WO2019193815A1 - 細菌検査装置および細菌検査方法 - Google Patents

細菌検査装置および細菌検査方法 Download PDF

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WO2019193815A1
WO2019193815A1 PCT/JP2019/002165 JP2019002165W WO2019193815A1 WO 2019193815 A1 WO2019193815 A1 WO 2019193815A1 JP 2019002165 W JP2019002165 W JP 2019002165W WO 2019193815 A1 WO2019193815 A1 WO 2019193815A1
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裕一 内保
植松　千宗
小出　哲士
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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Definitions

  • the present disclosure relates to a bacteria testing apparatus and a bacteria testing method.
  • the infectious disease-causing bacteria are cultured, and the bacterial species identification and drug sensitivity are determined from the presence or absence of the growth.
  • specimens such as blood, throat swabs, sputum and the like are collected from the patient and subjected to isolation culture for one day to obtain infection-causing bacteria as a single colony.
  • a bacterial suspension is prepared from a single colony and further cultured for identification culture and drug sensitivity test for one day and night. After culturing, the degree of growth of the bacteria is determined by turbidity, and the results of bacterial species identification and drug susceptibility are obtained.
  • Patent Document 1 discloses a technique using a microscope in order to quickly obtain drug sensitivity results.
  • a microscopic image or a feature amount (change in the number of cells, morphology, etc.) obtained from the microscopic image is compared with a database whose result is known.
  • the edge of the bacteria is detected, binarized, and the feature amount of the bacteria is extracted. Since the binarization threshold may vary depending on the degree of bacterial growth, binarization is automatically binarized using a discriminant analysis method or the like. However, if the growth of bacteria progresses and the bacteria grow on the entire image, the binarization threshold may not be set appropriately. For this reason, it is impossible to accurately determine the growth / inhibition of the bacteria.
  • the present disclosure has been made in view of such a situation, and provides a technique that makes it possible to accurately determine the proliferation / inhibition of bacteria.
  • a bacteria inspection apparatus includes a microscope optical system that acquires images of bacteria in each of a plurality of wells holding a culture solution containing an antibacterial drug and bacteria, and a bacteria A calculation unit that calculates a feature value of the brightness value for each image, a determination unit that determines the growth of bacteria in the well based on a change in the feature value of the brightness value, and a display device that displays a determination result by the determination unit
  • the calculation unit calculates a feature value including at least one of an average value, a median value, and a mode value as the feature value of the luminance value.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating an example of an internal configuration of an image processing unit 105.
  • FIG. 6 is a flowchart for explaining image processing and proliferation / blocking determination (details of processing of the image processing unit 105) according to the first embodiment. It is a figure which shows the example of the image of the binarization by the example of the raw image of bacteria, and the process of the image processing steps 300-326.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of an image and a growth curve when bacteria are detected by binarization using discriminant analysis. As shown in FIG. 1, it is clear from the image that the bacteria are growing with time, but the area of the bacteria detected by binarization using discriminant analysis is changed to about 200 minutes and then turned around. It can be seen that it is decreasing. As a result of such a decreasing trend, it may be difficult to determine whether the antibacterial agent is decreasing or the image processing effect is decreasing.
  • This embodiment proposes an improvement plan for such a conventional method for determining bacterial growth. More specifically, a bacterial growth determination based on a temporal change in a statistical feature quantity (also referred to as a statistical evaluation value of a luminance value of a microscopic image, for example, an average value, a median value, a mode value, etc.) is disclosed. .
  • a statistical feature quantity also referred to as a statistical evaluation value of a luminance value of a microscopic image, for example, an average value, a median value, a mode value, etc.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a schematic configuration example of the bacteria test apparatus 100 according to the embodiment of the present disclosure (common to all the embodiments).
  • the bacteria test apparatus 100 includes an illumination unit 101, a test plate 102, an objective lens 103, an imaging unit 104, an image processing unit 105, and a control unit 106.
  • the test plate 102 has a plurality of wells, and each well holds a medium component for growing bacteria and an antibacterial drug to be tested. After the bacterial solution containing the bacteria to be tested is dispensed to each well, the test plate 102 is introduced into the bacteria test apparatus 100.
  • the bacteria testing apparatus 100 is temperature adjusted to a temperature at which bacteria can grow, for example, 37 ° C.
  • the illumination unit 101 irradiates the inspection plate 102 with light.
  • the illumination unit 101 may use a light source such as an LED including white light such as a lamp or light in a specific wavelength range.
  • the light passing through each well in the inspection plate 102 is collected by the objective lens 103 and measured as an image by the imaging unit 104.
  • the objective lens 103 is preferably focused on the bottom surface of the well of the test plate 102 so that the state of bacterial growth can be observed, but may be photographed in accordance with the inside of the culture solution away from the bottom surface.
  • images of a plurality of points in the well may be acquired, or a plurality of images inside the culture solution separated from the well bottom surface of the test plate 102 may be measured.
  • Image capturing is performed at a preset time interval, for example, every 30 minutes.
  • the obtained image is processed by the image processing unit 105 and sent to the control unit 106.
  • the control unit 106 includes, for example, a general computer and a display device, and can set measurement conditions, start and stop measurement, and view the results according to instructions from an operator.
  • the measurement conditions are set by setting the type and concentration of the antibacterial drug on the test plate 102, information on the type of bacteria to be tested, the image measurement interval, the discrimination time, and the like.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an internal configuration example of the image processing unit 105.
  • the image processing unit 105 includes a calculation unit 1051, a storage unit 1053, and a discriminator (discriminating unit) 1055.
  • the computing unit 1051 processes the captured image and extracts a feature amount.
  • the discriminator 1055 uses the feature amount acquired from the calculation unit 1051 to determine whether the antibacterial drug is invalid and the bacteria are growing (“growth”), or the antibacterial drug is effective and the bacterial growth is suppressed (“ It is discriminated whether it is “blocking”).
  • the storage unit 1053 stores the measured image, feature amount, and discriminant.
  • the discriminant is created by learning from teacher data such as pre-measured images, feature amounts, and results of conventional methods.
  • the result of the conventional method is a result of growth or inhibition determined by a turbidimeter after 18 to 24 hours.
  • the result of this conventional method is set to “correct answer”, learning is performed using the image measurement result and the extracted feature amount, and a discriminant is created.
  • the discriminant is created for each type of antibacterial drug or fungus. You may discriminate
  • the discriminator 1055 When the discriminator 1055 acquires the feature amount, the discriminator 1055 discriminates the proliferation / inhibition of the well using a discriminant corresponding to the antibacterial drug. At this time, since the image input from the imaging unit 104 includes information on the bacterial species and the antibacterial agent, an appropriate discriminant is selected from the storage unit 1053.
  • the growth / inhibition discrimination using the image is output to the control unit 106 at a preset time, for example, 3, 6, 18 hours after the culture. In the control unit 106, a captured raw image, an image after image processing, a proliferation / blocking discrimination result, and the like can be viewed.
  • FIG. 4 is a flowchart for explaining image processing and proliferation / prevention determination (details of processing of the image processing unit 105) according to the first embodiment.
  • the image is assumed to be an 8-bit gray scale image, and the pixel value 0 is black and 255 is white. This process is effective (applicable) even for grayscale images other than 8 bits and black-and-white inverted images.
  • a color image can be similarly processed by converting it to a grayscale image.
  • Step 300 The computing unit 1051 acquires a captured image from the imaging unit 104 (S300).
  • the feature amount is extracted by two independent image processing.
  • One is a feature amount based on the luminance value (statistical feature amount related to the luminance value of each pixel of the captured image), and the other is a feature amount based on a known method (feature amount based on the binarized image).
  • Each feature amount extraction process can be executed in parallel, for example.
  • Step 310 The calculation unit 1051 calculates a luminance value histogram in the image from the luminance value of each pixel.
  • Step 312 The computing unit 1051 calculates feature values such as an average value, a median value, and a mode value as feature values of the brightness value from the brightness value histogram obtained in step 310, and stores the feature values of these brightness values as the storage unit 1053. To remember.
  • Step 320 The computing unit 1051 first performs a dispersion filter process on the target image.
  • the dispersion filter process is a process of replacing the value of the pixel of interest with the dispersion value of pixels around the pixel.
  • a pixel having a bacterium has a large change from a surrounding pixel without the bacterium, so that an edge of the bacterium can be detected.
  • Edge detection techniques other than the dispersion filter, such as a Sobel filter, may be used.
  • the computing unit 1051 performs Gaussian filter processing on the image that has been subjected to dispersion filter processing.
  • the Gaussian filter process is a process performed to smooth the detected edge. Thereafter, in order to make the processed image easier to see, black and white inversion processing is optionally performed. Bacteria are displayed as black and the background is displayed as white due to black and white reversal.
  • the arithmetic unit 1051 sets a black and white threshold value for the subsequent binarization process. Since the brightness and contrast of the bacteria in the image change depending on the bacterial species and the number of bacteria in the image, there are cases where the image of the same well changes as the culture proceeds. When binarization is performed with a certain threshold, the bacteria in the image cannot be sufficiently recognized, and an error may occur in the number of bacteria. Therefore, even in the same well, it is necessary to automatically determine for each image.
  • a binarization threshold value is set by a known method using discriminant analysis. Another known method may be used as the automatic threshold setting method.
  • Step 326 The arithmetic unit 1051 executes binarization processing based on the threshold set in step 324 and stores the binarized image in the storage unit 1053.
  • Step 328 The calculation unit 1051 extracts a feature amount for a portion recognized as black as bacteria from the binarized image.
  • the feature amount the number of bacteria in the image, the area of the bacteria, the circumference of the bacteria, the roundness of the bacteria, the length of the minor axis / major axis, and the ratio thereof are calculated.
  • Step 330 The computing unit 1051 uses temporal changes from the same well for each of the feature amount extracted in Step 312 (the feature amount of the luminance value) and the feature amount extracted in Step 328 (the feature amount based on the binarized image). A new feature amount is calculated. As the new feature amount, a maximum value, a minimum value, a slope, a difference between feature amounts between two specific times, a time when the maximum value and the minimum value are obtained, and the like are calculated. These new feature amounts are also stored in the storage unit 1053. The measured data can be used again as teacher data. By increasing the teacher data, the determination accuracy of the discriminator 1055 can be improved.
  • an image immediately after photographing may be processed in real time, or a plurality of images may be processed collectively after measurement.
  • the discriminator 1055 acquires a new feature amount from the calculation unit 1051 and outputs a discrimination result for each well. First, the discriminator 1055 discriminates whether or not bacterial growth has occurred using the feature value of the brightness value (statistical feature value regarding the brightness value). In the present embodiment, an average value is used as the statistical feature value of the luminance value. A luminance average value is calculated from an image taken at a preset discrimination time, and a difference from the luminance average value at the initial stage of culture is calculated. Here, the initial stage of culture is about 0 to 1 hour after the start of culture. The threshold is set by learning from teacher data. If bacteria grow on the entire image, they will also grow above the bottom of the focus.
  • the amount of transmitted light decreases, so that the luminance value of the entire image approaches black and the average luminance value decreases. Therefore, when the average luminance value of the image decreases below a certain threshold value, it can be determined that the bacteria are reliably growing.
  • the change in the average brightness value is very small, so that the bacteria are not mistakenly identified as growth.
  • the discriminator 1055 discriminates the proliferation or the inhibition by the discriminant using the feature amount of the bacteria when the difference in the luminance average value is equal to or less than the threshold value.
  • the feature amount of bacteria a discriminant is created using one or more feature amounts such as the number of bacteria, the maximum value of the bacteria area, the inclination of the bacteria area, and the minimum value of roundness.
  • the result of proliferation (step 350) or inhibition (step 370) is output to the control unit 106.
  • MIC Minimum Inhibitory concentration
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of a bacterial raw image and an example of an image binarized by the processing of image processing steps 300 to 326.
  • E. coli was cultured in a medium containing ampicillin / sulbactam concentration of 4/2 ⁇ g / mL and photographed at 0 minutes, 180 minutes, and 360 minutes.
  • a black part in the binarized image is a part recognized as bacteria.
  • feature amounts were extracted in S312 and S328 from images taken for 6 hours every 30 minutes under the same conditions as in FIG.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a result of plotting a bacterial area and an average luminance value in an image as an example of the feature amount.
  • the bacterial area has increased to 300 minutes but has decreased thereafter.
  • the luminance average value hardly changes from the initial stage of culture to 6 hours. From this, as an example of the feature amount based on the time change in step 330, the maximum bacterial area and the slope at each measurement time are calculated. For example, when the discrimination time is 6 hours, the maximum value of the bacterial area at 6 hours, the slope obtained from the bacterial area immediately before 6 hours, the average brightness value at 6 hours and the average brightness value at 0 hour Calculate differences, etc.
  • proliferation / inhibition is discriminated according to the discrimination procedures S340 and S350.
  • the absolute value of the difference between the luminance average values is 2.2, which is equal to or less than the threshold value, the proliferation is not determined and the process proceeds to the determination procedure S360.
  • the maximum bacterial area value and the slope are input to the discriminator to discriminate growth / inhibition. This result was determined to be blocking.
  • the result of the conventional method obtained with turbidity after 18 hours was blocking and was consistent with the result obtained from the image.
  • FIG. 7 is a diagram showing images taken at 0 minutes, 180 minutes, and 360 minutes after culturing Escherichia coli in a medium containing ampicillin / sulbactam concentration of 1 / 0.5 ⁇ g / mL.
  • FIG. 8 is a diagram showing the result of plotting the bacterial area and the luminance average value in the image using an image taken for 6 hours every 30 minutes under the same conditions as in FIG. As shown in FIG. 8, it starts to rise in the vicinity of 120 minutes from the change in bacterial area over time. The bacterial area reaches its maximum value at 240 minutes, but after that, it turns around and decreases.
  • the average brightness value it is possible to accurately determine the growth of bacteria.
  • the luminance value is not used, the bacterial area is apparently decreased, and it has been determined to be blocked after 270 minutes.
  • it can be correctly determined as proliferation by the determination based on the average luminance value.
  • proliferation can be determined without processing such as binarization by dividing an image into a plurality of regions, so that the calculation time and cost can be reduced. Therefore, it is possible to determine bacterial growth / inhibition quickly and in real time.
  • FIG. 9 shows microscopic images of 0, 180, and 360 minutes when E. coli is cultured in a medium containing cefoxitin at a concentration of 2 ⁇ g / mL.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating a result of plotting changes in average value, median value, and mode value of luminance values with respect to the image in FIG. 9. Even for the same image, the amount of change differs depending on the feature amount, and the mode value indicates the largest change.
  • the mode value at the beginning of the culture represents the luminance value of the background medium portion because the number of bacteria is small.
  • the medium portion disappears, and the majority of the bacterial portions having different luminance values are obtained.
  • Second Embodiment In the second embodiment, minimum value filter processing is performed on the image of each well, and the growth of bacteria is more quickly determined based on the temporal change of the luminance value of each image.
  • the form to perform is disclosed.
  • inspection apparatus by 2nd Embodiment the structure (example) similar to the bacteria test
  • FIG. 11 is a flowchart for explaining image processing executed by the bacteria testing apparatus according to the second embodiment.
  • FIG. 11 detailed description of portions denoted by the same reference numerals as those in FIG. 4 is omitted.
  • step 1101 is added to the process of FIG. That is, in the second embodiment, step 1101 for executing the minimum value filtering process on the image is added before the process of calculating the luminance value histogram (step 310).
  • the minimum value filtering process in step 1101 is a process of replacing the luminance value of the pixel of interest with the minimum value of surrounding pixels. The effect of emphasizing the edge (outline) of bacteria is obtained. Then, after performing the minimum value filtering process, a luminance value histogram is calculated, and a feature value of the luminance value is extracted. In this way, when there is a minimum value filtering process, the amount of change in the feature amount can be greatly emphasized compared to when there is no minimum value filtering process. Therefore, it becomes possible to determine bacterial growth more quickly.
  • FIG. 12 shows changes in the luminance mode value when the 3 ⁇ 3 minimum value filtering process is performed on the image shown in FIG. 9 and changes in the luminance mode value when the minimum value filtering process is not performed. It is a figure which shows the result of having compared.
  • the luminance mode value changes more greatly by adding the minimum value filter process. Therefore, proliferation can be determined more quickly. In this case, the growth of bacteria can be determined more than 30 minutes earlier by the minimum value filter processing.
  • FIG. 13 shows microscopic images of 0 minutes, 180 minutes, and 360 minutes when E. coli was cultured in a medium containing ampicillin at a concentration of 2 ⁇ g / mL.
  • FIG. 14 is a diagram showing a temporal change of the bacterial area under the conditions of FIG. 13 and a temporal change of the luminance mode value with or without the minimum value filter. As shown in FIG. 14, when the bacteria do not grow on the entire image, the luminance mode value does not change regardless of the presence or absence of the minimum value filter. Therefore, since the growth of bacteria is not erroneously detected by the minimum value filter process, the merit (emphasis on the amount of change in the feature amount) can be enjoyed to the maximum.
  • the third embodiment discloses a mode for estimating a growth curve of bacteria after the bacteria have grown on the entire image using a change in luminance value.
  • the bacteria testing apparatus according to the third embodiment can also have the same configuration (example) as the bacteria testing apparatus 100 according to the first embodiment (see FIG. 2). Further, in the bacteria testing apparatus 100 according to the third embodiment, after performing the image processing (see FIG. 4) according to the first embodiment, the bacteria growth curve estimation process (see FIG. 15) is performed. Detailed descriptions of the portions denoted by the same reference numerals as those in FIGS. 2 and 4 are omitted.
  • ⁇ Necessity for estimation of bacterial growth curve> In a general bacteria inspection apparatus, if bacteria grow on the entire image, it is impossible to detect whether or not the bacteria have grown thereafter. In addition, when the user confirms the bacterial growth curve using the bacterial area with the control unit 106, if the bacterial area is reduced due to the influence of automatic binarization, it is difficult to intuitively determine whether or not the bacterial growth has occurred. End up. For this reason, it is desirable to be able to determine whether or not a recent growth has occurred even if the bacterial area has decreased.
  • the present embodiment proposes to estimate the growth curve by combining the luminance value with the feature amount of bacteria.
  • FIG. 15 is a flowchart for explaining a process of estimating a growth curve based on the bacterial area based on the bacterial area and the luminance value.
  • the bacterial area growth curve estimation processing will be described.
  • Step 1401 The image processing unit 105 calculates each feature amount (the luminance mode value and the feature amount after the latest detection) using the input image based on the image processing of FIG.
  • Step 1403 The image processing unit 105 determines whether or not the absolute value of the difference between the luminance mode values of an image captured at a certain time with respect to the luminance mode value at the initial stage of culture exceeds a preset threshold value. If the absolute value of the difference between the luminance mode values is equal to or smaller than the threshold value, the process proceeds to step 1411. If the absolute value of the difference between the luminance mode values is larger than the threshold, the process proceeds to step 1421. When the absolute value of the difference between the luminance mode values is larger than the threshold value, it is determined that the detection of bacteria is less than actual.
  • the preset threshold value can be learned and set by teacher data, for example.
  • Step 1411 When the difference absolute value of the luminance mode value is equal to or smaller than the threshold value, the image processing unit 105 uses the extracted bacterial area as it is.
  • Step 1421 When the absolute value of the difference between the luminance mode values exceeds the threshold value, the image processing unit 105 calculates the inclination of the luminance mode value at each time from the images photographed in the same well. In addition, since it is clear that the number of bacteria is small at the beginning of the culture (from 0 to 1 hour), the slope is not calculated.
  • the image processing unit 105 uses the time when the inclination changes more than a certain value with respect to the inclination of the initial culture time and the next photographing time (for example, the inclination of the luminance mode between 1 hour and 1.5 hours). Set to time. For example, the time when the inclination becomes 10 times or more of the inclination at the beginning of the culture is set as the reference time.
  • Step 1425 The image processing unit 105 corrects the bacterial area for the bacterial area after the reference time by using the correction formula shown in Expression (1).
  • a ′ T ⁇ k ⁇ (L T ⁇ L 0 ) ⁇ s + A T0 (1)
  • the slope of the bacterial area at the reference time T0 and the time immediately before it is s is A T0
  • the bacterial area at the reference time T0 is A T0
  • the luminance mode at the current time T is L T
  • the corrected bacterial area A ′ T is estimated with the mode value L T0 and the proportionality constant specific to the feature value of the luminance value as k.
  • the bacterial area is assumed to be detected almost accurately until the reference time, and the logarithmic growth phase is considered immediately after the reference time. From this, it is assumed that the bacteria are growing at almost the same growth rate, and the growth curve is estimated.
  • the subsequent bacterial growth rate is considered to be substantially proportional to the amount of change from the luminance value at the reference time, and therefore the bacterial area is estimated by applying a gradient to the difference in luminance values.
  • Step 1431 The image processing unit 105 outputs the change in bacterial area to the control unit 106.
  • the control unit 106 displays the generated growth curve on the display screen of the display device. As a result, the user can confirm the growth curve.
  • FIG. 16 is a diagram showing temporal changes in the luminance mode value of the image shown in FIG. 9, the bacterial area before correction, and the bacterial area after correction (taken every 30 minutes).
  • the bacterial area up to 240 minutes is output as it is.
  • the slope of the luminance mode value for each time after 60 minutes is calculated.
  • the slope of the luminance mode value of 60 minutes and 90 minutes is used as a reference, and 210 minutes when the slope change is 10 times or more is set as the reference time. Therefore, the bacterial area after 240 minutes is corrected with 210 minutes as the reference time.
  • the bacteria area is output once for 240 minutes, but since the luminance mode value exceeds the threshold value in 270 minutes, the bacteria area is corrected retroactively. That is, the bacterial area is output as it is after 240 minutes of imaging, but the bacteria area is corrected after 270 minutes of imaging. In this way, it is possible to correct only the reduction in the bacterial area due to the influence of the binarization process.
  • the correction formula (the above formula (1))
  • the growth curve after correction shown in FIG. 16 was obtained.
  • the growth curve of the bacteria area can be estimated by combining the mode of brightness, and the state of bacterial growth can be displayed visually and in an easily understandable manner.
  • bacteria grow on the entire image it is difficult to estimate the state of growth by the image alone, but it is possible to estimate whether or not it has been grown by using the luminance value.
  • the bacterial inspection apparatus includes a microscope optical system for acquiring images of bacteria in each of a plurality of wells holding a culture solution containing an antibacterial drug and bacteria, and a feature value of a luminance value for each of the bacteria images.
  • the calculation unit calculates a feature value including at least one of an average value, a median value, and a mode value as the feature value of the luminance value.
  • the growth and inhibition of bacteria are determined based on the feature amount of the shape of the bacteria (at least one of the area, circumference, circularity, and number of the bacteria).
  • the presence or absence of growth is determined, so that bacterial growth can be detected reliably and accurately.
  • the shape feature value of the bacteria in the fungus image is acquired, and a plurality of the feature value of the brightness value and the shape feature value are combined, Try to distinguish between growth and inhibition.
  • the bacterial growth determination based on the shape feature amount of the bacteria it is possible to quickly detect bacterial growth and inhibition.
  • the feature value of the luminance value is calculated after applying the minimum value filter process to the bacteria image to emphasize the edge of the bacteria. By doing so, the amount of change in the feature value of the luminance value can be emphasized, so that the growth of bacteria can be detected quickly.
  • the bacterial growth curve is estimated by correcting the temporal change in the bacterial area based on the temporal change in the feature value of the luminance value, and the estimated bacterial growth curve is displayed on the display device. I am doing so. By doing in this way, even if it is a case where the area of bacteria is reducing by the influence of automatic binarization, it will become possible to perform bacterial growth determination with high accuracy.

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Abstract

菌の増殖／阻止判定を正確に行うことを可能とする技術を提供する。本開示による細菌検査装置は、抗菌薬と細菌を含む培養液を保持する複数のウェルのそれぞれにおける菌の画像を、複数の時点において取得する顕微鏡光学系と、菌の画像ごとに輝度値の特徴量を算出する演算部と、輝度値の特徴量の変化に基づいて、ウェルにおける細菌の増殖を判別する判別部と、判別部による判別結果を表示する表示装置と、を備え、演算部は、輝度値の特徴量として、平均値、中央値および最頻値のうち少なくとも１つを含む特徴量を算出する（図４参照）。

Description

細菌検査装置および細菌検査方法
　本開示は、細菌検査装置および細菌検査方法に関する。
　近年、感染症患者に対する抗生物質の濫用により薬剤耐性菌の割合が増加し、それに伴い院内感染の発生件数も増加傾向にある。しかし、利益率の低下のため新規抗生物質の開発は年々減少している。そのため、感染症発生時にその起因菌の菌種同定検査および薬剤感受性検査を実施し、抗生物質を適切に使用することによって、患者の早期回復、院内感染の拡大防止、さらに薬剤耐性菌の出現を抑制することは、極めて重要となっている。
　病院の細菌検査室で通常実施されている検査方法では、感染症起因菌を培養し、その増殖の有無から菌種の同定と薬剤感受性を判定する。まず、患者から血液、咽頭ぬぐい液、喀痰などの検体を採取し、感染起因菌を単独コロニーで得るための分離培養を１昼夜行う。単独コロニーから細菌懸濁液を調製し、同定培養や薬剤感受性検査のための培養をさらに１昼夜行う。培養後、菌の増殖度を濁度で判定し、感染症起因菌の菌種同定および薬剤感受性の結果が得られる。したがって、薬剤感受性検査の判定結果が得られ、適切な投薬が行われるためは、患者からの検体採取後例えば３日目以降となる。増殖速度が遅く、長時間の培養が必要な感染起因菌においては、さらに日数を要する。この検査結果が判明するまでは幅広い菌種に有効な抗菌剤が使用される場合が多い。そのため、従来に比べてより迅速に菌種同定および薬剤感受性の結果が得られる手法が求められている。
　例えば、特許文献１は、迅速に薬剤感受性結果を得るために、顕微鏡を用いた手法について開示している。当該手法においては、細菌の増殖状況を検知するため、顕微鏡画像または、顕微鏡画像から得られる特徴量（菌体数や形態の変化など）を、結果が既知のデータベースと比較する。
特開２０１５－１７７７６８号公報
　特許文献１に開示された顕微鏡画像を用いた細菌の増殖状況を判定する方法では、細菌のエッジを検出し、２値化し、細菌の特徴量を抽出する。細菌の増殖度合いに応じて２値化の閾値が異なることがあるため、２値化は判別分析法等を利用して自動で２値化される。しかし、細菌の増殖が進み、画像全体に細菌が増殖すると、２値化の閾値が適切に設定されなくなる可能性がある。このため、菌の増殖／阻止を正確に判定することができなくなる。
　本開示はこのような状況に鑑みてなされたものであり、菌の増殖／阻止判定を正確に行うことを可能とする技術を提供するものである。
　上記課題を解決するために、本開示による細菌検査装置は、抗菌薬と細菌を含む培養液を保持する複数のウェルのそれぞれにおける菌の画像を、複数の時点において取得する顕微鏡光学系と、菌の画像ごとに輝度値の特徴量を算出する演算部と、輝度値の特徴量の変化に基づいて、ウェルにおける細菌の増殖を判別する判別部と、判別部による判別結果を表示する表示装置と、を備え、演算部は、輝度値の特徴量として、平均値、中央値および最頻値のうち少なくとも１つを含む特徴量を算出する。
　本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
　本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではないことを理解する必要がある。
　本開示による細菌検査装置によれば、細菌が画像全体に増殖し、自動2値化処理が不適当な閾値設定により細菌検出に誤差が生じた場合でも、細菌の増殖を精度よく検知することができる。
判別分析を利用した２値化で細菌を検出した場合の画像と増殖曲線の例を示す図である。 本開示の実施形態（全実施形態共通）の細菌検査装置１００の概略構成例を示す図である。 画像処理部１０５の内部構成例を示す図である。 第１の実施形態による、画像処理および増殖／阻止判定（画像処理部１０５の処理の詳細）を説明するためのフローチャートである。 細菌の生画像の例と画像処理ステップ３００～ステップ３２６の処理により２値化した画像の例を示す図である。 特徴量の例として、画像内の細菌面積と輝度平均値をプロットした結果を示す図である。 アンピシリン／スルバクタムの濃度１／０．５μｇ／ｍＬを含む培地に大腸菌を培養し、０分、１８０分、３６０分で撮影した画像を示す図である。 図７と同じ条件で３０分毎に６時間撮影した画像を用い、画像内の細菌面積と輝度平均値をプロットした結果を示す図である。 濃度２μｇ／ｍＬのセフォキシチンを含む培地で大腸菌を培養したとき、０、１８０、３６０分の顕微鏡画像を示す図である。 図９の画像に対し、輝度値の平均値、中央値、最頻値の変化をプロットした結果を示す図である。 第２の実施形態の細菌検査装置によって実行される画像処理を説明するためのフローチャートである。 図９に示した画像に対して３×３の最小値フィルタ処理を施した場合の輝度最頻値の変化と当該最小値フィルタ処理を施さない場合の輝度最頻値の変化とを比較した結果を示す図である。 濃度２μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む培地で大腸菌を培養したときの、０分、１８０分、および３６０分の顕微鏡画像を示す図である。 図１３の条件の細菌面積の時間変化と、最小値フィルタの有無で輝度最頻値の時間変化を示す図である。 細菌面積と輝度値に基づいて細菌面積による増殖曲線を推定する処理を説明するためのフローチャートである。 図９に示した画像の輝度最頻値、補正前の細菌面積、および補正後の細菌面積の時間変化を示す（３０分毎に撮影）図である。
　以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。添付図面では、機能的に同じ要素は同じ番号で表示される場合もある。なお、添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施形態と実装例を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。
　本実施形態では、当業者が本発明を実施するのに十分詳細にその説明がなされているが、他の実装・形態も可能で、本発明の技術的思想の範囲と精神を逸脱することなく構成・構造の変更や多様な要素の置き換えが可能であることを理解する必要がある。従って、以降の記述をこれに限定して解釈してはならない。
（１）顕微鏡画像を用いた検査において細菌の増殖／阻止を正確に判定できなくなってしまう原因について
　顕微鏡画像を用いた細菌の増殖状況を判定する方法では、細菌の増殖度合いに応じて２値化の閾値が異なることがあるため、細菌の増殖が進み、画像全体に細菌が増殖すると、２値化の閾値が適切に設定されなくなる可能性がある。そのため、画像内の実際の細菌よりも少なく検出され、細菌が減少しているように見えてしまう場合がある。
　図１は、判別分析を利用した２値化で細菌を検出した場合の画像と増殖曲線の例を示す図である。図１を見ると、画像からは細菌が時間と共に増殖していることが明らかであるが、判別分析を利用した２値化で検出した細菌の面積は、２００分程度まで増殖した後、一転して減少していることが分かる。このような減少傾向の結果、抗菌薬の効果により減少しているのか、画像処理の効果により減少しているかの判断が困難な場合がある。
　本実施形態は、このような従来の細菌の増殖判定方法の改良案を提案するものである。より具体的には、顕微鏡画像の輝度値の統計的特徴量（統計的評価値ともいう。例えば、平均値、中央値、最頻値など）の時間変化に基づく細菌の増殖判定が開示される。
（２）第１の実施形態
　第１の実施形態は、検査プレートの各ウェルの画像を取得し、各ウェルの画像の輝度値（例えば、輝度平均値）の時間変化に基づいて細菌の増殖の有無を判定する形態について開示する。
　＜細菌検査装置の構成例＞
　図２は、本開示の実施形態（全実施形態共通）の細菌検査装置１００の概略構成例を示す図である。細菌検査装置１００は、照明部１０１と、検査プレート１０２と、対物レンズ１０３と、撮像部１０４と、画像処理部１０５と、制御部１０６と、を備えている。
　検査プレート１０２は、複数のウェルを有し、各ウェルには細菌が増殖するための培地成分および検査対象の抗菌薬が保持されている。各ウェルに対して検査対象の細菌を含む菌液が分注された後、検査プレート１０２は細菌検査装置１００へ導入される。細菌検査装置１００は細菌が増殖できる温度、例えば３７℃に温度調整されている。
　照明部１０１は、検査プレート１０２に光を照射する。照明部１０１は、ランプなどの白色光や、特定の波長域の光を含むＬＥＤ等の光源を利用してもよい。検査プレート１０２内の各ウェルを通った光は、対物レンズ１０３により集光され、撮像部１０４で画像として測定される。細菌の増殖の様子が観察できるように、対物レンズ１０３の焦点は検査プレート１０２のウェル底面に合わせることが望ましいが、底面から離れた培養液内部に合わせて撮影してもよい。また、ウェル内の複数の地点の画像を取得してもよいし、検査プレート１０２のウェル底面から離れた培養液内部の画像を複数枚測定してもよい。画像の撮影は、あらかじめ設定された時間間隔、例えば３０分ごとに実行される。得られた画像は画像処理部１０５で処理され、制御部１０６に送られる。
　制御部１０６は例えば一般的なコンピュータおよび表示装置などで構成され、オペレータの指示に応じて、測定条件の設定、測定の開始および中止、結果の閲覧が可能となる。測定条件の設定は、検査プレート１０２の抗菌薬の種類および濃度の配置、検査する菌種の情報、画像の測定間隔や判別時間などを設定する。
　＜画像処理部の内部構成例＞
　図３は、画像処理部１０５の内部構成例を示す図である。画像処理部１０５は、演算部１０５１と、記憶部１０５３と、判別器（判別部）１０５５と、を備えている。
　演算部１０５１は、撮影された画像を処理し、特徴量を抽出する。判別器１０５５は、演算部１０５１から取得した特徴量を用いて、抗菌薬が無効で細菌が増殖している(“増殖”)か、抗菌薬が有効で細菌の増殖が抑制されている(“阻止”)か判別する。
　記憶部１０５３は、測定された画像および特徴量、判別式を保存する。判別式は、あらかじめ測定された画像、特徴量、および従来法の結果などの教師データから学習し、作成される。また、従来法の結果とは、１８～２４時間後に濁度計で判定された、増殖または阻止の結果である。この従来法の結果を「正解」とし、画像の測定結果および抽出された特徴量を用いて学習し、判別式は作成される。判別式は、抗菌薬の種類または菌種ごとに作成される。発育速度や抗菌薬に対する応答が類似の菌種で学習された教師データを用いて判別してもよい。また、類似の菌種で教師データをまとめて判別式を作成してもよい。
　判別器１０５５は、特徴量を取得すると、抗菌薬に対応した判別式を用いて、当該ウェルの増殖／阻止を判別する。このとき、撮像部１０４から入力された画像には、菌種と抗菌薬の情報が含まれているため、適当な判別式が記憶部１０５３から選択される。画像を用いた増殖/阻止の判別は、あらかじめ設定された時点、例えば培養後３、６、１８時間後などで制御部１０６に出力される。制御部１０６では、撮影された生画像や画像処理後の画像、増殖／阻止の判別結果などが閲覧できる。
　＜画像処理部１０５における処理の詳細＞
　図４は、第１の実施形態による、画像処理および増殖／阻止判定（画像処理部１０５の処理の詳細）を説明するためのフローチャートである。なお、以降の説明において、画像は８ｂｉｔのグレースケール画像とし、画素値０が黒、２５５が白とする。８ｂｉｔ以外のグレースケール画像や、白黒反転した画像でも、当該処理は有効（適用可能）である。カラー画像も、グレースケール画像へ変換することで同様の処理が可能となる。
（i）ステップ３００
　演算部１０５１は、撮像部１０４から、撮影された画像を取得する（Ｓ３００）。演算部１０５１での画像処理では、２つの独立した画像処理により特徴量が抽出される。１つは輝度値に基づく特徴量（撮像画像の各画素の輝度値に関する統計的特徴量）であり、もう１つは既知の手法による特徴量（２値化画像に基づく特徴量）である。それぞれの特徴量抽出処理は、例えば、並行して実行することができる。
（ii）ステップ３１０
　演算部１０５１は、各画素の輝度値から、画像内の輝度値ヒストグラムを算出する。
（iii）ステップ３１２
　演算部１０５１は、ステップ３１０で得られた輝度値ヒストグラムから輝度値の特徴量として、平均値、中央値、最頻値などの特徴量を算出し、これらの輝度値の特徴量を記憶部１０５３に記憶する。
（iv）ステップ３２０
　演算部１０５１は、まず対象の画像に対して分散フィルタ処理を実行する。分散フィルタ処理は、注目する画素の値を、その画素の周囲の画素の分散値に置き換える処理である。細菌がある画素では、細菌がいない周囲の画素との変化が大きくなるため、細菌のエッジを検出することができる。分散フィルタ以外のエッジ検出技術、例えばソーベルフィルタなどを用いてもよい。
（v）ステップ３２２
　演算部１０５１は、分散フィルタ処理された画像に対してガウシアンフィルタ処理を実行する。ガウシアンフィルタ処理は、検出したエッジを平滑化するために行う処理である。その後、処理後の画像を見やすくするため、任意で白黒反転処理を行う。白黒反転により、細菌が黒、背景が白と表示される。
（vi）ステップ３２４
　続いて、演算部１０５１は、その後の２値化処理のため、白黒の閾値を設定する。画像内の細菌の明るさやコントラストは、菌種や画像内の細菌数によって変化するため、同じウェルの画像であっても、培養が進むに従って変化する場合がある。一定の閾値で２値化した場合には、画像内の細菌を十分に認識できず、細菌数などに誤差が生じることがある。したがって、同一ウェルであっても、画像毎に自動で判別する必要がある。本実施形態では、公知である判別分析を利用した方法で２値化の閾値を設定する。閾値の自動設定法は、公知の別の方法を利用してもよい。
（vii）ステップ３２６
　演算部１０５１は、ステップ３２４で設定された閾値に基づいて２値化処理を実行し、２値化された画像を記憶部１０５３に保存する。
（viii）ステップ３２８
　演算部１０５１は、２値化された画像から、細菌として黒で認識された部分について特徴量を抽出する。特徴量として、画像内の細菌数、細菌面積、細菌の周長、細菌の真円度、短軸・長軸の長さおよびそれらの比、などが算出される。
（ix）ステップ３３０
　演算部１０５１は、ステップ３１２で抽出した特徴量（輝度値の特徴量）とステップ３２８で抽出した特徴量（２値化画像に基づく特徴量）のそれぞれについて、同一ウェルからの時間変化を利用した新たな特徴量を算出する。この新たな特徴量としては、最大値、最小値、傾き、特定の２つの時刻間の特徴量の差分、最大値や最小値が得られた時間、などが算出される。これらの新たな特徴量も、記憶部１０５３で保存される。測定したデータは、再度教師データとして利用することも可能である。教師データを増やすことで、判別器１０５５の判定精度を向上させることができる。
　以上の特徴量抽出までの工程（ステップ３００～ステップ３３０）は、撮影直後の画像をリアルタイムに処理してもよいし、測定後にまとめて複数の画像を処理してもよい。
（x）ステップ３４０
　判別器１０５５は、演算部１０５１から新たな特徴量を取得し、ウェルごとに判別結果を出力する。まず、判別器１０５５は、輝度値の特徴量（輝度値に関する統計的特徴量）を用いて、細菌の増殖が起こっているか判別する。本実施形態では、輝度値の統計的特徴量として、平均値が使用される。あらかじめ設定された判別時刻で撮影された画像から輝度平均値を算出し、培養初期の輝度平均値との差分を算出する。ここで、培養初期とは、培養開始後０～１時間程度とする。閾値は、教師データにより学習して設定される。画像全体に細菌が増殖した場合、細菌は焦点が合っている底面よりも上部でも増殖が進む。細菌の増殖が進むと、透過する光量が減少するため、画像全体の輝度値が黒に近づき、輝度平均値は減少する。したがって画像の輝度平均値が、ある閾値以下に減少したときに、確実に細菌が増殖していると判別することができる。細菌の増殖が画像全体に至らない場合には、輝度平均値の変化は非常に少ないため、誤って細菌を増殖と判別することはない。
（xi）ステップ３５０
　判別器１０５５は、判別する時刻の輝度平均値と、培養初期の輝度平均値の差分の絶対値が閾値よりも大きい場合、増殖と判定する。
（xii）ステップ３６０
　一方、判別器１０５５は、輝度平均値の差分が閾値以下の場合は、細菌の特徴量を用いた判別式により、増殖または阻止と判別する。細菌の特徴量としては、細菌数や細菌面積の最大値、細菌面積の傾き、真円度の最小値など、1ないし複数の特徴量を用いて判別式を作成する。判別式は、抗菌薬や菌種により異なる特徴量を用いることが好ましい。
　従来法の結果に対して一致率が高い判別式を使用することで精度よく、かつ迅速に判別可能となる。判別式による判別の結果、増殖（ステップ３５０）または阻止（ステップ３７０）の結果が制御部１０６に出力される。
　その後、各抗菌薬の濃度ごとに増殖/阻止の結果が得られる。そして、阻止となった最小の抗菌薬濃度が、最小発育阻止濃度（MIC: Minimum Inhibitory concentration）としてとして出力される。さらに、ブレイクポイント表と比較して、対象の菌が抗菌薬に対して感受性（Ｓ）か、中間（Ｉ）か、耐性（Ｒ）か、を判定する。
　＜測定例：実施例１＞
　図５は、細菌の生画像の例と画像処理ステップ３００～ステップ３２６の処理により２値化した画像の例を示す図である。当該測定例では、アンピシリン／スルバクタムの濃度４／２μｇ／ｍＬを含む培地で大腸菌を培養し、０分、１８０分、３６０分で撮影した。２値化画像において黒色の部分が細菌と認識されている部分である。さらに、図５と同じ条件で３０分毎に６時間撮影した画像から、Ｓ３１２およびＳ３２８で特徴量を抽出した。図６は、特徴量の例として、画像内の細菌面積と輝度平均値をプロットした結果を示す図である。図６に示されるように、細菌面積は３００分まで増加しているが、その後は減少している。一方、輝度平均値は培養初期から６時間までほとんど変化がない。ここから、ステップ３３０における時間変化に基づく特徴量の例として、最大細菌面積や各測定時刻での傾きが算出される。例えば、判別時間が６時間のとき、６時間時点での細菌面積の最大値、６時間とその直前の細菌面積から求められる傾き、６時間での輝度平均値と０時間での輝度平均値の差分、などを算出する。
　これらの特徴量を用いて、前記の判別手順Ｓ３４０およびＳ３５０に従い、増殖／阻止が判別される。図４および５では、輝度平均値の差分の絶対値が２．２となり、閾値以下であるため、増殖とは判断されず、判別手順Ｓ３６０に進む。続いて、前記の細菌面積最大値や傾きを判別器に入力し、増殖／阻止を判別する。この結果は、阻止と判定された。１８時間後に濁度で得られた従来法の結果は阻止であり、画像から得られた結果と一致した。
　一方、図７は、アンピシリン／スルバクタムの濃度１／０．５μｇ／ｍＬを含む培地に大腸菌を培養し、０分、１８０分、３６０分で撮影した画像を示す図である。また、図８は、図７と同じ条件で３０分毎に６時間撮影した画像を用い、画像内の細菌面積と輝度平均値をプロットした結果を示す図である。図８に示されるように、細菌面積の経時変化から１２０分付近で立ち上がりはじめている。２４０分で細菌面積は最大値となるが、その後は一転して減少している。そして、２７０分時点での輝度平均値の差分絶対値が閾値を超えたため、上記ステップ３４０により、増殖と判定される。１８時間後の濁度による従来法の結果でも増殖と判定され、両判別法による判別結果は一致した。
　このように、輝度平均値を用いることで、精度良く細菌の増殖を判定することができる。輝度値を利用しない場合には、細菌面積が見かけ上減少することで、２７０分以降で阻止と判定されていたが、輝度平均値による判定により増殖と正しく判定することができる。また、各画素の輝度値の平均値を利用することで、画像を複数の領域に分割して２値化するといった処理なく増殖が判定できるため、計算時間およびコストが小さくできるという効果もある。したがって、迅速かつリアルタイムに細菌の増殖／阻止を判別することができる。
　なお、輝度値を利用した判別には、平均値以外に最頻値や中央値を用いることができる。最頻値や中央値を用いて判別しても平均値による判別と同様の効果が得られる。図９は、濃度２μｇ／ｍＬのセフォキシチンを含む培地で大腸菌を培養したとき、０、１８０、３６０分の顕微鏡画像を示す図である。また、図１０は、図９の画像に対し、輝度値の平均値、中央値、最頻値の変化をプロットした結果を示す図である。同じ画像であっても、特徴量により変化量は異なり、最頻値が最も大きな変化を示している。例えば、図９の３６０分の画像で特に顕著に見られるが、βラクタム系抗菌薬などの場合に、画像内で一部の細菌が白色となって撮影される場合がある。このような場合には、輝度値の平均値や中央値では、培養初期に比べたときに変化量が少なくなってしまう。一方、最頻値を用いればこのような影響を受けにくいことが分かった。培養初期の最頻値は、細菌数が少ないため、背景となる培地部分の輝度値を表している。細菌が画像全体に増殖すると、培地部分がなくなり、輝度値の異なる細菌部分が大多数となる。白く撮影される細菌もあるが、大多数の細菌は黒く撮影されるため、最頻値は減少する。このため、迅速かつ確実に増殖を検出可能となる。
（３）第２の実施形態
　第２の実施形態は、各ウェルの画像に対して最小値フィルタ処理を施し、各画像の輝度値の時間的変化に基づいて、より迅速に細菌の増殖を判定する形態について開示する。
　第２の実施形態による細菌検査装置について、第１の実施形態による細菌検査装置１００（図２参照）と同様の構成（例）を用いることができる。
　図１１は、第２の実施形態の細菌検査装置によって実行される画像処理を説明するためのフローチャートである。図１１において、図４と同一の符号を付した部分については詳細な説明は省略する。
　図１１において、第１の実施形態の処理との差異は、図４の処理にステップ１１０１が追加されている点である。つまり、第２の実施形態では、輝度値ヒストグラムを算出する処理（ステップ３１０）の前に、画像に対して最小値フィルタ処理を実行するステップ１１０１が追加されている。
　ステップ１１０１における最小値フィルタ処理は、注目する画素の輝度値を、周辺の画素の最小値で置き換える処理である。細菌のエッジ（輪郭）を太く強調する効果が得られる。そして、この最小値フィルタ処理をしてから輝度値ヒストグラムを算出し、輝度値の特徴量を抽出する。このようにすると、最小値フィルタ処理がある場合は、最小値フィルタ処理がない場合に比べて、特徴量の変化量が大きく強調できる。したがって、より迅速に細菌の増殖を判別できるようになる。
　＜測定例：実施例２＞
　図１２は、図９に示した画像に対して３×３の最小値フィルタ処理を施した場合の輝度最頻値の変化と当該最小値フィルタ処理を施さない場合の輝度最頻値の変化とを比較した結果を示す図である。
　図１２に示されるように、最小値フィルタ処理を加えることで、輝度最頻値がより大きく変化している。したがって、より迅速に増殖を判定することができる。この場合には、最小値フィルタ処理によって３０分以上早く細菌の増殖を判別できる。
　図１３は、濃度２μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む培地で大腸菌を培養したときの、０分、１８０分、および３６０分の顕微鏡画像を示す図である。図１４は、図１３の条件の細菌面積の時間変化と、最小値フィルタの有無で輝度最頻値の時間変化を示す図である。図１４に示されるように、細菌が画像全体に増殖していない場合には、最小値フィルタの有無に関係なく、輝度最頻値に変化はない。したがって、最小値フィルタ処理によって、細菌の増殖を誤検知することはないため、最小値フィルタ処理によるメリット（特徴量の変化量の強調）を最大限に享受することができる。
（４）第３の実施形態
　第３の実施形態は、輝度値変化を利用し、画像全体に細菌が増殖した後の細菌の増殖曲線を推定する形態について開示する。
　第３の実施形態による細菌検査装置についても、第１の実施形態による細菌検査装置１００（図２参照）と同様の構成（例）を採ることができる。また、第３の実施形態による細菌検査装置１００においては、第１の実施形態による画像処理（図４参照）を実行した後に、細菌の増殖曲線の推定処理（図１５参照）を実行する。図２および図４と同一の符号を付した部分については詳細な説明を省略する。
　＜細菌の増殖曲線の推定処理の必要性＞
　一般的な細菌検査装置においては、細菌が画像全体に増殖してしまうと、それ以降に細菌が増殖しているかどうかを検知することができなかい。また、ユーザが制御部１０６で細菌面積を利用して細菌の増殖曲線を確認する場合に、自動２値化の影響により細菌面積が減少していると、直感的に増殖かどうかわかりにくくなってしまう。このため、細菌面積が減少したとしても最近が増殖したか否かの判断を可能にすることが望ましい。
　そこで、本実施形態は、輝度値を細菌の特徴量と組み合わせて、増殖曲線を推定することを提案している。
　＜細菌面積の増殖曲線推定処理＞
　本実施形態では、輝度最頻値と細菌面積を組み合わせることにより、細菌面積の増殖曲線を推定している。図１５は、細菌面積と輝度値に基づいて細菌面積による増殖曲線を推定する処理を説明するためのフローチャートである。以下、細菌面積の増殖曲線推定処理について説明する。
（i）ステップ１４０１
　画像処理部１０５は、図４の画像処理に基づいて、入力された画像を用い、各特徴量（輝度最頻値および最近検知後の特徴量）を算出する。
（ii）ステップ１４０３
　画像処理部１０５は、培養初期の輝度最頻値に対して、ある時刻で撮影された画像の輝度最頻値の差分の絶対値が、あらかじめ設定された閾値を超えたか否か判断する。当該輝度最頻値の差分の絶対値が閾値以下の場合、処理はステップ１４１１に移行する。当該輝度最頻値の差分の絶対値が閾値よりも大きい場合、処理はステップ１４２１に移行する。当該輝度最頻値の差分の絶対値が閾値よりも大きい場合には、細菌の検知が実際よりも少なくなったと判断される。当該予め設定された閾値は、例えば、教師データにより学習し、設定することができる。
（iii）ステップ１４１１
　画像処理部１０５は、輝度最頻値の差分絶対値が閾値以下の場合、抽出された細菌面積をそのまま用いる。
（iv）ステップ１４２１
　画像処理部１０５は、輝度最頻値の差分の絶対値が閾値を超えた場合、同一ウェルで撮影された画像から、各時刻の輝度最頻値の傾きを計算する。なお、培養初期（0～1時間まで)では菌数が少ないことが明らかであるため、傾きは計算しない。
（v）ステップ１４２３
　画像処理部１０５は、培養初期と次の撮影時刻の傾き（例えば、１時間と１．５時間との輝度最頻値の傾き）に対して、一定以上の傾きの変化となった時刻を基準時刻に設定する。例えば、培養初期での傾きの１０倍以上の傾きとなった時刻が基準時刻とされる。
（vi）ステップ１４２５
　画像処理部１０５は、基準時刻以降の細菌面積について、式（１）に示される補正式を用いて、細菌面積を補正する。
　　Ａ’Ｔ＝－ｋ×（ＬＴ－Ｌ０）×ｓ＋ＡＴ０　・・・・　（１）
　式（１）では、基準時刻Ｔ０とその直前の時刻の細菌面積の傾きをｓ、基準時刻Ｔ０での細菌面積をＡＴ０、現在の時刻Ｔの輝度最頻値をＬＴ、基準時刻の輝度最頻値をＬＴ０、輝度値の特徴量に固有な比例定数をｋとし、補正後の細菌面積Ａ’Ｔを推定する。つまり、細菌面積は、基準時刻まではほぼ正確に検出できているとの仮定と、基準時刻直後も対数増殖期であると考えられる。このことから、ほぼ同等の増殖速度で細菌は増殖していると仮定し、増殖曲線を推定する。その後の細菌の増殖速度は、基準時刻の輝度値からの変化量にほぼ比例すると考えられるため、輝度値の差分に傾きをかけることで細菌面積が推定される。細菌の増殖が飽和し、静止期となると細菌の増殖速度が低下するため、輝度値の変化量も少なくなる。
（vii）ステップ１４３１
　画像処理部１０５は、細菌面積の変化を制御部１０６に出力する。制御部１０６は、生成された増殖曲線を表示装置の表示画面に表示する。これにより、ユーザは、増殖曲線を確認することができるようになる。
　＜測定例：実施例３＞
　図１６は、図９に示した画像の輝度最頻値、補正前の細菌面積、および補正後の細菌面積の時間変化を示す（３０分毎に撮影）図である。
　まず、輝度最頻値の変化量の絶対値は、２４０分まで閾値よりも小さい値であったため、２４０分までの細菌面積はそのまま出力される。次に、６０分以降の各時間の輝度最頻値の傾きを算出する。この場合、６０分と９０分の輝度最頻値の傾きを基準とし、１０倍以上の傾きの変化となった２１０分を基準時刻とする。したがって、２１０分を基準時刻に、２４０分以降の細菌面積が補正される。ここで、一度２４０分の細菌面積は出力されているが、２７０分で輝度最頻値が閾値を超えたため、さかのぼって細菌面積を補正する。つまり、２４０分撮影後時点では、そのままの細菌面積が出力されるが、２７０分撮影後では、細菌面積は補正される。このようにすることで、２値化処理の影響による細菌面積の減少のみを補正することができる。
　２４０分以降の細菌面積の補正には、１８０分－２１０分の傾きと、基準時刻である２１０分の細菌面積ＡＴ０をそれぞれ用いた。補正式（上記式（１））を用いて、図１６に示す補正後の増殖曲線が得られた。このように、細菌面積の増殖曲線が輝度最頻値を組み合わせることで推定でき、細菌の増殖の様子が視覚的にわかりやすく表示できる。また、画像全体に細菌が増殖したとき、増殖の様子は画像だけでは推定が困難だが、輝度値を用いることで、その後増殖しているかどうかを推定することができる。
（５）まとめ
（i）各実施形態は、細菌の同定や薬剤感受性を検査する細菌検出装置について開示する。当該細菌検査装置は、抗菌薬と細菌を含む培養液を保持する複数のウェルのそれぞれにおける菌の画像を、複数の時点において取得する顕微鏡光学系と、菌の画像ごとに輝度値の特徴量を算出する演算部と、輝度値の特徴量の変化に基づいて、ウェルにおける細菌の増殖を判別する判別部と、判別部による判別結果を表示する表示装置と、を備える。ここで、演算部は、上記輝度値の特徴量として、平均値、中央値および最頻値のうち少なくとも１つを含む特徴量を算出する。従来は、細菌の形状の特徴量（細菌の面積、周長、円形度、個数の少なくとも１つ）によって細菌の増殖および阻止を判別していたが、本実施形態では輝度値の特徴量に基づいて増殖の有無を判定するので、確実にかつ精度良く細菌の増殖を検知することができるようになる。
　本実施形態では、菌の画像の前記輝度値の特徴量に加えて、菌の画像内の細菌の形状特徴量を取得し、輝度値の特徴量と形状特徴量とを複数組み合わせて、細菌の増殖および阻止について判別するようにする。このように、細菌の形状特徴量に基づく細菌増殖判定を補完的に行うことにより、迅速に細菌の増殖および阻止を検知することができるようになる。
　第２の実施形態では、菌の画像に対して最小値フィルタ処理を施して菌のエッジを強調した後に輝度値の特徴量を算出する。このようにすることにより、輝度値の特徴量の変化量を強調することができるので、迅速に細菌の増殖を検知することができるようになる。
　第３の実施形態では、輝度値の特徴量の時間変化に基づいて細菌面積の時間変化を補正することにより細菌の増殖曲線を推定し、この推定された細菌の増殖曲線を表示装置に表示させるようにしている。このようにすることにより、自動２値化の影響によって細菌の面積が減少している場合であっても細菌の増殖判定を精度良く行うことができるようになる。
（ii）本開示は、上述した実施形態および実施例に限定されるものではなく、様々な変形例をも包含する。実施形態および実施例は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
１００　細菌検査装置
１０１　照明部
１０２　検査プレート
１０３　対物レンズ
１０４　撮像部
１０５　画像処理部
１０６　制御部

Claims (8)

  1. 　細菌の同定や薬剤感受性を検査する細菌検出装置であって、
    　抗菌薬と細菌を含む培養液を保持する複数のウェルのそれぞれにおける菌の画像を、複数の時点において取得する顕微鏡光学系と、
    　前記菌の画像ごとに輝度値の特徴量を算出する演算部と、
    　前記輝度値の特徴量の変化に基づいて、前記ウェルにおける前記細菌の増殖を判別する判別部と、
    　前記判別部による判別結果を表示する表示装置と、を備え、
    　前記演算部は、前記輝度値の特徴量として、平均値、中央値および最頻値のうち少なくとも１つを含む特徴量を算出する、細菌検査装置。
  2. 　請求項１において、
    　前記演算部は、前記菌の画像の前記輝度値の特徴量に加えて、前記菌の画像内の前記細菌の面積、円形度、周長および個数のうち少なくとも１つを含む形状特徴量を取得し、
    　前記判別部は、前記輝度値の特徴量と前記形状特徴量とを複数組み合わせて、前記細菌の増殖および阻止について判別する、細菌検査装置。
  3. 　請求項１において、
    　前記演算部は、前記菌の画像に対して最小値フィルタ処理を施して前記菌のエッジを強調した後に前記輝度値の特徴量を算出する、細菌検査装置。
  4. 　請求項１において、
    　前記演算部は、前記輝度値の特徴量の時間変化に基づいて前記細菌の面積の時間変化を補正することにより細菌の増殖曲線を推定し、前記推定された細菌の増殖曲線を前記表示装置に表示させる、細菌検査装置。
  5. 　細菌の同定や薬剤感受性を検査する細菌検出方法であって、
    　顕微鏡光学系を用いて、抗菌薬と細菌を含む培養液を保持する複数のウェルのそれぞれにおける菌の画像を、複数の時点において取得することと、
    　演算部が、前記菌の画像ごとに輝度値の特徴量を算出することと、
    　判別部が、前記輝度値の特徴量の変化に基づいて、前記ウェルにおける前記細菌の増殖を判別することと、
    　表示装置が、前記判別部による判別結果を表示することと、を含み、
    　前記演算部は、前記輝度値の特徴量として、平均値、中央値および最頻値のうち少なくとも１つを含む特徴量を算出する、細菌検査方法。
  6. 　請求項５において、さらに、
    　前記演算部が、前記菌の画像内における、前記細菌の面積、円形度、周長および個数のうち少なくとも1つを含む形状特徴量を取得することと、
    　前記判別部が、前記輝度値の特徴量と前記形状特徴量とを組み合わせて、前記細菌の増殖および阻止を判別することと、
    を含む、細菌検査方法。
  7. 　請求項５において、
    　前記演算部は、前記菌の画像に最小値フィルタ処理を施して前記菌のエッジを強調した後、前記輝度値の特徴量を算出する、細菌検査方法。
  8. 　請求項５において、さらに、
    　前記演算部が、前記輝度値の特徴量の時間変化に基づいて前記細菌の面積の時間変化を補正することにより細菌の増殖曲線を推定することと、
    　前記表示装置が、前記推定された細菌の増殖曲線を画面上に表示することと、
    を含む、細菌検査方法。
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