JP2003116593A

JP2003116593A - 微生物の判定方法およびその装置

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Publication number: JP2003116593A
Application number: JP2001355389A
Authority: JP
Inventors: Akikuni Hara; 昭邦原; Toshimitsu Asano; 敏光浅野; Yoshiaki Herai; 義明戸来; Yoshiyuki Oota; 佳志太田
Original assignee: Hakuju Institute for Health Science Co Ltd; HAKUJU INST FOR HEALTH SCIENCE CO Ltd
Current assignee: Hakuju Institute for Health Science Co Ltd; HAKUJU INST FOR HEALTH SCIENCE CO Ltd
Priority date: 2001-10-17
Filing date: 2001-10-17
Publication date: 2003-04-22

Abstract

(57)【要約】【課題】培地に育成した細菌や微生物などのコロニーを
計数し、またそれらの種類の判別を行う方法およびその
装置に関する。【解決手段】微生物の特徴の現れる部位の明るさおよ
び、または色を数値化し、これに統計的手法を用いて得
られた数値と比較して、微生物の集落数および、または
菌種判定を行うことを特徴とする微生物の判定方法と判
定装置、培地を設置しない状態で撮像した画像から作成
した補正値により、背景となる培地の明るさ、色のむら
を補正することを特徴とする前記記載の微生物の判定方
法、およびそれらのコンピュータプログラムのデータベ
ース、前記記載のデータベースに、微生物の遺伝子情報
を付属させたことを特徴とするデータベース。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、微生物の集落の
明るさ、色による微生物の判定方法およびその装置に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】微生物などの検出、評価において最も信
頼性の高いと云われるのは培養法であるが、この培養に
は多くの培地について、２４時間以上の時間を必要と
し、また微生物の計数や種類の判定にあたっては、測定
者に相応の経験が要求される。一方、微正物管理につい
ては、培養時間の短時間化、測定者の個人的能力によら
ない測定が必要となっている。本件出願人はこれらに関
する技術として、先に「微生物などの検査方法およびそ
の装置」として、特願平１０−３６８２７号（特開平１
１−２２１０７０号）、特願平１０−３３４９３１号
（特開２０００−１３９４４５号）の出願をなしている
が、この発明はさらにそれらの発展にかかるものであ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】この発明は、培地に育
成した細菌や微生物などのコロニー（集落）を計数し、
またそれらの種類の判別を行う方法およびその装置であ
り、前記コロニーあるいはその周辺培地の明るさ、色を
コンピュータ処理により数値化し、統計的処理すること
によって、微生物の特徴を抽出し、通常の培養時間、ま
たは短時間培養で、計数と種類の判別を行うことを目的
とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】この発明は、光散乱板と
照明からなる光源と、検体（シャーレなど）を透過し、
あるいは検体で反射した光、あるいはそれらの双方を用
いて受光し、撮像する装置とそれに関連するコンピュー
タ機器からなる装置により構成される。この発明では、
まず前記検体を設置しない状態で撮像を行い、装置特有
の“むら”（ばらつき）を記録し、“むら”を軽減させ
るための補正値を得る。つぎに検体を撮像した結果、得
られる画像に、検体の種類に応じた補正値と、装置特有
の“むら”から算出される補正値により補正を実施し、
“むら”の少ない検体画像を得、この検体画像から対象
とする微生物の特徴を得る。それはコロニーの画像の中
央部、あるいは周辺部、あるいは周辺培地から微生物特
徴を示す部位の画素を抽出し、その明るさ、色を数値化
し、統計的処理を実施する。その結果、微生物の特徴を
示す明るさ、色の数値範囲や、目標とする対象の微生物
にどれだけ近い特徴を備えているかを算出する数式を求
める。

【０００５】すなわち、検査対象の検体画像について
“むら”補正を施し、微生物特徴を示す明るさ、色の数
値範囲に該当する画素を抽出する。その結果、コロニー
部または微生物により変色などの特徴が見られる部位の
画素が抽出される。ここでコロニーとして抽出した画素
は、たとえば中央部など、より特徴を示す部位の明る
さ、色の数値を評価し、該当する微生物の判定を行う。
これにより目視により判定が困難、あるいは手数を要す
るコロニーの計数、微生物種類の判定を行うことが可能
となる。また抽出した画素の数により、目標とする微生
物の存在を評価、判定することができる。さらにこの発
明により、短時間培養で発現する微生物量と、通常（正
規）培養時間で発現する微生物量との差異、相関など
で、成長量の評価を得ることができる。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下図面にしたがってこの発明の
方法と装置について述べる。図１はこの発明の装置の概
略を示し、各部とその構成は図示に記述するとおり撮像
部と、それに関連するコンピュータ機器とからなってい
る。ここでその照明光源（１）には白色ＬＥＤ、撮像装
置（２）にはＣＣＤカメラを用い、画像はＲＧＢ（２５
６階調）で取り扱う。しかし波長域が異なる複数の光に
よる画像であれば、これに限定するものでない。その
他、モノクロームカメラと光学的フィルターによる画
像、モノクロームカメラと複数の光源による画像、撮像
装置（２）にライセンサを用いること、照明光源（１）
にオレンジ色を追加したり、または差し替えすることな
ど様々な組み合わせてを行ってもよい。まず検体［シャ
ーレ］（３）を設置しない状態で撮像し、画像周辺部が
暗くなるなどの装置固有の“むら”が出るが、この画像
データから補正値を作成する。つぎに検体（３）は培地
の種類ごとに様々な色や濃さを呈しているので、培地の
種類に応じて照明光源（１）の光量を設定する。また前
記“むら”の補正に乗ずる数値を透過率、反射率、また
は実際に蓄積したデータにより予め設定しておく。

【０００７】図２は検体（３）の撮像画像（３’）であ
り、多数のコロニー（ｃ）が撮影されているのが見られ
る。図３は図２のＡ−Ａ’線において、線上の画素を縦
軸輝度（明るさ）で示したグラフであり、図４は図３に
おいて前述の“むら”補正後のグラフであり、前述の検
体（３）の画像周辺になるにしたがい、暗くなっていた
画像を、補正により、培地についてほぼ均一の輝度とし
たものである。さらに画像のノイズを除去するには、中
間値フィルターなどを用いる画像処理、あるいは複数回
の撮像によるそれらの平均などによる処理などが有効で
ある。

【０００８】つぎに微生物の特徴を示す画像を選択、抽
出することについて述べる。多くの場合、微生物などの
コロニーの中央部がその特徴を示すのであるが、コロニ
ーの外輪部に顕著な特徴があればそれも併せてその部分
の画素を抽出する。培地の種類とその使用目的によって
は、コロニーではなく、培地そのものの変色が評価対象
となるので、その際には変色部分の画素を抽出する。コ
ロニーの中央部を選択するにあたっては、たとえばコロ
ニー形状の重心、距離などから抽出するとか、コロニー
の最も暗い画素を一つ以上抽出して平均することが手段
としてよい。抽出した画素情報について統計的処理を施
し、その微生物の画像から、明るさおよび色についての
特徴を数値化する。以下の記述はコロニー最暗部をその
特徴とした例によって説明することとする。

【０００９】この発明では明るさはＲＧＢ各成分の輝度
値、色はそのＲＧＢ輝度値の除算、減算などの演算によ
り、明るさの影響を受けにくい数値を用いる。すなわ
ち、明るさとしてＲＧＢ輝度値、色として（Ｇ＋Ｂ）／
２−Ｒ、（Ｂ＋Ｒ）／２−Ｇ、（Ｒ＋Ｇ）／２−Ｂによ
る演算結果を用いるが、統計処理可能な数値へ変換でき
るものであれば、明るさを周波数とその振幅で表現した
り、色を色彩、色相をはじめとする演算値としたりして
もよい。図５は一例としてクロモアガーＥＣＣ上の大腸
菌および大腸菌群（１０時間培養）の明るさの数値のヒ
ストグラム、図６は同じく色の数値のヒストグラムであ
り、その分布に差異が顕著に現れていることが分かる。

【００１０】これらのヒストグラムから各微生物の数値
について上限値、下限値を定め、前述の検体画像からそ
の培地に発育し得る微生物の数値に該当する画素を抽出
する。ここで抽出された画素はコロニーとほぼ一致して
おり、集落を形成している。ひとまとまりとなった画素
のさらに最暗部を抽出し、その数値について評価する。
図７はクロモアガーＥＣＣ上の大腸菌および大腸菌群
（１０時間培養）について、ヒストグラムの度数から複
数の上限、下限値による範囲より判定した結果と、平均
値と標準偏差から、どちらの菌に近いか次式により判定
した結果を示す。ＭＣ＝Σ｛（Ｂｉ−Ｍｂｉ）^２／σｂ
ｉ^２｝＋Σ｛（Ｃｉ−Ｍｃｉ）^２／σｃｉ^２｝、ここで
ＭＣ：目標微生物“らしさ”を表す数値、小さいほど目
標微生物の平均的な明るさ、色に近い、Ｂｉ：Ｒ，Ｇ，
Ｂの、各輝度値などの明るさを表す検体から得られる数
値、Ｍｂｉ：データベースから統計の結果、得られたＢ
ｉの平均値、σｂｉ：データベースから統計の結果、得
られたＢｉの標準偏差、Ｃｉ：（Ｇ＋Ｂ）／２−Ｒ、
（Ｂ＋Ｒ）／２−Ｇ、（Ｒ＋Ｇ）／２−Ｂの各輝度値な
どの色を表す検体から得られる数値、Ｍｃｉ：データベ
ースから統計の結果、得られたＣｉの平均値、σｃｉ：
データベースから統計の結果、得られたＣｉの標準偏差
である。そしてそれぞれの判定を単独また併用し、微生
物のコロニーと判断される画素のまとまりの数を、コロ
ニーとして計数し、微生物の種類の判定を行う。

【００１１】培地上の塵埃やシャーレの印字などが存在
する場合、一部の画素は、対象となるコロニーと、ほぼ
同様の分布を示す画素となることがある。その際には、
意図的にこれらのノイズが抽出されるように、一旦、対
象範囲を拡げて、最暗部を判定評価することで、ノイズ
を除去することができる。ここで判定率の正答率は培地
と微生物の組み合わせ、さらに培養時間との組み合わせ
により異なる。疑惑数として表記することも一つの手段
であるが、正答率が予め分かれば数学的（連立方程式に
より）に容易に補正することができる。図８はクロモア
ガーＥＣＣ上の大腸菌および大腸菌群の１０時間培養結
果について、補正を実施した例を示す。

【００１２】平均値・標準偏差による判定を実施する
と、図７より大腸菌の正答率は８９．５％、大腸菌群の
正答率は９２．５％である。この値をたとえば図８のシ
ャーレ番号Ｍ＿０１に適用すると判定結果は、大腸菌４
１個、大腸菌群は２９個であるが、それぞれ誤認された
コロニーを含む。前記Ｍ＿０１の大腸菌数をＥ個、大腸
菌群をＣ個とすると各正答率により、Ｅ×０．８９５＋
Ｃ×（１−０．９２５）＝４１とＥ×（１−０．８９
５）＋Ｃ×０．９２５＝２９の連立方程式を立てること
ができる。この結果、Ｅ＝４３．６、Ｃ＝２６．４とな
る。これらを整数として表記するとＥ＝４４、Ｃ＝２６
であり、実際にシャーレ上に育成するコロニー数（大腸
菌４５個、大腸菌群２５個）に近い数字となっている。
正答率を固定すると算出した結果のコロニー数が対象数
と異なる場合が生じるが、算出結果の割合に応じ、コロ
ニー数を修正すればよく、疑惑数がある場合、対象微生
物が三種以上ある場合でも、前述の手段により、補正す
ることができる。一般に培養時間が短いほど正答率は低
下するが、この手段により判定の精度を向上することが
できる。

【００１３】この発明によれば、従来目視のために困難
であった培養時間の違いによる成長量や、（見かけ上
の）コロニー数の変化を定量的に評価することができ
る。通常、この種の計測装置には一定の精度が要求され
るが、この発明では画素の判定に際し、統計的手法によ
る数値を使用しているので、必要により標本検体の撮像
画像から容易に補正値を求め、判定用のデータに反映
し、校正、標準化することができる。この発明によれば
コロニーとその種類の判定だけでなく、培地の変色など
の変化を表現することができる。ここに述べた実施例で
は対象領域は画素にして約１０万個であるが、前述の手
法によれば効率よく微生物の特徴を示す画素を表示する
ことができる。そして各培地、微生物の種類、培養時間
に応じたコロニー平均画素数をデータとして用意し、コ
ロニーが密集したため計数が困難な場合でも、抽出画素
数÷コロニー平均画素数により、計数結果を補足するこ
とができる。またコロニーそのものよりも、ハローを含
む周囲の変色部がより重要となる検査については、この
変色部の画素を微生物特徴として用い、画素数から定量
的に表現することができる。逆に変色の無い部分を定量
評価し、微生物を評価することもできる。

【００１４】なお微生物の遺伝子情報［遺伝子増幅（Ｐ
ＣＲ）法：ランダムＰＣＲ（ＲＡＰＤ）法、パルスフィ
ールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）法］］を第２データと
する。この第２データとして含まれるものを例示する
と、（１）通常の培養法、（２）酵素抗体（ＥＩＡ）
法、（３）免疫磁気ビーズ法などがあり、それらの手法
で得た微生物の特徴を数値化したデータを、それぞれ、
または幾つかを用いる。この発明では、この微生物の遺
伝子情報を、そのデータベースに、第２データとして付
属させて用いることによって、微生物の判定の精度を一
段と向上させることができる。

【００１５】

【発明の効果】この発明によれば、通常に必要とする培
養時間よりも短時間の培養であっても、コロニー計数が
可能であり、また通常の培養を実施した場合のコロニー
数の予測をすることができる。また前述の変色部の定量
的評価、およびその微生物の判定を行うことができる。
この発明はデータベースとの照合だけではなく、統計処
理により得られる数値の比較、または演算結果などで微
生物の判定ができるため、判定に要する時間を短縮する
ことができる。なおこの発明の装置はその用途に応じ、
随意、低価格化を図ることもできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の装置の概略を示す図。

【図２】検体撮像画像の一例を示す図。

【図３】図２のＡ−Ａ’線上の輝度を表すグラフ図。

【図４】図３の補正グラフ図。

【図５】検体の画像の明るさのヒストグラム図。

【図６】検体の画像の色のヒストグラム図。

【図７】検体の判定結果を示す図表を示す図。

【図８】図７の補正結果を示す図表を示す図。

【符号の説明】

（１）照明光源（２）撮像装置（３）シャーレ（３’）撮像画像（ｃ）コロニー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者太田佳志神奈川県横浜市中区伊勢佐木町７丁目152 番地サンヴェール伊勢佐木町601号室Ｆターム(参考） 2G045 AA28 BB20 CB21 FA11 GC22 JA01 4B029 AA07 BB01 CC07 FA03 FA04 GB06 4B063 QA18 QQ05 QQ43 QS39 QX01 QX04 5C054 AA01 EA05 EE08 FC15 FC16 HA05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物の特徴の現れる部位の明るさおよ
び、または色を数値化し、これに統計的手法を用いて得
られた数値と比較して、微生物の集落数および、または
菌種判定を行うことを特徴とする微生物の判定方法。
【請求項２】光散乱板と照明からなる光源と、検体か
ら受光し、撮像する装置とそれと関連するコンピュータ
機器からなる装置により構成されたことを特徴とする請
求項１記載の微生物の判定装置。
【請求項３】培地を設置しない状態で撮像した画像か
ら作成した補正値により、背景となる培地の明るさ、色
のむらを補正することを特徴とする請求項１記載の微生
物の判定方法。
【請求項４】請求項１記載の微生物の判定方法に用い
るコンピュータプログラムのデータベース。
【請求項５】請求項４記載のデータベースに、微生物
の遺伝子情報を付属させたことを特徴とするデータベー
ス。