態では、栓 233の通路 233dの出口部は、図 25に示すように、栓 233 を容器 230, 240に気密に密着させた状態で取り付けるための役目も果たし、出口部 233dの内径は、円筒状の容器 230， 240の外径と同じ大きさに形成されている。ただし、栓 233の容器への取り付けかたが異なる場合、出口部 233dを栓 233の容器への取り付けに利用しない場合などは、出口部 233dの内径は適宜設定でき、また、出口部 233dを設けない構成にすることもできる。また、栓 233の仕切板 233eの中央部に形成された貫通穴 233cは、中空金十 236, 237, 246, 247などの管体または糸田管を揷通可能な径で形成されてレ、る。

[0137] 栓 233の入口部 233aが設けられている側の端面には、図 14、図 23—図 25に示すように、その端面を覆うように気密性を有するフィルムまたは膜からなる外部閉塞部材 235, 245が取り付けられている。外部閉塞部材 235， 245は、例えば、アルミ箔と合成樹脂製のフィルムなどをラミネートしたラミネートフィルム、柔軟性と弾性を有するゴムやシリコン、エラトマ樹脂などの樹脂製の膜など、殺菌剤の蒸発を抑制することができる様々な材料で形成することができる。また、外部閉塞部材 235, 245としてラミネートフィルムなどを用いた場合には、栓 233を備えた容器 230, 240を使用するときに、栓 233の入口部 233a側の端面から剥離する。

[0138] 一方、外部閉塞部材 235， 245として樹脂製の膜などを用いた場合には、中空針 2 36, 237, 246, 247などの管体または細管を外部閉塞部材 235, 245に穿刺して用いる。穿刺した中空針 236, 237, 246, 247などの管体または細管を外部閉塞部材 235, 245から抜いても、外部閉塞部材 235, 245が柔軟性と弾性を有する樹脂製であれば、中空金十 236， 237, 246, 247などの管体または細管によって外部閉塞部材 235, 245に形成された穴はほとんど閉じた状態となる。なお、外部閉塞部材 23 5, 245を樹脂製とする場合には、通路 233a 233dなどの栓 233の他の部分と一体に形成することもできる。この場合、外部閉塞部材 235， 245は、通路 233a— 233 dの入口部に対応する部分にのみ形成される。

[0139] この実施の形態では、栓 233の通路 233bすなわち収容室に収容され、円盤状になった殺菌剤含浸部材 234, 244は、仕切板 233eによって通路 233b内に保持されてレヽる。殺菌斉 IJ含浸部材 234, 244は、中空針 236, 237, 246, 247などの管体または細管を穿刺して挿通させることが可能であり、例えば、不織布または酒精綿などにより形成されている。酒精綿で殺菌剤含浸部材 234, 244を形成した場合には、ァルコールが含浸されていることになる力殺菌剤になれば、アルコールの他、逆性石鹼などの殺菌作用を有する薬剤を不織布などに含浸させて殺菌剤含浸部材 234, 2 44を形成することができる。さらに、殺菌剤含浸部材 234， 244は、殺菌剤をゲル状にすること、例えば、アルコールゲルなどでも形成できる。アルコールゲルなどで殺菌剤含浸部材 234, 244を形成すれば、殺菌剤含浸部材 234， 244の殺菌剤が殺菌剤含浸部材 234, 244から流出し、この栓 233を備えた容器内に進入し、容器の内容物に影響するのを抑制できる。

[0140] この実施の形態に係る栓 233は、多重蓋様の構造になっており、容器 230， 240のような内部を滅菌した状態で使用する適宜の容器の液の出し入れを行う開口部に取り付けられる。栓 233は、図 25に例示した容器 230, 240のような形状に限らず、様々な形状の容器に適用でき、また、様々な用途の容器に適用できる。例えば、滅菌された薬剤を収容した薬剤容器、培養液を収容した培養器、細胞懸濁液から細胞を遠心分離により回収するための遠沈管、また、管状の容器、直方体状の容器、輸液バックのようなフレキシブル容器など、栓 233は、滅菌して使用する様々な形状と用途の容器に適用できる。

[0141] ここで、例えば、栓 233を備えた容器 230, 240力細胞懸濁液から細胞を遠心分離により回収するための遠沈管であったとすると、容器 230, 240は、内部は滅菌され細胞懸濁液が収容された状態になっているが、遠心分離を行うためにクリーンベンチから出され、一般環境に設置された遠心機にかけられることによって、一般環境に置かれた状態となり、外面が汚染された可能性がある状態となる。このような容器 230 , 240から液を抽出したり、容器 230, 240内に液を注入したりするとき、作業者は、アルコール噴霧などによる容器 230， 240の外面の殺菌操作を行うことなぐ液の抽出または液の注入用のシリンジなどに取り付けた中空針などの管体または細管を、図 25に示す波線の矢印のように、检 233の通路 233a 233dに挿通させる。このとき、栓 233の通路 233a— 233dの入口部から揷入された管体または細管は、殺菌剤含浸部材 244に穿刺されて殺菌剤含浸部材 244を貫通し、仕切板 233eの貫通穴 233 cを通って容器 230, 240の内部に入ることになる。

[0142] したがって、クリーンベンチ内などの清浄環境から一般環境に出されたために外側が汚染されている可能性がある容器 230, 240の影響で、管体または細管の外面が汚染された可能性があつたとしても、中空針などの管体または細管を栓 233に揷通するとき、殺菌剤含浸部材 244に管体または細管が穿刺されることによって、殺菌剤含浸部材 244に含浸されている殺菌剤によって管体または細管の外面を殺菌することができる。したがって、作業者は一般環境に置かれた容器 230， 240にアルコールを噴霧する容器外面の殺菌操作や、栓の周囲のアルコールを拭き取って栓を開けるといった操作を行うことなぐ管体または細管を栓に揷通させるだけでコンタミネーションの発生を抑制しながら、容器 230, 240からの液の抽出や容器 230, 240への液の注入を行うことができる。

[0143] このようにこの実施の形態に係る容器用の栓ゃ容器であれば、容器からの液の抽出や容器への液の注入を行う際の操作を簡素化しながらコンタミネーシヨンの発生を抑制できる。さらに、容器からの液の抽出や容器への液の注入を行う際の操作を簡素化しながらコンタミネーシヨンの発生を抑制できることにより、熟練した技テ者が容器からの液の抽出や容器への液の注入を行う必要がなくなる。また、熟練した技術者による操作が必要なくなることから、例えば再生医療に用いる細胞の増殖などのための細胞培養など、産業的な細胞の生産における細胞培養のコストを低減できる。加えて、従来のように、栓部分の滅菌のための蒸気を供給するための設備や配管が必要ないため、栓ゃ容器の使用に対する制限を低減でき、また、栓などの構造を簡素化できる。

[0144] 一般環境に置かれた容器をアルコールの噴霧などにより殺菌する、容器の栓を外すなどといった操作は、自動的に容器や注入動作などを行う液取扱装置には馴染まず、手作業によって行われることになる。手作業による操作は、作業者自身による汚染の持ち込みや作業者のケアレスミスによるコンタミネーシヨンの発生を招く可能性がめる。

[0145] これに対して、この実施の形態に係る容器用の栓ゃ容器であれば、一般環境に置かれた容器をアルコールの噴霧などにより殺菌する、容器の栓を外すなどといった操作を行う必要がないため、液取扱装置などを用いた容器からの液の抽出や容器への液の注入の自動化が可能となる。そして、自動化が可能になることにより、作業者自身による汚染の持ち込みや作業者のケアレスミスによるコンタミネーシヨンの発生などを防ぐことができる。

[0146] さらに、本実施形態の容器用の栓ゃ容器では、栓 233の通路 233a 233dの入口部側の端面が、管体または細管を穿刺可能であるか、または、取り外し可能で、通路 233aを気密に密閉可能な外部閉塞部材 235, 245で閉塞されている。このため、殺菌剤がアルコールなどであっても、殺菌剤の殺菌剤含浸部材 234， 244からの蒸発を抑制できる。カロえて、外部閉塞部材 235， 245が殺菌剤含浸部材 234， 244に含浸された殺菌剤の蒸発を防ぐため、例えば容器内に試薬を注入した後、この容器内力細胞などの試料のサンプリングを行うといった操作を行う場合でも、殺菌剤含浸部材の殺菌効果が持続する時間を長くでき、また、容器の栓を開ける必要もない。このため、作業者は、容器内へ液を注入し、さらに、容器内からサンプリングつまり液の抽出を行うといった一連の操作を、時間的余裕を持って行うことができる。したがって、作業者に対し、できるだけ速やかにこのような一連の無菌操作を行うといった高度なスキルを求める必要がなくなる。

[0147] 図 26は、図 23— 25の容器用の栓の変形例を示す断面図である。図 26において、図 23—図 25と同じ構成のものには同一の符号が付してあるので、その説明は省略し、相違する構成や特徴部などにっレ、て説明する。

[0148] 図 26の容器用の栓 2331が図 23—図 25の栓 233と相違する点は、栓の通路に収容した殺菌剤含浸部材と殺菌剤含浸部材を通路内に保持する仕切板との間に通路を閉塞する内部閉塞部材が設けられている点である。すなわち、この実施の形態に係る容器用の栓 2331は、入口部 233a、収容室 233b、仕切板 233eの中央部に形成された貫通穴 233c、そして出口部 233dなどからなる通路の形状などは図 23 図 25の栓 233と同じである。しカゝし、収容室 233bを画成する壁の内面のうち、収容室 2 33bの底面となる仕切板 233eの面及び収容室 233bの側面となる面を覆うように膜状の内部閉塞部材 233fが設けられている。そして、殺菌剤含浸部材 234, 244は、内部閉塞部材 233fで覆われた状態で収容室 233b内に収容されている。言い換えれば、内部閉塞部材 233fは、殺菌剤含浸部材 234, 244と、収容室 233bの底面となる仕切板 233eの面や収容室 233bの側面となる面との間に挟まれた状態で設置された器状の部材である。

[0149] 図 26の内部閉塞部材 233fは、柔軟性と弾性を有する樹脂製、例えば注射薬などの容器の栓などで使用されるエラトマ樹脂やシリコン、天然ゴムなどの樹脂製の膜で構成され、貫通穴 233cの収容室 233b側の開口を密閉すると共に、穿刺した中空針などの管体または細管を抜いた後でもそれに形成された穴はほとんど閉じた状態となるものである。さらに、内部閉塞部材 233fは、器状に形成されていることで内側に液体を保持できるようになつている。また、殺菌剤含浸部材 234_P244を貫通してきた中空針などの管体または細管の外面に付着した殺菌剤を払拭することもできる。

[0150] 内部閉塞部材 233fの中央部、つまり、仕切板 233eに形成された貫通穴 233cに対応する部分は、収容室 233b内側に向けて先端に向力うに連れて細くなる円錐台状に突出しており、この円錐台状に突出した部分が中空針などの管体または細管が穿刺されて貫通する貫通部 233gとなる。円錐台状の貫通部 233g内は、中空針などの管体または細管を穿刺して貫通させ易いように、貫通穴 233cに連続した中空状態を形成するようになっている。なお、この殺菌剤含浸部材 234， 244は、器状の内部閉塞部材 233f内に収容された状態で収容室 233b内に設置されている。また、この殺菌剤含浸部材 234, 244は、内部閉塞部材 233fの貫通部 233gに対応する部分が凹んだ状態となっている。

[0151] このような栓 2331は、収容室 233bつまり殺菌剤含浸部材 234, 244側に突出した貫通部 233gを有する器状の内部閉塞部材 233fを備えており、さらに、その内部閉塞部材 233f内に殺菌剤含浸部材 234, 244を備えている。そして、中空針などの管体または細管を穿刺する貫通部 233gが内部閉塞部材 233fの他の部分よりも高くなるように段差を有し、他の部分よりも表面積が狭い貫通部 233gの頂点部分に中空針などの管体または細管が穿刺される。このため、殺菌剤含浸部材 234, 244からの過剰な殺菌剤が流出したり、殺菌剤含浸部材 234, 244に中空針などの管体または細管を穿刺するときの管体または細管による加圧で殺菌剤含浸部材 234, 244から殺菌剤が流出したりしても、流出した殺菌剤は、内部閉塞部材 233fの貫通部 233g周囲の器状の部分に溜まる。したがって、殺菌剤含浸部材 234, 244から殺菌剤が流出したとしても、流出した殺菌剤が貫通穴 233cを介して容器内へ流入し、容器の内容物に影響を与えるのを抑制することができる。

[0152] さらに、殺菌剤含浸部材 234, 244から殺菌剤が流出したとしても、流出した殺菌剤が貫通穴 233cを介して容器内へ流入し難いため、中空針などの管体または細管を穿刺して容器からの液の抽出や容器内への液の注入といった操作を行うときに、殺菌剤含浸部材 5から殺菌剤が流出しないよう、また、流出した殺菌剤が貫通穴 233 cを介して容器内へ流入しないよう注意しながら操作を行う必要がなくなり、このような操作を容易にすることができる。また、この実施の形態では、内部閉塞部材 233fは、全体を柔軟性と弾性を有する樹脂で形成したが、少なくとも図示していない中空針などの管体または細管が揷通される部分のみを柔軟性と弾性を有する樹脂製とした構成などにすることもできる。

[0153] 図 27は、図 23— 25の容器用の栓の別の変形例を示す断面図である。図 27において、図 23—図 25と同じ構成のものには同一の符号が付してあるので、その説明は省略し、相違する構成や特徴部などについて説明する。

[0154] 図 27の容器用の栓 2332が図 23—図 25の栓 233と相違する点は、栓の通路に収容した殺菌剤含浸部材と殺菌剤含浸部材を通路内に保持する仕切板との間に通路を閉塞する内部閉塞部材が設けられており、さらに、内部閉塞部材と殺菌剤含浸部材の形状が異なる点である。すなわち、この実施の形態に係る栓 2332は、収容室 2 33b側の仕切板 233eを覆うように円形の膜状の内部閉塞部材 233hと、収容室 233 bに収容された粒状の複数の殺菌剤含浸部材 234a， 244aとを備えている。

[0155] この実施の形態に係る内部閉塞部材 233hは、柔軟性と弾性を有する樹脂製、例えば注射薬などの容器の栓などで使用されるエラトマ樹脂やシリコン、天然ゴムなどの樹脂製の円形の膜であり、貫通穴 233cの収容室 233b側の開口を密閉すると共に、穿刺した中空針などの管体または細管を抜いても形成された穴はほとんど閉じた状態となるものである。また、この内部閉塞部材 233hでは、仕切板 233e側の面の中央部つまり仕切板 233eの貫通穴 233cに対応する位置に、貫通穴 233cに嵌合する突起 233jが形成されている。この殺菌剤含浸部材 234a, 244aは、吸水性を有する粒状の部材、例えばウレタンビーズなどで形成されており、殺菌剤が含浸されている

[0156] 内部閉塞部材 233hは、栓 2332を備えた容器内への殺菌剤の流入を抑制すると共に、殺菌剤含浸部材 234a, 244aの径が貫通穴 233cの径よりも小さい場合には、殺菌剤含浸部材 234a， 244aが貫通穴 233cを介して容器内へ入るのを防いでいる。これにより、栓 2332を備えた容器の内容物への殺菌剤の影響を抑制している。

[0157] この実施の形態に係る栓 2332では、殺菌剤含浸部材 234a, 244aが粒状で収容室 233bに複数収容された状態となっている。このため、中空針などの管体または細管を円盤状の殺菌剤含浸部材に穿刺する必要がなぐ中空針などの管体または細管は、複数の殺菌剤含浸部材 234a， 244aの間を殺菌剤含浸部材 234a， 244aに外面が接触しながら栓 2332に揷通されることになる。したがって、中空針などの管体または細管を円盤状の殺菌剤含浸部材に穿刺する場合に比べ、中空針などの管体または細管の栓への抜き差しを容易にできる。さらに、円盤状の殺菌剤含浸部材を中空針などの管体または細管を穿刺するときに加圧し難いため、中空針などの管体または細管を栓に挿通するときの殺菌剤含浸部材からの殺菌剤の流出を抑制できる

[0158] 図 28は、図 23— 25の容器用の栓のさらに別の変形例を示す断面図である。図 28 において、図 23—図 25と同じ構成のものには同一の符号が付してあるので、その説明は省略し、相違する構成や特徴部などについて説明する。

[0159] 図 28の容器用の栓 2333が図 25—図 27のものと相違する点は、栓の通路の殺菌剤含浸部材よりも容器内側に、中空針などの管体または細管の外面に付着した液体を拭き取る拭き取り部材を設けたことにある。すなわち、この実施の形態に係る容器用の栓 2333は、通路 233a— 233dの出口部内に設置された円盤状の拭き取り部材 233kを備えた点にある。拭き取り部材 233kは、仕切板 233eの殺菌剤含浸部材 23 4, 244が設置された側の面と反対側の面、つまり、容器内側の面に接した状態で設けられており、仕切板 233eに形成されている貫通穴 233cの出口側を塞いだ状態になっている。拭き取り部材 233kは、中空針などの管体または細管を穿刺可能で、中空針などの管体または細管外面に付着した液体を拭き取ることができる材料、例えば発泡スチロール、綿、ウレタン、その他のフィルターまたはフィルタ一様の部材などで形成されている。

[0160] この実施の形態の容器用の栓 2333は、中空針などの管体または細管が殺菌剤含浸部材 234, 244に穿刺され貫通した後、拭き取り部材 233kに穿刺されることによつて、殺菌剤含浸部材 234， 244を貫通したときに中空針などの管体または細管の外面に付着したアルコールなどの殺菌剤を拭き取ることができる。したがって、殺菌剤含浸部材 234, 244を貫通した中空針などの管体または細管の外面に殺菌剤が付着することによって、容器内に殺菌剤が持ち込まれるのを抑制できるため、殺菌剤の容器の内容物への影響を低減できる。

[0161] 図 29及び図 30は、容器からの液の抽出や容器への液の注入を行う際の操作の概略を説明する図である。図 23の容器用の栓 233を備えた容器 230を用レ、、液の容器への注入及び液の容器からの抽出の少なくとも一方の機能、つまり、サンプリング装置及び分注装置の少なくとも一方の機能を果たす液取扱装置について説明する。この液取扱装置は、図 14の培養前細胞を貯留する容器 230から培養前細胞を培養器 140に送液したり、培養器 140から容器 230に培養後細胞を送液するものである。すなわち、液取扱装置は、例えば、培養器 140からの細胞懸濁液のサンプリングや薬液の吸入とレ、つたような液の抽出、培養液が入った培養器 140への細胞懸濁液の注入による細胞の播種や薬液の注入といったような液の注入など、サンプリング装置及び分注装置の少なくとも一方の機能を果たすものである。この実施の形態では、図 2 5に示すように栓 233を備えた容器 230を用いた場合を例示する。なお、図 26—図 2 8に示した检 2331， 2332, 2333を備えた容器を用レヽることもできる。

[0162] 図 29及び図 30の液取扱装置は、栓 233を備えた容器 230は、台座 291上の保持具 292によって保持されている。容器 230の栓 233の上方には、液の容器 230への注入及び液の容器 230からの抽出の少なくとも一方を行なうための中空針などの管体または細管 293が支持部材 294によって支持されている。支持部材 294は、駆動機構 295を介して、駆動機構 295による管体または細管 293の上下方向の移動をガイドするガイド棒 295に連結されている。ガイド棒 295は、台座 291から上方に向けて延在した状態で台座 291に固定されている。管体または細管 293は、チューブ 296 を介して、液の吸引及び排出の少なくとも一方を行なうためのポンプ 297に接続されている。ここでの、管体または細管 293が図 14の針 236, 246に、ポンプ 297が図 14 のしごきポンプ 144， 147に、チューブ 296が図 14のチューブ 142d, 141bにそれぞれ対応することになる。なお、図 29及び図 30では、図 14のモータ 231については省略してある。

[0163] チューブ 196は、管体または細管 293の一方の端部と支持部材 294の下面に設けられた連結部 294aで連結されている。また、連結部 294aには、管体または細管 29 3を覆う袋状の被覆部材 298の開口部分が気密に取り付けられている。被覆部材 29 8は、管体または細管 293を穿刺可能な柔軟で弾性及び気密性を有する膜状の材料、例えばゴムやシリコン、エラトマ樹脂などで形成された袋状の部材である。

[0164] この実施の形態に係る液取扱装置では、中空針などの管体または細管 293を栓 2 33に挿通させていないときは、図 29に示すように、中空針などの管体または細管 29 3は、被覆部材 298に内包されることによって、被覆部材 298の外側の環境と気密に隔離された状態になっている。したがって、液取扱装置が、清浄環境つまりクリーンベンチの外など、外気に触れる一般環境下に置かれても、被覆部材 298内に在る管体または細管 293は外気から汚染されることはない。

[0165] 液の注入や抽出のために、中空針などの管体または細管 293を栓 233に揷通させて容器 230内に挿入するときは、駆動機構 295がガイド棒 295に沿って下方に移動する。これにより、図 25に示すように、管体または細管 293は、栓 233の外部閉塞部材 235、殺菌剤含浸部材 234に順次穿刺され、容器 230内に挿入される。このとき、管体または細管 293は、図 30に示すように、被覆部材 298の下端部分が栓 233の外部閉塞部材 235の外面に接触した状態で、被覆部材 298と外部閉塞部材 235とを穿刺し、栓 233の通路 233a— 233d内に揷通されて行く。したがって、管体または細管 293が容器 223内に挿入されるときも、被覆部材 298内は密閉状態が保たれており、管体または細管 293の栓 233の外側にある部分が外気に曝されることはなぐ被覆部材 298内に在る管体または細管 293の部分の外気からの汚染は生じなレ、。また、管体または細管 293の栓 233内に揷通されている部分も、上述したように汚染が生じることは無い。

[0166] 管体または細管 293を容器 230から抜くときは、駆動機構 295がガイド棒 294に沿つて上方に移動する。これにより、管体または細管 293は、図 30の状態から図 29に示すように、被覆部材 298に内包された状態に戻る。また、被覆部材 298は柔軟性かつ弾性を有しているため、管体または細管 293が穿刺されたときに形成された穴は閉じられた状態となり、被覆部材 298の密封性が維持される。したがって、管体または細管 293を容器 230から抜いた後も、管体または細管 293が外気に触れることによる汚染は防止されることとなる。

[0167] この実施の形態に係る液取扱装置では、図 23に示したような栓 233を備えた容器を用レ、、さらに、中空針などの管体または細管 293が、管体または細管 293を穿刺可能な柔軟で弾性及び気密性を有する膜状の材料で形成された袋状の被覆部材 298 によって覆われているため、栓に揷通されていない状態の管体または細管の汚染も抑制できるため、コンタミネーシヨンの発生をより確実に抑制できる。また、この液取扱装置は、図 29及び図 30の構成のものに限らず、管体または細管を被覆部材で被覆していれば様々な態様で実施することは可能であり、種々の変形例を包含するものである。さらに、容器用の栓 233や容器 230は、上述した実施の形態の構成の容器用の栓に限らず、管体または細管が挿通される通路が形成されており、この通路内に、管体または細管を穿刺可能で、殺菌剤を含浸した殺菌剤含浸部材が保持した構成の栓であれば様々な構成のものを適用するができることは言うまでもない。

[0168] 通常、図 1及び図 14に示すようなピンチ弁を用いた細胞培養装置は、ピンチ弁を駆動するための圧力を細胞培養装置の外部に設置された空気圧縮装置 (エアコンプレッサ）などから圧縮空気として取り込むか、又は細胞培養装置に内蔵された空気圧縮機を用いて動作させてていた。外部から圧縮空気を取り込む場合、空気圧縮装置力、ら細胞培養装置までの配管が必要となり、通常は配管は壁、天井などに固定されるため細胞培養装置の設置場所が制限されたり、設置が不可能となったりして、好ましくなかった。また、細胞培養装置に内蔵された空気圧縮機を用レ、る方式では設置場所に制限はないが、発塵、振動、騒音などの問題があり、好ましくなかった。

[0169] そこで、図 14の実施の形態では、二酸化炭素ボンべ 210内のガスをチューブの各所に設けられたピンチ弁を駆動のための圧縮空気として使用している。二酸化炭素ボンべ 210内のガスは、レギユレータ 211及び多連型電磁弁 213を介して、チューブの各所に設けられたピンチ弁に送出される。なお、二酸化炭素のガス圧力が低くなるとピンチ弁の駆動はできなくなるが、細胞培養時においては、二酸化炭素の使用は必須であるので、その可能性は少ない。また、ピンチ弁の二酸化炭素ガスの使用量は 1回当たり 0. 5cc程度であるので、保温箱 160内で使用される二酸化炭素ガスの量と比較してもかなり少ないものである。図 1の実施の形態の場合も同様にしてピンチ弁を駆動している。

[0170] 図 1及び図 14の細胞培養装置では、任意のタイミングで任意の時間だけピンチ弁を開閉制御することにより、必要な試薬を必要量、培養器 140に注入したり、培地を廃液したりすることができる。二酸化炭素ホンべ 210は、エアチューブ（図 14の点線で示した配管）を通して各ピンチ弁に二酸化炭素ガスを供給している。一方、二酸化炭素ボンべ 210からはレギユレータ 211及び電磁弁 212を介して所定量の二酸化炭素が保温箱 160内に供給されている。

[0171] 各ピンチ弁に供給される二酸化炭素ガスは、ピンチ弁駆動用のエアシリンダに圧縮空気として送出され、そこでピンチ弁の駆動に使用され、保温箱 160に供給される二酸化炭素ガスは保温箱 160内の二酸化炭素濃度を調整するのに用いられる。ピンチ弁駆動用のエアシリンダは、エアシリンダにかかる圧力が仕様を満たすならば、何個でも増設可能である。図 14では、二酸化炭素ボンべ 210からの二酸化炭素ガスは、エアチューブでレギユレータ 211に接続されているが、図示していないがこの間には、菌を取り除く滅菌フィルタ、水分を取り除くミストフィルタなどが設けられている。ピンチ弁駆動用のエアシリンダは、通常 2本のチューブを持ち、一方に二酸化炭素ガスを供給することによりエアシリンダが動作し、ピンチ弁を閉じ、他方に二酸化炭素ガスを供給することによりエアシリンダが逆方向に動作し、ピンチ弁を開くように構成されている。このような二酸化炭素ガスの供給を切り替えるのが、多連型電磁弁 213である。一方、保温箱 160に供給する二酸化炭素ガスは、電磁弁 212によって、その注入と遮断が制御されるようになっている。通常は二酸化炭素センサ 205を用いて保温箱 1 60内の二酸化炭素濃度を測定し、目標値よりも低い場合は、電磁弁 212を開放し、高い場合は電磁弁 212を閉じて、保温箱 160内の二酸化炭素濃度を一定に保持している。なお、ここでは二酸化炭素ボンべを例に説明した力非可燃性ガスであれば、同様にして使用できることは言うまでもない。

[0172] 通常、培養細胞中において、コロニーの有無またはその大きさを確認するには、糸田胞を染色して肉眼で確認したり、カメラで撮影した画像に対して画像処理を施すことによって確認、していた。カメラを用いてコロニーを撮影する際は、たとえば、特開 200 1—275659号公報に記載されているように、培養器全体が一時に撮影できるような広レヽ画角を持った低倍率のレンズを使用してレ、た。このように培養器全体を低倍率広画角のレンズを使ったカメラで撮影することによってコロニーの有無を迅速に確認していた。

[0173] しかし、培養細胞中にコロニーが小さかったり、カメラの解像度が低い場合などには、コロニーを明瞭に描出できないことがあった。また、コロニーの有無とサイズを確認した後、任意のコロニー内の細胞を撮影するには、より高い倍率のレンズを別途用意しなければならな力た。このような場合に、低倍率のレンズで確認された位置精度の低い画像から目標位置を探し出して、高倍率レンズでの撮影のためカメラまたは培養器をその位置に移動するのは大変に手間のかかる作業であった。

[0174] そこで、この実施の形態では、細胞を培養する際に、コロニーの有無とそのサイズ確認という作業と、コロニー内の細胞の培養経過の詳細な観察という作業とを同時に行なうことができ、さらに、作業間の切り替えをするにあたり、外部からのコンタミネーシヨンを排除し、培養状態の観察にあたり、培養細胞へのダメージを極力排除することができるようなカメラ撮影システムを採用した。

[0175] 図 31は、カメラ撮影システムに概略構成を示すブロック図である。カメラ撮影システム 310は、保温箱 160内の培養器 140を撮影する CCDカメラ 31から得られる画像データに種々の処理を施して細胞などを確認できるように表示するものであり、コンバータ 311、画像処理ユニット 312、モータコントローラ 313及びカメラ'培養器駆動装置 3 14から構成される。培養器 140と CCDカメラ 31との位置関係は、図 14に示す通りであり、保温箱 160の上側に設けられた光源 34aからの光を保温箱 160の下側に設けられた観察窓 32aを介して CCDカメラ 31 aで撮影する。図 1の細胞培養装置の場合にも同様の位置関係にあるものとする。

[0176] コンバータ 311は、 CCDカメラ 31で撮影された画像データを画像処理ユニット 14 に転送するための電気信号に変換するものである。画像処理ユニット 14は、コンバータ 311から入力された電気信号に種々の処理をカ卩えて、細胞を視認し易い画像に変換する。モータコントローラ 313は、画像処理された画像に基づいて CCDカメラ 31と培養器 140との相対的な位置関係を所望の関係に制御するものであり、カメラ'培養器駆動装置 314は、 CCDカメラ 31と培養器 12をその所望の関係となるように移動するものである。

[0177] 図 32は、図 14の中におけるカメラ撮影システムに関係する部分を抽出して模式的に示す図である。すなわち、この図は、 CCDカメラ 31と培養器 140との相対的な位置関係を制御する場合の最も典型的な制御機構を示す図である。保温箱 160内に培養器 140が固定的に存在する場合に、この培養器 140に対して CCDカメラ 31を移動させて、両者の相対的な位置関係を制御している。なお、図 1に示すように CCD カメラ 31が固定的に設けられ、培養器 140 (又は内部の鏡）が移動するようにしてもよいし、図 14に示すように両者が同時に移動するようにしてもよい。

[0178] 図 32では、保温箱 160の中に CCDカメラ 31と、培養器 140と、 CCDカメラ 31の移動用ガイド 315とが閉鎖的に内含される場合を図示している。これ以外に、培養器 14 0内の細胞に光をあてる照明装置となる光源 34、カメラ'培養器駆動装置 314によつて駆動されるモーター 29a、画像信号を電気信号に変換するコンバータ 311などを保温箱 160の中に内含していてもよい。

[0179] 培養器 140は、培養に通常使用されるフラスコや培養皿であってもよいし、特願 20 02— 180120号公報、特願 2003— 027710号公報又は特願 2003— 420510号公報のような構成のものであってもよレ、。

[0180] CCDカメラ 31は光学的な撮像装置であれば、 CCDでもよレ、し CMOSでもよレ、し、そのほか電気的、電子的、あるいは光学的な信号を取得できるものであれば何でもよレ、。 CCDカメラ 31にはレンズ 316が取り付け可能であり、レンズ 316は交換式でもあるいは据付式でもよレ、。 CCDカメラのレンズ交換マウントとして、例えば通称 Cマウントと呼ばれるネジ式のマウントの他、バョネット式のものも適用可能である。レンズ据付式であれば、カメラ内へのごみやほこりや湿気の混入をより避けることが可能で、撮影画像にこれらが映りこむ危険を減らすことができるとともに、これらが保温箱 160内にもれてコンタミネーシヨンを生じる危険も回避することができる。

[0181] なお、レンズの交換は必須ではないために安価でコンタミ招来の危険性の少なく密封性の高いレンズ固定式のカメラが使用可能である。また、レンズ 316は、比較的高い倍率で視野が広くないものを使用する。これ以降、倍率といえば、カメラの撮像素子サイズとレンズの焦点距離と撮影距離によって決まる撮影倍率のことをいうものとする。また、視野範囲も同様にカメラの撮像素子サイズとカメラの絞りないしはシャッター開口径とレンズの画角によって決まるものをいう。

[0182] 図 32では、照明装置は図示していないが、培養器を透明にしてその裏側から照射する透過光を撮影する方式やカメラ側から光を当てて反射光を撮影する方式などがある。透過光方式であれば、照明装置は培養器の下部に配置する。このとき必ずしも保温箱 160内におく必要はなぐ保温箱 160の下部を光透過性のある構成とすれば、保温箱 160の外側においてもよレ、。保温箱 160の外においておけば、万が一の故障や玉切れなどの際に、コンタミネーシヨンの危険を冒さずに修理交換できる。

[0183] また、光源は、培養する細胞にとって有害な波長成分を有さなレ、ものがよい。例えば、紫外線は細胞の DNAに損傷を与えたり、紫外線誘発アポトーシスを惹起し、結果的に細胞の癌化の原因となると言われている。したがって、通常の細胞を培養するときは、光源としてそのような成分を含むことは避けなければならない。

[0184] また、赤外線は熱を生じるために細胞にとってストレスとなりうる。逆に、特定の波長の光が細胞を活性化することもあるので、積極的に光源の波長が培養に有利なものとなるよう制御することもできる。光源の波長やその成分比は、培養する細胞やその目的に合わせて変更できるようにしておくことが望ましい。具体的には、光源と培養器の間にフィルターを介在させることで上記のように細胞の培養に好ましくない紫外線成分を遮断させたり、単色性の強レ、 LEDなどの光源を複数用意しておき選択的にォンオフすることでも任意の波長成分を含んだ光源の作成が可能である。あるいは 3波長蛍光管とフィルターを併用することでも波長の選択が可能である。

[0185] また、反射光式の場合も、透過光式と同様に、光源は保温箱 160内にあっても外にあってもよレ、。保温箱 160内にあれば細胞との距離が短いため光源への供給電力が少なくて済む反面、光強度が強すぎて細胞にダメージを与えたり、光が十分拡散しないため画像に明度のむらを生じることもある。保温箱 160の外にあれば、透過光式のところで説明したのと同じ理由でコンタミネーションの機会を減少できるとともに、光源の保守が容易となる反面、照明からの光がカメラによって遮られるために画像に明度のむらの生じることもある。このような場合には、保温箱内にレンズ周りを取り囲むようなリングライトを使用することもできる。あるいは、特に照明装置を設けずに保温箱外の部屋の照明で細胞を照らすことも可能である。この場合も、光源の波長についてはすでに透過光方式のところで説明したとおりである。

[0186] なお、透過光の場合は光が細胞表面に回りこみにくいために、培養細胞の下にフィーダー細胞が存在するときなどは、細胞表面が確認しにくい場合が生じる。このような場合には、反射光方式を併用するとよい。照明装置は、波長だけでなくその光量や照射角度などを調整可能なものとすれば、撮影画像をより高画質にすることができる。

[0187] カメラ'培養器駆動装置 314は、図 32に示すように保温箱 160内に配置されているものとして説明する。図 32では、 CCDカメラ 31と、これを支えるスタンド 317、このスタンド 317を支えるためのベースとなる台車 318がレール 315上を直線移動するようになっている。台車 318には動力伝達部 319を介してモーター 320aが取り付けられている。このモーター 320aを駆動回転することで、動力伝達部 319を経由して台車 31 8を直線移動させることができる。

[0188] このように図 32では、カメラ.培養器駆動装置 314は、モーター 320a、台車 3189、およびレール 315から構成されている力図 14では、培養器駆動モータ 29a、レール 34b, 31b、ローラ 34c, 34d, 31c, 31dなどで構成され、培養器 140が旋回移動し、 CCDカメラ 31が直線移動して、両者の相対的な位置関係を調節している。

[0189] モーター 320aは、モーターコントローラ 313からの指示を受けて、培養器 140の表面との距離をほぼ一定に保ちながら、その表面を 2次元的に走查するように駆動しいてる。そして、この走査と同時に CCDカメラ 31で撮影することによって、培養器 140 の全面を画像化することができる。 [0190] 図 33は、 CCDカメラの走査の様子を示す図である。図 33 (a)は、培養器 140の形状が横長矩形であって、 Y方向を視野範囲 331に収めることのできる倍率のレンズ 3 16を用いた場合を示すものである。この場合には、 Y方向への走査は不要なので、 X 方向にだけ走查すればよい。このとき培養器とカメラの位置関係は相対的なものであればいいので、図 33 (a)のような一方向走查をする場合には、図 32に示すようにカメラ側を XYに動かす構成と図 34に示すように培養器 140側を動かす構成のいずれを採用してもよい。

[0191] 図 33 (b)は、培養器 140が正方形に近くその面積が大きいため X方向の走查だけでは Y方向を視野範囲 331に収められない場合を示す。この場合には、 X方向及び γ方向の両方に走查すればよい。この場合も、同様に培養器とカメラの位置関係は相対的なものであればいいので、図 32の構成で走查することができる。図 34の構成の場合には、カメラ'培養器駆動装置 314によってカメラ 31を少なくとも Y方向に走查可能に構成する必要がある。例えば、図 32の場合、モータ 320a、動力伝達部 319 及びレール 315と同様のセットを台車 318上に 90度回転させて載置すれば X-Y方向に走査が可能となる。また、図 34に示すように培養器を動かす構成の場合にも、同様に直交する 2方向に走査可能な構成にすれば、図 33 (b)のような撮影を行うことができる。

[0192] 図 33 (c)に示すように、培養器 140が図 1又は図 14に示すように円形に近ぐその半径を視野範囲 331に収められる場合には、培養器 140の中心を回転軸として Θ方向にのみ走査すればよい。この場合は、図 5のような構成を利用することで走査可能となる。図 35では、培養器 140は円形のものとし、スタンド 350の先端にモーター 35 1を取り付けて、モーター 351を回転させることでカメラ 31を円形状に走查する。なお、カメラ 31でなく培養器 140を円形状に移動可能としてもよい。

[0193] 図 33 (d)に示すように、培養器 140が円形に近ぐその半径を視野範囲 331に収められない場合には、 r方向と Θ方向の両方に走查すればよい。この場合も、図 35のような構成によって走查可能である。ただし、 r方向にも走查する必要があるために、カメラ 31がその上に搭載された別のモーター 353によって回転アーム 352上をスライド可能とすればよい。また、カメラ 31ではなく培養器 140の方を移動可能としてもよい [0194] 図 33 (e)は、図 14の培養器 140とカメラ 31との関係を示す図である。図に示すように、培養器 140は、ロータ 153を中心として、保温箱 160内を矢印 140sのように旋回する。一方、カメラ 31は、矢印 331aのようにレール 31bに沿って直線移動するので、両者の位置関係を適宜調整することによって、視野範囲 331に培養器 140を全て含めて走查することが可能である。

[0195] 図 36は、図 31の画像処理ユニット 312の詳細を示す図である。画像処理ユニット 3 12は、データバス 361を介して演算処理を行う CPU362と、この CPU362が一時的に記憶領域として使用する主メモリ 363と、画像データや位置情報を格納する外部記憶装置 364と、モータコントローラ 313と通信するための通信ポート 365と、細胞抽出後の画像を表示するモニタ 366と、ユーザの入力を受け付けるキーボード 367とから構成される。この画像処理ユニット 312は、 CCDカメラ 31からの画像をコンバータ 3 11を介して取り込み、種々の画像処理を行なう。

[0196] 図 37は、画像処理ユニット 14が実行するコロニー判別の処理手順を示すフローチヤート図である。培養器 140の大きさは予め外部記憶装置 364に設定されている場合と、カメラ 31を用いて画像処理により検出する場合とがあるが、この実施の形態では予め設定されている場合で説明する。

[0197] ステップ S371では、培養器 140を撮影するための走査位置情報である画像撮影位置リストを作成する。走査にあたっては培養器 140全体を撮影するように決定してもよレ、し、培養器 140の一部を撮影するように決定してもよい。画像位置リストは、例えば培養器 140の培養に供する平面を X— Y座標系とすると、その上の複数の X— Y 座標点の集合である。この画像撮影位置リストは、主メモリ 363に格納され、その内容はモーターコントローラ ₃₁₃などによって随時参照可能となる。画像撮影位置リストは

、図 33で説明したように、レンズの視野範囲（画角）と培養器 140の大きさとによって決定されるものである。

[0198] ステップ S372では、前のステップ S371で作成された画像撮影位置リストに従って、 CPU362が移動命令を出す。 CPU362が出した移動命令は、データバス 361、通信ポート 365を経由してモーターコントローラ 367に到達する。モーターコントローラ 3 13は、カメラ'培養器駆動装置 314を動作させて、画像撮影位置リストに記録された撮影位置でカメラ 31または培養器 140を停止させる。

[0199] ステップ S373では、画像撮影位置リストに対応した目的位置に到達する度に、画像の撮影と多値化処理を行う。つまり、 CPU362により画像取り込み命令がカメラ 31 に出される。カメラ 31は、画像データをコンバータ 311にて電気的信号に変換した後、この信号をデータバス 361経由で主メモリ 363に転送する。 CPU362では、この信号をモニタ 366に表示するための多値化処理を実行する。

[0200] ステップ S374では、主メモリ 363に格納されている画像データに基づいて CPU36 2が濃淡情報を取得するためにヒストグラム算出処理を実行する。

[0201] ステップ S375では、濃淡情報すなわちヒストグラムが最大となる画素値を撮影位置情報と共に外部記憶装置 364に保存する。

[0202] ステップ S376では、画像撮影位置リストに記された撮影位置をすベて撮影し終えたか否かの判定、すなわち、全計測ポイントについて撮影が終了したか否かの判定を行い、撮影終了（yes)と判定された場合には次のステップ S377に進み、そうでない場合にはステップ S372にリターンする。

[0203] ステップ S377では、外部記憶装置 364に格納されている位置情報と画素値を読み出し、主メモリ 363にその位置情報に対応する画素値を格納し、モニタ 366に表示可能な画像として準備する。

[0204] ステップ S378では、このようにして作成された濃淡画像を、予め経験的に求められ外部記憶装置 364に格納されている閾値と比較することにより、二値化する。

[0205] ステップ S379では、前のステップ S377で得られた二値化画像力コロニーの有無、すなわち大きさ、面積、周囲長を算出して終了する。

[0206] 以上のようにして、コロニーの大きさ、面積、周囲長が取得できるが、こうして確認したコロニーの詳細画像を確認する場合は、撮影データを外部記憶装置 364などに画像撮影位置リスト内の走査位置情報や撮影位置の情報とともに記録しておき、該当する撮影位置を手力 Sかりに撮影画像を呼び出すようにすればよい。上述したように、レンズは高い倍率のものを使用可能であるため、再度別のレンズを使用して撮りなおさなくても、撮影済みの画像力培養状態を評価可能である。これによつて継代のタイミングなどの決定がより確実に短時間でコンタミのリスクなしに行えるようになる。

[0207] 次に培養器 140の大きさをカメラ 31を用いて画像処理により検出する場合にについて説明する。この場合は、図 37のステップ S371の画像撮影位置リストの作成の部分を次のように変形することによって実現可能である。すなわち、ステップ S371の実行にあたり、設計の許す範囲内で、できるだけ広く培養器 140を含む領域をスキャンする。こうして得られた画像から培養器 140の大きさを求める。さらに、カメラの倍率や視野範囲の情報から CPU362にて画像撮影位置リストを作成する。この際、カメラ 31 の撮影距離からレンズの倍率やカメラ 31の視野範囲の情報も認識可能である。

[0208] 従って、培養器 140の大きさ及びレンズの倍率やカメラ 31の視野範囲の情報を全て撮影前に自動的に認識可能であり、画像撮影位置リストも全自動で設定可能となる。画像撮影位置リストを作成するにあたっては、 CPU362は、図 33 (a)から図 33 (d )のように培養器 140を網羅的に走查できる視野範囲 331の経路を決定する。さらに同経路中撮影するタイミングも計算して、その地点を撮影位置とする。この経路は、培養物に極力ストレスを与えない観点から、ひとふで書きでトレースできるようなものが望ましい。こうして作成した撮影位置の集合を、 X— Y座標ないしは r一 Θ座標の集合として外部記憶装置 364などに記憶する。これが画像撮影位置リストの作成方法である。なお、ステップ S371の実行に当たってはステップ 373で説明した照明を使用して撮影してもよい。

[0209] このようにしてカメラ 31を用いて画像処理により撮影位置を特定しているために、異なるサイズの培養器に対してそのサイズを入力しなくても走査が可能となる。例えば、完全密閉の保温箱内で培養の前に培養器表面積を計測し忘れても、ステップ 371の事前走査によって画像撮影位置リストを作成可能である。このためより作業者の負担が軽減できる。

[0210] 上述の実施の形態では、画像撮影位置リストに記載の撮影位置で撮影を行う場合について説明したが、走査の経路に沿ってカメラを随時移動させながら撮影位置でカメラを停止させることなく撮影を行う場合について説明する。

[0211] 撮影位置でカメラを停止させることなく撮影を行う場合には、カメラが移動していることによって画像のブレが心配される。この画像のブレは、シャッタースピードと走查速度によってその許容度が決まるものである。例えば、培養細胞の大きさが 100マイク口ミリ程度、走査速度が 1 [mm]当り 1秒、シャッタースピードが 1/1000秒ならば、一画像あたりの移動距離は 1マイクロミリでり、この数値は培養細胞の大きさに対し無視できるブレとなる。このように培養対象の細胞の大きさに応じて、走查速度とシャツタ一スピードを変化させて連続撮影に最適なパラメータを決定する。

[0212] コロニー判別のためには画像の濃淡を用いるため、コロニーの辺縁を明瞭に捉える必要はなぐまた撮影は短時間で終了するため、撮影時にカメラ 31または培養器 14 0が完全に静止している必要はない。連続撮影することでカメラ 31や培養器 140の移動停止を繰り返す必要がなくなり培養器 140に与える震動なども小さくすることができる。このように構成することで撮影時間を短縮可能であるとともに、特に培養器 14 0を移動させて撮影する場合には、細胞に対するストレスを低減できるという長所もある。

[0213] 上述の実施の形態では、カメラの光学系は、単純光を用いて細胞表面における散乱光ないしは透過光を検出する方式で説明した力これにこだわらず位相差方式の光学系を用いてもよい。

[0214] 通常、培養中に取得した画像データから細胞を抽出するには、画素値の分布をもとに閾値を算出し、その閾値以上あるいは閾値以下の画素を細胞として抽出していた。培地の色変化、光源の光量の変化、画像中心部と周辺部の明暗差、画像に含まれるノイズなどの影響を受けずに安定して細胞を抽出するためには、細胞抽出処理の前にノイズ除去、平滑化フィルタ、輪郭強調などのフィルタ処理が必須であった。画像データ内で明るさの変化をモニタし、特定のしきい値でトリガ信号を発生して、所定の遅延時間後に繰り返しカメラで撮像してその加算平均を求めるようにしたものがある。

[0215] このようにフィルタ処理を行なうものは、細胞抽出処理前のフィルタ処理が細胞抽出精度に大きな影響を与えていた。このフィルタ処理によって、画像中心部と周辺部の明暗差、画像に含まれるノイズなどをある程度除去することができ、また、特許文献 1 に記載されたものも画像に含まれるノイズなどをある程度除去することができる。ところが、画像データによってはその効果が少なかったり、細胞の輪郭が不明瞭になる場合などがあった。

[0216] そこで、培地の色変化、光量の変化、画像中心部と周辺部の明暗差、ノイズなどの影響を受けずに細胞部分のみを抽出することができるようにしたカメラ撮影システムについて説明する。

[0217] このカメラ撮影システムの基本構成は、図 36に示したブロック図と同じであるが、この実施の形態では、 CCDカメラ 31力移動用ガイドに沿って上下に移動し、任意の焦点での培養器 140の画像を撮影するように構成してある点が前述のものとは異なる。

[0218] 図 38は、細胞培養装置内の各構成手段の配置の概略を示す図である。図から明かなように、培養装置内の上面部に光源 381が取り付けられている。この光源 381の下側に培養器 140が配置され、さらにこの培養器 140の中央付近下側に対物レンズ 382を備えた CCDカメラ 31が配置されている。 CCDカメラ 31は、カメラ'培養器駆動装置 314によって、移動用ガイド 383に沿った上下方向に移動制御され、任意の焦点での培養器 140の画像を撮影することができるように構成されている。

[0219] 図 39は、任意の焦点で培養器 140の画像を撮影する場合の画像処理ユニットの実行する細胞抽出処理の一例を示すフローチャート図である。

[0220] [ステップ S391]

このステップでは、モータコントローラ 313に命令を出して CCDカメラ 31を上下に移動させながら画像を撮影する画像取得処理を実行する。この画像取得処理によって取得された画像データは、コンバータ 311を経由して外部記憶装置 364に保存される。

[0221] [ステップ S392]

このステップでは、全ての画像を取り終えた後、画像選択処理を実行する。この画像選択処理では、細胞の辺縁が明瞭な画像を少なくとも 2枚以上選択する。細胞の辺縁が明瞭な画像では不明瞭な画像に比べて画素値の変化が大きくなる。そこで隣り合う画素値の差の絶対値を算出し、それらの総和を求め主メモリ 363に保持する。

[0222] 図 40は、カメラの移動距離と隣り合う画素値の差の総和との関係を示す図である。

図 40では、 2箇所のピークがあり、このピーク値を示す画像が細胞の辺縁が明瞭な画像となる。図 41及び図 42は、前述の 2箇所のピークに相当する画像の一例を示す図である。図 41は、対物レンズ 382の焦点位置が培養器 140の底面に位置する場合の画像の一例を示す図であり、図 42は、対物レンズ 382の焦点位置が培養器 14 0の底面よりも前側にある場合の画像の一例を示す図であり、図 43は、対物レンズ 3 82の焦点位置が培養器 140の底面よりも後側にある場合の画像の一例を示す図である。これらの図から明かなように、対物レンズ 382の焦点位置が前後いずれか一方にずれている方が細胞の辺縁が明瞭な画像を取得することができる。

[0223] [ステップ S393]

このステップでは、前述の 2箇所のピークに相当する 2枚以上の画像が選択され、その位置が算出されたか否かの判定を行レ、、 yesの場合は次のステップ S394に進み、 noの場合はステップ S392にリターンする。

[0224] [ステップ S394]

このステップでは、 2枚の画像のうち 1枚を X, Y方向に 1ピクセルずつずらし差分を取り、その位置を合わせるための差分 ·位置合わせ処理を行なう。

[0225] [ステップ S395]

前のステップ S394の差分.位置合わせ処理の結果、細胞数が最小で、かつ、その細胞の長さの合計が最大であるか否かの判定を行い、 yesの場合は、その位置で 2 枚の画像の差分'位置合わせ処理を終了し、ステップ S396に進み、 noの場合は、ステツプ S394にリターンし、このステップ S395の判定が yesとなるまで差分'位置合わせ処理を行なう。

[0226] [ステップ S396]

このステップでは、細胞の長さ、個数、形状などの解析を容易にするために画像の二値化処理を行なう。図 44は、図 42及び図 43の画像に対する差分'位置合わせ処理の結果、細胞数が最小で、かつ、その細胞の長さの合計が最大となる差分画像について、二値化処理を施した場合の画像を示す図である。図 44の画像に基づいて、細胞の長さ、個数、形状などの解析を容易に行なうことが可能となる。

[0227] 通常、撮影位置を指定するためには、カメラが目的の位置に達するまで目視で位置を確認しているし、カメラの現在の位置も同様に目視で確認している。そして、一度撮影した位置は、目視で定性的に確認している。一度撮影した画像と培養器上の位置関係は、操作者が細胞を撮影するたびに両者の対応表を作成して管理しなければならなかった。このような方法では、カメラを目的の場所に移動するのに煩雑な操作が必要であり、目的の位置に到達するまでに何度も試行錯誤する必要があった。現在の撮影位置を確認するために、保温箱の中の培養器を目視して確認する必要があったが、正確な位置を把握するのは困難であり、一度カメラを動力てしまうと正確に同一位置に戻るのは困難である。撮影した画像は培養器内のどの位置で撮影したものか判別不能になり、ある一点の経時的な画像を表示するのも手動操作によるものであった。

[0228] そこで、操作端末上に培養器を示す図を表示しておき、この図面上に現在のカメラの位置を示す印、移動したい位置を示す印、過去に画像が保存された印を表示し、移動開始命令の入力を受け付けるコントロール手段によって培養器の図面上であつて、移動したい位置を指定して移動開始命令を発行することにより、目的の撮影位置にカメラを移動することができるような構成を採用した。移動終了後は移動したい位置を示す印は現在のカメラの位置を示す印に変化する。

[0229] 図 45は、カメラを所望の位置に移動することのできるカメラ位置調整機能を備えたカメラ撮影システムの概略を示す図である。図に示すように、カメラ撮影システム 450 は、細胞培養に最適な温度や二酸化炭素濃度を提供する保温箱 160と、細胞を培養する培養器 140と、細胞を撮影するための対物レンズ 382と、この対物レンズ 382 のデータを電子化する CCDカメラ 31と、この CCDカメラ 31から得られる画像データを画像処理ユニット 312に転送するためのコンバータ 311と、 CCDカメラ 31を移動するためのカメラ駆動装置 314aと、培養器 140を移動するための培養器駆動装置 314 bと、カメラ駆動装置 314aと培養器駆動装置 314bを制御するモータコントローラ 313 とから構成されている。

[0230] 図 45の画像処理ユニット 312の詳細構成は、図 36に示したものとほとんど同じである。画像処理ユニット 312は、データバス 361を介して演算処理を行う CPU362と、この CPU362が一時的に記憶領域として使用する主メモリ 363と、画像データや位置情報を格納する外部記憶装置 364と、モータコントローラ 313と通信するための通信ポート 365と、細胞抽出後の画像を表示するモニタ 366と、ユーザの入力を受け付けるキーボード 367とから構成される。この画像処理ユニット 312は、 CCDカメラ 31力らの画像をコンバータ 311を介して取り込み、種々の画像処理を行なう。図 45の画像処理ユニット 312の場合、図 36では図示していないが、ユーザの入力を受け付ける装置としてキーボード 367の他にマウスが接続されているものとして説明する。

[0231] 図 46は、図 14の保温箱 160内の培養器 140と、カメラ 31との関係を模式的に示す図である。なお、図 14では、培養器 140は、ロータ 153を中心として、保温箱 160内を旋回するように移動するが、図 46では、培養器 140が図 34の場合と同様に、モータ 320aによって直線的に駆動されるものとして説明する。

[0232] 図 47は、撮影位置設定'表示の操作画面の一例を示す図である。この撮影位置設定 '表示画面 470には、培養器 140を模した円形上の培養器 471が示されており、この培養器 471上に、カメラの現在位置を示すカメラ位置マーカー 472と、カメラの移動位置を示す移動位置マーカー 473と、既に保存された画像の位置を示す保存画像位置マーカー 474— 476がそれぞれ示されている。さらに、この撮影位置設定'表示画面 470には、培養器 471の背景を選択する背景選択コントローラ 477と、カメラを移動位置マーカー 473に移動させるためのカメラ移動コントローラ 478と、画像を表示する画像表示コントローラ 479と、カメラの位置を保存する位置保存コントローラ 47Aと、保存した位置を呼び出す位置呼び出しコントローラ 47Bと、処理を終了する終了コントローラ 47Cが表示されている。なお、保存画像位置マーカー 474には選択 •非選択の状態が存在し、後述する画像表示画面の表示画像判定に用いられる。

[0233] 図 48は、モニタに表示される画像の表示例を示す図であり、画像処理ユニット 312 によって表示される。この表示画像は、現在カメラの存在する位置の画像および保存された画像を表示する画像表示領域 480と、この画像表示領域 480に表示されている画像を保存する表示画像保存コントローラ 481と、保存された画像を読み出す画像読み込みコントローラ 482と、画像表示領域 480に表示されている画像を変更する画像送りコントローラ 483と、画像戻しコントローラ 484と、画像表示領域 480に表示されている画像と同一位置で異なる時刻に撮影された画像を比較する命令を発行する画像比較コントローラ 485とを表示してなる。 [0234] 図 49は、撮影位置設定'表示処理ソフトウェアの処理の一例を示すフローチャート図である。以下、このフローチャートに従って、撮影位置設定'表示処理の動作を説明する。

[0235] 最初のステップ S490では、画像処理ユニット 312は入力待ちループにて操作者が何らかの入力を行なうのを監視している。

[0236] ステップ S491では、図 47に示される終了コントローラ 47Cからの入力を判定し、入力有り（yes)の場合は、処理を終了し、ステップ S49Mに進み、入力待ちループ処理を実行する。一方、入力無し (no)の場合は、次のステップ S492に進む。

[0237] ステップ S492では、カメラの現在を算出し、そのカメラ現在位置マーカー 472を画像上に表示する。

[0238] ステップ S493では、背景選択コントローラ 477によって背景が指定されているか否かの判定を行レ、、指定されている（yes)場合は、ステップ S494に進み、そうでない（ no)場合はステップ S495に進む。

[0239] ステップ S494では、背景選択コントローラ 477によって背景が指定されているので

、その指定された背景を表示する処理を実行する。この処理によって、培養器 471上にグリッド及び細胞の密度分布画像が表示される。

[0240] ステップ S495では、既に保存された画像が存在する場合に、その画像の位置を示す保存画像位置マーカー 474— 476を図 47に示すように培養器 471上に表示する

[0241] ステップ S496では、操作者が保存画像位置マーカー 474— 476のいずれかを選択して、又は位置呼び出しコントローラ 47Bを用いて予め保存してある画像の保存位置の読み込みを行なっているか否かの判定を行レ、、読み出し中（yes)の場合はステップ S497(こ進み、そうでなレヽ（no)場合 ίまステップ S498こ進む。

[0242] ステップ S497では、保存位置の読み込みを行なっているので、移動位置マーカー

473を培養器 471上に表示する移動位置表示処理を実行する。図 47に示すように既に移動位置マーカー 473が培養器 471上に表示されている場合には、保存画像位置マーカー 474 476のいずれかを移動位置マーカー 473に変更する。この他にも操作者がマウスまたはキーボードを用いて移動位置マーカー 473を設定した場合にも同様の処理を実行する。

[0243] ステップ S498では、カメラ移動コントローラ 478によってカメラの移動命令が発行されたか否かの判定を行い、発行された (yes)場合は、ステップ S499に進み、そうでない（no)場合はステップ S49Cに進む。

[0244] ステップ S499では、カメラ移動コントローラ 478によってカメラの移動命令が発行されたので、その移動命令に従ってカメラ移動処理を実行する。このカメラ移動処理では、図 36の CPU362が座標の変換を行レ、、通信ポート 365を介してモータコント口ーラ 313に指令を出し、図 45のカメラ駆動装置 314a及び培養器駆動装置 314bを駆動する。カメラが移動位置マーカー 473で示される位置に移動するとその移動位置マーカー 473はカメラ現在位置マーカー 472に変化する。

[0245] ステップ S49Aでは、位置保存コントローラ 47Aから現在位置の保存命令が発行されたか否かの判定を行い、発行された (yes)場合はステップ S49Bに進み、そうでなレヽ（no)場合はステップ S49Cに進む。

[0246] ステップ S49Bでは、位置保存コントローラ 47Aから現在位置の保存命令が発行されたので、その保存命令に従って現在位置の保存処理を実行する。この保存処理によって保存された位置が新たな保存画像位置マーカーとして図 47の培養器 471上に表示されるようになる。

[0247] ステップ S49Cでは、画像表示コントローラ 479から画像表示の命令が発行されたか否かの判定を行い、発行された (yes)場合はステップ S49Dに進み、そうでない（n o)場合はステップ S49Dに進む。

[0248] ステップ S49Dでは、保存画像位置マーカー 474— 476のいずれかが選択状態にあるか否かの判定を行レ、、選択状態にある (yes)場合はステップ S49Eに進み、そうでない（no)場合はステップ S49Fに進む。

[0249] ステップ S49Dでは、選択状態にある保存画像位置マーカー 474 476のいずれかの位置で保存された画像を表示する選択位置画像表示処理を実行する。このときに、 1つの保存画像位置マーカーに対して複数の画像が存在する場合は、画像送りコントローラ 483と画像戻しコントローラ 483を用いて、その位置における全ての画像を表示することができるようになってレ、る。 [0250] ステップ S49Eでは、保存画像位置マーカー 474— 476のいずれも選択されずに画像表示コントローラ 479からの画像表示命令が出された場合に対応するので、現在のカメラの位置の画像を表示する現在位置画像表示処理を実行して、ステップ S4 9Gに進む。

[0251] ステップ S49Gでは、図 48の画像読み込みコントローラ 482から画像読み込み命令が発行されたか否かの判定を行レ、、発行された (yes)場合はステップ S49Hに進み、そうでない（no)場合はステップ S49Kに進む。

[0252] ステップ S49Hでは、前のステップ S49Gで操作者が指定した画像を図 36の外部記憶装置 364から主メモリ 363に読み込んで、画像表示領域 480に表示する画像読込み処理を実行して、ステップ S49Jに進む。

[0253] ステップ S49Jでは、対応する位置の保存画像位置マーカー 474 476を選択状態にし、どの位置で画像が撮像されたかを、操作者に明示する画像位置表示更新処理を実行して、ステップ S49Kに進む。

[0254] ステップ S49Kでは、図 48の画像比較コントローラ 485から画像比較命令が発行されたか否かの判定を行い、発行された (yes)場合はステップ S49Lに進み、そうでない（no)場合はステップ S49Mに進み、入力待ちループ処理を実行する。

[0255] ステップ S49Lでは、異なる色のモノトーン画像を作成し、各々の画像に設定された透過度により重み付けを行った後、加算処理を行い、その結果を示す画面を表示するモノトーン/加算処理を実行して、ステップ S49Mに進み、入力待ちループ処理を実行する。

[0256] ステップ S49Mでは、ステップ S490と同様に画像処理ユニット 312によって入力待ちループ処理を行レ、、操作者が何らかの入力を行なうのを監視する。

[0257] 図 50は、モノトーン Z加算処理の詳細を示す図である。このモノトーン/加算処理における画像データは、 1画素あたり RGBの 3成分を持つものである。まず最初のステツプ S500では、入力がカラー画像カグレースケール画像かのカラー画像判定を行レ、、 yesの場合はステップ S501に進み、 noの場合は次のステップ S502に進む。

[0258] ステップ S501では、入力がカラー画像なので、そのカラー画像を白黒画像に変換するグレースケール変換処理を行レ、、ステップ S502に進む。 [0259] ステップ S502では、処理対象が画像表示領域 480に表示されている画像か否か、すなわち現在表示中画像であるか否かの判定を行レ、、 yesの場合はステップ S503 に進み、 noの場合はステップ S505に進む。

[0260] ステップ S503では、画像データが持つ RGB成分のうち、 R成分に白黒変換した後の画素値を代入（コピー）し、他の G成分及び B成分には 0を代入するとレ、う R成分代入処理を実行する。この時点で画像は R成分の濃淡として表現される。

[0261] ステップ S504では、現在表示中の画像と比較対象画像の合成比、つまり現在表示中の画像に重み付けを行う透過度演算処理を行レ、、ステップ S505に進む。

[0262] ステップ S505では、処理対象が比較対象画像か否かの判定を行い、 yesの場合はステップ S506(こ進み、 noの場合 fまステップ S508こ進む。

[0263] ステップ S506では、ステップ S503と同様に比較対象画像に対して、 RBG成分の中で G成分に白黒変換後の画像の画素値を代入し、他の R成分及び B成分には 0を代入するとレ、う G成分代入処理を実行する。この時点で比較対象となる画像は G成分の濃淡として表現される。

[0264] ステップ S507では、ステップ S504と同様に現在表示中の画像と比較対象画像の合成比、つまり比較対象画像に重み付けを行う透過度演算処理を行い、ステップ S5

08に進む。

[0265] ここで、ステップ S504とステップ S507の透過度演算処理の場合、ステップ S504の処理における透過度が高いと比較対象画像が強調され、ステップ S507の処理における透過度が高いと現在表示中の画像が強調して表示されることになる。

[0266] ステップ S508では、ステップ S504及びステップ S507の透過度演算処理の結果画像を加算処理する。ここで、ステップ S504の透過度演算処理後の画像は R成分だけを持ち、ステップ S507の透過度演算処理後の画像は G成分のみを持つので、ステツプ S508の加算処理後は、両者の画像データの重複画素部分は RG成分を持つ画像となり、両者で重複していない画素は R成分、または G成分のみの画素値をもつこととなる。このようにして、モノトーン/加算処理により、色成分で 2つの画像の相違点を表現することができる。

[0267] 細胞培養は、培養器内の培地の交換や、継代培養のための他の培養器への再播種などといった煩雑な作業が手作業で行われているのが現状であり、また、熟練した作業者を必要とするものであるため、容易に実施しがたいものである。そのために、細胞の培養を自動的に行わせる細胞培養装置が種々提案されている。これらの細胞培養装置は、ほとんどが電気的に制御され、基本的には CPUで実現されるものであり、プログラマブルであるため、カスタマイズしゃすぐ信頼性の高レ、ものである。しかしながら、細胞の培養は通常数週間と長期にわたり、その間、細胞培養装置は連続稼動状態にしなければならない。一般に広く使われている CPUやメモリからなる制御装置いわゆるパーソナルコンピュータ等を応用することが可能である力 s、これらの制御装置は、細胞を自動的にかつ長期的に増殖させる装置として信頼性を確保するには不十分であった。そこで、自動培養装置を自動的にかつ長期的に高い信頼性で稼働させることができるような構成を採用した。

[0268] 図 51は、自動的にかつ長期的に高い信頼性で稼働させることのできる細胞培養装置の概略構成を示す図である。自動培養装置 511は、装置制御手段 512、ユーザィンターフェース手段 513、培養スケジュール管理手段 514及び UPS (無停電電源） 5 15から構成される。 UPS515は、培養スケジュール管理手段 514に接続されている。自動培養装置 511に電源が入ると、培養スケジュール管理手段 514と装置制御手段 512との間、及び培養スケジュール管理手段 514とユーザインターフェース手段 5 13との間で、所定間隔で通信を行い、お互いを監視する。なお、この所定間隔は、一定の時間間隔でもいいし、可変可能な時間でもよぐ定期的に通信を行うという意味である。

[0269] 図 52は、図 51の自動培養装置が実行する所定監視通信処理の一例を示すフローチャート図である。以下、培養スケジュール管理手段 514と装置制御手段 512との間における監視通信について図 52のフローチャートに従って説明する。

[0270] まず、監視通信の開始によって、ステップ S520では、培養スケジュール管理手段 5 14から装置制御手段 512に対して応答要求信号が送信される。ステップ S521では、培養スケジュール管理手段 514は、所定間隔で装置制御手段 512からの応答確認信号を受信したか否かの判定を行い、受信した (yes)場合は、装置制御手段 512 は、培養スケジュール管理手段 514からの応答確認信号を受信すると、培養スケジュール管理手段 514へ応答確認信号を送る。培養スケジュール管理手段 514は、装置制御手段 512からの応答確認信号を受け取る事によって、培養スケジュール管理手段 514から装置制御手段 512に対する監視通信を終了し、リターンする。一方、応答確認信号を受信しなかった (no)場合は、次のステップ S522に進む。

[0271] ステップ S522では、培養スケジュール管理手段 514が装置制御手段 512に対して応答要求信号を送信した回数が所定値 a以下であるか否かの判定を行い、応答要求信号送信回数が所定値 a以下 (yes)の場合にはステップ S520にリターンし、応答要求信号を再送する。一方、応答要求信号送信回数が所定値 aよりも多い場合には、次のステップ S523に進む。

[0272] ステップ S523では、応答確認信号を受信できなかった場合に行われる処理である。この処理は、装置制御手段 512に不具合が発生し、培養スケジュール手段 514が所定間隔で装置制御手段 512からの応答確認信号が受け取れな力た場合や培養スケジュール管理手段 514が装置制御手段 512に対して数回（可変設定可）の応答要求信号を送信するが、それでも装置制御手段 512からの応答確認信号を受信できなかった場合に実行される処理であり、培養スケジュール管理手段 514から装置制御手段 512に対して再起動命令を送信し、ソフト的に装置制御手段 512の再起動を行う。

[0273] ステップ S524では、装置制御手段 512の再起動に要する時間（可変設定可）を経過し、かつ、装置制御手段 512からの応答要求信号を培養スケジュール管理手段 5 14が受信したか否かの判定を行い、 yesの場合は、正常に装置制御手段 512が再起動したと認識し、ステップ S529にジャンプする。ステップ S529では、装置制御手段 512に培養スケジュールデータを送信して、監視通信処理を終了し、リターンする

[0274] 一方、培養スケジュール管理手段 514から装置制御手段 512に再起動命令を送信しても、装置制御手段 512から培養スケジュール管理手段 514に対して応答要求信号が来なかった場合は、正常に装置制御手段 512が再起動しなかったと判断し、ステツプ S525に進む。

[0275] ステップ S525では、培養スケジュール管理手段 514が装置制御手段 512に対して再起動命令信号を送信した回数が所定値 b以下であるか否かの判定を行い、再起動命令信号送信回数が所定値 b以下 (yes)の場合にはステップ S523にリターンし、再起動命令信号を再送する。一方、再起動命令信号送信回数が所定値 bよりも多い場合には、次のステップ S526に進む。

[0276] ステップ S526では、培養スケジュール管理手段 514が装置制御手段 512に、再起動命令を b回送信したが、それでも、装置制御手段 512から培養スケジヱール管理手段 514に対して応答要求信号が来ない場合に該当するので、この場合には、培養スケジュール管理手段 514が、装置制御手段 512の電源を強制的にオフ（OFF)し、オン (ON)するという処理、すなわち、強制再起動処理を行う。

[0277] ステップ S527では、培養スケジュール管理手段 514が、装置制御手段 512の再起動に要する時間（可変設定可）を経過し、かつ、装置制御手段 512からの応答要求信号を培養スケジュール管理手段 514が受信したか否かの判定を行い、 yesの場合は、正常に装置制御手段 512が再起動したと認識し、ステップ S529にジャンプする。ステップ S529では、装置制御手段 512に培養スケジュールデータを送信して、監視通信処理を終了し、リターンする。

[0278] 一方、培養スケジュール管理手段 514から装置制御手段 512に対して電源のオン

'オフによる再起動を実行しても、装置制御手段 512から培養スケジュール管理手段 514に対して応答要求信号が来なかった場合は、正常に装置制御手段 512が再起動しなかったと判断し、ステップ S528に進む。

[0279] ステップ S528では、培養スケジュール管理手段 514が装置制御手段 512に対して電源のオン'オフによる強制再起動を実行した回数が所定値 c以下であるか否かの判定を行い、強制再起動回数が所定値 c以下 (yes)の場合にはステップ S526にリターンし、強制再起動を再度実行する。一方、強制再起動回数が所定値 cよりも多い場合には、次のステップ S52Aに進む。

[0280] ステップ S52Aでは、培養スケジュール管理手段 514が装置制御手段 512に対して、電源のオン'オフによる強制再起動を c回実行したが、それでも、装置制御手段 5 12から培養スケジエール管理手段 514に対して応答要求信号が来ない場合に該当するので、この場合には、ユーザに対してシステムの異常が発生したことを報告する。この報告は、ブザーやモニタ上にその旨を表示することによって行なう。

[0281] なお、装置制御手段 512から培養スケジュール管理手段 514に対しての監視通信は、前述と逆の方法で行う。また、ユーザインターフェース手段 513と培養スケジユール管理手段 514との間での監視通信も同じ方法で行う。もし、電源が遮断された場合、培養スケジュール管理手段 514は UPS (無停電電源） 515が接続されているため、電源復旧時に装置制御手段 512とユーザインターフェース手段 513へ培養スケジュールデータを送信する。

[0282] このように、培養スケジュールを有し、かつ、双方向通信手段を備えた複数ユニット

(装置制御手段 512、ユーザインターフェース手段 513、培養スケジュール管理手段 514)がそれぞれ培養期間中に、複数のユニット間で通信を行レ、、相対するユニットの異常を検出する異常検出処理を行なうことにより、複数ユニットのいずれかが障害により異常状態になっても、自動培養装置の異常を外部に知らしめることが可能になる。さらに、複数のユニットのいずれかが異常状態を検出した場合、他の正常状態のユニットから培養スケジュールデータをロードすることにより、異常状態になったュニットを正常状態に戻すことが自動で実現でき、また、複数ユニットのいずれかが無停電電源手段に接続されていため、電源が遮断されても、複数ユニットのいずれかは動作しているので、電源復旧時に無停電電源手段が接続されたユニットを中心として自動培養装置全体の動作を復旧することができ、自動培養装置の信頼性がより向上する。

[0283] 以上述べてきたように、代表的には、本発明によれば、細胞を培養する培養器手段と、前記培養器手段を培養に適した状態に配置し所定温度に保持する保温箱手段と、前記培養器手段を前記保温箱手段内で回動させる駆動手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段に前記保温箱手段の外側から未使用の薬品を供給する薬品供給手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段から不要な廃液を前記保温箱手段の外側に排出する廃液排出手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段の細胞培養の状態を前記保温箱手段の外側から観察する培養状態観察手段とを備えた、閉鎖系細胞培養装置が提供される。

[0284] 細胞培養装置は、前記培養器手段と前記薬品供給手段との間に、ポンプ、弁および可撓性管部材が設けられ、細胞を供給し培養し回収することが好ましい。

[0285] 前記培養器手段は、中央部が平滑で透明な非毒性の材料力なる容器であることが好ましいが、前記中央部は多少の凹凸を有していてもよい。

[0286] 前記透明な非毒性の材料は、ポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートであることが好ましい。

[0287] 細胞培養装置は、前記培養状態観察手段がカメラを備えることが好ましレ、。

[0288] 細胞培養装置は、前記カメラを前記培養器手段の全面にわたり走查させ、かつ、前記細胞培養器手段内のピントを光軸方向に設定可能なカメラ移動手段を備えることが好ましい。

[0289] 細胞培養装置は、前記カメラの前記培養器手段上の撮影位置を記憶する記憶手段を備え、前記カメラ移動手段は前記記憶手段に記憶されたと同じ撮影位置の再現をすることが好ましい。

[0290] 細胞培養装置は、外部を閉塞部材にて封止された細管を備え、前記細管は細胞の供給口または回収口であり、細胞を収納する容器を備え、前記容器の上部には殺菌剤含浸部材が備えられ、前記細管は前記容器内に前記殺菌剤含浸部材を貫通後挿入されることが好ましい。

[0291] 細胞培養装置は、前記保温箱手段内に雰囲気を供給するガスボンベを備え、前記弁は前記ガスボンベのガス圧を駆動源として開閉されることが好ましい。

[0292] 細胞培養装置は、前記ポンプの動作時間で薬品供給手段から前記培養器手段に供給される薬品の量を決定する薬品量決定手段を有することが好ましい。

[0293] 前記廃液排出手段が、可撓性管部材、ポンプおよび廃液タンクからなり、そのいずれかに pH測定部を備えることが好ましい。

[0294] pH測定部が、 pHの変化により色が変化する物と、その物の色を読み取る受光素子を有することが好ましい。

[0295] 細胞培養装置は、細胞の培養手順として、細胞の供給、培養器手段の回動、薬液の供給、廃液および細胞供給回収のタイミングと内容を記憶して実行する制御手段を備えることが好ましい。

[0296] 前記制御手段は前記細胞培養装置を複数稼動する場合に他の制御手段と培養情報を交換するインターフェイスを有することが好ましレ、。

図面の簡単な説明

[図 1]本発明を適用してなる細胞培養装置の基本構成を示すブロック図である。

[図 2]本発明を適用してなる細胞培養装置の機構部の詳細図であり、図 1におけるシステムコントローラ 11を省レ、た実際の構成を示してレ、る。

[図 3]図 2の培養器 38の詳細構成を示す図である。

[図 4]図 2の細胞培養装置の制御ブロック図の詳細を示し、複数の細胞培養装置を接続してそれをプラント化した場合を示すブロック図である。

[図 5]細胞培養装置の動作を説明するためのフローチャートである。

[図 6]図 5のステップ S55の「培養器をシャッフリングし、均一化'播種」の動作の一例を示す図である。

[図 7]上述の実施の形態に係る細胞培養装置の培養器 38の第 1の変形例を示す図であり、図 7 (A)は、上面から見て図を、図 7 (B)はその側面図を示す。

[図 8]上述の実施の形態に係る細胞培養装置の培養器 38の第 2の変形例を示す図である。

[図 9]図 8の培養器を用いた細胞培養装置の動作を説明するためのフローチャートでめる。

[図 10]上述の実施の形態に係る細胞培養装置の培養器 38の第 3の変形例を示す断面図である。

[図 11]細胞を均一に播種する手法の一例を示す図である。

[図 12]上述の実施の形態における培養器とチューブの接続方法の一例を示す図でめる。

[図 13]上述の実施の形態における培養装置の一部の滅菌法を示す図である。

[図 14]本発明を適用してなる細胞培養装置の別の実施の形態に係る機構部の詳細図を示す図である。

[図 15]図 14で使用される培養器の詳細を示す図である。

[図 16]培養器における第 1ポート 141、第 2ポート 142、第 3ポート 143の詳細を示す図である。 [図 17]図 15の一部断面を示す図であり、培養器内の培地を排出する場合を示す図である。

[図 18]図 14の保温箱の詳細構成を示す図であり、図 18 (A)は、保温箱の内部構造を分かり易く示したものであり、図 18 (B)は保温箱の外観斜視図である。

[図 19]図 18 (A)の断熱構造の詳細を示す S— S面の断面を示す図である。

[図 20]図 14の細胞培養装置の保温箱 16の制御ブロックを示す図であり、図 4の中から説明に必要な部分を抜き出し、他は省略して示したものである。

[図 21]ペーハー測定部の詳細構成を示す図であり、図 14の一部を拡大して示したものである。

[図 22]ペーハー測定部の詳細構成を示す図であり、ペーハー測定部のセンサ部の詳細構成を示す図である。

[図 23]容器 230, 240用の栓の概略構成を示す図であり、図 23 (A)は、その斜視図であり、図 23 (B)は、その断面図である。

[図 24]容器 230, 240用の栓の概略構成を示す図であり、図 24 (A)は、外部閉塞部材を外した状態で示す上面図であり、図 24 (B)は、容器用の栓の概略構成を示す底面図である。

[図 25]図 24の容器用の栓を備えた容器の一例を示す斜視図である。

[図 26]図 23— 25の容器用の栓の変形例を示す断面図である。

[図 27]図 23— 25の容器用の栓の別の変形例を示す断面図である。

[図 28]図 23— 25の容器用の栓のさらに別の変形例を示す断面図である。

[図 29]容器からの液の抽出や容器への液の注入を行う際の操作の概略を説明する図である。

[図 30]容器からの液の抽出や容器への液の注入を行う際の操作の概略を説明する図である。

[図 31]カメラ撮影システムに概略構成を示すブロック図である。

[図 32]図 14の中におけるカメラ撮影システムに関係する部分を抽出して模式的に示す図である。

[図 33]CCDカメラの走査の様子を示す図である。 [図 34]CCDカメラの走査の様子を示す図である。

[図 35]CCDカメラの走査の様子を示す図である。

[図 36]図 31の画像処理ユニット 312の詳細を示す図である。

[図 37]画像処理ユニット 14が実行するコロニー判別の処理手順を示すフローチヤ一ト図である。

[図 38]細胞培養装置内の各構成手段の配置の概略を示す図である。

[図 39]任意の焦点で培養器 140の画像を撮影する場合の画像処理ユニットの実行する細胞抽出処理の一例を示すフローチャート図である。

[図 40]カメラの移動距離と隣り合う画素値の差の総和との関係を示す図である。

[図 41]対物レンズ 382の焦点位置が培養器 140の底面に位置する場合の画像の一例を示す図である。

[図 42]対物レンズ 382の焦点位置が培養器 140の底面よりも前側にある場合の画像の一例を示す図であり、

[図 43]対物レンズ 382の焦点位置が培養器 140の底面よりも後側にある場合の画像の一例を示す図である。

[図 44]図 42及び図 43の画像に対する差分 ·位置合わせ処理の結果、細胞数が最小で、かつ、その細胞の長さの合計が最大となる差分画像について、二値化処理を施した場合の画像を示す図である。

[図 45]カメラを所望の位置に移動することのできるカメラ位置調整機能を備えたカメラ撮影システムの概略を示す図である。

[図 46]図 14の保温箱 160内の培養器 140と、カメラ 31との関係を模式的に示す図でめる。

[図 47]撮影位置設定'表示の操作画面の一例を示す図である。

[図 48]モニタに表示される画像の表示例を示す図であり、画像処理ユニット 312によつて表示される図である。

[図 49]撮影位置設定'表示処理ソフトウェアの処理の一例を示すフローチャート図でめる。

[図 50]モノトーン Z加算処理の詳細を示す図である。 [図 51]自動的にかつ長期的に高い信頼性で稼働させることのできる細胞培養装置の概略構成を示す図である。

[図 52]図 51の自動培養装置が実行する所定監視通信処理の一例を示すフローチヤート図である。

符号の説明

2 可撓性管部材

3 ポンプ

4 リザーブタンク

5 可撓性管部材

6 ポンプ

7 廃液タンク

8 駆動手段

9 カメラ

10 光源

11 システムコントローラ

15 本体

16 ガス透過膜

17 培地

18 チューブ接続部材

19 チューブ接続部材

20 堰

21 供給チューブ

22 ロータ

23 廃液チューブ

24 ピンチ弁

25 ケープ/レドラム

26 卷き取りドラムカムフォロア

ピユオン

培養器駆動モータ保温箱（フレーム） CCDカメラ

観察窓

フイノレター

光源

ガイド部材

チューブ固定部材しごきポンプ

培養器

傾斜部

針

エアーフィルター針

エアーフィルターシャッターモータシャッター

培養前細胞を貯留する容器針

細胞注入チューブピぺッターアーム軸

ピぺッタ回転動モータ回転部材

ピぺッタ上下動モータプーリホ/レダ一部

ベル卜

モータ

ファン

a, 66b ピンチ弁

培地タンク

緩衝液タンク

， 70, 71 細胞剥離剤タンク, 105, 73, 74, 75 ピンチ弁, 79 空気流入口

断熱箱

シャッターモータシャッター

針

培養後細胞を貯留する容器ピぺッタアーム

軸

ピぺッタ回転動モータ回転部材

ピぺッタ上下動モータプーリ

ベノレ卜

ホルダー部

モータ

送りねじ

， 97 スタンド

廃液回収箱

ガイド部材 100 チューブ固定部材

101 しごきポンプ

102 廃液タンク

103 ピンチ弁

104 ピンチ弁

106 温度センサ

107 継ぎ手

108 ヒータ

120 I/O

121 バス

122 CPU

123 操作卓

124 メモリ

125 コンピュータネットワークドライノく 126 操作器

127, 128, 129 糸田胞培養装置 130 制御監視装置

167, 168, 169 培養器

170a— 170d 培養器

171 チューブ

174a— 174d チューブ接続部材 175a-175d チューブ接続部材 182 供給チューブ

183， 184 接続チューブ

185 廃液チューブ

186, 187, 188 ピンチ弁

191 , 192 培養補助板

195 培養器本体 197 供給チューブ

199 蓋

201 , 202 培養補助板

250 画像取り込みボード

278, 279, 282, 283, 284, 285 鏡

280 CCDカメラ

281 光源

286 フイノレター

288 ユニット

300 培養器本体

301 蓋

302 供給用チューブ接続部材

307, 308, 309, 310 磁石

303, 304, 305, 306 球状部材

314 供給用チューブ接続部材

315 棒状部材

320 供給チューブ

321 , 327 栓

322, 328 針

323 供給チューブ

324 シリンジ

325 培養器

326 廃液チューブ

329 廃液チューブ

381 傾斜部

140 培養器

141 第 1ポート

142 第 2ポート 143 第 3ポート

141b 廃液チューブ

144, 145 しごきポンプ 142b 供給チューブ

142c 供給チューブ

142d 補助供給チューブ 146, 147 しごきポンプ 146a, 147a ピンチ弁 143a チューブ

143b エアーフィルター 148 保持リング

149 フック

150 レノく一

151 チルトモータ

153 ロータ

160 保温箱（インキータ） 170 加温バッグ

172 ピンチ弁

173 エアーフィルター 177 ペーハー測定部

29a 培養器駆動モータ 109 ペルチヱ素子

1 10 放熱ヒートシンク

11 1 吸熱ヒートシンク

201— 204 ヒータ

205, 206 放熱板

205 二酸化炭素センサ

Claims

請求の範囲

[1] 細胞を培養する培養器手段と、前記培養器手段を培養に適した状態に配置し所定温度に保持する保温箱手段と、前記培養器手段を前記保温箱手段内で回動させる駆動手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段に前記保温箱手段の外側から未使用の薬品を供給する薬品供給手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段から不要な廃液を前記保温箱手段の外側に排出する廃液排出手段と、前記保温箱手段内の前記培養器手段の細胞培養の状態を前記保温箱手段の外側から観察する培養状態観察手段とを備えた、閉鎖系細胞培養装置。

[2] 前記培養器手段と前記薬品供給手段との間に、ポンプ、弁および可撓性管部材が設けられ、細胞を供給し培養し回収する、請求項 1の細胞培養装置。

[3] 前記培養器手段は、中央部が平滑で透明な非毒性の材料力なる容器である、請求項 1の細胞培養装置。

[4] 前記透明な非毒性の材料が、ポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートである

、請求項 3の細胞培養装置。

[5] 前記培養状態観察手段がカメラを備えた、請求項 1の細胞培養装置。

[6] 前記カメラを前記培養器手段の全面にわたり走査させ、かつ、前記細胞培養器手段内のピントを光軸方向に設定可能なカメラ移動手段を備えた、請求項 5の細胞培

[7] 前記カメラの前記培養器手段上の撮影位置を記憶する記憶手段を備え、前記カメラ移動手段は前記記憶手段に記憶されたと同じ撮影位置の再現をする、請求項 6の

[8] 外部を閉塞部材にて封止された細管を備え、前記細管は細胞の供給口または回収ロであり、細胞を収納する容器を備え、前記容器の上部には殺菌剤含浸部材が備えられ、前記細管は前記容器内に前記殺菌剤含浸部材を貫通後挿入される請求項 1、 2、 5のいずれかの細胞培養装置。

[9] 前記保温箱手段内に雰囲気を供給するガスボンベを備え、前記弁は前記ガスボンベのガス圧を駆動源として開閉されることを特徴とする請求項 2の細胞培養装置。

[10] 前記ポンプの動作時間で薬品供給手段から前記培養器手段に供給される薬品の量を決定する薬品量決定手段を有する、請求項 2の細胞培養装置。

[11] 前記廃液排出手段が、可撓性管部材、ポンプおよび廃液タンクからなり、そのいずれかに pH測定部を備えた請求項 1の細胞培養装置。

[12] pH測定部が、 pHの変化により色が変化する物と、その物の色を読み取る受光素子を有することを特徴とする請求項 11の細胞培養装置。

[13] 細胞の培養手順として、細胞の供給、培養器手段の回動、薬液の供給、廃液および細胞供給回収のタイミングと内容を記憶して実行する制御手段を備えた、請求項 2 の細胞培養装置。

[14] 前記制御手段は前記細胞培養装置を複数稼動する場合に他の制御手段と培養情報を交換するインターフェイスを有する、請求項 13の細胞培養装置。